ES2954937T3 - Sistemas de clasificación de células por citometría de flujo y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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ES2954937T3 ES15865108T ES15865108T ES2954937T3 ES 2954937 T3 ES2954937 T3 ES 2954937T3 ES 15865108 T ES15865108 T ES 15865108T ES 15865108 T ES15865108 T ES 15865108T ES 2954937 T3 ES2954937 T3 ES 2954937T3
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Abstract

Se proporcionan sistemas y métodos para usar los mismos para clasificar células. Los sistemas pueden incluir un clasificador de células que incluye un deflector capaz de desviar una gota analizada hacia una ubicación receptora de la gota desviada, una etapa de soporte que incluye un contenedor y está configurada para moverse continuamente en dos dimensiones. Los sistemas y métodos de uso de los mismos encuentran uso en una variedad de aplicaciones diferentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas de clasificación de células por citometría de flujo y métodos de uso de los mismos
Introducción
La citometría de flujo es un método valioso para el análisis y aislamiento de partículas biológicas tales como células y moléculas constituyentes. Como tal, tiene una amplia gama de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. El método utiliza una corriente de fluido para segregar linealmente las partículas de tal forma que puedan pasar, en fila india, a través de un aparato de detección. Las células individuales se pueden distinguir según su ubicación en la corriente de fluido y la presencia de marcadores detectables. Por tanto, se puede usar un citómetro de flujo para producir un perfil de diagnóstico de una población de partículas biológicas.
El aislamiento de partículas biológicas se ha logrado agregando una capacidad de clasificación o recogida a los citómetros de flujo. Las partículas en una corriente segregada, detectada como teniendo una o más características deseadas, se aíslan individualmente de la corriente de muestra mediante retirada mecánica o eléctrica. Una técnica común de clasificación por flujo utiliza la clasificación por goteo en donde una corriente de fluido que contiene partículas separadas linealmente se rompe en gotas y las gotas que contienen partículas de interés se cargan eléctricamente y se desvían hacia un tubo de recogida al pasar a través de un campo eléctrico.
Las partículas segregadas linealmente en la corriente pueden caracterizarse a medida que pasan a través de un punto de observación situado justo debajo de la punta de boquilla. Una vez que se identifica que una partícula cumple uno o más criterios deseados, se puede predecir el momento en que alcanzará el punto de ruptura de la gota y se separará de la corriente en una gota. Idealmente, se aplica una breve carga a la corriente de fluido justo antes de que la gota que contiene la partícula seleccionada se separe de la corriente y se conecte después a tierra inmediatamente después de que la gota se rompa. La gota que se va a clasificar mantiene una carga eléctrica a medida que se desprende de la corriente de fluido, y todas las demás gotas quedan sin carga. La gota cargada puede desviarse de la trayectoria descendente de las otras gotas mediante un campo eléctrico y recogerse en un recipiente adecuado, mientras que las gotas sin carga caen directamente en un desagüe. Los clasificadores de gotas desvían las gotas que contienen células de interés aplicando una carga (de forma típica de 50 a 150 voltios) a las gotas. Las gotas son desviadas por un campo electrostático y, dependiendo de la carga, siguen distintas trayectorias para llegar a un recipiente de recogida. Las células se pueden distribuir en múltiples grupos mediante la aplicación de diferentes cargas, guiando cada carga discreta una gota hasta un recipiente.
En algunas aplicaciones, se desea emplear una bandeja de múltiples pocillos como recipiente en donde se depositan las gotas clasificadas, por ejemplo, para que cada gota clasificada pueda clasificarse en su propio recipiente individual. Con respecto a los sistemas que usan bandejas de múltiples pocillos, los sistemas están configurados para mover la bandeja en relación con la ubicación de clasificación, de modo que las gotas clasificadas puedan depositarse en pocillos individuales (por ejemplo, recipientes) de la bandeja de múltiples pocillos. El movimiento de la bandeja con respecto a la ubicación de clasificación se implementa actualmente a través de un perfil de movimiento de 'intermitente', donde la bandeja se mueve a una posición determinada en el espacio y se detiene, después de lo que comienza la clasificación. A continuación, la bandeja se mueve a la siguiente posición y así sucesivamente.
El documento US 2009/0061513 A1 describe un método de siembra de células que comprende proporcionar una muestra de células, sembrar una célula de la muestra de células en un pocillo de microplaca que tiene al menos 5 pocillos/cm2. Este documento describe también un método de cultivo celular que comprende sembrar una célula en una microplaca usando el método de siembra celular, incubar la microplaca y analizar el contenido de un pocillo de la microplaca.
Según su resumen, el documento US 2014/307940 A1 establece 'Se describen aparatos y métodos para realizar automáticamente las etapas de configuración para operaciones de citometría de flujo. La invención prevé la determinación espacial de una corriente de flujo y la posterior alineación automática de dispositivos de análisis y/o recipientes de recogida. La determinación automática de las propiedades de la corriente de flujo permite la configuración automática de los parámetros del citómetro de flujo.
Breve descripción de las figuras
Se entiende que los dibujos, descritos a continuación, son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.
La figura 1 representa un diagrama de bloques de un sistema (100) que incluye un instrumento clasificador (101), una plataforma (102) de soporte que lleva un recipiente y puede moverse continuamente con respecto al clasificador, y un controlador (103) que coordina la interacción entre el clasificador y la plataforma.
La figura 2 muestra un esquema de una bandeja (200) de 24 pocilios vista desde arriba. La línea discontinua (201) muestra una trayectoria de la boquilla de un clasificador con respecto a la bandeja, en un diseño intermitente. La trayectoria comienza en el centro 202 del pocillo A1 y termina en D1.
La figura 3 representa un esquema de un fragmento de una bandeja (300) de 24 pocillos y un fragmento de una trayectoria (línea discontinua 301) de la boquilla del clasificador que corresponde a la ubicación de recepción de gotas. Este fragmento de la trayectoria comienza en el punto 302, a la izquierda del pocillo A1 y se extiende más allá del pocillo A6. Las áreas sombreadas 303 marcan las regiones donde es posible y fiable depositar una gota en el pocillo. Cuando la boquilla del clasificador está alineada dentro de dichas áreas, el clasificador recibe una orden del controlador que proporciona la deposición de una gota (por ejemplo, mediante la desviación de la gota).
La figura 4 ilustra el desplazamiento de la plataforma a lo largo de un eje en una trayectoria intermitente. En el momento 0, la boquilla está alineada con el centro del primer pocillo, A1. Descansa allí durante aproximadamente 0,75 s, después en 0,25 s se mueve al centro de A2, vuelve a descansar durante 0,75 s y así sucesivamente. Procesar 6 pocillos, toma casi 6 s.
La figura 5 ilustra una trayectoria de desplazamiento continuo de la plataforma a lo largo de un eje a lo largo del tiempo. La boquilla del clasificador comienza alineada en el borde izquierdo del pocillo A1 y se mueve continuamente hacia el borde derecho del pocillo A6, con la misma velocidad que se mueve en la implementación intermitente existente. Ahora toma cuatro veces menos tiempo, 1,5 s, procesar 6 pocillos. La región 501 en el eje vertical entre las dos líneas discontinuas muestra el intervalo de desplazamiento donde es fiable depositar células en el pocillo A4. La región 502 en el eje horizontal entre las dos líneas discontinuas muestra el intervalo de tiempo correspondiente, aproximadamente 0,5 s.
Definiciones
Antes de describir las realizaciones ilustrativas con mayor detalle, se establecen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y el alcance de los términos utilizados en la descripción.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Singleton, y col., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley e Hijos, Nueva York (1994), y Hale y Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a los expertos el significado general de muchos de los términos usados en el presente documento. Aún así, ciertos términos se definen a continuación en aras de la claridad y facilidad de referencia.
Cabe señalar que tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ una” y “ el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “ un cebador” se refiere a uno o más cebadores, es decir, un solo cebador y múltiples cebadores. Se observa además que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como “ únicamente” , “ solamente” y similares en relación con la recitación de los elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación “ negativa” .
Un “ procesador” hace referencia a cualquier combinación de hardware y/o software que realizará las funciones que se le exigen. Por ejemplo, cualquier procesador del presente documento puede ser un microprocesador digital programable como el disponible en forma de controlador electrónico, unidad central, servidor u ordenador personal (de escritorio o portátil). Cuando el procesador es programable, la programación adecuada se puede comunicar desde una ubicación remota al procesador, o se puede guardar previamente en un producto de programa informático (como un medio de almacenamiento portátil o fijo legible por ordenador, ya sea magnético, óptico o basado en un dispositivo de estado sólido). Por ejemplo, un medio magnético o disco óptico puede llevar la programación y puede ser leído por un lector adecuado que se comunique con cada procesador en su estación correspondiente.
Un “ sistema basado en ordenador” se refiere a los medios de hardware, medios de software y medios de almacenamiento de datos utilizados para analizar la información de la presente invención. El hardware mínimo de un sistema basado en ordenador incluye una unidad central de procesamiento (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Se puede usar cualquier sistema basado en ordenador conveniente. Los medios de almacenamiento de datos pueden incluir cualquier construcción que incluya un registro de la presente información como se describe en el presente documento, o un medio de acceso a la memoria que pueda tener acceso a una construcción de este tipo.
Como se usa en el presente documento, el término “ registro” de datos, programación u otra información en un medio legible por ordenador se refiere a un proceso para almacenar información, usando cualquier método conveniente. Se puede elegir cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, basándose en los medios usados para acceder a la información almacenada. Se puede utilizar una variedad de programas y formatos de procesamiento de datos para el almacenamiento, por ejemplo, archivo de texto de procesamiento de texto, formato de base de datos, etc.
Como se usa en el presente documento, el término “ muestra” se refiere a un material o mezcla de materiales, en algunos casos en forma líquida, que contiene uno o más analitos de interés. En algunas realizaciones, el término, tal como se usa en su sentido más amplio, se refiere a cualquier material vegetal, animal o bacteriano que contenga células o que produzca metabolitos celulares, tales como, por ejemplo, tejido o fluido aislado de un individuo (incluyendo, pero sin limitarse a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, linfa, lágrimas, saliva y secciones de tejido) o de constituyentes de cultivos celulares in vitro, así como muestras del entorno. El término “ muestra” puede referirse también a una “ muestra biológica” . Como se usa en el presente documento, la expresión “ una muestra biológica” se refiere a un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, fluido vaginal y semen). Una “ muestra biológica” puede referirse también a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, plasma, suero, fluido espinal, líquido linfático, las secciones externas de la piel, vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores y órganos. En determinadas realizaciones, la muestra se ha extraído de un animal o una planta. Las muestras biológicas pueden incluir células. El término “ células” se usa en su sentido convencional para referirse a la unidad estructural básica de los organismos vivos, tanto eucariotas como procariotas, que tienen al menos un núcleo y una membrana celular. En ciertas realizaciones, las células incluyen células procarióticas, como las de bacterias. En otras realizaciones, las células incluyen células eucariotas, tales como células obtenidas de muestras biológicas de animales, plantas u hongos.
Como se usa en el presente documento, los términos “ determinar” , “ medir” y “ evaluar” y “ ensayar” se usan indistintamente e incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ aislado” se refiere a una fracción de interés que es al menos un 60 % libre, al menos un 75 % libre, al menos un 90 % libre, al menos un 95 % libre, al menos un 98 % libre, e incluso al menos un 99 % libre de otros componentes con los que está asociada la fracción antes de la purificación.
Una “ pluralidad” contiene al menos 2 miembros. En ciertos casos, una pluralidad puede tener 10 o más, como 100 o más, 1000 o más, 10.000 o más, 100.000 o más, 106 o más, 107 o más, 108 o más o 109 o más miembros.
Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
El término “ separar” , como se usa en el presente documento, se refiere a la separación física de dos elementos (por ejemplo, por tamaño o afinidad, etc.) así como a la degradación de un elemento, dejando el otro intacto.
Los métodos descritos en el presente documento incluyen múltiples etapas. Cada etapa se puede realizar después de que haya transcurrido una cantidad de tiempo predeterminada entre las etapas, según se desee. Como tal, el tiempo entre la realización de cada etapa puede ser de 1 segundo o más, 10 segundos o más, 30 segundos o más, 60 segundos o más, 5 minutos o más, 10 minutos o más, 60 minutos o más e incluyendo 5 horas o más. En ciertas realizaciones, cada etapa subsiguiente se realiza inmediatamente después de completar la etapa anterior. En otras realizaciones, una etapa se puede realizar después de un tiempo de incubación o de espera después de completar la etapa anterior, por ejemplo, de unos minutos a un tiempo de espera de toda la noche.
Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la memoria descriptiva.
Al describir adicionalmente el objeto de la invención, los sistemas se describen primero con mayor detalle. A continuación, se revisan los medios legibles por ordenador que pueden usarse en los sistemas en cuestión. También se describen métodos de interés en donde los sistemas en cuestión encuentran uso.
Sistemas de clasificación de células
Los aspectos de la descripción incluyen sistemas para clasificar células y métodos para usar los mismos. En algunos casos, el sistema es un sistema de citómetro de flujo que tiene un canal de flujo cargado con una muestra que incluye una mezcla de células, células que pasan sustancialmente una a la vez a través de una región de detección donde las células son detectadas e/o identificadas (es decir, analizadas). Esta corriente de flujo de células analizadas puede después clasificarse para entregar una población deseada de células analizadas a una ubicación de recepción de células, mientras que el resto de la corriente de flujo se desecha o se recoge por separado.
Como tal, el sistema incluye un clasificador de células que dirige las células analizadas deseables a la ubicación de recepción de células (es decir, clasificación de células), donde se configura una plataforma de soporte en movimiento continuo posicionada para recoger las células analizadas deseables en los múltiples recipientes de una bandeja montada en la plataforma de soporte. Una plataforma de soporte que se mueve con movimiento continuo puede proporcionar una vida útil más prolongada de las partes mecánicas y/o un menor mantenimiento del sistema debido al menor desgaste de los motores y otras partes mecánicas del mecanismo móvil de la plataforma de soporte que se produce para las etapas de movimiento continuo en comparación con las etapas que se mueven con un movimiento intermitente (por ejemplo, un movimiento que incluye períodos donde la velocidad es de 0 pocillos/s). El sistema puede incluir un controlador que sincroniza el movimiento continuo de la bandeja de múltiples pocillos con la entrega secuencial de células desde el clasificador de células. La lógica del controlador identifica intervalos de tiempo en la trayectoria del recipiente durante los que se puede recoger una célula analizada en recipientes particulares según la posición de la bandeja de múltiples pocillos a medida que se mueve a lo largo de la trayectoria. Cuando comienza dicho intervalo de tiempo, la recogida de una célula en un recipiente es posible y se emite un comando apropiado al mecanismo de clasificación del clasificador de células para dirigir realmente una célula deseable (por ejemplo, desviando una gota que contiene la célula) a una ubicación de recepción de células. Cuando finaliza el intervalo de tiempo, el controlador puede emitir un comando para evitar la clasificación de células. En algunos casos, el controlador puede emitir un comando para evitar la clasificación de células cuando se ha recogido una cantidad deseada de gotas y/o células en un recipiente, ya sea que haya terminado o no un intervalo de tiempo particular.
El sistema es un sistema para clasificar células, que incluye: un clasificador de células configurado para producir una corriente analizada de gotas y que comprende un desviador capaz de desviar una gota analizada de la corriente analizada de gotas a una ubicación de recepción de gotas desviadas; una plataforma de soporte que comprende un recipiente y configurada para moverse continuamente en dos dimensiones; y un procesador acoplado operativamente a una memoria que incluye instrucciones almacenadas para determinar la alineación del recipiente con la ubicación de recepción de gotas desviadas y enviar una señal de desviación al clasificador de células cuando el recipiente está alineado con la ubicación de recepción de gotas desviadas.
Clasificador de células
El sistema en cuestión incluye un clasificador de células capaz de separar y aislar una población celular deseable de una muestra. Cualquier clasificador de células conveniente para analizar y/o separar partículas dianas (por ejemplo, células) puede encontrar uso en los sistemas en cuestión, tales como clasificadores de células capaces de clasificación mecánica, clasificación electrostática o clasificación magnética. En algunos casos, el clasificador de células es parte de un sistema de citómetro de flujo. En ciertos casos, el sistema está configurado para producir una corriente de gotas, donde las gotas contienen células analizadas. El clasificador de células puede lograr el desvío de una gota de interés a una ubicación de recepción mediante la carga electrostática de la gota y la desviación de la gota cargada de la corriente de flujo mediante la aplicación de un campo electrostático. Dichos campos electrostáticos pueden ser creados por placas desviadoras colocadas adyacentes a la corriente de flujo. Como se usa en el presente documento, los términos “ desviación” o “ desviado/a” se refieren a la desviación electrostática de las gotas de interés de una corriente de flujo de gotas analizada, por lo que el clasificador de células puede identificar y rastrear las células de interés en la corriente de flujo y desviar solo esas gotas de la corriente de flujo que incluyen aquellas células de interés a ser recogidas por un recipiente. En algunos casos, el sistema está configurado para desviar una sola gota hacia cada recipiente.
El clasificador de células está configurado para producir una corriente analizada de gotas y desviar una gota analizada desde la corriente analizada de gotas hasta una ubicación de recepción de gotas desviadas. Como tal, el clasificador de células puede incluir un desviador capaz de desviar una gota analizada de una corriente de gotas a una ubicación de recepción de gotas desviadas. Como se usa en el presente documento, la expresión “ ubicación de recepción de gotas desviadas” se refiere a una ubicación en el sistema donde una gota clasificada que contiene una célula de interés puede recogerse después de que haya sido desviada por el clasificador de células. En algunos casos, el clasificador de células puede desviar una gota de interés a través de una boquilla opcional hasta un recipiente de recogida. La boquilla puede configurarse encima (es decir, ortogonalmente a lo largo de un eje z) de una plataforma de soporte que sujeta el recipiente, donde la plataforma de soporte está configurada para moverse continuamente (es decir, en el plano x-y). La ubicación de recepción de gotas desviadas corresponde a la posición en el plano x-y definido por la plataforma de soporte donde se cruza el eje z definido por la corriente de flujo de las gotas desviadas. A medida que la plataforma de soporte se mueve continuamente, también lo hace la ubicación de recepción de gotas desviadas en el plano x-y.
Solo la desviación de las gotas de interés por parte del clasificador de células conduce a la recogida de material de muestra en la ubicación de recepción de gotas desviadas. Si se colocara un solo recipiente en la ubicación de recepción de gotas desviadas, entonces el recipiente se colocaría para recoger una población enriquecida de células analizadas de interés del clasificador de células. En algunos casos, las gotas no desviadas siguen una corriente de flujo del clasificador de células que no está influenciada por un campo eléctrico, o una corriente de flujo que está influenciada por la aplicación de un campo eléctrico que tiene una polaridad y/o fuerza que evita la desviación hasta la ubicación de recepción de gotas. Las gotas no desviadas pueden desecharse o recogerse por separado.
Las células de interés pueden ser objeto de separación de la corriente de flujo de un clasificador de células según una variedad de parámetros, tales como una característica fenotípica identificada mediante la unión de una etiqueta fluorescente particular a las células de interés. Cualquier célula conveniente puede ser objeto de desvío en el clasificador de células del sistema en cuestión. En algunas realizaciones, el sistema está configurado para desviar las gotas analizadas que se determina que incluyen una célula diana.
Plataforma de soporte
El sistema incluye una plataforma de soporte para montar el (los) recipiente(s). La plataforma de soporte puede ser cualquier dispositivo de montaje conveniente configurado para mantener en su lugar un (los) recipiente(s) y para mover el (los) recipiente(s) en relación con una corriente de flujo de un clasificador de células. La plataforma de soporte puede incluir un sustrato plano, un dispositivo de montaje contorneado, estructuras de soporte cilíndricas o tubulares, o portadores de láser o LED, pero sin limitarse a tipos de estructuras de soporte. En algunos casos, la plataforma de soporte es un soporte para una bandeja de múltiples pocillos. Como se usa en el presente documento, las expresiones “ bandeja de múltiples pocillos” y “ placa de múltiples pocillos” se usan indistintamente para referirse a una disposición bidimensional de recipientes de recogida, por ejemplo, pocillos, viales, tubos, etc., que pueden configurarse en cualquier formato conveniente. Las bandejas de múltiples pocillos de interés incluyen, pero sin limitarse a, una construcción que incluye una configuración de pocillos, tubos y/o viales dispuestos en una serie de filas y columnas en un plano X-Y (por ejemplo, 2*3, 2*6, 3*4, 8*12, 16*24), tales como placas de 12 pocillos, 24 pocillos, 96 pocillos y 384 pocillos o bandejas de recipientes. Como se usa en el presente documento, el término “ recipiente” se refiere a un recipiente discreto que puede ser uno de una disposición de recipientes (por ejemplo, pocillos, viales, tubos, etc. en una bandeja de múltiples pocillos). Dependiendo del número de recipientes en los sistemas en cuestión, el número de plataformas de soporte puede variar, según se desee, como dos o más, tres o más, o cuatro o más plataformas e incluir cinco o más plataformas de soporte. En determinadas realizaciones, los sistemas de interés incluyen una plataforma de soporte, como una plataforma de soporte que tiene un recipiente montado, por ejemplo, una bandeja de múltiples pocillos montada. En ciertas realizaciones, la plataforma de soporte incluye dos o más recipientes montados, como 6 o más, 12 o más, 24 o más, 48 o más, 96 o más o 384 o más recipientes montados discretos.
La plataforma de soporte es móvil. La plataforma de soporte se mueve continuamente para ajustar la alineación del recipiente con la corriente de flujo de células analizadas de interés del clasificador de células. Como se usa en el presente documento, por movimiento “ continuo” se entiende que la plataforma de soporte no descansa (es decir, tiene una velocidad de 0) en una ubicación particular durante un período de movimiento continuo cuando las células se clasifican y recogen. El movimiento continuo de la plataforma de soporte puede ser lineal, curvo o angular y puede implicar uno o más cambios en la dirección del movimiento. En algunos casos, la plataforma de soporte se mueve continuamente con una velocidad constante. En ciertos casos, la plataforma de soporte se mueve continuamente con velocidad variable, donde la velocidad de la plataforma de soporte puede, en algunos casos, no caer por debajo de un umbral adecuado. En tales casos, la velocidad de la plataforma de soporte puede ser una velocidad media. En ciertas realizaciones, la plataforma de soporte se mueve continuamente con una velocidad de 0,2 pocillos/s o más, 0,5 pocillos/s o más, 1 pocillo/s o más, tal como 2 pocillos/s o más, 3 pocillos/s o más, 4 pocillos/s o más, 5 pocillos/s o más, 6 pocillos/s o más, 7 pocillos/s o más, 8 pocillos/s o más, 9 pocillos/s o más, o incluso 10 pocillos/s o más. La velocidad del movimiento continuo puede cambiar durante la trayectoria de la plataforma de soporte dependiendo de una variedad de factores, como el espacio entre los recipientes en una bandeja de múltiples pocillos y la frecuencia de las gotas clasificadas, etc. En ciertos casos, la plataforma de soporte se mueve continuamente, pero con cambios en la velocidad (es decir, cambios en la dirección del movimiento).
Como se usa en el presente documento, el término “ alineación” se refiere a las posiciones relativas del (de los) recipiente(s) montado(s) en la plataforma de soporte con una ubicación de recepción para la corriente de flujo de las células analizadas. Se dice que la plataforma de soporte está alineada con la ubicación de recepción de gotas desviadas cuando un recipiente montado en la plataforma es capaz de recibir o recoger una gota de interés desviada del clasificador de células. La plataforma de soporte se mueve continuamente en dos dimensiones, como en un plano X-Y ortogonal al eje de la corriente de flujo de las células analizadas (por ejemplo, el eje Z) de interés del clasificador de células. Como tal, la plataforma de soporte puede configurarse para alinear secuencialmente los pocillos de una bandeja de múltiples pocillos con la ubicación de recepción de gotas desviadas, mientras que la plataforma de soporte se mueve continuamente. La expresión “ se mueve continuamente en dos dimensiones” pretende abarcar movimientos lineales en el plano x-y, como el movimiento en una dimensión x (por ejemplo, como se describe en la Figura 3 a lo largo de la fila A, A1 a A6), seguido de un movimiento lineal en una dirección y (por ejemplo, de la fila A a la fila B), seguido de un movimiento lineal en una dirección x (por ejemplo, a lo largo de la fila B, de B6 a B1 o de B1 a B6), etc. En algunos casos, la plataforma de soporte incluye dos o más recipientes y el sistema está configurado para alinear automática y secuencialmente los dos o más recipientes con la ubicación de recepción de gotas desviadas en la dimensión Z a través del movimiento continuo de la plataforma de soporte en el plano X-Y.
La figura 3 ilustra una trayectoria (301) que representa la alineación de la ubicación de recepción de gotas desviadas con una bandeja de múltiples pocillos montada en una plataforma de soporte que se mueve continuamente con respecto al clasificador de células. La figura 5 ilustra la alineación espacial (región 501) y temporal (región 502) del pocillo A4 (figura 3) con la ubicación de recepción de gotas desviadas a medida que la plataforma se mueve continuamente. Para simplificar, las regiones correspondientes a la alineación espacial y temporal de los pocillos A1-A3, A5 y A6 (figura 3) con la ubicación de recepción de gotas desviadas no se indican en el gráfico.
En algunos casos, la estructura de soporte se puede mover en tres dimensiones. La plataforma de soporte está configurada para moverse continuamente. La plataforma de soporte se puede mover mediante un movimiento continuo durante el tiempo en que la bandeja de múltiples pocillos montada recibe o recoge gotas del clasificador de células.
La plataforma de soporte está configurada para no moverse en intervalos discretos durante la recogida de células del clasificador de células, por ejemplo, para no moverse con un movimiento intermitente como se muestra en el gráfico de la Figura 4. En ejemplos que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones, la plataforma de soporte se puede mover en intervalos discretos, como por ejemplo en incrementos de 0,01 micrómetros o mayores, como 0,05 micrómetros o mayores, tales como 0,1 micrómetros o mayores, tales como 0,5 micrómetros o mayor, como 1 micrómetro o más, como 10 micrómetros o más, como 100 micrómetros o más, como 500 micrómetros o más, como 1 mm o más, como 5 mm o más, como 10 mm o más e incluyendo incrementos de 25 mm o más.
Se puede emplear cualquier protocolo de desplazamiento para mover las estructuras de soporte, como mover las plataformas de soporte con una etapa de traslación accionada por motor, un conjunto de traslación de husillo, un dispositivo de traslación con engranajes, como los que emplean un servomotor, un motor eléctrico sin escobillas, un motor de CC con escobillas, entre otros tipos de motores.
En ciertas realizaciones, los sistemas en cuestión están configurados para evaluar la alineación del recipiente y/o la plataforma de soporte, directa o indirectamente, con la ubicación de recepción de gotas desviadas. Puede utilizarse cualquier componente y método conveniente para evaluar la alineación. En algunas realizaciones, los sistemas en cuestión incluyen uno o más fotodetectores para detectar señales de luz que indican la alineación. Los fotodetectores en los sistemas en cuestión pueden ser cualquier protocolo de detección de detección posicional conveniente, incluyendo, pero sin limitarse a, fotosensores o fotodetectores, como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodos de cuadrante, sensores de imagen, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga intensificada. dispositivos acoplados (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotoconductores o fotodiodos de puntos cuánticos y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. El posicionamiento relativo de todos los recipientes montados en una plataforma de soporte puede mapearse en relación con la corriente de flujo natural o una ubicación de recepción de la corriente de flujo de un clasificador de células evaluando la alineación relativa o el posicionamiento de cualquier punto de la plataforma de soporte.
Controlador
Los sistemas en cuestión pueden incluir un controlador que sincroniza el movimiento continuo de la plataforma de soporte (y, por tanto, una bandeja de múltiples pocillos montada) con la entrega de células desde el clasificador de células. En algunas realizaciones, se describe un producto de programa informático que incluye un medio utilizable por ordenador que tiene almacenada lógica de control en el mismo. La lógica de control, cuando la ejecuta el procesador del ordenador, hace que el procesador realice las funciones descritas en el presente documento. La lógica del controlador puede identificar intervalo(s) de tiempo en donde una célula analizada podría dirigirse a un pocillo particular y recogerse según el posicionamiento relativo de la bandeja de múltiples pocillos a medida que se mueve. Como se usa en el presente documento, el término “ sincronizar” se refiere a un proceso mediante el que el desvío de una corriente de flujo de interés a una ubicación de recepción ocurre solo cuando un recipiente está adecuadamente posicionado para recibir la corriente de flujo desviada. Se considera que un recipiente está colocado en la ubicación de recepción en cualquier momento en que el líquido desviado de la corriente de flujo a ese lugar se recoja dentro de la boca del recipiente. Como se usa en el presente documento, la expresión “ intervalo de tiempo” se refiere a un período de tiempo durante la trayectoria de la plataforma de soporte cuando un recipiente montado discreto está en una posición adecuada para recibir y recoger la corriente de flujo desviada de un clasificador de células (por ejemplo, para recibir una gota desviada gotita en un ubicación de recepción de gotas desviadas). En algunos casos, la trayectoria de la plataforma de soporte se determina trazando el posicionamiento relativo de una ubicación de recepción de gotas desviadas (proyectada desde un eje z ortogonal) con el movimiento continuo (por ejemplo, propuesto) de la plataforma en el plano x-y.
Cualquier dispositivo controlador conveniente puede utilizarse en los sistemas en cuestión. El controlador puede acoplarse operativamente a la plataforma de soporte y/o al clasificador de células y proporcionar instrucciones para llevar a cabo las funciones del sistema (por ejemplo, como se describe en el presente documento). En algunas realizaciones, el sistema incluye un procesador acoplado operativamente a una memoria que incluye instrucciones almacenadas en su interior para determinar la alineación temporal y espacial de un recipiente con la ubicación de recepción de la gota desviada. La figura 5 ilustra un período determinado de alineación espacial (región 501) y temporal (región 502) (es decir, intervalos de tiempo) de un pocillo A4 (figura 3) con la ubicación de recepción de gotas desviadas a medida que la plataforma de soporte se mueve continuamente. Para simplificar, las regiones correspondientes a los períodos de alineación espacial y temporal de los pocillos A1 -A3, A5 y A6 (Figura 3) con la ubicación de recepción de gotas desviadas no se indican en el gráfico. A medida que la plataforma se mueve continuamente, los períodos de alineación espacial y temporal (es decir, intervalos de tiempo) durante los que se puede recoger una célula desviada en las ubicaciones particulares de la bandeja de múltiples pocillos pueden depender de una serie de variables, según se desee. Se pueden tomar variables como la velocidad y la trayectoria propuesta de la plataforma de soporte, el ancho de la boca de los recipientes particulares utilizados (por ejemplo, pocillo, tubo o vial) y la distancia y/o el tiempo de demora entre la clasificación de las células y la recogida de las células. en cuenta para determinar regiones de alineamiento espacial y temporal.
En algunos casos, las instrucciones incluyen mapear una trayectoria de la plataforma de soporte en relación con la ubicación de recepción de gotas desviadas y determinar los intervalos de tiempo durante los que varios recipientes montados en la plataforma de soporte se colocarían adecuadamente para recibir células desviadas. Como tal, los intervalos de tiempo se refieren a períodos de tiempo en donde los recipientes están alineados espacialmente con la ubicación de recepción de la gota desviada. En algunos casos, determinar la alineación temporal y espacial de un recipiente incluye instrucciones para determinar la trayectoria de la plataforma de soporte en relación con la ubicación de recepción de gotas desviadas e instrucciones para determinar regiones de alineación temporal y espacial para cada recipiente. En determinadas realizaciones, un recipiente es un pocillo de una bandeja de múltiples pocillos montada en la plataforma de soporte.
El sistema puede configurarse para sincronizar la entrega de células desde el clasificador de células con el posicionamiento adecuado de un recipiente para recibir una gota desviada. En algunos casos, el sistema está configurado para desviar las gotas de interés solo cuando un recipiente está en una posición adecuada para recibir la gota. En algunas realizaciones, el sistema incluye un procesador acoplado operativamente a una memoria que incluye instrucciones almacenadas en su interior para enviar una señal de desviación al clasificador de células cuando el recipiente está alineado con la ubicación de recepción de gotas desviadas. Se considera que un recipiente está alineado con una ubicación de recepción de gotas desviadas cuando el recipiente está temporal y espacialmente presente en la ubicación de recepción de manera que puede recibir una gota desviada hacia la ubicación de recepción de gotas desviadas. El procesador puede configurarse para controlar el desviador del clasificador de células según las instrucciones ejecutables almacenadas en una memoria que proporcionan un número deseado de gotas a desviar durante cada intervalo de tiempo. Por señal de desviación se entiende cualquier instrucción o señal directa o indirecta conveniente que configure el clasificador de células para desviar una gota de interés, si está presente, a la ubicación de recepción de la gota desviada durante un período de tiempo deseado (por ejemplo, un intervalo de tiempo). La señal de desviación puede dividirse en dos o más partes o subseñales, que pueden funcionar para iniciar la desviación o para evitar una mayor desviación.
En algunas realizaciones del sistema, la señal de desviación incluye una subseñal de desviación inicial y una subseñal de desviación final. La memoria puede incluir instrucciones para producir la señal de desviación enviando una subseñal de desviación inicial al clasificador de células al comienzo del intervalo de tiempo que configura el desviador para desviar una gota analizada, cuando está presente. Las instrucciones para producir la señal de desviación incluyen además el envío de una subseñal de desviación final al clasificador de células al final del intervalo de tiempo que configura el desviador para no desviar una gota analizada. En algunas realizaciones del sistema, las instrucciones para producir la señal de desviación incluyen además el envío de una subseñal de desviación final al clasificador de células después de que se haya desviado una única gota analizada durante el intervalo de tiempo, en donde la señal de desviación final configura el desviador para no desviar una gota analizada. En algunos casos, cuando el sistema está configurado para desviar un número objetivo de gotas por recipiente, se envía una subseñal de desviación final durante el intervalo de tiempo para evitar que se desvíen más gotas desviadas a la ubicación de recepción de gotas desviadas. En ciertos casos, el sistema está configurado para desviar 5 gotas o menos por recipiente, tal como 5, 4, 3, 2 o 1 gotas por recipiente.
Un sistema de citómetro de flujo incluye un clasificador de células que puede proporcionar una frecuencia de gotas desviadas que depende de una variedad de factores, como la concentración de células de interés en la muestra, la velocidad y el volumen de la corriente de flujo, los medios de detección y/o identificación de células en la corriente de flujo y los medios de formación de gotas. Si una gota que contiene células de interés está disponible o no para la desviación durante un intervalo de tiempo depende de la frecuencia de dichas células en la corriente de flujo de las gotas analizadas y de la frecuencia de los intervalos de tiempo durante los que un recipiente está en una posición adecuada en la ubicación de recepción de gotas desviadas. La frecuencia de los intervalos de tiempo depende de una variedad de factores, tal como la velocidad y la trayectoria propuesta de la plataforma de soporte, el ancho de la boca de los recipientes particulares utilizados (por ejemplo, pocillo, tubo o vial) y el espacio entre los recipientes en la plataforma de soporte. En algunos casos, las bandejas de múltiples pocillos de interés tienen un espacio regular entre pocillos que proporciona una frecuencia de intervalo de tiempo constante durante el movimiento continuo de la plataforma de soporte. En algunas realizaciones, la plataforma de soporte incluye múltiples recipientes y el sistema está configurado para alinear automática y secuencialmente los dos o más recipientes con la ubicación de recepción de gotas desviadas en la dimensión Z a través del movimiento continuo de la plataforma de soporte en el plano X-Y.
El procesador puede configurarse para controlar el movimiento continuo de la plataforma de soporte según instrucciones ejecutables almacenadas en una memoria que tiene en cuenta la frecuencia de las gotas desviadas del clasificador de células al determinar las regiones de alineación espacial y temporal y los parámetros que las controlan. Como tal, en algunos casos del sistema, la memoria incluye un algoritmo para determinar la frecuencia de las gotas desviadas del clasificador de células. La memoria puede incluir un algoritmo para hacer coincidir la longitud y/o la frecuencia del lo(s) intervalo(s) de tiempo con la frecuencia de las gotas desviadas por lo que se determina que el clasificador de células desvía una única gota durante el intervalo de tiempo. Como se usa en el presente documento, el término “ coincidencia” se refiere a un algoritmo que tiene en cuenta una frecuencia determinada de gotas desviadas del clasificador de células al seleccionar uno o más parámetros que controlan el movimiento continuo de la plataforma de soporte, como la velocidad de movimiento y ruta espacial en un plano x-y, y así proporcionar una longitud y/o frecuencia deseable de intervalos de tiempo. Como tal, en algunos casos, las instrucciones para determinar las regiones de alineación espacial y temporal de los múltiples recipientes con la ubicación de recepción de las gotas desviadas incluyen la selección de una frecuencia deseable del l(os) intervalo(s) de tiempo. En algunos casos, la ruta espacial propuesta de la plataforma de soporte en el plano x-y en relación con la ubicación de recepción de gotas desviadas (eje z) se puede seleccionar de forma predeterminada según la configuración de una bandeja de múltiples pocillos (véase, por ejemplo, Figura 3). En tales casos, las instrucciones pueden incluir un algoritmo para seleccionar automáticamente una velocidad de plataforma de soporte deseable para proporcionar una frecuencia de intervalos de tiempo que coincida con una frecuencia determinada de desviación de gotas del clasificador de células. Se entiende además que el movimiento continuo de la plataforma de soporte se puede ajustar en respuesta a un cambio en las condiciones, como un cambio en la frecuencia de las células desviadas del clasificador de células, o un cambio en el número deseado de células desviadas por recipiente. Cualquier parámetro conveniente del sistema puede ajustarse automáticamente en respuesta a un cambio en las condiciones y/o parámetros deseados. En algunos casos, la memoria incluye instrucciones para ajustar automáticamente la velocidad de la plataforma de soporte (por ejemplo, a lo largo de una ruta espacial establecida) en respuesta a un cambio en la frecuencia de las gotas desviadas del clasificador de células. Por tanto, si la frecuencia de las gotas desviadas disminuye por un factor de 2, entonces la memoria puede incluir instrucciones para disminuir la velocidad de la plataforma de soporte, disminuyendo así la frecuencia de los intervalos de tiempo por un factor similar de 2. En algunos casos, la memoria incluye instrucciones para ajustar automáticamente uno o más parámetros del clasificador de células para proporcionar una frecuencia de gotas desviadas que coincida con la frecuencia de los intervalos de tiempo durante los que se pueden recoger las gotas. Los parámetros de interés del clasificador de células que pueden ajustarse automáticamente incluyen, pero sin limitarse a, la presión de fluido envolvente, la tensión de carga de las gotas, la tensión de la placa de desviación, el valor de corrección de carga, el retraso de caída, la frecuencia de activación de caída, la amplitud de caída y la fase de carga.
La memoria puede ser cualquier dispositivo adecuado en donde el procesador pueda almacenar y recuperar datos, tales como dispositivos de almacenamiento magnéticos, ópticos o de estado sólido (incluidos discos magnéticos u ópticos, cintas o RAM, o cualquier otro dispositivo adecuado, ya sea fijo o portátil). El procesador puede incluir un microprocesador digital de propósito general adecuadamente programado a partir de un medio legible por ordenador que lleva el código de programa necesario. La programación se puede proporcionar de forma remota al procesador a través de un canal de comunicación, o se puede guardar previamente en un producto de programa informático, como una memoria o algún otro medio de almacenamiento portátil o fijo legible por ordenador usando cualquiera de esos dispositivos en conexión con la memoria. Por ejemplo, un disco magnético u óptico puede llevar la programación y puede ser leído por un escritor/lector de disco. Los sistemas en cuestión incluyen también programación, por ejemplo, en forma de productos de programas informáticos, medios legibles por ordenador, algoritmos, etc. para su uso en el control de los sistemas en cuestión y la implementación de los métodos descritos en el presente documento.
Medio legible por ordenador
También se describe un medio legible por ordenador que incluye una memoria que incluye instrucciones (por ejemplo, como se describe en el presente documento) almacenadas allí. Las instrucciones y los algoritmos descritos en el presente documento pueden grabarse en cualquier medio legible por ordenador conveniente, por ejemplo, cualquier medio que pueda ser leído y accedido directamente por un ordenador. Dichos medios incluyen, pero sin limitarse a: medios de almacenamiento magnético, como disquetes, medios de almacenamiento en discos duros y cintas magnéticas; medios de almacenamiento óptico como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico como RAM y ROM; unidad flash portátil; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos.
En algunas realizaciones, las instrucciones incluyen: instrucciones para mover una plataforma de soporte que comprende un recipiente continuamente en el plano X-Y; un algoritmo para determinar la alineación temporal y espacial del recipiente con la ubicación de recepción de gotas desviadas; e instrucciones para enviar una señal de desviación a un clasificador de células cuando el recipiente está alineado con una ubicación de recepción de gotas desviadas, donde el clasificador de células incluye un desviador capaz de desviar una gota analizada de una corriente analizada de gotas a la ubicación de recepción de gotas desviadas.
En ciertas realizaciones, la memoria incluye instrucciones para determinar un intervalo de tiempo durante el que el recipiente se alinea con la ubicación de recepción de gotas desviadas. En algunos casos, la señal de desviación incluye una subseñal de desviación inicial y una subseñal de desviación final; y la memoria incluye instrucciones para producir la señal de desviación enviando una subseñal de desviación inicial al clasificador de células al comienzo del intervalo de tiempo que configura un desviador para desviar una gota analizada, cuando está presente. En ciertos casos, la memoria incluye además instrucciones para producir la señal de desviación enviando una subseñal de desviación final al clasificador de células al final del intervalo de tiempo que configura el desviador para no desviar una gota analizada. En algunos casos, la memoria incluye además instrucciones para enviar una subseñal de desviación final al clasificador de células después de que se haya desviado una sola gota analizada durante el intervalo de tiempo que configura el desviador para no desviar una gota analizada. En ciertos casos, las instrucciones pueden prever la recogida de dos o más gotas analizadas en un recipiente durante un intervalo de tiempo.
En algunas realizaciones, la memoria incluye instrucciones para mover automática y continuamente la plataforma de soporte en el plano X-Y para alinear secuencialmente los dos o más recipientes con la ubicación de recepción de gotas desviadas en la dimensión Z. En ciertas realizaciones, la memoria incluye un algoritmo para hacer coincidir la longitud del intervalo de tiempo con la frecuencia de las gotas desviadas, por lo que se determina que el clasificador de células desvíe una sola gota durante el intervalo de tiempo.
En algunos casos, la memoria incluye instrucciones para ajustar la velocidad de la plataforma de soporte en respuesta a un cambio en la frecuencia de las gotas desviadas del clasificador de células.
Citómetros de flujo
En ciertas realizaciones, el sistema incluye un citómetro de flujo. En algunos casos de dichas realizaciones, el sistema en cuestión puede configurarse para detectar la desviación y/o la recogida de una gota de una corriente de flujo, por ejemplo, mediante dispersión de luz. La luz dispersada hacia delante puede recogerse de una corriente de flujo irradiada y mediante uno o más detectores de dispersión hacia delante. En determinadas realizaciones, los detectores de dispersión frontal se colocan en el lado opuesto de la corriente de flujo de la fuente de luz y se colocan para recoger y detectar la luz dispersa frontal. En ciertas realizaciones, los sistemas en cuestión están configurados para evaluar la alineación con la corriente de flujo mediante la detección de señales de luz de la luz propagada aguas arriba por la reflectancia interna total.
En ciertos aspectos, el sistema puede incluir también una fuente de luz configurada para dirigir la luz a una región de ensayo del canal de flujo. El sistema puede incluir un detector configurado para recibir una señal de una región de ensayo del canal de flujo, en donde la composición fluorescente proporciona la señal. Opcionalmente, además, el sistema de análisis de muestras puede incluir uno o más detectores y/o fuentes de luz adicionales para la detección de una o más señales adicionales. En ciertos aspectos, el sistema puede incluir además sistemas informáticos configurados para detectar la presencia de la señal fluorescente. Los sistemas en cuestión pueden incluir una serie de componentes adicionales, como dispositivos de salida de datos, por ejemplo, monitores y/o altavoces, dispositivos de entrada de datos, por ejemplo, puertos de interfaz, teclados, etc., componentes de manejo de fluidos, fuentes de energía, etc.
Los citómetros de flujo de interés que pueden modificarse para incluir un recipiente en movimiento continuo en relación con una ubicación de clasificación de gotas según las realizaciones de la invención (por ejemplo, como se describe anteriormente), incluyen, pero sin limitarse a, los descritos en Ormerod (ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Conferencia de la Universidad de Oxford (1997); Jaroszeski y col. (eds.), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology No. 91, Conferencia Humana (1997); Practical Flow Cytometry, 3a ed., Wiley-Liss (1995); Virgo, y col. (2012) Ann Clin Biochem. Ene;49(pt 1):17-28; Linden, y col., Semin Throm Hemost. octubre de 2004;30(5):502-11; Allison, y col. J Pathol, diciembre de 2010; 222(4):335-344; y Herbig, y col. (2007) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.
24(3):203-255. En ciertos casos, los sistemas de citometría de flujo de interés incluyen el citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™, los sistemas BD Biosciences FACSvantage™, BD Biosciences FACSort™, BD Biosciences FACSCount™, BD Biosciences FACScan™y BD Biosciences FACSCalibur™, un clasificador de células BD Biosciences Influx™, un clasificador de células BD ACCURI™ C6, BD FACSVERSE™, BD LSRFORTESSA™ X-20, BD LSRFORTESSA™, BD Biociencias Jazz™ y un clasificador de células BD Biosciences Aria™ o similar.
En ciertas realizaciones, los sistemas en cuestión son sistemas de citómetros de flujo que incorporan uno o más componentes de los citómetros de flujo descritos en las Patente de EE. UU. n.° 3.960.449; 4.347.935; 4.667.830; 4.704.891; 4.770.992; 5.030.002; 5.040.890; 5.047.321; 5.245.318; 5.317.162; 5.4 64.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.620.842; 5.627.040; 5.643.796; 5.700.692; 6.372.506;6.809.804; 6.813.017; 6.821.7 40; 7.129.505; 7.201.875; 7.544.326; 8.140.300; 8.233.146; 8.753.573; 8.975.595; 9.092.034; 9.095.494 y 9.097.640.
Métodos
Como se ha resumido anteriormente, los aspectos de la invención incluyen métodos para clasificar células en un recipiente utilizando los sistemas en cuestión. En algunas realizaciones, el método incluye: cargar una muestra que incluye células en un sistema para clasificar células, por ejemplo, como se describe anteriormente, y clasificar las células mientras se opera el sistema de tal manera que el sistema funciona para mover la plataforma de soporte continuamente en dos dimensiones y enviar la señal de desviación al clasificador de células cuando el recipiente esté alineado con la ubicación de recepción de gotas desviadas.
Se puede utilizar cualquier protocolo conveniente para cargar una muestra en un sistema para clasificar células (por ejemplo, como se describe en el presente documento). En algunos casos, el sistema es un citómetro de flujo y la carga de la muestra incluye introducir la muestra en una corriente de flujo del citómetro de flujo. Cualquier muestra conveniente que incluya (o se sospeche que incluya) células de interés puede ser objeto de clasificación utilizando los sistemas en cuestión. Las células de interés pueden ser objeto de separación de la corriente de flujo de un clasificador de células según una variedad de parámetros, tales como una característica fenotípica identificada mediante la unión de una etiqueta fluorescente particular a las células de interés. En algunas realizaciones, el sistema está configurado para desviar las gotas analizadas que se determina que incluyen una célula diana. Una variedad de células pueden ser objeto de clasificación usando los métodos en cuestión. Las células diana de interés incluyen, pero sin limitarse a, células madre, células T, células dendríticas, células B, granulocitos, células de leucemia, células de linfoma, células de virus (por ejemplo, células de VIH), células NK, macrófagos, monocitos, fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales y células eritroides. Las células diana de interés incluyen células que tienen un marcador de superficie celular conveniente o un antígeno que puede ser capturado o marcado por un agente de afinidad conveniente o conjugado del mismo. Por ejemplo, la célula diana puede incluir un antígeno de superficie celular como CD11b, CD123, CD14, CD15, CD16, CD19, CD193, CD2, CD25, CD27, CD3, CD335, CD36, CD4, CD43, CD45RO, CD56, CD61, CD7, CD8, CD34, CD1c, CD23, CD304, CD235a, receptor de células T alfa/beta, receptor de células T gamma/delta, CD253, CD95, CD20, CD105, CD117, CD120b, Notch4, Lgr5 (N-Terminal), SSEA -3, antígeno TRA-1-60, disialogangliósido GD2 y CD71. En algunas realizaciones, la célula diana se selecciona de células que contienen VIH, células Treg, poblaciones de células T específicas de antígeno, células tumorales o células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) de sangre completa, médula ósea o sangre del cordón umbilical.
Los métodos en cuestión incluyen clasificar las células mientras se opera el sistema en cuestión (por ejemplo, como se describe en el presente documento). El sistema puede funcionar de forma parcial o totalmente automática. En algunos casos, el sistema funciona para mover la plataforma de soporte continuamente en dos dimensiones y para enviar la señal de desviación al clasificador de células cuando el recipiente está alineado con la ubicación de recepción de gotas desviadas. Por “ automático” se entiende que el movimiento continuo de la plataforma de soporte y la desviación de las gotas del clasificador de células requiere poca o ninguna intervención humana o entrada manual. En algunas realizaciones, los sistemas de interés pueden estar parcial o totalmente automatizados de modo que el movimiento continuo de la plataforma de soporte y la desviación de las gotas del clasificador de células estén controlados por el procesador. En ciertas realizaciones, los sistemas en cuestión están configurados para sincronizar el movimiento continuo de la plataforma de soporte y la desviación de las gotas desde el clasificador de células sin ninguna intervención humana. En ciertos casos, la entrada humana puede incluir seleccionar una bandeja de múltiples pocillos para montarla en la plataforma de soporte y determinar una trayectoria espacial para la plataforma de soporte (véase, por ejemplo, la figura 3 y la figura 2).
En ciertas realizaciones del método, el sistema funciona para determinar un intervalo de tiempo durante el que el recipiente se alinea con la ubicación de recepción de gotas desviadas. En algunos casos del método, la señal de desviación incluye una subseñal de desviación inicial y una subseñal de desviación final; y el sistema funciona para producir la señal de desviación enviando una subseñal de desviación inicial al clasificador de células al comienzo del intervalo de tiempo que configura el desviador para desviar una gota analizada, cuando está presente. En ciertos casos del método, el sistema funciona para enviar una subseñal de desviación final al clasificador de células al final del intervalo de tiempo que configura el desviador para no desviar una gota analizada. En algunas realizaciones del método, el sistema funciona para enviar una subseñal de desviación final al clasificador de células después de que una sola gota analizada haya sido desviada durante el intervalo de tiempo, donde la subseñal de desviación final configura el desviador para no desviar una gota analizada. En ciertas realizaciones del método, la plataforma de soporte incluye dos o más recipientes; y el método incluye mover automática y continuamente la plataforma de soporte en el plano X-Y para alinear secuencialmente los dos o más recipientes con la ubicación de recepción de gotas desviadas en la dimensión Z, recogiendo así las células analizadas en los dos o más recipientes. En ciertos casos del método, la plataforma de soporte incluye 12 o más recipientes.
En algunos casos del método, se determina que la corriente de gotas analizada incluye una célula objetivo clasificada. En ciertas realizaciones del método, el clasificador de células desvía una gota analizada solo cuando se determina que está presente una célula objetivo. En ciertos casos, el método incluye desviar una sola gota hacia cada uno de los dos o más recipientes. En ciertos casos, el método incluye recoger una sola célula objetivo en cada uno de los 12 o más recipientes.
En algunas realizaciones del método, el sistema funciona para hacer coincidir la longitud y/o la frecuencia del lo(s) intervalo(s) de tiempo con la frecuencia de las gotas desviadas por lo que se determina que el clasificador de células desvía una única gota durante el intervalo de tiempo. En ciertos casos, el método incluye además ajustar la velocidad de la plataforma de soporte en respuesta a un cambio en la frecuencia de las gotas desviadas desde el clasificador de células.
En algunos casos, el tiempo transcurrido para clasificar células en 6 o más recipientes (como 12 o más, 24 o más, 48 o más, 96 o más, o 384 o más recipientes discretos) es al menos 2 veces más rápido que un método de control que incluye mover el plataforma de soporte con un movimiento discontinuo de la misma velocidad (por ejemplo, con un movimiento intermitente como se describe en la figura 4 donde, cuando la plataforma se está moviendo, se mueve con la misma velocidad que la plataforma en movimiento continuo), como al menos 3 veces más rápido, 5 veces más rápido o incluso 10 veces más rápido que el método de control. Por “tiempo transcurrido” se entiende el tiempo que tarda la plataforma de soporte en moverse desde una posición de alineación entre el primer pocillo y la ubicación de recepción hasta una posición de alineación con el último “ pocillo” de una bandeja de múltiples pocillos.
En ciertas realizaciones del método, el método incluye además detectar y/o analizar la célula diana. En algunos casos, el método incluye además el análisis de citometría de flujo de la célula diana. La detección de la célula en un citómetro de flujo puede incluir excitar un tinte fluorescente con uno o más láseres en un punto de interrogación del citómetro de flujo y, posteriormente, detectar la emisión de fluorescencia del tinte usando uno o más detectores ópticos. Puede ser deseable, además de detectar la partícula, determinar el número de partículas (por ejemplo, células) clasificadas o separadas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos incluyen además contar y/o clasificar la partícula marcada (por ejemplo, célula diana). Al detectar, contar y/o clasificar partículas, primero se introduce un medio líquido que incluye las partículas en la ruta de flujo del citómetro de flujo. Cuando están en la trayectoria del flujo, las partículas pasan sustancialmente una a la vez a través de una o más regiones de detección (por ejemplo, un punto de interrogación), donde cada una de las partículas se expone individualmente a una fuente de luz en una sola longitud de onda y las mediciones de los parámetros de dispersión de luz y/o las emisiones fluorescentes según se desee (por ejemplo, dos o más parámetros de dispersión de luz y mediciones de una o más emisiones fluorescentes) se registran por separado para cada partícula. Los datos registrados para cada partícula se analizan en tiempo real o se almacenan en un medio de almacenamiento y análisis de datos, como una ordenador, según se desee. La patente de EE. UU. n.° 4.284.412 describe la configuración y el uso de un citómetro de flujo de interés equipado con una sola fuente de luz, mientras que la patente de EE.UU. n.° 4.727.020 describe la configuración y el uso de un citómetro de flujo equipado con dos fuentes de luz. También pueden emplearse citómetros de flujo que tengan más de dos fuentes de luz.
Más específicamente, en un citómetro de flujo, las partículas pasan, en suspensión, sustancialmente una a la vez en una trayectoria de flujo a través de una o más regiones de detección (o “ puntos de interrogación” ) donde en cada región cada partícula es iluminada por una fuente de energía. La fuente de energía puede incluir un iluminador que emita luz de una sola longitud de onda, tal como la proporcionada por un láser (por ejemplo, He/Ne o argón) o una lámpara de arco de mercurio con filtros apropiados. Por ejemplo, la luz a 488 nm puede usarse como una longitud de onda de emisión en un citómetro de flujo que tenga una sola región de detección. Para los citómetros de flujo que emiten luz en dos longitudes de onda distintas, se pueden emplear longitudes de onda adicionales de luz de emisión, donde las longitudes de onda específicas de interés incluyen, pero sin limitarse a: 535 nm, 635 nm y similares.
En serie con una región de detección, se utilizan detectores, por ejemplo, colectores de luz, como tubos fotomultiplicadores (o “ PMT” ), para registrar la luz que pasa a través de cada partícula (en ciertos casos denominados dispersiones de luz frontal), la luz que es reflejada ortogonalmente a la dirección del flujo de las partículas a través de la región de detección (en algunos casos denominados dispersiones de luz ortogonal o lateral) y la luz fluorescente emitida por las partículas, si está etiquetada con marcador(es) fluorescente(s), a medida que la partícula pasa a través de la región de detección y es iluminada por la fuente de energía. Cada una de la dispersión de luz frontal (o FSC), dispersión de luz ortogonal (SSC) y emisiones de fluorescencia (FL1, FL2, etc.) incluyen un parámetro separado para cada partícula (o cada “ evento” ). Por tanto, por ejemplo, se pueden recopilar (y registrar) dos, tres o cuatro parámetros de una partícula marcada con dos marcadores de fluorescencia diferentes.
Por consiguiente, en el ensayo de citometría de flujo de las partículas, las partículas pueden detectarse e identificarse de forma única exponiendo las partículas a luz de excitación y midiendo la fluorescencia de cada partícula en uno o más canales de detección, según se desee. La luz de excitación puede provenir de una o más fuentes de luz y puede ser estrecha o de banda ancha. Los ejemplos de fuentes de luz de excitación incluyen láseres, diodos emisores de luz y lámparas de arco. La fluorescencia emitida en los canales de detección utilizados para identificar las partículas y los complejos de unión asociados con las mismas puede medirse después de la excitación con una única fuente de luz, o puede medirse por separado después de la excitación con distintas fuentes de luz. Si se usan fuentes de luz de excitación separadas para excitar los marcadores de partículas, los marcadores pueden seleccionarse de manera que todos los marcadores sean excitables por cada una de las fuentes de luz de excitación usadas.
Los citómetros de flujo incluyen además medios de adquisición, análisis y registro de datos, como un ordenador, en donde múltiples canales de datos registran datos de cada detector para la dispersión de luz y la fluorescencia emitida por cada partícula a medida que pasa a través de la región de detección. La finalidad del sistema de análisis es clasificar y contar partículas, en donde cada partícula se presenta como un conjunto de valores de parámetros digitalizados. En el ensayo de citometría de flujo (por ejemplo, detección, conteo y/o clasificación) de partículas en los métodos de la invención, el citómetro de flujo se puede configurar para que se dispare en un parámetro seleccionado con el fin de distinguir las partículas de interés del fondo y el ruido. “ Disparo” se refiere a un umbral preestablecido para la detección de un parámetro y puede usarse como un medio para detectar el paso de una partícula a través del rayo láser. La detección de un evento que supera el umbral del parámetro seleccionado desencadena la adquisición de datos de fluorescencia y dispersión de luz para la partícula. No se adquieren datos de partículas u otros componentes en el medio que se está analizando que provocan una respuesta por debajo del umbral. El parámetro de disparo puede ser la detección de la luz dispersada hacia delante provocada por el paso de una partícula a través del haz de luz. A continuación, el citómetro de flujo detecta y recopila los datos de dispersión de luz y fluorescencia de la partícula.
Después, una subpoblación de interés particular se analiza más a fondo mediante “ activación periódica” basándose en los datos recopilados para toda la población. Para seleccionar una activación adecuada, los datos se representan gráficamente para obtener la mejor separación de subpoblaciones posible. Este procedimiento puede realizarse trazando la dispersión de luz frontal (FSC) frente a la dispersión de luz lateral (es decir, ortogonal) (SSC) en un diagrama de puntos bidimensional. El operador del citómetro de flujo selecciona después la subpoblación deseada de partículas (es decir, aquellas células dentro de la puerta) y excluye las partículas que no están dentro de la puerta. Cuando lo desee, el operador puede seleccionar la puerta dibujando una línea alrededor de la subpoblación deseada usando un cursor en la pantalla de una ordenador. Solo aquellas partículas dentro de la puerta se analizan más a fondo trazando los otros parámetros para estas partículas, como la fluorescencia.
El análisis de citometría de flujo de las partículas, como se describe anteriormente, proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre las partículas. Cuando se desee, el análisis anterior produce recuentos de las partículas de interés en la muestra. Como tal, el protocolo de análisis de citometría de flujo anterior proporciona datos sobre el número de uno o más tipos diferentes de partículas en una muestra.
Utilidad
Los sistemas, métodos y medios legibles por ordenador en cuestión, como se describe en el presente documento, encuentran uso en una variedad de aplicaciones diferentes en donde es deseable automatizar la recogida de partículas, como en la recogida de gotas desviadas en una bandeja de múltiples pocillos en un citómetro de flujo. La presente descripción encuentra también uso en aplicaciones en donde pueden desearse células preparadas a partir de una muestra biológica para investigación, pruebas de laboratorio o para su uso en terapia. En algunas realizaciones, los métodos y dispositivos en cuestión pueden facilitar la obtención de células individuales preparadas a partir de una muestra biológica tisular o fluídica diana. Por ejemplo, los métodos y sistemas en cuestión facilitan la obtención de células a partir de muestras de fluidos o tejidos para su uso como muestra de investigación o diagnóstico para enfermedades tales como el cáncer. Asimismo, los métodos y sistemas en cuestión facilitan la obtención de células a partir de muestras fluídicas o tisulares para su uso en terapia. Los métodos y dispositivos de la presente descripción permiten separar y recoger células de una muestra biológica (por ejemplo, órgano, tejido, fragmento de tejido, fluido) con mayor eficiencia y bajo coste en comparación con los sistemas de citometría de flujo tradicionales.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Experimental
Ejemplo 1: Diseño de sistema
Se diseña un sistema (por ejemplo, 100, figura 1) que incluye un instrumento clasificador (por ejemplo, 101, figura 1), una plataforma (por ejemplo, 102, figura 1) que lleva una bandeja de recipientes y que puede moverse continuamente con respecto al clasificador, y el controlador (por ejemplo, 103, figura 1) que coordina la interacción entre el clasificador y la plataforma. La figura 1 muestra un diagrama de bloques del sistema. El clasificador notifica al controlador cuando está listo para clasificar. Después el controlador inicia el movimiento de la plataforma. Cuando la plataforma está en la posición en donde es posible y lo suficientemente confiable depositar una célula en un pocillo específico, el controlador notifica al clasificador que desvíe la gota al pocillo.
Trayectoria Intermitente
La figura 2 muestra un esquema de una bandeja (200) de 24 pocillos vista desde arriba. La línea discontinua 201 muestra la trayectoria de la boquilla del clasificador con respecto a la bandeja, en un diseño intermitente. La trayectoria comienza en el centro 202 del pocillo A1 y termina en D1.
La figura 4 ilustra el desplazamiento de la plataforma a lo largo de un eje en una implementación intermitente a lo largo del tiempo. En el momento 0, la boquilla está ubicada contra el centro del primer pocillo, A1. Descansa allí durante aproximadamente 0,75 s, después en 0,25 s se mueve al centro de A2, vuelve a descansar durante 0,75 s y así sucesivamente. Procesar 6 pocillos, toma casi 6 s.
Trayectoria continua
La figura 3 representa un esquema de un fragmento de una bandeja (300) de 24 pocillos y un fragmento de la trayectoria (línea discontinua 301) de la boquilla en una realización de la invención. Este fragmento de la trayectoria comienza en el punto 302, a la izquierda del pocillo A1 y se extiende más allá del pocillo A6. Las áreas sombreadas 304 marcan las regiones donde es posible y fiable depositar una gota en el pocillo. Cuando la boquilla está ubicada dentro de dichas áreas, el clasificador recibe el comando del controlador que permite la deposición.
La figura 5 ilustra una trayectoria de desplazamiento continuo de la plataforma a lo largo de un eje a lo largo del tiempo. La boquilla comienza en el borde izquierdo del pocillo A1 y se mueve continuamente hacia el borde derecho del pocillo A6 (véase Figura 3), con la misma velocidad que se mueve en la implementación intermitente que se muestra en la figura 4. Se necesita cuatro veces menos tiempo, 1,5 s, para procesar 6 pocillos. La región 501 en el eje vertical entre las dos líneas discontinuas muestra el intervalo de desplazamiento donde es fiable depositar células en el pocillo A4 (eje y). La región 502 en el eje horizontal entre las dos líneas discontinuas muestra el intervalo de tiempo correspondiente, aproximadamente 0,5 s, en donde es fiable depositar células en el pocillo A4 (eje y).

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema (100) para clasificar células, comprendiendo el sistema:
un clasificador (101) de células configurado para producir una corriente analizada de gotas y que comprende un desviador capaz de desviar una gota analizada de la corriente analizada de gotas a una ubicación de recepción de gotas desviadas;
una plataforma (102) de soporte que comprende un recipiente y configurada para moverse continuamente en dos dimensiones; y
un procesador acoplado operativamente a una memoria que incluye instrucciones almacenadas en la misma para determinar la alineación del recipiente de una plataforma de soporte en movimiento continuo con la ubicación de recepción de gotas desviadas y enviar una señal de desviación al clasificador de células cuando el recipiente está alineado con la ubicación de recepción de gotas desviadas, en donde la memoria comprende instrucciones para determinar un intervalo de tiempo durante el que el recipiente se alinea con la ubicación de recepción de gotas desviadas, caracterizado por que se basa en la velocidad de movimiento de la plataforma de soporte y la trayectoria espacial en un plano x-y de la plataforma de soporte.
2. El sistema (100) según la reivindicación 1, en donde la señal de desviación comprende una subseñal de desviación inicial y una subseñal de desviación final; y la memoria comprende instrucciones para producir la señal de desviación enviando una subseñal de desviación inicial al clasificador (101) de células al comienzo del intervalo de tiempo que configura el desviador para desviar una gota analizada, cuando está presente.
3. El sistema (100) según la reivindicación 2, en donde las instrucciones para producir la señal de desviación comprenden además el envío de una subseñal de desviación final al clasificador (101) de células al final del intervalo de tiempo que configura el desviador para no desviar una gota analizada.
4. El sistema (100) según la reivindicación 2, en donde las instrucciones para producir la señal de desviación comprenden además el envío de una subseñal de desviación final al clasificador (101) de células después de que se haya desviado una única gota analizada durante el intervalo de tiempo, en donde la señal de desviación final configura el desviador para no desviar una gota analizada.
5. El sistema (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la memoria comprende un algoritmo para determinar una frecuencia de gotas desviadas desde el clasificador (101) de células.
6. El sistema (100) según la reivindicación 5, en donde la memoria comprende un algoritmo para hacer coincidir la longitud del intervalo de tiempo con la frecuencia de las gotas desviadas, por lo que se determina que el clasificador (101) de células desvíe una sola gota durante el intervalo de tiempo.
7. El sistema (100) según la reivindicación 6, en donde la memoria comprende instrucciones para ajustar automáticamente la velocidad de la plataforma (102) de soporte en respuesta a un cambio en la frecuencia de las gotas desviadas del clasificador (101) de células.
8. El sistema (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la plataforma (102) de soporte comprende dos o más recipientes y el sistema (100) está configurado para alinear automática y secuencialmente los dos o más recipientes con la ubicación de recepción de gotas desviadas en la dimensión Z a través del movimiento continuo de la plataforma de soporte en el plano X-Y.
9. El sistema (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema (100) está configurado para desviar las gotas analizadas que se determina que incluyen una célula diana.
10. El sistema (100) según la reivindicación 1, en donde el sistema (100) está configurado para desviar una única gota al interior del recipiente.
11. El sistema (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la plataforma (102) comprende dos o más recipientes configurados como una bandeja de múltiples pocillos.
12. El sistema (100) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema es un sistema de citómetro de flujo.
13. Un método para clasificar células en un recipiente, comprendiendo el método:
(a)cargar una muestra que comprende células en un sistema (100) para clasificar células, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores
y
(b)clasificar las células mientras opera el sistema (100) de tal manera que el sistema (100) funciona para mover la plataforma de soporte continuamente en dos dimensiones y para enviar la señal de desviación al clasificador de células cuando el recipiente está alineado con la ubicación de recepción de gotas desviadas.
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