DE69211434T2

DE69211434T2 - Verfahren zur Probevorbereitung zur Klassifizierung und Zählung der Leukozyten

Info

Publication number: DE69211434T2
Application number: DE69211434T
Authority: DE
Inventors: Mitsue Ito; Takashi Sakata
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1991-07-29
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2012-06-27
Also published as: CA2071732A1; AU1842192A; US5264369A; EP0525398B1; JPH0534251A; EP0525398A2; EP0525398A3; CA2071732C; JP3048260B2; DE69211434D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Probe zum Klassifizieren und Zählen von Blutkörperchen in der Praxis der klinischen Testung. Genauer ausgedrückt betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung einer Probe, die zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten mit einem Fließzytometer mit Hilfe von optischen oder optischen/elektrischen Messungen an Blutkörperchen verwendet werden.
Peripheres Blut von normalen Subjekten umfaßt fünf Typen von Leukozyten, nämlich Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile.
Diese Leukozyten unterscheiden sich voneinander im Hinblick auf die Funktion, und daher ist die Klassifizierung und die Zählung von Leukozyten, die in dem peripheren Blut enthalten sind, bei der Diagnose von verschiedenen Erkrankungen sehr nützlich.
Es ist gut bekannt, daß das periphere Blut von Patienten mit z.B. Leukämie, hämolytischer Anämie oder Krebs unreife Granulozyten, Blasten und Erythroblasten enthält, die üblicherweise nicht in dem peripheren Blut, aber in dem Knochenmark zusätzlich zu den oben erwähnten fünf Typen beobachtet werden. Diese drei Blutkörperchen werden nachfolgend mit abnormale Zellen bezeichnet. Daher ist es sehr wichtig, diese abnormalen Zellen für Diagnosezwecke zu ermitteln, zu klassifizieren und zu zählen.
Die Klassifizierung und die Zählung von Leukozyten wurden ganz allgemein durch das Differentialzählverfahren durchgeführt, das ebenfalls als visuelles Zählverfahren oder einfach als manuelles Verfahren bezeichnet wird. Bei diesem Verfahren wird eine Blutprobe auf einen Glasobjektträger gestrichen, und die Blutkörperchen in dem Abstrich werden fixiert und für die mikroskopische Untersuchung gefärbt. Der Techniker identifiziert die Art der individuellen Leukozyten entsprechend ihrer morphologischen Merkmale oder entsprechend des Grades der Farbstoffaufnahme und führt somit die Klassifizierung und Zählung durch. In üblichen Labors werden 100 bis 200 Leukozyten üblicherweise für jede Probe gezählt, und der Prozentsatz der gesamten Leukozytenzählung, der durch jeden Typ von Korpuskeln besetzt wird, wird als gemessener Wert aufgezeichnet.
Das Differentialzählverfahren hat mehrere Nachteile, z.B. daß die Herstellung der Probe, die untersucht werden soll, schwierige Vorgänge erfordert; daß die Klassifizierung durch mikroskopische Beobachtung durch eine erfahrene Person durchgeführt werden soll und daß der gemessene Wert von Techniker zu Techniker deutlich variiert; daß die kleine Anzahl von Leukozyten, die gezählt werden soll, große statistische Fehler verursacht; und daß es für den Techniker eine große Aufgabe ist, Leukozyten durch dieses Verfahren zu klassifizieren und zu zählen.
Daher wurden Versuche durchgeführt, um eine Zahl von Leukozyten automatisch zu klassifizieren und zu zählen, um dadurch die Genauigkeit zu erhöhen und Arbeit einzusparen. Seit kurzem werden automatisierte Geräte, basierend auf einem Fließsystem, zur Lösung der oben erwähnten Probleme verkauft.
Diese automatisierten Geräte können grob in die folgenden drei Typen in Abhängigkeit von dem Meßprinzip klassifiziert werden.
Ein Gerät des ersten Typs besteht aus drei Lysiermitteln und drei Arten von Ermittlungseinheiten. Im ersten Schritt werden andere Zellen als Leukozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind, mit dem ersten Lysiermittel lysiert, und RF- und DC-Signale der verbleibenden Leukozyten werden gemessen. Dann werden die Leukozyten in drei Typen, nämlich Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten in Abhängigkeit von der Differenz der Signalintensität klassifiziert.
Im zweiten Schritt werden andere Zellen als Eosinophile, die in der Blutprobe enthalten sind, mit dem zweiten Lysiermittel lysiert, und die DC-Signale der verbleibenden Zellen werden gemessen. Somit werden die Eosinophile alleine in Abhängigkeit von der Differenz der Signalintensität klassifiziert und gezählt.
Die RF- und DC-Signale werden nachfolgend erläutert.
Ein direkter Strom (DC) wird zwischen Elektroden auferlegt, die an den beiden Seiten einer kleinen Öffnung lokalisiert sind. Dann wird ein Signal, das aufgrund einer Änderung der Impedanz wegen des Durchleitens eines Teilchens durch die Öffnung erzeugt wird, mit DC-Signal bezeichnet. Auf der anderen Seite wird ein Signal, das aufgrund einer Anderung der Impedanz wegen des Durchleitens eines Teilchens durch eine Öffnung erzeugt wird, wenn ein Radiofrequenz-(RF)-Strom mehreren 10 MHz zwischen den Elektroden auferlegt wird, mit RF-Signal bezeichnet.
Es muß nicht erwähnt werden, daß beide dieser Ströme gleichzeitig auferlegt werden können und daß somit sowohl die DC- als auch die RF-Signale ermittelt werden können.
In dem dritten Schritt werden andere Zellen als Basophile, die in der Blutprobe enthalten sind, mit dem dritten Lysiermittel lysiert, und die DC-Signale der verbleibenden Zellen werden gemessen. Somit werden Basophile alleine in Abhängigkeit von der Differenz der Signalintensität klassifiziert und gezählt.
Schließlich werden die Neutrophile durch Subtrahieren der in dem zweiten Schritt ermittelten Eosinophile und der in dem dritten Schritt ermittelten Basophilen von den in dem ersten Schritt ermittelten Granulozyten berechnet.
Ein Gerät des zweiten Typs besteht aus einem Lysiermittel und einer Ermittlungseinheit. Wie das japanische offengelegte Patent Nr. 502533/1989 detailliert beschreibt, umfaßt dieses Verfahren die Behandlung einer Blutprobe mit einem Lysiermittel, wodurch andere Blutkörperchen als Leukozyten lysiert werden können, ohne daß die Leukozyten beschädigt werden, die Messung von RF-, DC und Lichtstreuungssignalen zur gleichen Zeit und das anschließende Klassifizieren und Zählen von fünf Typen von Leukozyten durch angemessenes Kombinieren der oben erwähnten drei Signale.
Ein Gerät des dritten Typs besteht aus zwei Mitteln und zwei Ermittlungseinheiten. Bei diesem Verfahren werden andere Blutkörperchen als Leukozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind, zunächst mit einem Lysiermittel lysiert und dann einer Peroxydasefärbung mit einer Färbelösung unterworfen. Als nächstes werden die Absorbans und das gestreute Lichtsignal eines jedes Leukozyts gemessen, und die Leukozyten werden in vier Typen (Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile) klassifiziert und in Abhängigkeit von der Differenz der Signalintensität gezählt. Dann wird die Blutprobe mit einem anderen Lysiermittel behandelt, das in der Lage ist, andere Blutkörperchen als Basophile zu lysieren. Nach der Messung von zwei Typen von Streulichtsignalen werden die Basophile in Abhängigkeit von der Differenz der Signalintensität klassifiziert und gezählt.
Die oben erwähnten Nachteile des manuellen Verfahrens werden durch jedes dieser automatisierten Verfahren gelöst. Im Hinblick auf die Präzision wurde insbesondere eine beachtliche Verbesserung erzielt. Somit sind diese automatisierten Verfahren in der Praxis der klinischen Versuche nahezu zufriedenstellend.
Jedoch ermöglicht keines dieser Verfahren, abnormale Zellen alleine spezifisch zu klassifizieren und zu zählen. Demgemäß gibt es ein Problem, daß eine Probe, die abnormale Zellen enthält, nicht genau analysiert werden kann oder daß das Vorhandensein von abnormalen Zellen per se nicht durch diese Verfahren ermittelt werden kann. Bei den verkauften Geräten wird eine Abnormität in einem Streudiagramm aufgrund des Auftretens von abnormalen Zellen ermittelt, und eine Warnung von z.B. einem abnormalen oder suspekten Kennzeichen wird gegeben, wodurch die erneute Prüfung mit dem manuellen Verfahren durch einen Techniker erforderlich ist, wodurch das Übersehen von Abnormalitäten minimiert wird. In diesem Fall ist jedoch die erneute Prüfung mit dem manuellen Verfahren erforderlich, was bedeutet, daß das Ziel der Arbeitsersparnis nicht vollständig erreicht wird.
Unabhängig davon wurde von einigen Verfahren berichtet, bei denen die Fluoreszenz oder das Streulicht eines jeden Leukozyten in einer Fluorochrom-gefärbten Blutprobe mit einem Fließzytometer gemessen werden, um so die Leukozyten zu klassifizieren. Hauptsächliche Beispiele dieser Verfahren sind in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 853/1984, dem offengelegten japanischen Patent Nr. 20820/1975 und der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 70166/1988 beschrieben.
Wenn eine Probe, erhalten durch Elimination von Einflüssen von anderen Blutkörperchen als Leukozyten von einer hämatologischen Probe durch ein angemessenes Verfahren, mit einem auf dem Markt erhältlichen Fließzytometer untersucht wird, wie in Figur 1 gezeigt ist, ist es im allgemeinen bekannt, daß ein Streudiagramm, wie es in Figur 3 gezeigt ist, erhalten wird und daß die Leukozyten in drei Subpopulationen unterteilt werden, die jeweils Lymphozyten 1', Monozyten 2' und Granulozyten 3' enthalten, wobei dies hauptsächlich von der Differenz der seitengestreuten Lichtintensität abhängt, und jede dieser Subpopulationen kann leicht klassifiziert und gezählt werden.
Es ist ebenfalls möglich, die Granulozyten und Subpopulationen weiter zu unterteilen, umfassend Eosinophile, Basophile und Neutrophile, indem dieses Verfahren mit der oben erwähnten Fluorochrom-Färbung kombiniert wird. In dem japanischen offengelegten Patent Nr. 134958/1988 (JP-A-63134958) haben wir bereits ein Verfahren zum Unterteilen von Leukozyten in fünf Subpopulationen und zum Klassifizieren und Zählen einer jeden Subpopulation durch Verwendung eines Fließzytometers und Reagenzien, die bei diesem Verfahren verwendet werden, beschrieben.
In dem japanischen offengelegten Patent Nr. 134957/1988 (JP-A-6314957) haben wir weiterhin ein Verfahren zum Klassifizieren von Leukozyten in fünf Typen offenbart, wobei eine Kombination von Neutralrot, das Eosinophile spezifisch färbt, mit Astrazon Orange G verwendet wird, das spezifisch Basophile färbt. Jedoch ermöglicht keines dieser Verfahren abnormale Zellen spezifisch zu ermitteln.
Auf der anderen Seite offenbart das US-Patent Nr. 4 500 509 ein manuelles Verfahren zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten, worin alle Leukozyten, einschließlich abnormale Zellen, mit Basic Orange 21 fluorochrom-gefärbt und dann unter einem Fluoreszenzmikroskop behandelt werden. Jedoch können die oben erwähnten Nachteile des manuellen Verfahrens durch dieses Verfahren nicht gelöst werden. Somit schafft dieses US-Patent kein automatisiertes Verfahren.
Wie oben beschrieben, ist diese Erfindung darauf gerichtet, abnormale Zellen spezifisch zu ermitteln, zu klassifizieren und zu zählen, was durch die konventionellen, automatisierten Verfahren nicht erreicht werden kann und ein Verfahren zur Herstellung einer Probe für die Fließzytometrie anzugeben, um abnormale Zellen zu klassifizieren und zu zählen, und um Leukozyten, einschließlich abnormale Zellen, zu klassifizieren und zu zählen.
Das Verfahren zur Herstellung einer Probe entsprechend dieser Erfindung kann grob in zwei Schritte unterteilt werden. In einem ersten Schritt werden die Einflüsse von Erythrozyten, die in einer hämatologischen Probe enthalten sind, eliminiert, um eine genaue Messung der Intensität des gestreuten Lichtes von Leukozyten oder der Intensität des gestreuten Lichtes und des Zeilvolumens zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt werden Leukozyten und Erythroblasten spezifisch gefärbt.
Figur 1 ist eine schematische Ansicht, die den Aufbau eines allgemeinen Fließzytometers zeigt.
Figur 2 ist eine schematische Ansicht eines Fließzytometers, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wodurch optische Signale und elektrische Widerstandssignale gleichzeitig gemessen werden können.
Figur 3 ist ein Streudiagramm, erhalten durch Messung einer Probe, die durch Eliminierung der Einflüsse von anderen Blutkörperchen als Leukozyten von einer hämatologischen Probe hergestellt ist, mit dem in Figur 1 gezeigten Fließzytometer.
Figur 4 ist ein Streudiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Probe als Koordinatenachsen angegeben sind.
Figur 5 ist ein Streudiagramm, worin die Intensität des seitengestreuten Lichtes und die Intensität von roter oder grüner Fluoreszenz der Daten der Subpopulation [A1] gemäß Figur 4 als Koordinatenachsen bezeichnet sind.
Figur 6 ist ein Streudiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Probe die Koordinatenachsen bedeuten.
Figur 7 ist ein Streudiagramm, worin die Intensität des seitengestreuten Lichtes und die Intensität von roter oder grüner Fluoreszenz der Daten der Subpopulation [A3] in der Figur 6 die Koordinatenachsen bedeuten.
Figur 8 ist ein Streudiagramm, worin die Intensität des seitengestreuten Lichtes und das Zählvolumen, gemessen auf der Basis des elektrischen Widerstand-Assay-Systems, der von dem Fenster W9 von Figur 7 erhaltenen Daten die Koordinatenachsen bedeuten.
In diesen Figuren hat jedes Symbol die folgende Bedeutung:
1: Lichtquelle,
2: Linse,
3: Kondensatorlinse,
4: Kondensatorlinse,
5: Strahlstopper,
6 - 9: Lichtdetektionseinheiten,
10 - 11: Dikroitische Spiegel,
13: Teilchen,
14: Fluideinlaß des Gehäuses,
15: Signal-Behandlungseinheit,
16: Analyse-Einheit,
17: Düse,
18: Fließzelle,
18a: Öffnung,
19: Detektionseinheit,
20: Fließfläche des Teilchens,
20a, b: Elektroden,
21: vorwärtsgestreutes Licht,
22: rote Fluoreszenz,
23: grüne Fluoreszenz,
24: seitengestreutes Licht,
1': Lymphozyten,
2': Monozyten,
3': Granulozyten,
[NRBC]: Erythroblasten,
[Eo]: Eosinophile,
[A1]: Subpopulation, umfassend andere Leukozyten als Eosinophile und Erythroblasten,
[A2]: Subpopulation, umfassend andere Blutkörperchen als Leukozyten,
[W1] - [W9]: Fenster 1 - 9,
[Lym]: Lymphozyten,
[Mono]: Monozyten,
{Neut}: Neutrophile,
[Ba]: Basophile,
[Iml]: unreife Granulozyten-Gruppe 1,
[Im2]: unreife Granulozyten-Gruppe 2,
[Blast]: Blasten,
[Lym+Blasten]: Lymphozyten, Blasten.
Im allgemeinen enthält eine hämatologische Probe etwa 1 000 mal so viel Erythrozyten wie Leukozyten. Bei der Fließzytometrie ist die Intensität eines gestreuten Lichtsignals von Lymphozyten dem von Erythrozyten vergleichbar, was es schwierig macht, Lymphozyten von Erythrozyten zu trennen. Als ein Ergebnis können genaue Klassifizierungsdaten von Leukozyten schwer erhalten werden. Wenn eine große Anzahl von Erythrozyten durch eine Detektionseinheit eines Fließzytometers gleichzeitig mit Leukozyten wandert, wird das gestreute Lichtsignal der Leukozyten weiterhin weniger genau, und daher wird es schwierig, Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile in Abhängigkeit von der seitengestreuten Lichtintensität zu trennen. Alternativ kann das Zählvolumen nicht mit einem Gerät des elektrischen Widerstand-Assay-Systems in der Gegenwart einer große Menge an Erythrozyten gemessen werden. Um diese Probleme zu lösen, ist es erforderlich, Erythrozyten in einer hämatologischen Probe durch einige Verfahren zu eliminieren.
Um Einflüsse von Erythrozyten ohne Beeinflussung der Färbung von Leukozyten zu eliminieren, wird eine hämatologische Probe auffolgende Weise behandelt. Zunächst wird eine hämatologische Probe unter sauren und hypotonischen Bedingungen behandelt. Somit werden die Erythrozyten in Geister umgewandelt und dann zu Fragmenten reduziert. Wenn die Erythrozyten vollständig lysiert sind, werden pH-Wert und der osmotische Druck jeweils auf ein Niveau eingestellt, daß bei den Leukozyten keine Schädigung erfolgt. Somit können Erythrozyten zu Fragmenten reduziert werden, ohne daß die Leukozyten geschädigt werden. Als ein Ergebnis wird die gestreute Lichtintensität von Erythrozyten auf einen Gehalt reduziert, der 1/2 bis 1/3 dem von Leukozyten entspricht. Somit ist in der Praxis die gleichzeitige Durchleitung von Erythrozyten mit Leukozyten vernachlässigbar, weiterhin wird das Streulichtsignal von Leukozyten genauer.
Um Blasten in einer hämatologischen Probe zu untersuchen, ist es erforderlich, das Zellvolumen, basierend auf dem elektrischen Widerstand-Assay-Prinzip, genau zu messen. Die Erythrozyten, die nur in Fragmente reduziert wurden, können gleichzeitig mit Leukozyten durchwandern und machen so das Leukozyten-Zählvolumen weniger genau. Um dieses Phänomen zu vermeiden ist es erforderlich, die Größe der Erythrozyten- Fragmente weiter zu vermindern. Somit wird ein Schritt, bei dem die fragmentierten Erythrozyten alleine mit einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel lysiert werden, weiter zugegeben.
Ein Schritt zum Färben von Leukozyten und Erythroblasten basiert auf den Funktionen von vier Farbstoffen. Die spezifischen Färbeeigenschaften dieser Erfindung basieren auf der Funktion von drei Farbstoffen. Zunächst wird eine hämatologische Probe in der Koexistenz von Astrazon Yellow 3G und Neutralrot fluorochromgefärbt. Somit färbt Astrazon Yellow 3G spezifisch Basophile und unreife Granulozyten, während Neutralrot spezifisch Eosinophile in Rot färbt.
Ein drittes Fluorochrom, das in der Lage ist, den Kern von geschädigten Zellen ausschließlich zu färben, färbt spezifisch die Kerne von Erythroblasten, deren Zellmembrane lysiert wurden. Ein vierter Farbstoff, der zumindest die Kerne und Zytoplasma von Leukozyten färben kann, färbt Leukozyten, die mit Astrazon Yellow 3G oder Neutralrot oder dem dritten Fluorochrom nicht gefärbt wurden. Somit können diese Leukozyten von anderen Blutkörperchen, die in der hämatologischen Probe enthalten sind, in Abhängigkeit von dem Unterschied der Fluoreszenzintensität getrennt werden.
In einer üblichen Messung von optischen Parametern mit einem Fließzytometer ist es nicht erforderlich, die elektrische Leitfähigkeit einer hergestellten Probe zu kontrollieren. Wenn das Zellvolumen auf der Basis des elektrischen Widerstands-Assay-Prinzips gemessen werden soll, ist es jedoch erforderlich, die elektrische Leitfähigkeit einer Probe auf einen Gehalt einzustellen, der für die Messung des Zellvolumens durch das elektrische Widerstands-Assay-System geeignet ist. Dies kann durch Zugabe einer angemessenen Menge an Salzen erreicht werden, die in wäßrigen Lösung in Ionen dissoziieren.
Die elektrische Leitfähigkeit, die für die Messung des Zellvolumens geeignet ist, liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 25 mS/cm, mehr bevorzugt von 10 bis 20 mS/cm.
Der Ausdruck "hämatologische Probe", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine biologische Probe, die hauptsächlich Blutzellen enthält, die vom peripheren Blut eines Säugers (insbesondere eines Menschen) oder aus einer Knochenmarkpunktion erhalten ist. Ein bevorzugtes Beispiel davon ist venöses Blut, das mit einem Antikoagulanz behandelt wurde. Weiterhin kann eine Probe, erhalten durch vorheriges Eliminieren von anderen Blutkörperchen als Leukozyten von der oben erwähnten hämatologischen Probe durch ein geeignetes Verfahren wie Dichtegradientenzentrifugation bevorzugt bei dieser Erfindung verwendet werden. Die Ausdrücke "Lymphozyten", "Monozyten", "Neutrophile", "Basophile" und "Eosinophile", wie sie hierin verwendet werden, sind identisch zu Zellen, die durch das manuelle Verfahren mit Hilfe der Romanovsky's Färbung identifiziert werden, die allgemein bei klinischen Tests verwendet wird.
Unreife Granulozyten bestehen aus Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten, die durch das manuelle Verfahren identifiziert sind. Die oben erwähnten beiden Gruppen von unreifen Granulozyten beinhalten die unreife Granulozyten- Gruppe 1, die hauptsächlich Promyelozyten enthält, worin das Vorhandensein von primären Körnchen (blaue Körnchen) identifiziert wird, und eine andere Gruppe 2, die hauptsächlich Myelozyten und Metamyelozyten enthält, worin wenige primäre Körnchen identifiziert werden.
Der Ausdruck "Erythroblasten", wie er hierin verwendet wird, bedeutet erythroide Zellen mit einem Kern in der Zelle.
Der Ausdruck "Blasten", wie er hierin verwendet wird, bedeutet die meisten unreifen Zellen von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten und Zellen, deren Größe die von Lymphozyten von denen, die mit dem manuellen Verfahren untersucht werden, übersteigen.
Ein Fließzytometer ist ein Gerät, durch das zumindest drei optische Daten (rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz, seitengestreutes Licht), vorzugsweise vier optische Daten (vorwärts gestreutes Licht und die oben erwähnten drei Faktoren) gemessen werden können, wie in Figur 1 gezeigt ist. Es ist weiterhin bevorzugt, ein Fließzytometer zu verwenden, das mit einem elektrischen Widerstand-Assay-System (vgl. Figur 2) versehen ist, durch das das Zellvolumen gleichzeitig gemessen werden kann.
Das bevorzugteste Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens kann wie folgt durchgeführt werden. Eine hämatologische Probe wird mit einer hypotonischen und sauren, ersten, wäßrigen Lösung vermischt, umfassend:
(1) Astrazon Yellow 3G, das in der Lage ist, zumindest Basophile und unreife Granulozyten spezifisch zu färben;
(2) Neutralrot, das in der Lage ist, zumindest Eosinophile spezifisch zu färben;
(3) ein Fluorochrom, das in der Lage ist, die Kerne von Zellen mit geschädigten Zellmembranen zu färben;
(4) einen Farbstoff, der in der Lage ist, den Kern und/oder das Zytoplasma von Leukozyten zu färben; und
(5) einen Puffer in einer Menge, die ausreichend ist, um den pH-Wert der wäßrigen Lösung sauer zu machen.
Nach dem vollständigen Fragmentieren der Erythrozyten und der Schädigung von Zellmembranen von Erythroblasten und vor der Schädigung der Leukozyten wird eine zweite wäßrige Lösung, umfassend:
(6) einen Puffer in einer Menge, die zum Neutralisieren der Säure in der ersten wäßrigen Lösung und zum Einstellen des pH-Wertes auf einen für die Färbung geeigneten Gehalt ausreichend ist;
(7) ein Osmolaritäts-Kompensierungsmittel in einer Menge, die zum Einstellen des osmotischen Druckes auf einen Gehalt ausreichend ist, der geeignet ist, Leukozyten nicht geschädigt zu lassen; und
(8) ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge, die zum Lysieren der Erythrozyten-Fragmente ausreichend ist;
zugegeben, um die Erythrozyten zu lysieren, mit anschließender Färbung.
Wenn die Messung des Zellvolumens, basierend auf dem elektrischen Widerstand-Assay-Prinzip, nicht durchgeführt wird, ist die Komponente (8) nicht immer erforderlich.
Die Menge an Astrazon Yellow 3G, die zum spezifischen Färben von basophilen und unreifen Granulozyten ausreichend ist, entspricht 50 mg/l oder mehr in der wäßrigen Lösung. Es wurde experimentell bestätigt, daß die obere Grenze der Konzentration von Astrazon Yellow 3G zum Erzielen der Effekte dieser Erfindung 1 000 mg/l ist, obwohl dies nicht bedeutet, daß die erfindungsgemäßen Wirkungen bei einer Konzentration oberhalb des oben erwähnten Gehaltes verschwinden wurden.
Die Konzentration von Neutralrot, die zum spezifischen Färben von Eosinophilen ausreichend ist, entspricht 1 mg/l oder mehr in der wäßrigen Lösung. Mehr bevorzugt liegt die Konzentration von Neutralrot in dem Bereich von 1/50 bis 1/10 der Konzentration von Astrazon Yellow 3G. Die Färbung mit Astrazon Yellow 3G ist zu der Färbung mit Neutralrot, kompetitiv, und daher wurde eine extrem hohe Konzentration von Neutralrot, verglichen mit Astrazon Yellow 3G, die spezifische Färbung von unreifen Granulozyten mit Astrazon Yellow 3G inhibieren.
Das oben erwähnte Fluorochrom, das in der Lage ist, die Kerne von Zellen mit geschädigten Zellmembranen zu färben, bedeutet zumindest ein Fluorochrom, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus den folgenden.
(1) Ethidiumbromid.
(2) Propidiumjodid.
(3) N-Methyl-4-(1-pyren)vinyl-pyridiumjodid.
Die Menge, die zum Färben der Kerne von Zellen mit geschädigten Zellmembranen ausreichend ist, bedeutet eine solche Menge, die zum Emittieren der Fluoreszenz einer Intensität ausreichend ist, durch die Erythroblasten von anderen Zellen in der Fließzytometrie getrennt werden können. Die optimale Konzentration variiert von Farbstoff zu Farbstoff und sollte somit durch Experimente bestimmt werden. Bei Ethidiumbromid z.B. ist eine Konzentration von 10 mg/l oder mehr geeignet.
Die Wirkungen dieser drei Farbstoffe zum Färben der Kerne von Zellen mit geschädigten Zellmembranen wurden experimentell bestätigt. Jedoch ist diese Erfindung nicht darauf beschränkt, und irgendein Fluorochrom kann verwendet werden, so lange es ausschließlich die Kerne von Zellen mit geschädigten Zellmembranen färben kann.
Der oben erwähnte Farbstoff, der zum Färben entweder des Kerns oder des Zytoplasmas oder beider Substanzen geeignet ist, bedeutet zumindest ein Fluorochrom, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Farbstoffen.
(1) Astrazon Orange P (CI Nr. 48040, CI Basic Orange 22)
(2) Astra Violet (CI Nr. 48070, Basic Red 12)
(3) Rhodamin 6G (CI Nr. 45160)
(4) Rhodamin 19
(5) Rhodamin B (CI Nr. 45170, Basic Violet 10)
(6) Rhodamin 3G0 (CI Nr. 45210, Basic Red 3)
(7) Ryronin B (CI Nr. 45010)
(8) Cyanosin
(9) 3,3'-Dimethylthiocarbocyaninjodid
(10) 3,3'-Diethylthiocarbocyaninjodid
(11) 3,3'-Dipropyloxacarbocyaninjodid
(12) 3,3'-Dihexyloxacarbocyaninjodid
(13) 3,6-Bis(dimethylamino)-10-dodecylacridiniumbromid
(14) 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol
(15) 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol
(16) Astrazon Red 6B (CI Nr. 48020, Basic Violet 7).
Die Menge, die zum Färben entweder des Kerns oder des Zytoplasmas von Leukozyten oder beiden ausreichend ist, bedeutet eine solche Menge, die zum Emittieren von Fluoreszenz mit einer Intensität ausreichend ist, durch die Leukozyten von anderen Zellen in der Fließzytometrie getrennt werden können. Die optimale Konzentration variiert von Farbstoff zu Farbstoff und sollte somit durch ein Experiment bestimmt werden. Bei Astrazon Orange P z.B. ist eine Konzentration von 100 mg/l oder mehr geeignet. Die Wirkungen dieser 16 Farbstoffe wurden durch uns experimentell bestätigt. Jedoch ist diese Erfindung nicht darauf beschränkt, und irgendein Farbstoff kann verwendet werden, solange er die oben erwähnten Erfordernisse erfüllt.
Die Azidität der ersten wäßrigen Lösung kann vorzugsweise in einem pH-Bereich von 2,0 bis 4,0, noch mehr bevorzugt von 2,0 bis 3,5 fallen. Der in der ersten wäßrigen Lösung verwendete Puffer ist nicht besonders beschränkt. Es wird empfohlen, einen Puffer mit einem pKa von 3,0 1 2,0 zu verwenden. Der Puffer wird in einer Konzentration verwendet, die zum Beibehalten des pH-Wertes der Mischung bei 2,0 bis 4, geeignet ist. Die Konzentration liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 50 mM/l.
Wenn der pH-Wert niedriger ist als 2,0, wird die Färbung von Leukozyten offenbar inhibiert. Wenn der pH-Wert 4, übersteigt, wird auf der anderen Seite die Fragmentierung von Erythrozyten offenbar inhibiert. Der Ausdruck "hypotonisch" bedeutet einen osmotischen Druck von 100 mOsm/kg oder weniger. Wenn der osmotische Druck 100 mOsm/kg übersteigt, wird die Fragmentierung von Erythrozyten offenbar inhibiert.
Die Reaktionszeit zwischen der ersten Lösung und der hämatologischen Probe, die zum vollständigen Reduzieren von Erythrozyten in Fragmenten erforderlich ist, hängt etwas von der Temperatur ab. Bei Raumtemperatur (18 bis 25ºC) wird sie innerhalb von 5 bis 20 s vollendet. Die Reaktionszeit wird bei einer höheren Temperatur etwas verkürzt und bei einer niedrigeren Temperatur etwas verlängert. Das Mischungsverhältnis pro Volumen der hämatologischen Probe zu der ersten wäßrigen Lösung ist nicht besonders beschränkt. Bei der Messung mit einem Fließzytometer ist ein Mischungsverhältnis im Bereich von 1:5 bis 1:200 bevorzugt.
Der pH-Wert, der zum Färben geeignet ist, bedeutet von pH 7, bis 11,0, mehr bevorzugt von 7,5 bis 10,0. Wenn der pH-Wert niedriger als 7,0 ist, können die Wirkungen der spezifisch gefärbten Basophilen und unreifen Granulozyten schwer erreicht werden. Wenn der pH-Wert 11,0 übersteigt, können auf der anderen Seite Leukozyten geschädigt werden.
Der in der zweiten wäßrigen Lösung verwendete Puffer ist nicht besonders beschränkt. Es wird empfohlen, einen Puffer mit einem pKa von 9,0 ± 2,0 zu verwenden. Die Konzentration des Puffers ist nicht besonders beschränkt und liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 100 mM/l.
Die Zeit, die zur Vollendung der Färbung erforderlich ist, hängt etwas von der Temperatur ab. Bei Raumtemperatur (18 bis 25ºC) wird sie innerhalb von 10 bis 40 5 vollendet. Die Reaktionszeit ist bei einer höheren Temperatur etwas kürzer und bei einer niedrigeren Temperatur etwas länger.
Um die Schädigung für Leukozyten zu limitieren und zumindest Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile in einer Form zu lassen, die für die Trennung in Abhängigkeit vom gestreuten Licht erforderlich ist, ist es vorteilhaft, daß der osmotische Druck der Mischung im Bereich von 100 bis 500 mOsm/kg, mehr bevorzugt von 200 bis 400 mOsm/kg liegt. Wenn der osmotische Druck der Mischung nicht in diesen Bereich fällt, wird empfohlen, ein Osmolaritäts- Kompensierungsmittel zu der wäßrigen Lösung zu geben. Die Art des Osmolaritäts-Kompensierungsmittels ist nicht besonders beschränkt. Es ist bevorzugt, Substanzen zu verwenden, die zum Aufrechterhalten von biologischen Zellen bei physiologischem osmotischem Druck dafür verwendet werden (z.B. Alkalimetalle und Saccharide). Wenn das Zellvolumen mit einem Fließzytometer, das mit einem elektrischen Widerstands- Assay-System versehen ist, gemessen wird, ist es bevorzugt, die elektrische Leitfähigkeit der schließlich hergestellten Probe zu steuern. Es ist im allgemeinen vorteilhaft, die elektrische Leitfähigkeit der Probe auf den gleichen Gehalt wie die des Gerätefluids einzustellen.
üblicherweise dissoziieren die Puffer, die in der ersten oder zweiten Lösung enthalten sind, in Ionen, um so eine angemessene elektrische Leitfähigkeit zu ergeben, was die Einstellung unnötig macht. Jedoch ist es bevorzugt, Salze, die in wäßrigen Lösungen in Ionen dissoziieren und somit dieser eine elektrische Leitfähigkeit verleihen, zu der zweiten Lösung zu geben, um dadurch die elektrische Leitfähigkeit auf einen Gehalt einzustellen, der zum Messen des Zellvolumens geeignet ist. Alkalimetallsalze können vorteilhafterweise für diese Zweck verwendet werden, obwohl diese Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel zum Lysieren von fragmentierten Erythrozyten ist ein oberflächenaktives Mittel mit Polyoxyethylen in hydrophilen Gruppen in der molekularen Struktur. Es ist bevorzugt, solche mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von Polyoxyethylen von 20 oder mehr, mehr bevorzugt 25 oder mehr zu verwenden. Ein oberflächenaktives Mittel mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von weniger als 20 ist kaum verwendbar, da dieses Leukozyten schädigen könnte.
Das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel kann entweder zu der ersten oder der zweiten wäßrigen Lösung oder zu beiden gegeben werden. Es ist bevorzugt, dieses zu der zweiten wäßrigen Lösung alleine zuzugeben.
Nachfolgend werden die Strukturen der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Farbstoffe angegeben.
Astrazon Yellow 3 G (CI Nr. 48 055, CI Basic Yellow 11) Neutral Red (CI Nr. 50 040, CI Basic Red 5) Astrazon Orange P (CI Nr. 48 040, CI Basic Orange 22) Astrazon Violet (CI Nr. 48 070, Basic Red 12) Rhodamin 6G (CI Nr. 45 160)
In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;HC&sub2;H&sub5;,
R&sub2;: -NH-C&sub2;H&sub5;,
R&sub3;: -COOC&sub2;H&sub5;,
R&sub4;, R&sub5;: -CH&sub3;.

Rhodamin 19

In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;H-C&sub2;H&sub5;,
R&sub2;: -NH-C&sub2;H&sub5;,
R&sub3;: -COOH,
R&sub4;, R&sub5;: -CH&sub3;.

Rhodamin B (CI Nr. 45 170, Basic Violet 10)

In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;H&sub2;,
R&sub2;: -NH&sub2;,
R&sub3;: -COOCH&sub3;,
R&sub4;, R&sub5;: -H.

Rhodamin 3G0 (CI Nr. 45 210, Basic Red 3)

In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;H-CH&sub3;,
R&sub2;: -NH&sub2;,
R&sub3;: -COOCH&sub3;,
R&sub4;: CH&sub3;,
R&sub5;: -H. Pyronin B (CI Nr. 45 010) Cyanosin 3,3'-Dimethylthiocarbocyaninjodid
In der Formel (II), R&sub1;: -CH&sub3;,
R&sub2;: -S-.
3,3'-Diethylthiocarbocyaninjodid
In der Formel (II), R&sub1;: -C&sub2;H&sub5;,
R&sub2;: -S-.
3,3'-Dipropyloxacarbocyaninjodid
In der Formel (II), R&sub1;: -C&sub3;H&sub7;,
R&sub2;: -O-.
3,3'-Dihexyloxacarbocyaninjodid
In der Formel (II), R&sub1;: -C&sub6;H&sub1;&sub3;,
R&sub2;: -O-. 3,6'-Bis(dimethylamino)-10-dodecylacridiniumbromid 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol Astrazon Red 68 (CI Nr. 48 020, Basic Violet 7). Ethidiumbromid Propidiumjodid N-Methyl-4-(1-pyren)vinylpyridiniumiodid
Nachfolgend wird ein Fließzytometer, das in dem Ausführungsbeispiel dieser Erfindung verwendet wird, erläutert. Figur 1 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau eines allgemeinen Fließzytometers zeigt. In Figur 1 ist 1 eine Lichtquelle des Fließzytometers, von der Licht mit einer Wellenlänge emittiert wird, die zum Anregen der spezifischen Fluoreszenz zumindest von Eosinophilen, Basophilen und unreifen Granulozyten, die mit Astrazon Yellow 3G und Neutralrot gefärbt sind, geeignet ist. Als diese Lichtquelle 1 kann ein Argonionen-Laser oder eine
Quecksilberbogenlampe, die Licht mit einer Wellenlänge von 400 bis 520 nm emittieren kann, bevorzugt verwendet werden. Das Licht von der Lichtquelle wird in einer Fließfläche 20 von Teilchen durch eine Linse 2 in der Form eines flachen Kreises kondensiert, und ein Teilchen 13 (Zelle etc.), das durchwandert, wird mit diesem bestrahlt. Somit wird vorwärts gestreutes Licht 21 vorwärts von dem Teilchen 13 emittiert, während rote Fluoreszenz 22, grüne Fluoreszenz 23 und seitengestreutes Licht 24 seitwärts von demselben emittiert werden.
Die Teilchen werden von einer Düse 17 entladen, in einem Gehäusefluid eingehüllt, das von einem Gehäusefluid-Einlaß 14 zugeführt wird, und bilden dann einen Gerätefluß in einer Fließzelle. Direktes Licht wird von dem vorwärts gestreuten Licht 21 mit einem Strahlstopper 5 entfernt, und das gestreute Licht wird zu einer Lichtdetektionseinheit 6 über die Kondensatorlinse 4 transportiert.
Auf der anderen Seite werden die Lichter 22, 23 und 24, die seitwärts emittiert werden, zu Lichtdetektionseinheiten über die Kondensatorlinse 3 transportiert.
Das seitengestreute Licht 24 wird auf einen dichroiden Spiegel 10 reflektiert und dann zu einer Lichtdetektionseinheit 7 transportiert.
Die rote Fluoreszenz 22 wird auf einem dichroiden Spiegel 11 reflektiert und zu einer Lichtdetektionseinheit 8 transportiert.
Die grüne Fluoreszenz 23 passiert einen dichroiden Spiegel 11 und wird zu einer Lichtdetektionseinheit 9 transportiert.
Dann werden die Lichter, die zu den Lichtdetektionseinheiten 6, 7, 8 und 9 transportiert werden, jeweils in elektrische Signale umgewandelt, die in einer Signalbehandlungseinheit 15 verstärkt und in einer Analyseeinheit 16 analysiert werden.
Der Ausdruck "vorwärts gestreutes Licht", wie er hierin verwendet wird, bedeutet gestreutes Licht, das von einer Zelle, die durch die Detektionseinheit wandert, bei einem engen Winkel von nahezu 0 emittiert wird, bezogen auf die Emissionsachse der Lichtquelle. Der Ausdruck "seitengestreutes Licht", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein gestreutes Licht, das von einer Zelle emittiert wird, das bei einem Winkel von nahezu 90 emittiert wird, bezogen auf die Emissionsachse der Lichtquelle. Der Ausdruck "rote Fluoreszenz" bedeutet Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 560 nm und mehr von solchen, die in allen Richtungen von einer Zelle emittiert werden. Die Fluoreszenz bei nahezu oder 90 von der Emissionsachse einer Lichtquelle kann mit einem üblichen Fließzytometer kondensiert werden.
Der Ausdruck "grüne Fluoreszenz" bedeutet Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von etwa 520 bis 560 nm von solchen, die in allen Richtungen von einer Zelle emittiert werden. Die Fluoreszenz bei nahezu 0 oder 90 von der Emissionsachse einer Lichtquelle kann mit einem üblichen Fließzytometer kondensiert werden.
Figur 2 ist ein schematisches Diagramm eines Fließzytometers, das erfindungsgemäß verwendet wird, durch das optische Signale und elektrische Signale gleichzeitig gemessen werden können. Optische Signale können durch das gleiche Verfahren, das im Hinblick auf Figur 1 beschrieben ist, ermittelt werden. Auf der anderen Seite können elektrische Signale, wie folgt ermittelt werden. Eine Fließzelle 18 wird mit einer Öffnung 18a zum Messen des elektrischen Widerstands versehen.
Von der Lichtquelle 1 emittiertes Licht wird um ein Zentrum der Öffnung 18a mit einer Linse 2 kondensiert. Wie gut bekannt ist, kann das genaue Volumen einer Zelle mit einer bestimmten Größe durch Messung der Anderung des elektrischen Widerstandes zwischen Elektroden 20a und 20b aufgrund der Durchleitung der Zelle durch die Öffnung 18a bestimmt werden. Erfindungsgemäß können die elektrischen und optischen Signale gleichzeitig ermittelt werden.
Gleichermaßen wie die Ermittlung von optischen Signalen wird eine Probe in die Zelle 18 über die Düse 17 eingeführt. Das Gehäusefluid wird von dem Gehäusefluideinlaß 14 zugeführt, und somit wird ein langer Fluß in der Fließzelle 18 gebildet. Teilchen 13 werden einzeln durch die Öffnung 18a geleitet. Zu diesem Zeitpunkt können ein elektrisches Signal, basierend auf dem elektrischen Widerstandsprinzip, und das optische Signal gleichzeitig erhalten werden.
Das elektrische Signal, das auf dem Prinzip des elektrischen Widerstands basiert, wird ermittelt und dann in ein elektrisches Pulssignal mit einer Höhe umgewandelt, die dem Volumen der Zelle in der Ermittlungseinheit 19 entspricht. Signale, die in den Einheiten 6, 7, 8, 9 und 19 ermittelt werden, werden in der Signalbehandlungseinheit 15 verstärkt und dann in der Analyseeinheit 16 analysiert.

Beispiele

Nachfolgend werden die Behandlungsschritte dieser Erfindung durch Bezugnahme auf besondere Beispiele beschrieben. In diesen Beispielen verwendete Reagenzien wurden von verkauften chemischen Materialien mit Reagenzgrad hergestellt.

Beispiel 1

Zusammensetzungsbeispiel 1:

Erste Reagenzlösung:

Astrazon Yellow 3G 300 mg
Neutral Red 20 mg
Ethidiumbromid 50 mg
Astrazon Orange R 300 mg
Zitronensäuremonohydrat 2,10 g (pH 2,62) gereinigtes Wasser 1 l
(pH: 2,62, osmotischer Druck: etwa 10 mOsm/kg)

Zweite Reagenzlösung:

Taurin 37,5 g
NaCl 58,4 g
NaOH 16,0 g
gereinigtes Wasser 1 l
0,90 ml der ersten Reagenzlösung des obigen Zusammensetzungsbeispiels 1 wurden mit 0,05 ml peripherem Blut, das abnormale Zellen enthält (Erythroblasten und unreife Granulozyten), vermischt und konnte dann 5 5 oder länger inkubieren. Dann wurden 0,10 ml der zweiten Reagenzlösung weiter dazugegeben, und die erhaltene Mischung konnte für zusätzliche 10 s oder länger inkubieren. Somit wurde eine Probe, die untersucht werden sollte, erhalten. Leukozyten wurden durch Messen der roten Fluoreszenz, grünen Fluoreszenz, des seitengestreuten Lichtes und vorwärtsgestreuten Lichtes einer jeden Zelle mit einem Fließzytometer gemäß Figur 1 klassifiziert und gezählt. Dann wurde ein Streudiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und die der grünen Fluoreszenz als Koordinatenachsen genommen wurden, wie in Figur 4 gezeigt. Somit wurden Leukozyten in Subpopulationen unterteilt, nämlich eine mit Erythroblasten [NRBC], eine mit Eosinophilen [Eo], einen mit anderen Leukozyten [A1] und eine mit anderen Blutkörperchen als Leukozyten [A2]. Dann wurden die gesamten Leukozyten innerhalb eines Fensters 1 [W1] skizziert und gezählt. Somit wurde die Gesamtzahl von Leukozyten bestimmt. Als nächstes wurden die Eosinophile und Erythroblasten mit einem Fenster 2 [W2] bzw. einem Fenster 3 [W3] gesammelt, mit anschließendem Zählen. Andere Leukozyten wurden mit einem Fenster 4 [W4] herausgenommen, und ein Streudiagramm wurde gebildet, wobei die Intensität des seitengestreuten Lichtes und die Intensität der grünen oder roten Fluoreszenz als Koordinatenachsen genommen wurden, wie in Figur 5 gezeigt ist. Somit wurden Subpopulationen erhalten, einschließlich eine mit Lymphozyten [Lym], eine mit Monozyten [Mono], eine mit Neutrophilen [Neut], eine mit unreifen Granulozyten 1 [Im1] und eine mit unreifen Granulozyten 2 [Im2]. Jede dieser Subpopulationen wurde mit einem Fenster gesammelt und gezählt. Der somit erhaltene Wert wurde durch die Gesamtzahl von Leukozyten, die oben bestimmt wurde, dividiert. Somit wurde der Prozentsatz eines jeden Leukozyten-Typs erhalten.

Beispiel 2

Zusammensetzungsbeispiel 2

Erste Reagenzlösung:

Astrazon Yellow 3G 300 mg
Neutral Red 20 mg
Ethidiumbromid 50 mg
Astrazon Orange P 300 mg
Zitronensäuremonohydrat 2,10 g (pH 2,62)
gereinigtes Wasser 1 l
(pH: 2,62, osmotischer Druck: etwa 10 mOsm/kg)

Zweite Reagenzlösung:

Taurin 37,5 g
NaCl 58,4 g
NaOH 16,0 g
Polyoxyethylencetylether 50 g
gereinigtes Wasser 1 l
0,90 ml der ersten Reagenzlösung des obigen Zusammensetzungsbeispiels 2 wurden mit 0,05 ml peripherem Blut vermischt und konnten dann 5 5 oder länger inkubieren. Dann wurden 0,10 ml der zweiten Reagenzlösung weiter dazugegeben, und die erhaltene Mischung konnte für weitere 10 s oder länger inkubieren. Somit wurde eine Probe, die untersucht werden sollte, erhalten. Leukozyten wurden klassifiziert und gezählt, indem die rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz, das seitengestreute Licht und das Zellvolumen einer jeden Zelle mit einem Fließzytometer gemessen wurden, das mit einem elektrischen Widerstands-Assay-System gemäß Figur 2 versehen war. Dann wurde ein Streudiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und die der grünen Fluoreszenz als Koordinatenachsen genommen wurden, wie in Figur 6 gezeigt ist. Somit wurden Leukozyten in Subpopulationen unterteilt, nämlich eine mit Erythroblasten [NRBC], eine mit Eosinophilen [Eo], eine mit anderen Leukozyten [A3]. Dann wurden die gesamten Leukozyten innerhalb eines Fensters 5 [W5] skizziert und gezählt. Somit wurde die Gesamtleukozytenzahl bestimmt. Als nächstes wurden Eosinophile und Erythroblasten mit einem Fenster 6 [W6] bzw. einem Fenster 7 [W7] gesammelt, mit anschließendem Zählen. Andere Leukozyten wurden mit einem Fenster 8 [W8] herausgenommen, und ein Streudiagramm wurde gebildet, indem die Intensität des seitengestreuten Lichtes und die Intensität der grünen oder roten Fluoreszenz als Koordinatenachsen genommen wurden, wie in Figur 7 gezeigt ist. Somit wurden Subpopulationen erhalten, einschließlich eine mit Lymphozyten und Blasten [Lym + Blast], eine mit Monozyten [Mono], eine mit Neutrophilen [Neut], eine mit Basophilen [Ba], eine mit unreifen Granulozyten 1 [Im1] und eine mit unreifen Granulozyten 2 [Im2]. Jede dieser Subpopulationen wurde mit einem Fenster gesammelt und gezählt. Die Lymphozyten und Blasten wurden mit einem Fenster 9 [W9] gesammelt, und ein Streudiagramm wurden gebildet, indem die seitengestreute Lichtintensität und das Zellvolumen, gemessen auf dem Prinzip des elektrischen Widerstand-Assays, als Koordinatenachsen verwendet wurden, wie in Figur 8 gezeigt ist. Somit wurden zwei Subpopulationen, nämlich eine mit Lymphozyten [Lym] und eine mit Blasten beobachtet. Jede Subpopulation wurde innerhalb eines Fensters skizziert und gezählt. Der somit erhaltene Wert wurde durch die Gesamtleukozytenzahl, die oben bestimmt wurde, dividiert. Somit wurde der Prozentsatz eines jeden Leukozyten-Typs erhalten.
1. Eine hämatologische Probe wird durch das Verfahren dieser Erfindung behandelt, und somit wird eine Probe hergestellt, die durch Fließzytometrie untersucht werden soll. Somit können unreife Granulozyten spezifisch gefärbt und getrennt werden.
Als ein Ergebnis können Leukozyten in zumindest acht Gruppen durch bloßes Messen einer einzelnen Probe mit einem Fließzytometer unterteilt werden.
2. Die Messung mit einem Fließzytometer, das mit einem elektrischen Widerstands-Assay-System versehen ist, ermöglicht weiterhin die Trennung von Blasten.
Somit können Leukozyten in zumindest neun Gruppen durch bloßes Messen einer einzelnen Probe mit einem Fließzytometer unterteilt werden.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen einer Probe zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten in zumindest acht Gruppen, nämlich zwei, die jeweils unreife Granulozyten enthalten, eine mit Erythroblasten, eine mit Basophilen, eine mit Eosinophilen, eine mit Lymphozyten, eine mit Monozyten und eine mit Neutrophilen, durch Untersuchen einer einzelnen Probe mit einem Fließzytometer, umfassend die folgenden Schritte:

(1) einen Schritt zur Eliminierung von Einflüssen von Erythrozyten von einer hämatologischen Probe ohne morphologische Anderung der Leukozyten, der umfaßt:

(i) Fragmentieren von Erythrozyten, die in der hämatologischen Probe enthalten sind, durch Zugabe einer ersten wäßrigen Lösung mit einem niedrigen osmotischen Druck, umfassend einen Puffer zum Aufrechterhalten des pH-Wertes der Lösung innerhalb eines sauren Bereiches, zu der hämatologischen Probe und somit Zerstören der Zellmembranen von Erythroblasten;

(ii) Zugabe zu der gemäß (i) erhaltenen Mischung einer zweiten Lösung, umfassend ein Osmolaritäts- Kompensierungsmittel, damit die Morphologie der Leukozyten unverändert beibehalten werden kann, und einen Puffer zum Neutralisieren der Säure in der ersten wäßrigen Lösung, und Einstellen auf einen pH-Gehalt, der zum Färben geeignet ist; und

(2) einen Schritt zum Färben von Leukozyten, die in der hämatologischen Probe enthalten sind, mit zumindest den vier nachfolgend angegebenen Farbstoffen:

(i) Astrazon Yellow 3G, das in der Lage ist, zumindest Basophile und unreife Granulozyten zu färben;

(ii) Neutralrot, das in der Lage ist, zumindest Eosinophile zu färben;

(iii) einen Farbstoff, der in der Lage ist, zumindest die Kerne oder das Zytoplasma von Leukozyten oder beide zu färben; und

(iv) ein Fluorochrom, das in der Lage ist, ausschließlich die Kerne von zerstörten Zellen zu färben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Farbstoff, der in der Lage ist, zumindest die Kerne oder das Zytoplasma von Leukozyten zu färben, zumindest ein Farbstoff ist, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus den folgenden Farbstoffen:

(1) Astrazon Orange R

(2) Astra Violet

(3) Rhodamin 6G

(4) Rhodamin 19

(5) Rhodamin B

(6) Rhodamin 3GO

(7) Pyronin B

(8) Cyanosin

(9) 3,3'-Dimethylthiocarbocyaninjodid

(10) 3,3'-Diethylthiocarbocyaninjodid

(11) 3,3'-Dipropyloxacarbocyaninjodid

(12) 3,3-Dihexyloxacarbocyaninjodid

(13) 3,6-Bis (dimethylamino)-10-dodecylacridiniumbromid

(14) 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol

(15) 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol

(16) Astrazon Red 68.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Fluorochrom, das in der Lage ist, ausschließlich die Kerne von zerstörten Zellen zu färben, zumindest ein Farbstoff ist, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus den folgenden Farbstoffen:

(1) Ethidiumbromid

(2) Popidiumjodid

(3) N-Methyl-4-(1-pyren)vinyl-pyridiniumjodid.

4. Verfahren zur Herstellung einer Probe zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten in zumindest neun Gruppen, nämlich zwei, die jeweils unreife Granulozyten enthalten, eine mit Erythroblasten, eine mit Blasten, eine mit Basophilen, eine mit Eosinophilen, eine mit Lymphozyten, eine mit Monozyten und eine mit Neutrophilen, durch Untersuchung einer einzelnen Probe mit einem Fließzytometer, umfassend die folgenden Schritte:

(1) einen Schritt zum Eliminieren von Einflüssen von Erythrozyten von einer hämatologischen Probe ohne morphologische Änderung der Leukozyten, der umfaßt:

(i) Fragmentieren von Erythrozyten, die in der hämatologischen Probe enthalten sind, durch Zugabe einer ersten wäßrigen Lösung mit niedigem osmotischern Druck, umfassend einen Puffer zum Aufrechterhalten des pH Wertes der Lösung innerhalb eines sauren Bereiches, zu der hämatologischen Probe;

(ii) Zugabe einer zweiten Lösung zur der gemäß (i) erhaltenen Lösung, umfassend ein Osmolaritäts- Kompensierungsmittel, damit die Morphologie der Leukozyten unverändert beibehalten bleibt, und einen Puffer zum Neutralisieren der Säure in der ersten wäßrigen Lösung und Einstellen auf einen pH-Wert, der zum Färben geeignet ist;

(iii) Lysieren der in den obigen Schritten (i) oder (ii) fragmentierten Erythrozyten mit einem nichtioni schen oberflächenaktiven Mittel;

(iv) Zugabe eines Salzes, das in wäßrigen Lösungen in Ionen dissoziiert, um dadurch die elektrische Leitfähigkeit der wäßrigen Lösung bei einem geeigneten Gehalt aufrecht zu erhalten, zu der Probe, die schließlich hergestellt werden soll, um so die elektrische Leitfähigkeit der Probe auf einen Gehalt einzustellen, der zum Messen mit einer Vorrichtung, die mit einem elektrischen Widerstands-Assay-System versehen ist, geeignet ist, wodurch eine genaue Bestimmung des Zellvolumens möglich ist; und

(2) einen Schritt zum Färben von Leukozyten, die in der hämatologischen Probe enthalten sind, mit zumindest den vier nachfolgend spezfifizierten Farbstoffen:

(ii) Neutralrot, das in der Lage ist, zumindest Eosinophile zu färben;

(iv) ein Fluorochrom, das in der Lage ist, ausschließlich die Kerne von zerstörten Zellen zu färben

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel zum Lysieren der Erythrozyten- Fragmente ein oberflächenaktives Mittel mit einer hydrophilen Gruppe ist, umfassend Polyoxyethylen mit einem Polymerisationsgrad von 20 oder mehr.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Farbstoff, der in der Lage ist, zumindest Kerne oder das Zytoplasma von Leukozyten zu färben, zumindest ein Farbstoff ist, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus folgenden Farbstoffen:

(1) Astrazon Orange R

(2) Astra Violet

(3) Rhodamin 6G

(4) Rhodamin 19

(5) Rhodamin B

(6) Rhodamin 3GO

(7) Pyronin B

(8) Cyanosin

(9) 3,3'-Dimethylthiocarbocyaninjodid

(10) 3,3'-Diethylthiocarbocyaninjodid

(11) 3,3'-Dipropyloxacarbocyaninjodid

(12) 3,3'-Dihexyloxacarbocyaninjodid

(13) 3,6-Bis (dimethylamino)-10-dodecylacridiniumbromid

(14) 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol

(15) 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol

(16) Astrazon Red 6B.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Fluorochrom, das in der Lage ist, ausschließlich die Kerne von zerstörten Zellen zu färben, zumindest ein Farbstoff ist, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus den folgenden Farbstoffen:

(1) Ethidiumbromid

(2) Popidiumjodid

(3) N-Methyl-4-(1-pyren)vinyl-pyridiniumjodid.