DE69829606T2

DE69829606T2 - Reagenz und Verfahren zur Klassifizierung und Zählung von Leukozyten

Info

Publication number: DE69829606T2
Application number: DE69829606T
Authority: DE
Inventors: Toshihiro Nishi-ku Mizukami; Munetaka Kumamoto-shi Ishyama; Takashi Kakogawa-shi Sakata
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1998-05-19
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2018-05-20
Also published as: US6004816A; EP0882983A2; DE69829606D1; EP0882983B1; SA01220457A; JP3783808B2; EP0882983A3; JPH10319010A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Reagenz und ein Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten durch Durchflusszytometrie.
Im Feld der Laboruntersuchung kann die Klassifizierung und das Zählen von Leukozyten sehr nützliche Information zur Diagnose einer Krankheit liefern. Zum Beispiel umfassen Leukozyten im normalen periphären Blut typischerweise fünf normale Arten von Leukozyten, d.h. Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile in konstanten Verhältnissen. Bei Vorliegen einer Krankheit kann das Verhältnis dieser Leukozyten variieren. Das Messen des Verhältnisses der verschiedenen Arten von Leukozyten durch das Klassifizieren und Zählen dieser normalen Leukozyten ist nützlich, um Information über das Vorliegen einer Krankheit zu erhalten.
Abhängig von der Art der Krankheit können unreife Leukozyten oder Erythrozyten, welche üblicherweise im Knochenmark und nicht im periphären Blut vorhanden sind, z.B. unreife Granulozyten, wie Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten oder Metamyelozyten und Erythroblasten im periphären Blut zusätzlich zu den normalen Leukozyten auftreten. Darüber hinaus können abnormale Leukozyten, wie Lymphoblasten, atypische Lymphozyten oder abnormale Lymphozyten auftreten. Nachweis dieser Zellen und ihre Klassifizierung und Zählung sind von großer Wichtigkeit für die Diagnose einer Krankheit.
Zur Klassifizierung von Leukozyten war es übliche Praxis, einen Blutausstrich herzustellen, diesen passend zu färben und die gefärbte Probe mikroskopisch für die Klassifizierung und das Zählen zu untersuchen. In den letzten Jahren wurden verschiedene vollautomatische differenzielle Leukozytenzähler, basierend auf dem Prinzip eines Durchflusszytometers, zur Verfügung gestellt. Diese Geräte erlauben die hoch präzise Klassifizierung normaler Leukozyten, aber machten es nicht möglich, die obengenannten abnormalen Zellen, wie unreife Leukozyten, gleichzeitig mit der Klassifizierung und Zählung der normalen Leukozyten zu klassifizieren und zu zählen.
Zum Beispiel wurden ein Reagenz und ein Verfahren, welche das Auftreten von unreifen Leukozyten hoch präzise nach dem Prinzip der RF/DC-Messung nachweisen, zur Verfügung gestellt (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6-273413). Das Verfahren dieser Veröffentlichung misst unreife Leukozyten elektrisch unter Verwendung der Eigenschaft, dass unter bestimmten Bedingungen diese weniger zerstörbar sind als normale Leukozyten. Es ist auch vorgeschlagen worden, dass ihre Messung auf Basis von Informationen über gestreutes Licht von ihnen gemacht werden kann. Jedoch zielt dieses Verfahren nur auf den Nachweis von unreifen Leukozyten, und hat eine hervorragende Wirksamkeit in ihrem Nachweis, kann jedoch nicht gleichzeitig mit der Messung der unreifen Leukozyten normale Leukozyten klassifizieren und zählen. Andere Verfahren sollten für die Klassifizierung und das Zählen der normalen Leukozyten durchgeführt werden.
Ein anderes Verfahren, das zur Verfügung gestellt wurde, verwendet das Prinzip der Fluorometrie, um verschiedene unreife Leukozyten simultan mit der Klassifizierung von Leukozyten in vier verschiedene Populationen zu klassifizieren und zu zählen (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6-207942). Mit diesem Verfahren können normale Leukozyten gleichzeitig nur in vier Populationen klassifiziert werden und Basophile müssen auf andere Weise getrennt gemessen werden. Darüber hinaus muss eine Vielzahl von Fluoreszenzsignalen gemessen werden, was einen komplizierten, teuren Apparat benötigt.
Es ist auch ein Verfahren zur Klassifizierung und Zählung verschiedener unreifer Leukozyten gleichzeitig mit der Klassifizierung von Leukozyten in fünf Populationen zur Verfügung gestellt worden (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 5-34251). Dieses Verfahren benötigt einen komplizierten Detektor zur Klassifizierung der Leukozyten in fünf Populationen. Auch werden zwei Arten von Fluoreszenzinformation benötigt, wodurch ein großes, teures Gerät benötigt wird.
Darüber hinaus ist ein Verfahren zum Färben von Retikulozyten, RNA oder DNA unter Verwendung von Thiazolorange, Thiazolblau, Methyloxazolgelb oder verwandten Farbstoffen zur Verfügung gestellt worden ( US 4,957,870 ). Zusätzlich ist ein Verfahren zur Identifizierung von fünf verschiedenen Arten von Leukozyten durch Durchflusszytometrie zur Verfügung gestellt worden ( EP 0 268 766 ), worin ein fluorochromer Farbstoff, wie Astrazongelb 3G, verwendet wurde. Dieser Farbstoff färbt selektiv Eosinophile und Basophile.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Reagenz und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche fähig sind, anormale Zellen, wie unreife Leukozyten und abnormale Leukozyten einfach und mit großer Präzision zu klassifizieren und zu zählen, und gleichzeitig die Klassifizierung und das Zählen von normalen Leukozyten sowie das Zählen von Leukozyten durchzuführen.
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat herausgefunden, dass Leukozyten unter Verwendung eines bestimmten Farbstoffs einfach in zumindest 5 Populationen klassifiziert werden können. Das heißt, die vorliegende Erfindung umfasst zumindest einen Farbstoff, welcher die folgende Strukturformel
hat, wobei R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe ist, R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine Alkylgruppe darstellt, Z ein Schwefelatom darstellt, n gleich 1 ist und X^– ein Anion darstellt,
wobei zumindest einer von R₁ und R₄ eine Alkylgruppe mit 6, 8 oder 10 Kohlenstoffatomen darstellt
und spezifisch an RNA bindet, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen.
Ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte:

1) Mischen einer Blutprobe mit einem hämolytischen Agens, das Erythrozyten in der Blutprobe in einem solchen Maße lysiert, dass die Messung nicht behindert wird, wodurch normale oder abnormale Zellen in einen für die Färbung geeigneten Zustand gebracht werden;
2) Mischen der in Schritt 1) zubereiteten Probe mit einem Farbstoff, welcher die folgende Strukturformel aufweist
wobei R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe ist, R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine Alkylgruppe darstellt, Z ein Schwefelatom darstellt, n gleich 1 ist und X^– ein Anion darstellt, wobei zumindest einer von R₁ und R₄ eine Alkylgruppe mit 6, 8 oder 10 Kohlenstoffatomen darstellt und spezifisch an zelluläre RNA bindet, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen, wodurch kernhaltige Zellen in der Blutprobe fluoreszenzgefärbt werden;
3) Messen der Assay-Probe, die in Schritt 2) zubereitet wurde mit einem Durchflusszytometer, um zumindest ein gestreutes Licht und zumindest eine Fluoreszenz zu messen; und
4) Klassifizieren normaler Leukozyten in zumindest 5 Populationen und Zählen derselben unter Verwendung von in Schritt 3) gemessenen Unterschieden im gestreuten Licht und der Fluoreszenz.

In der Erfindung bezieht sich "Blutprobe" auf eine Körperflüssigkeitsprobe, enthaltend Leukozyten, wie peripheres Blut, Knochenmarkflüssigkeit, Urin oder eine durch Apherese gewonnene Blutprobe.
In der Erfindung bezieht sich "abnormale Zellen" auf unreife Zellen, welche normalerweise im Knochenmark und nicht im periphären Blut vorliegen, z.B. unreife Leukozyten, umfassend unreife Granulozyten (IG), wie Myeloblasten (Blasten), Promyelozyten, Myelozyten oder Metamyelozyten, abnormale Leukozyten, wie atypische Lymphozyten (A-Lymph), Lymphoblasten (L-Blast) oder abnormale Neutrophile (Ab-Neut), Erythroblasten (kernhaltige rote Blutzellen; NRBC) oder Zellen, welche üblicherweise nicht im periphären Blut vorkommen.
Der Schritt des Mischens einer Blutprobe mit einem hämolytischen Agens, welches Erythrozyten in der Blutprobe in einem solchen Maße lysiert, dass die Messung nicht behindert wird, wodurch normale und abnormale Zellen in einen für die Färbung geeigneten Zustand gebracht werden, einer der Schritte der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf den Schritt der Mischung einer Blutprobe mit einem geeigneten hämolytischen Agens. Der Zweck dieses Schritts ist bloß, Poren in der Zellmembran des zu messenden Leukozyten zu formen, wobei die Poren von einer ausreichenden Größe sind, damit zumindest Farbstoffmoleküle hindurchtreten. Das für diesen Zweck verwendete hämolytische Agens ist eine wässrige Lösung mit pH 4,5 bis 11,0, vorzugsweise 5,0 bis 10,0, welche zumindest eine kationische oberflächenaktive Substanz, zumindest eine nichtionische oberflächenaktive Substanz und einen Puffer zum Beibehalten eines konstanten pHs enthält.
Als die kationische oberflächenaktive Substanz wird eine oberflächenaktive Substanz von der Art eines quaternären Ammoniumsalzes oder oberflächenaktive Substanz von der Art eines Pyridinsalzes bevorzugt. Beispiele der oberflächenaktiven Substanz von der Art eines quaternären Ammoniumsalzes und des Pyridinsalzes sind oberflächenaktive Substanzen mit einer Gesamt-Kohlenstoffanzahl von 9 bis 30, ausgedrückt durch die Formel:
wobei R₁ ein Alkyl- oder eine Alkenylgruppe mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, R₂ und R₃ jeweils eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, R₄ eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe darstellt, und X ein Halogenatom darstellt.
Als R₁, welches eine Alkyl-- oder Alkenylgruppe mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, können Hexyl, Octyl, Decyl, Dodecyl oder Tetradecyl beispielhaft genannt werden. Eine geradkettige Alkylgruppe, wie Octyl, Decyl oder Dodecyl, ist insbesondere bevorzugt. Beispiele von R₂ und R₃, welche eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, sind Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl. Besonders bevorzugt ist eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl oder Propyl. Als R₄, welcher eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, können Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl genannt werden. Insbesondere ist eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl oder Propyl, bevorzugt.
Als die nichtionische oberflächenaktive Substanz wird eine nichtionische oberflächenaktive Substanz der Polyoxyethylenserie mit der folgenden Formel bevorzugt: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)n-H wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl oder Alkinylgruppe mit 8 bis 25 Kohlenstoffatomen darstellt, R₂ -O-,
oder -COO darstellt, und n eine ganze Zahl von 10 bis 50 angibt.
Es bestehen keine Einschränkungen bezüglich der Zusammensetzung des hämolytischen Agens, aber es kann vorzugsweise z.B. das hämolytische Agens, welches in der Japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 6-207942 und 7-181177 beschrieben wird, verwendet werden.
Darüber hinaus ist es bevorzugt, in das hämolytische Agens zumindest eine organische Säure mit zumindest einem aromatischen Ring in einem Molekül, oder ein Salz davon, zu inkorporieren, mit dem Zweck, die Intensitätsverteilung des gestreuten Lichts der Leukozyten so einzustellen, dass sie geeigneter für die Klassifizierung ist. Zum Beispiel kann Benzoesäure, Phthalsäure, Hippursäure, Salicylsäure, p-Aminobenzolsulfonsäure oder Benzolsulfonsäure oder ein Salz irgendeiner dieser Säuren vorzugsweise als die organische Säure oder ihr Salz verwendet werden. Das Hinzufügen der organischen Säure steigert die Intensität des gestreuten Lichts von Eosinophilen und verbessert schließlich die Trennung von Eosinophilen und Neutrophilen. Zum Beispiel wird im wesentlichen nur seitlich gestreutes Licht verwendet, um die Klassifizierung von Leukozyten in 4 Populationen zu ermöglichen.
Der pH des hämolytischen Agens ist 4,5 bis 11,0, vorzugsweise 5,0 bis 10,0. Um einen konstanten pH beizubehalten, ist ein Puffer, wie Citrat, HEPES oder Phosphat in dem hämolytischen Agens enthalten. Wenn die obengenannte Säure als ein Puffer wirkt, ist besagter Puffer keine absolut notwendige Komponente. Wenn der pH zu niedrig ist, werden Eosinophile und Basophile schlecht getrennt, und es wird schwierig, normale Leukozyten in 5 Populationen zu klassifizieren. Es ist jedoch möglich, normale Leukozyten in 3 Kategorien zu klassifizieren (Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten) und unreife Leukozyten und abnormale Leukozyten zu klassifizieren und zu zählen.
Ein zu hoher pH ist nicht bevorzugt, da er Leukozyten anfällig gegenüber Schädigung macht.
Als der Farbstoff, welcher spezifisch an zelluläre RNA bindet, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen, kann ein Farbstoff verwendet werden, welcher in einer RNA-freien Umgebung eine geringe Fluoreszenzintensität hat, und welcher durch Bindung an RNA in Fluoreszenzintensität zunimmt.
Die Mehrzahl abnormaler Zellen, wie unreife Leukozyten oder abnormale Leukozyten sind im Vergleich zu normalen Leukozyten reich an RNA. Zum Beispiel sind unreife Leukozyten Zellen auf ihrem Weg zur Reifung, und führen daher verschiedene Produktionsaktivitäten, welche mit Zellreifung assoziiert sind (z.B. Proteinsynthese) durch, so dass sie eine große Menge von RNA enthalten können.
Zur Verwendung im Reagenz und dem Verfahren zur Klassifizierung und Zählung von Leukozyten der vorliegenden Erfindung ist einer der folgenden Farbstoffe bevorzugt:
wobei R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe ist, R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine Alkylgruppe darstellt, Z ein Schwefelatom darstellt, n gleich 1 ist und X^– ein Anion darstellt, wobei zumindest einer von R₁ und R₄ eine Alkylgruppe mit 6, 8 oder 10 Kohlenstoffatomen darstellt.
Die obengenannten Farbstoffe haben die Eigenschaft, durch Bindung an RNA deutlich an Fluoreszenzintensität zuzunehmen.
Unerwarteterweise macht es die Verwendung dieser Farbstoffe möglich, Basophile gleichzeitig zu klassifizieren.
Wie oben ausgeführt, nehmen diese Farbstoffe an Fluoreszenzintensität zu (sie haben Spezifität), wenn sie an RNA gebunden sind, aber oft nehmen sie selbst dann an Fluoreszenzintensität zu, wenn sie an DNA gebunden sind.
Die Farbstoffe, welche auf für DNA spezifisch sind, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Jedoch werden die Fluoreszenzsignale von DNA mit Fluoreszenzsignalen von RNA überlagert, wodurch eine Tendenz zur Verringerung der Unterschiede in der Fluoreszenzintensität zwischen normalen Leukozyten und unreifen oder abnormalen Leukozyten verursacht wird. Daher sind für das Ziel der vorliegenden Erfindung die Farbstoffe mit einer geringen Affinität (Spezifität) für DNA bevorzugter.
Wir haben jene Farbstoffe der zuvor genannten Farbstoffe synthetisiert, in welchen zumindest einer von R₁ und R₄ eine langkettige Alkylgruppe (Kohlenstoffanzahl: 6 bis 18) ist, um den Einfluss ihrer Bindung an DNA zu verringern und ihre Spezifität für RNA zu erhöhen. Wir haben diese Farbstoffe verwendet, um normale und abnormale Leukozyten zu klassifizieren und zu zählen.
Im Ergebnis wurde festgestellt, dass obwohl der Wirkmechanismus nicht klar ist, die obigen Farbstoffe wegen des Vorhandenseins der langkettigen Alkylgruppe in ihrer Molekularstruktur nicht durch die Membran des Zellkerns hindurchtreten können, oder ihre Bindung an DNA-Moleküle infolge von sterischer Hemmung verhindert wird. Somit wurde festgestellt, dass diese Farbstoffe eine geringere Fluoreszenzzunahme infolge von DNA aufweisen und zu dem Vorteil führen, dass Fluoreszenz hauptsächlich infolge von RNA gemessen werden kann. Somit kann die Trennung von abnormalen Zellen, wie unreifen oder abnormalen Leukozyten von normalen Leukozyten deutlich verbessert werden.
Um so größer die Kettenlänge (Kohlenstoffanzahl) der langkettigen Alkylgruppe, desto mehr wird die Zunahme an Fluoreszenzintensität infolge von DNA unterdrückt, und um so höher wird die Spezifität für RNA. Die längere Kette tendiert auf der anderen Seite dazu, das Molekül hydrophobischer zu machen. Daher werden die Farbstoffe gering löslich in Wasser und schwierig zu handhaben, jedoch nicht unverwendbar. Im Hinblick auf diese Tatsachen sind die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung solche, in welchen R₁ oder R₄ eine Alkylgruppe mit 6, 8 oder 10 Kohlenstoffatomen darstellen.
Bevorzugte Anionen als X^– umfassen z.B. Halogenionen, wie F^–, Cl^–, Br^– und I^–, CF₃SO₃ ^– und BF₄ ^–.
Z ist ein Schwefelatom.
Die Konzentration des Farbstoffs ist unterschiedlich gemäß der Art des verwendeten Farbstoffs. Im allgemeinen ist seine Konzentration 0,001 bis 1.000 ppm, vorzugsweise 0,01 bis 100 ppm, noch bevorzugter 0,1 bis 10 ppm. Diese Konzentration ist die Konzentration im Reagenz zum Zählen und Klassifizieren von Leukozyten und wenn eine Färbelösung und das hämolytische Agens getrennt zubereitet werden, bezieht sich die Konzentration auf die Konzentration in einer Mischung der Färbelösung und des hämolytischen Agens.
Das Reagenz zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten der vorliegenden Erfindung kann durch Auflösen des obengenannten Farbstoffs in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Ethylenglykol, Methanol oder DMSO, Lagern der Lösung als eine Färbelösung, und bei der Verwendung Hinzufügen der Färbelösung zu einer Probe, welche durch Mischen einer Blutprobe mit dem hämolytischen Agens hergestellt wurde, zubereitet werden. Alternativ kann der Farbstoff zu dem hämolytischen Agens hinzugefügt werden, um ein Einkomponenten-Reagenz herzustellen.
Die so zubereitete Assay-Probe wird mit einem Durchflusszytometer gemessen, um zumindest ein gestreutes Licht und zumindest eine Fluoreszenz zu bestimmen.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet gestreutes Licht ein gestreutes Licht, welches mit einem kommerziell erhältlichen Durchflusszytometer gemessen werden kann. Dieses gestreute Licht umfasst z.B. seitwärts gestreutes Licht, vorwärts gestreutes Licht mit geringem Winkel (Lichtauffangwinkel: beinahe 0 bis 5 Grad) und vorwärts gestreutes Licht mit hohem Winkel (Lichtauffangwinkel: beinahe 5 bis 20 Grad). Als das gestreute Licht der Erfindung wird gestreutes Licht mit einem derartigen Streuwinkel ausgewählt, um Information über die Größe oder die internen Strukturen der Leukozyten wiederzugeben. Das bevorzugteste gestreute Licht ist seitwärts gestreutes Licht.
Die Verwendung von einer oder mehreren Arten von gestreutem Licht kann die Präzision der Klassifizierung erhöhen.
Insbesondere gibt die Verwendung von vorwärts gestreutem Licht mit geringem Winkel Information über die Größe von Zellen. Zum Beispiel ermöglicht seine Verwendung der vorliegenden Erfindung, abnormale Zellen nachzuweisen, welche nur in ihrer Größe verändert sind, und keine Zunahme an RNA-Gehalt aufweisen, wie in Haarzell-Leukämie.
Die Verwendung von vorwärts gestreutem Licht mit großem Winkel stellt auf der anderen Seite Information zur Verfügung, welche zwischen der Information, welche mit der Verwendung von vorwärts gestreutem Licht mit geringem Winkel und der Information, welche mit der Verwendung von seitwärts gestreutem Licht erhalten wird, liegt. Kurz gesagt wird Information umfassend Informationen über die Zellgröße und Information über die interne Struktur der Zellen erhalten.
Fluoreszenz wird von dem Farbstoff, welcher an Zellkomponenten wie RNA und DNA gebunden ist, emittiert. In Abhängigkeit von der Art des verwendeten Farbstoffs wird die bevorzugte zu empfangende Wellenlänge des Lichts ausgewählt.
Die Lichtquelle für das Durchflusszytometer ist nicht eingeschränkt, aber kann eine Lichtquelle mit einer für die Anregung des Farbstoffs geeigneten Wellenlänge sein. Zum Beispiel wird ein Argonlaser, ein He-Ne-Laser, ein roter Halbleiterlaser oder eine Quecksilberbogenlampe verwendet. Insbesondere wird der Halbleiterlaser bevorzugt, da er sehr billig und von kleiner Größe ist im Vergleich zu dem Gaslaser. Somit kann er die Kosten des Geräts deutlich verringern und kann die Größe des Geräts weiter verringern.
Der Schritt "Klassifizierung normaler Leukozyten in mindestens 5 Populationen und ihre Zählung unter Verwendung von Unterschieden im gemessen gestreuten Licht und der Fluoreszenz" umfasst- das Folgende: (1) Wenn ein Scattergramm gezeichnet wird (ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm), z.B. mit seitwärts gestreutem Licht auf der X-Achse und roter Fluoreszenz auf der Y-Achse, werden weiße Blutzellen in entsprechende Zellpopulationen gruppiert. (2) Diese Zellpopulationen werden mit geeigneter analytischer Software analysiert, um die Anzahl von Leukozyten in jeder Zellpopulation und das Verhältnis der entsprechenden Zellpopulationen zu berechnen. Zum Beispiel wird ein Fenster, welches jede Zellpopulation umgibt zur Verfügung gestellt, und die Anzahl der Zellen in jedem Fenster wird gezählt, wodurch die Anzahl der Zellen in jeder Leukozyten-Population und die Verhältnisse der entsprechenden Leukozyten-Populationen berechnet werden können.
Wenn das Reagenz und das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können nicht nur normale Leukozyten in zumindest 5 Populationen klassifiziert werden und anhand der Art der Population gezählt werden, sondern es kann auch gleichzeitig die Klassifizierung und das Zählen von abnormalen Zellen mit deren Klassifizierung und Zählen durchgeführt werden. Die für die Klassifizierung und das Zählen unter Verwendung des Reagenz und der Methode der vorliegenden Verwendung geeigneten abnormalen Zellen sind Zellen mit einem im Vergleich zu normalen Zellen erhöhten RNA-Gehalt. Zum Beispiel sind sie eines oder mehrere Mitglieder, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus unreifen Granulozyten, Myeloblasten, Erythroblasten und atypischen Lymphozyten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Reagenzkit zur Klassifizierung und Zählung von Leukozyten zur Verfügung, umfassend ein Reagenz, enthaltend:

1) Ein hämolytisches Agens, welches Erythrozyten in einer Blutprobe in einem solchen Maße lysiert, dass die Messung nicht behindert wird, wodurch normale und abnormale Zellen in einen für die Färbung geeigneten Zustand gebracht werden; und
2) eine Färbelösung, enthaltend zumindest einen Farbstoff, welcher die folgende Strukturformel hat
wobei R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe ist, R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine Alkylgruppe darstellt, Z ein Schwefelatom darstellt, n gleich 1 ist und X^– ein Anion darstellt, wobei zumindest einer von R₁ und R₄ eine Alkylgruppe mit 6, 8 oder 10 Kohlenstoffatomen darstellt und wobei der Farbstoff spezifisch an RNA bindet, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen.

1 ist ein seitwärts gestreutes Licht/rote Fluoreszenz- Scattergramm einer Blutprobe eines normalen Individuums, gemessen unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3;
2 ist ein vorwärts gestreutes Licht mit niedrigem Winkel/rote Fluoreszenz-Scattergramm einer Blutprobe eines normalen Individuums, gemessen unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3;
3 ist ein seitwärts gestreutes Licht/vorwärts gestreutes Licht mit geringem Winkel – Scattergramm einer Blutprobe eines normalen Individuums, gemessen unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3;
4 ist ein Histogramm von seitwärts gestreutem Licht einer Blutprobe von einem normalen Individuum, gemessen unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3;
5 ist ein Graph, welcher die Korrelation zwischen dem Prozentsatz von Lymphozyten, gemessen mit einer konventionellen Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jenem, gemessen mit der Methode zur Klassifizierung und Zählung von Beispiel 3, zeigt;
6 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen dem Prozentsatz von Monozyten, gemessen mit der konventionellen Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jenem, gemessen durch die Methode zur Klassifizierung und zum Zählen von Beispiel 3, zeigt;
7 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen dem Prozentsatz von Neutrophilen, gemessen mit der konventionellen Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jenem, gemessen mit der Methode zur Klassifizierung und zum Zählen von Beispiel 3 zeigt;
8 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen dem Prozentsatz von Eosinophilen, gemessen mit der konventionellen Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jenem, gemessen mit dem Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Beispiel 3 zeigt;
9 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen dem Prozentsatz von Basophilen, gemessen mit der konventionellen Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jenem, gemessen mit dem Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Beispiel 3 zeigt;
10 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen einer WBC-Zählung, bestimmt nach der konventionellen Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jener, bestimmt durch das Verfahren zur Klassifizierung und Zählung von Beispiel 3 zeigt;
11 ist das seitwärts gestreute Licht/rote Fluoreszenz-Scattergramm einer unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3 gemessenen Probe, wobei die Probe das Auftreten von unreifen Granulozyten (Metamyelozyten, Myelozyten) zeigt;
12 ist ein seitwärts gestreutes Licht/rote Fluoreszenz-Scattergramm einer unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3 gemessenen Probe, wobei die Probe das Auftreten von Myeloblasten zeigt;
13 ist ein seitwärts gestreutes Licht/rote Fluoreszenz-Scattergramm einer unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3 gemessenen Probe, wobei die Probe das Auftreten von Erythroblasten zeigt;
14 ist ein seitwärts gestreutes Licht/rote Fluoreszenz-Scattergramm einer unter Verwendung des Reagenz von Beispiel 3 gemessenen Probe, wobei die Probe das Auftreten von atypischen Lymphozyten und unreifen Granulozyten zeigt;
15 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer normalen Probe, welche unter Verwendung von Thiazolblau als Farbstoff im Beispiel 5 gemessen wurde;
16 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer Probe, gemessen unter Verwendung von Thiazolblau als Farbstoff in Beispiel 5, wobei die Probe das Auftreten von unreifen Granulozyten zeigt;
17 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer normalen Probe, gemessen unter Verwendung des Farbstoffs A als Farbstoff in Beispiel 5;
18 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer Probe, gemessen unter Verwendung des Farbstoffs A als ein Farbstoff in Beispiel 5, wobei die Probe das Auftreten von unreifen Granulozyten zeigt;
19 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer normalen Probe, gemessen unter Verwendung des Farbstoffs B als Farbstoff in Beispiel 5;
20 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer Probe, gemessen unter Verwendung des Farbstoffs B als Farbstoff in Beispiel 5, wobei die Probe das Auftreten von unreifen Granulozyten zeigt;
21 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer Blutprobe eines normalen Individuums, gemessen unter Verwendung von Zitronensäure als Säure in Beispiel 6; und
22 ist ein seitwärts gestreutes Licht/Fluoreszenz-Scattergramm einer Blutprobe eines normalen Individuums, gemessen unter Verwendung von Phthalsäure als Säure in Beispiel 6.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail durch die folgenden Beispiele beschrieben, wobei verschiedene Abwandlungen und Modifizierungen in der vorliegenden Erfindung gemacht werden können. Somit wird der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht durch diese Beispiele beschränkt.

In den beiliegenden Zeichnungen haben die Abkürzungen die folgenden Bedeutungen:

Lymph:	Lymphozyten
Eo:	Eosinophile
Mono:	Monozyten
Baso:	Basophile
Neut:	Neutrophile
WBC:	Weiße Blutzellen oder Leukozyten
IG:	Unreife Granulozyten
Blast:	Myeloblasten
NRBC:	Kernhaltige rote Blutzellen oder Erythroblasten
A-Lymph:	Atypische Leukozyten

Beispiel 1
Synthese des Farbstoffs A
Der Farbstoff A (R₁ = Methyl, R₂, R₃ = H, R₄ = n-Octyl, n = 1, Z = S, X = CF₃SO₃ ^–) wurde in der folgenden Weise hergestellt:
Ein Äquivalent 3-Methyl-2-methylbenzothiazol-methansulfat und drei Äquivalente N,N-Diphenylformamidin wurden in Essigsäure unter Rühren für 1,5 Stunden auf einem Ölbad mit 90°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde in Hexan geschüttet und eine rote, ölige Substanz wurde weiter in Hexan suspendiert und damit gewaschen, um Essigsäure zu entfernen. Das Rohprodukt wurde aus Ethylacetat-Hexan rekristallisiert (Ausbeute: 48%). Zu den Kristallen wurden ein Äquivalent 1-Octyl-lepidin-trifluorat und Pyridin hinzugefügt und die Mischung wurde unter Rühren für 3 Stunden auf einem Ölbad mit 90°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde aufkonzentriert und das verbleibende blaue Rohprodukt wurde mit Methanol- Chloroform durch Flash-Chromatographie gereinigt (Ausbeute: 62%).
In dieser Weise wurde Farbstoff A (R₁ = Methyl, R₂, R₃ = H, R₄ = n-Octyl, n = 1, Z = S, X = CF₃SO₃ ^–) als tief dunkles blaues Pulver erhalten.
Dünnschichtchromatographie (TLC) (Kieselsäuregel, 10% Methanol-Methylenchlorid): Rf = 0,5
¹H-NMR (CDCl₃) δ ppm (TMS): 0,88 (t, 3H) 1,28 (bR, 10H) 1,64 (s, 2H) 1,82 (bR, 2H) 3,60 (s, 3H) 4,23 (t, 2H) 6,35 (d, 1H) 6,82-7,26 (m, 2H) 7,39-7,90 (m, 6H) 8,10-8,26 (dd, 2H)
IR (cm 1): 1625, 1560, 1540, 1520, 1480, 1460, 1410, 1400, 1310, 1260, 1210, 1150, 1130, 740, 640
MASS (FAB positiv) m/z = 429
TLC 95,7% (10% Methanol-Methylenchlorid)
Absorptionsmaximum 629 nm (Methanol).
Beispiel 2
Synthese des Farbstoffs B
Der Farbstoff B (R₁ = Hexyl, R₂, R₃ = H, R₄ = Methyl, n = 1, Z = S, X = CF₃SO₃ ^–) wurde in der folgenden Weise hergestellt:
Ein Äquivalent 3-Hexyl-2-methylbenzothiazol-trifluorat und vier Äquivalente N,N-Diphenylformamidin wurden in Essigsäure unter Rühren für 10 Stunden auf einem Ölbad mit 90°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde aufkonzentriert und das verbleibende Rohprodukt wurde mit Hexanethylacetat durch Flash-Chromatographie aufgereinigt (Ausbeute: 27%). Zu dem Produkt wurden 1,3 Äquivalente 1-Methyl-lepidin-iodid und Pyridin hinzugefügt und die Mischung wurde unter Rühren für 3 Stunden auf einem Ölbad mit 90°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde aufkonzentriert und das verbleibende blaue Rohprodukt wurde mit Methanol-Chloroform durch Flash-Chromatographie aufgereinigt (Ausbeute: 75%).
In dieser Weise wurde Farbstoff B (R₁ = Hexyl, R₂, R₃ = H, R₄ = Methyl, n = 1, Z = S, X = CF₃SO₃ ^–) als tiefdunkles blaues Pulver erhalten.
TLC (Kieselgel, 10% Methanol-Methylenchlorid): Rf = 0,5
¹H-NMR (CDCl₃) δ ppm (TMS): 0,90 (t, 3H) 1,17-1,81 (m, 12H) 4,12 (s, 3H) 6,50 (m, 1H) 6,96-8,26 (m, 10H)
IR (cm^–1): 1620, 1560, 1530, 1510, 1480, 1460, 1410, 1380, 1310, 1250, 1210, 1150, 1100, 750, 640
MASS (FAB positiv) m/z = 401
TLC 93,0% (10% Methanol-Methylenchlorid)
Absorptionsmaximum 629 nm (Methanol).
Beispiel 3
Herstellung des Reagenz zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten
Ein Reagenz mit der folgenden Zusammensetzung wurde vorbereitet:
pH eingestellt auf 7,0 mit NaOH.
Zu 1,0 ml des obigen Reagenz wurden 30 μl Blut, behandelt mit einem Antikoagulans, von einem normalen Individuum hinzugefügt und die Mischung reagierte für 40 Sekunden bei 35°C. Dann wurde die Reaktionsmischung mit einem Durchflusszytometer (FCM) auf seitwärts gestreutes Licht, vorwärts gestreutes Licht mit geringem Winkel und Fluoreszenz gemessen.
Die verwendete Lichtquelle war ein roter Halbleiterlaser, der bei 633 nm operiert. Die Fluoreszenz wurde als Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder mehr (rote Fluoreszenz) gemessen.
1 ist ein Scattergramm mit seitwärts gestreutem Licht auf der X-Achse und roter Fluoreszenz auf der Y-Achse.
2 ist ein Scattergramm mit vorwärts gestreutem Licht mit niedrigem Winkel auf der X-Achse und roter Fluoreszenz auf der Y-Achse.
Leukozyten wurden in 5 Populationen klassifiziert, d.h. Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile.
Zur Information zeigt 3 ein Scattergramm mit seitwärts gestreutem Licht auf der X-Achse und vorwärts gestreutem Licht mit niedrigem Winkel auf der Y-Achse, während 4 ein Histogramm der Intensitäten des seitwärts gestreuten Lichts zeigt. Leukozyten wurden in 4 Populationen klassifiziert, d.h. Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile.
Ein Fenster wurde für jede Population zur Verfügung gestellt, und die Anzahl der Zellen in jedem Fenster und die Verhältnisse der Zellen in den entsprechenden Fenstern wurden berechnet.
5 bis 9 sind jeweils ein Graph, der die Korrelation zwischen dem Prozentsatz von Leukozyten, gemessen durch eine konventionelle Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jenem, gemessen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung (1) zeigt.
10 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen der WBC-Zahl, bestimmt durch die konventionelle Methode (SE-9000, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und jener, bestimmt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung (1) zeigt.
Es wurde eine hohe Korrelation zwischen allen Parametern, welche mit der konventionellen Methode gemessen wurden und jenen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemessen wurden, festgestellt.

Messungen durch die konventionelle Methode wurden unter Verwendung der folgenden Reagenzien vollautomatisch mit Hilfe von SE-9000 durchgeführt:

WBC-Zahl:	Gemessen nach Hinzufügen von Blut zu einer 1:1-Mischung von Cellpack-3D(II)^TM (TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und Stromatolyzer EO(II)^TM (TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.).
Lymphozyten und Monozyten:	Gemessen nach Hämolyse mit Cellpack-3D(II)^TM (TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) und dann Hinzufügen von Stromatolyzer 3D(II)^TM (TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.).
Eosinophile:	Gemessen unter Verwendung von Stromatolyzer EO(II)^TM (TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.).
Basophile:	Gemessen unter Verwendung von Stromatolyzer BA(II)^TM (TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.).
Neutrophile:	Berechnet aus der Gleichung (WBC-Zahl) – {(Lymphozytenzahl) + (Monozytenzahl) + (Zahl der Eosinophilen) + (Zahl der Basophilen)}.

Beispiel 4
Klassifizierung und Zähluag von Proben, in welche unreife Granulozyten oder abnormale Leukozyten auftraten
Unter Verwendung des Reagenz und des Verfahrens von Beispiel 3 wurden die folgenden Proben gemessen:

• Eine Probe, in welcher unreife Granulozyten (Metamyelozyten, Myelozyten) auftraten (11) 4,5% in der konventionellen Methode (visuelle Überprüfung), 4,0% für das Verfahren der Erfindung
• Probe, in welcher Myeloblasten auftraten (12) 81,5% für das konventionelle Verfahren, 85,1% für das Verfahren der Erfindung
• Probe, in welcher Erythroblasten auftraten (13) 25% für die konventionelle Methode, 21,5% für das Verfahren der Erfindung
• Probe, in welcher atypische Lymphozyten und unreife Granulozyten auftraten (14) Atypische Lymphozyten: 2,0% für die konventionelle Methode, 1,89% für das Verfahren der Erfindung Unreife Granulozyten: 2,0% für die konventionelle Methode, 2,17% für das Verfahren der Erfindung.

Jegliche unreife Granulozyten und abnormale Leukozyten wurden klar von normalen Leukozyten unterschieden, klassifiziert und gezählt. Gemäß der konventionellen Methode wurde ein Ausstrich durch eine May-Grünwald-Giemsa-Färbung doppelgefärbt und Leukozyten wurden mikroskopisch klassifiziert und in 200er Schritten gezählt (Vergrößerung: 1.000fach). Beispiel 5 Zubereitung des Reagenz
pH auf 7,0 eingestellt mit NaOH
Wenn der folgende Farbstoff verwendet wurde:
Zu 1,0 ml des obigen Reagenz wurden 30 μl Blut, welches mit einem Antikoagulans behandelt wurde, zugefügt und die Mischung reagierte bei 35°C für 40 Sekunden. Dann wurde die Reaktionsmischung mit FCM auf seitwärts gestreutes Licht und Fluoreszenz gemessen. Die Assay-Proben waren normale Proben und Proben, in welchen unreife Granulozyten auftraten. Die verwendete Lichtquelle war ein roter Halbleiterlaser, der bei 633 nm operiert. Die Fluoreszenz wurde als Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder mehr gemessen. Die Lichtquelle und die Wellenlänge der Fluoreszenz waren dieselben wie in Beispiel 3.
15 und 16 sind Scattergramme, erhalten unter Verwendung von Thiazolblau. 17 und 18 sind Scattergramme, erhalten unter Verwendung von Farbstoff A. 19 und 20 sind Scattergramme, erhalten unter Verwendung von Farbstoff B.
Wenn R₁ und R₄ jeweils eine niedrige Alkylgruppe waren, war es schwierig, zwischen normalen Neutrophilen und unreifen Granulozyten zu unterscheiden. Wenn im Gegensatz eine langkettige Alkylgruppe eingeführt wurde, wurde es möglich, zwischen normalen Neutrophilen und unreifen Granulozyten klar zu unterscheiden.
Beispiel 6
Zusammensetzung des Reagenz
Ein Reagenz mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:
Der pH wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt.
Als Säure wurde Zitronensäure oder Phthalsäure verwendet.
Zu 1,0 ml des obigen Reagenz wurden 30 μl Blut, behandelt mit einem Antikoagulans, von einem normalen Individuum hinzugefügt, und die Mischung reagierte bei 35°C für 40 Sekunden. Dann wurde die Reaktionsmischung mit FCM auf seitwärts gestreutes Licht und Fluoreszenz gemessen. Die verwendete Lichtquelle war ein roter Halbleiterlaser, der bei 633 nm operiert. Die gemessene Fluoreszenz war eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder mehr (rote Fluoreszenz).
21 ist ein Scattergramm, erhalten unter Verwendung von Zitronensäure als Säure. 22 ist ein Scattergramm, erhalten unter Verwendung von Phthalsäure als Säure.
Wenn Phthalsäure (eine organische Säure mit einem aromatischen Ring in der Molekularstruktur) als Säure verwendet wurde, wurde die Auftrennung von Neutrophilen und Eosinophilen im Vergleich zur Verwendung von Zitronensäure verbessert.
Gemäß dem Reagenz zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten der vorliegenden Erfindung wird eine Blutprobe und ein hämolytisches Agens gemischt und gemischt mit dem Farbstoff der vorliegenden Erfindung, um kernhaltige Zellen in der Blutprobe fluoreszenzzufärben. Dann wird zumindest ein gestreutes Licht und zumindest eine Fluoreszenz mit einem Durchflusszytometer gemessen. Indem man einfach dies durchführt, können abnormale Zellen, wie unreife Leukozyten und abnormale Leukozyten einfach und hochgenau klassifiziert und gezählt werden, und zur selben Zeit kann die Klassifizierung und das Zählen von normalen Leukozyten sowie das Zählen von Leukozyten durchgeführt werden.

Claims

Reagens zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten, wobei besagtes Reagens zumindest einen Farbstoff enthält, der die folgende Strukturformel aufweist:
wobei R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe ist, R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine Alkylgruppe darstellt, Z ein Schwefelatom darstellt, n gleich 1 ist und X^– ein Anion darstellt, wobei zumindest einer von R₁ und R₄ eine Alkylgruppe mit 6, 8 oder 10 Kohlenstoffatomen ist, und wobei der Farbstoff spezifisch an RNA bindet, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen.
Reagens gemäss Anspruch 1, wobei R₁ Methyl, R₄ n-Octyl und X CF₃SO₃ ^– ist.
Reagens gemäss Anspruch 1, wobei R₁ Hexyl, R₄ Methyl und X CF₃SO₃ ^– ist.
Verwendung des Reagenzes gemäss Ansprüchen 1 bis 3 zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten.
Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten, umfassend die Schritte: (1) Mischen einer Blutprobe mit einem hämolytischen Agens, das Erythrozyten in der Blutprobe in einem solchen Masse lysiert, dass die Messung nicht behindert wird, wodurch normale und abnormale Zellen in einen für die Färbung geeigneten Zustand gebracht werden; (2) Mischen der in Schritt (1) zubereiteten Probe mit dem Reagens gemäss Ansprüchen 1 bis 3; (3) Messen der Assay-Probe, die in Schritt (2) zubereitet wurde, mit einem Flusszytometer, um zumindest ein gestreutes Licht und zumindest eine Fluoreszenz zu messen; und (4) Klassifizieren normaler Leukozyten in zumindest fünf Populationen und Zählen derselben unter Verwendung von Unterschieden im gestreuten Licht und der Fluoreszenz, die in Schritt (3) gemessen wurden.
Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten gemäss Anspruch 5, wobei das hämolytische Agens zumindest eine nicht-ionische oberflächenaktive Substanz und zumindest eine kationische oberflächenaktive Substanz enthält und einen pH von 4,5 bis 11,0 aufweist.
Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten gemäss Anspruch 6, wobei das hämolytische Agens ferner eine organische Säure mit zumindest einem aromatischen Ring oder ein Salz derselben enthält.
Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten gemäss Anspruch 5, wobei das gestreute Licht zumindest ein Mitglied der Gruppe, bestehend aus vorwärts gestreutem Licht mit geringem Winkel, vorwärts gestreutem Licht mit hohem Winkel und seitwärts gestreutem Licht, ist.
Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten gemäss Anspruch 5, das die Klassifizierung und das Zählen von abnormalen Zellen simultan durchführen kann.
Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten gemäss einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die abnormalen Zellen Zellen mit einem im Verhältnis zu den normalen Zellen erhöhten RNA-Gehalt sind.
Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten gemäss Anspruch 10, wobei die abnormalen Zellen ein oder mehrere Mitglieder, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus unreifen Granulozyten, Myeloblasten, Erythroblasten und atypischen Lymphozyten, sind.
Reagens-Kit zur Klassifizierung und zum Zählen von Leukozyten, umfassend: (1) ein hämolytisches Agens, das Erythrozyten in der Blutprobe in einem solchen Masse lysiert, dass die Messung nicht behindert wird, wodurch normale und abnormale Zellen in einen zum Färben geeigneten Zustand gebracht werden; und (2) eine Färbelösung, enthaltend das Reagens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3.