DE3587636T2

DE3587636T2 - Reagenssystem und verfahren zum nachweis, aufzählen und prüfen der klassen und unterklassen von blutleukozyten.

Info

Publication number: DE3587636T2
Application number: DE85902859T
Authority: DE
Inventors: Robert Feinberg; Stephen Ledis; Robert Leif
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Coulter Corp
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-20
Publication date: 1994-03-10
Anticipated expiration: 2005-05-21
Also published as: JPS61502280A; AU4406185A; EP0182874A4; EP0182874B1; DE3587636D1; ES543656A0; EP0182874A1; ES8609726A1; WO1985005640A1; KR860700136A; CA1310904C

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Immunohämatologie-Verfahren und insbesondere auf ein Reagenssystem und ein Verfahren zur Identifizierung von Klassen als auch von Subklassen innerhalb einer Klasse und Aufzählen von Zellen innerhalb dieser Subklassen von Blutleukozyten aus einer Gesamtblutprobe, die mit einem Fluoreszenz-Antikörper gegen eine ausgewählte Antigen-Determinante auf der Oberfläche spezifizierter Subklassen von Blutleukozyten inkubiert wurde.
Es ist bekannt, daß die Lymphozytenpopulation von Blutleukozyten in eine Anzahl von Subklassen unterteilt wird, die verschiedene Rollen bei der Immunantwort spielen. In Krankheitszuständen verändert sich sehr wahrscheinlich die relative Anzahl von Lymphozyten, die in verschiedenen Subklassen gefunden werden. Daher wird die Aufzählung und Identifizierung der Zellen in den verschiedenen Subklassen nützliche Information bei der Untersuchung und Behandlung von Krankheiten liefern, wie von James R. Downing et al in Laboratory Management, Mai 1984, Seiten 29 bis 37 beschrieben.
Es ist bekannt, daß mehrere einzelne Subklassen von funktionell verschiedenen Lymphozyten und anderen Blutleukozyten auf der Basis von Antigen-Determinanten auf der Zelle identifiziert werden können.
Monoklonale Antikörpertechniken sind verwendet worden, um große Mengen von hochreinem Antikörper gegen verschiedene Lymphozyten- und andere Leukozyten-Subklassen zu produzieren. Durch Verwendung derartiger Antikörper wurde es möglich, die Lymphozyten einer Einzelperson zu untersuchen, um die relative Anzahl von Zellen in verschiedenen Subklassen zu bestimmen. Durch Verwendung direkter oder indirekter Techniken können die Antikörper außerdem Fluoreszenz-markiert werden, wodurch die betreffenden Proben flußcytometrischer Analyse und Morphologie zugänglich werden. Vor kurzem wurden zusätzliche monoklonale Antikörper entwickelt, die mehrere einschließen, die mit Monozyten und Granulozyten reagieren.
Hansen et al beschreiben im US-Patent 4,284,412 (1981) und in Immunology, Band 77, Nr. 8, Seiten 4914 bis 4917 (1980) ein Verfahren und einen Apparat für automatische Identifizierung und Aufzählung von spezifizierten Lymphozyten-Subklassen. Eine nicht-koagulierte Gesamtblutprobe oder eine "buffy coat"-Probe wird mit einem Antikörper gegen eine spezifische Lymphozyten-Subklasse von Interesse inkubiert. Die Bindung dieses Antikörpers ist nachweisbar, wenn er entweder mit einem fluoreszierenden chemischen Anteil (direkte Technik) gekoppelt wurde oder wenn er anschließend durch ein weiteres Makromolekül spezifisch gebunden wurde, an das ein fluoreszierender Farbstoffanteil (indirekte Technik) gekoppelt wurde. Diese fluoreszierenden Anteile besitzen die Eigenschaft, daß sie fluoreszierendes Licht bei Beleuchtung mit einfallendem Laserlicht emittieren. Die Probe wird dann durch Verwendung von Ammoniumchlorid als das Lysierungsreagens lysiert und zentrifugiert, wodurch man ein Pellet erhält, das Leukozyten, Blutplättchenrückstände und Erythrozyten-"ghosts" enthält. Das Pellet wird gewaschen und mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper (indirekte Technik) behandelt. Eine verdünnte Probe wird dann einer flußzytofluorometrischen Analyse unterzogen. Vier Zellhaufen werden unterschieden. Es stellt sich jedoch heraus, daß nur drei Haufen auf Leukozyten zurückzuführen sind. Diese Haufen wurden als (1) Lymphozyten, (2) Monozyten und (3) Granulozyten identifiziert. Der vierte Haufen wird als Aggregate oder Vielfaches von Blutplättchen und Trümmern von roten Blutkörperchen, verursacht durch unvollständiges Lysieren der roten Blutkörperchen, identifiziert.
Die in diesen Druckschriften beschriebenen Lysierungstechniken sind jetzt durch die Erfindung verbessert worden, um die Morphologie der immunologisch markierten spezifischen Leukozyten besser zu erhalten, ihre Stabilität bei der Lagerung zu verbessern und sie geeigneter für eine Zytofluoreszenzanalyse, oder für andere Verfahren, wie mikroskopische Untersuchung von gefärbten Zellen auf einem Objektträger, zu machen.
Vorliegend werden die Warenzeichen COULTER, COULTER CLONE, ISOTON, E.A.SY.1, MDADS und EPICS verwendet, die im Besitz von Coulter Corporation, Coulter Electronics, Inc., oder Coulter Electronics, Ltd. sind.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Identifizierung von Klassen und vorzugsweise auch von ausgewählten Subklassen von Leukozyten im Gesamtblut, umfassend:
Markierung von Leukozyten mittels markierter, für Antigen- Determinanten auf der Zelloberfläche spezifischer Antikörper, und
Behandlung der Probe mit einem Lysierungsreagens, gekennzeichnet durch
Behandlung der Probe mit einem Saponin enthaltenden Lysierungsreagens für eine vorbestimmte Zeit und unter angegebenen Temperaturbedingungen derart, daß die Erythrozyten lysiert werden, und
Behandlung der lysierten Probe mit einem vernetzenden Fixierungsreagens für eine vorbestimmte Zeit und unter angegebenen Temperaturbedingungen derart, daß die physikalischen Eigenschaften und vorzugsweise auch die morphologischen Eigenschaften der Leukozyten beibehalten werden, und
Identifizierung der Klassen und vorzugsweise auch der ausgewählten Subklassen der Leukozyten unter Verwendung von Flußzytometrie und/oder Mikroskop-Morphologie.
Erläuternde Ausführungen der Erfindung werden nun durch Beispiele mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, wobei
Fig. 1A und 1B die durch flußzytometrische Analyse erzeugten Zell-Membran-Antigen-Histogramme zeigen. Die Abszisse stellt einen Wert dar, der direkt proportional zu dem Log der grünen Fluoreszenzintensität ist. Die Ordinate stellt die Anzahl der in jedem Kanal gezählten Zellen in relativem Maßstab dar.
Fig. 1A eine Probe mit T4-FITC wie in Beispiel 1 zeigt.
Fig. 1B eine Kontrolle ohne zugegebenen fluoreszierenden Antikörper zeigt.
Fig. 2 eine Höhenlinienkarte ist, in der die Abszisse den Log der Rechtwinkel-Lichtstreuungsintensität darstellt und die Ordinate die Vorwärtswinkel- Lichtstreuungsintensität darstellt. Die Rechtecke kennzeichnen die spezifischen Flächen dieser zweidimensionalen Verteilung, die die spezifischen Leukozytenzellklassen enthalten: Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten. Diese Höhenlinienkarte wurde aus den zweidimensionalen Daten mittels eines Flußzytometers bestimmt. Jede Höhenlinie kennzeichnet die Lagen auf der Karte, wo im wesentlichen die gleiche Anzahl von Zellen, unabhängig von der Lichtstreuungsintensität, vorhanden ist.
Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Reagenssystem und Verfahren zur Identifizierung von Klassen und zum Aufzählen der Zellen in ausgewählten Subklassen innerhalb solcher Klassen von Leukozyten im Gesamtblut, basierend auf der Verwendung von Antigen-Determinanten auf der Zelloberfläche und ihrer Reaktivität mit markierten Antikörpern. In der Erfindung wird das von Hansen et al beschriebene allgemeine Gesamtverfahren verwendet, jedoch mit Verbesserungen, insbesondere während des herkömmlichen Lysierungs- und Zellfixierungsverfahrens.
Erfindungsgemäß umfaßt das Reagenssystem wäßrige Lösungen (A) eines Saponin enthaltenden Lysierungsreagens, und (B) eines ein Vernetzungsmittel enthaltenden Fixierungsreagenses. Das verbesserte Reagenssystem lysiert die Blutery-throzyten, während sowohl die physikalischen und morphologischen Eigenschaften der Blutleukozytenklassen beibehalten werden, als auch spezifische Leukozyten-Subklassen markiert werden. Die Proben können entweder mittels der Prinzipien von Flußzytometrie oder mittels Mikroskop-Morphologie analysiert werden.
Durch Verwendung von Saponin als Lysierungsmittel erlaubt das Verfahren ein Fixieren mit einer begrenzten Menge von vernetzendem Fixiermittel. Dieses wird dadurch durchgeführt, daß man bei Raumtemperatur oder vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur, wie 42 ºC, lysiert, wodurch die Erythrozytenmembran selektiv destabilisiert wird und die Lysierungsreaktion beschleunigt wird. Die Verwendung eines hypotonischen Puffers, der hauptsächlich aus Kaliumsalzen besteht, unterstützt ebenfalls die Lyse.
Glyoxal wird Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel vorgezogen, selbst wenn das letztere ein stärkeres Fixiermittel ist, da Glyoxal nach Reaktion mit einem Leukozyten eine minimale Hintergrundfluoreszenz, wenn überhaupt, ergibt, während Glutaraldehyd eine signifikante Menge Fluoreszenz produziert. Aldehyde werden Monoaldehyden vorgezogen, wie z. B. Formaldehyd, die nur eine schwache Vernetzungswirkung für diesen Zweck haben.
Die Zugabe von Dimethylsulfoxid oder Harnstoff zu dem Fixiermittel verbessert die Reaktion und führt dazu, daß die Menge an Fixiermittel verringert wird, die erforderlich ist, um die Wirkung des Saponins auf die Leukozyten zu verzögern. Ein Temperaturabfall aufannähernd 4 ºC (wie durch Verwendung eines Eisbades) verlangsamt zusätzlich die Reaktion. Die Zellen werden leicht fixiert und können in ausreichender Weise auf einem Objektträger für zytologische Präparation ausgestrichen werden.
In der US-Anmeldung, S.N. 615,966, eingereicht am gleichen Tag wie vorliegende Anmeldung, wird ein einigermaßen analoges Lysierungsverfahren beschrieben, aber ein solches Verfahren schließt nicht immunologische Techniken zur Verwendung von Antigen-Determinanten auf der Zelloberfläche und ihrer Reaktivität mit Antikörpern, die Zellen markieren, die unter be-kannten Bedingungen fluoreszieren, ein.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Klassen und zum Aufzählen von Zellen in Subklassen von Leukozyten im Gesamtblut, basierend auf der Verwendung von Antigen-Determinanten auf der Zelloberfläche und ihrer Reaktivität mit markierten Antikörpern, und nachfolgender Verwendung der Prinzipien von Flußzytometrie oder Mikroskop- Morphologie, um die Zellen, die markiert worden sind, zu identifizieren.
Es werden hierin die Ausdrücke "Lyse", oder Formen davon und "Morphologie" verwendet. Lyse der Erythrozyten bedeutet, die Erythrozyten so zu behandeln, daß sie nicht mehr durch physikalische Techniken nachweisbar sind, oder der Erythrozytenrückstand ist derart, daß die Signale, die sie erzeugen, in ausreichender Weise verringert sind, daß sie diejenigen nicht stören, die von den Blutleukozyten erzeugt werden. Morphologie bedeutet das Verfahren der mikroskopischen Untersuchung von Zellen und die Bestimmung ihrer Klassen und Subklassen entweder durch den Menschen oder durch Techniken mit künstlicher Intelligenz.
Gemäß der Erfindung wird eine Gesamtblutprobe mit verdünntem monoklonalen Antikörper inkubiert, um bestimmte Subklassen von Leukozyten zu markieren. Die Erythrozyten werden dann durch Lyse entfernt und die Leukozyten durch Verwendung eines vernetzenden Fixiermittels stabilisiert, bevor eine Klassen- und Subklassenidentifizierung erfolgt. Die roten Blutzellen werden vorzugsweise vor den Identifizierungsschritten der Klassen und Subklassen von Leukozyten lysiert, um die Gefahr zu vermeiden, daß ein gleichzeitiger Durchlauf von zwei oder mehreren Erythrozyten oder Fragmenten davon durch einen Zähl-Transducer irrtümlich für weiße Blutzellen gehalten werden könnte. Ein bevorzugtes Verfahren ist es, die roten Blutzellen vor der Identifizierung der Leukozyten durch Zugabe eines Lysierungsreagenses zu der Zellsuspension zu lysieren, um die roten Blutzellen dazu zu bringen, daß sie zerreißen und ihren Hämoglobingehalt in die Lösung freisetzen.
Das Problem ist, die roten Blutzellen zu lysieren, ohne die Antigen-Antikörper-Komplexe auf den Leukozyten zu beschädigen, während man ihre Zellmorphologie bewahrt und eine stabile Zellsuspension erzeugt.
Die Gesamtblutprobe muß in einer Weise behandelt werden, daß die roten Blutzellen lysiert werden und die Leukozyten-Blutzellen zur gleichen Zeit in einem Zustand gehalten werden, der Messungen erlaubt, um sie und ihre Subklassen zu differenzieren. Das Lysierungsreagens muß schnell wirken, vorzugsweise in weniger als einer Minute. Das erstellte Zytogramm sollte die Aggregathaufen oder die Vielfachen von Blutplättchen enthalten und Trümmer von roten Blutzellen von den Leukozytenhaufen trennen.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Gesamtblutprobe mit einem Fluorochrom-Antikörper inkubiert, um eine bestimmte Subklasse von Leukozyten zu markieren. Die Erythrozyten werden selektiv mit einem Saponin-enthaltenden Lysierungsreagens lysiert und die direkt markierten Leukozyten dann fixiert, wobei ein Fixierungsreagens verwendet wird, das einen Dialdehyd enthält. Die Leukozyten-Zellsuspension wird dann mittels einer Kombination aus Vorwärtswinkel- und Rechtwinkel-Lichtstreuung analysiert, um Daten zu erhalten, die wenigstens drei Klassen repräsentieren. Die positiv immunfluoreszierenden Leukozyten-Populationen werden mit einem COULTER®-EPICS®-Flußzytometer aufgezählt. Das Fixiermittel ist ein vernetzendes oder bifunktionelles Fixiermittel, vorzugsweise ein Dialdehyd.
Erfolgreiche Ergebnisse wurden mit den folgenden COULTER- CLONE®-Antikörpern erhalten: T4-FITC, T8-FITC, T11, T11- FITC, B1-FITC und Mo2-FITC. Andere für diesen Zweck brauchbare Antikörper würden OKT1.PAN, OKT4.IND und ebenfalls OKM1.M/G einschließen, der mit Monozyten und Granulozyten reagiert.
Der hier verwendete "Fluoreszenz-empfindliche Antikörper" bezieht sich auf Antikörper, die selbst fluoreszieren oder auf Antikörper, die markiert sind, um bei spezifischer Stimulation zu fluoreszieren.
Eine Technik wurde entwickelt, um die Bluterythrozyten zu lysieren, während die physikalischen Eigenschaften und die Morphologie der Blutleukozyten beibehalten und spezifische Leukozyten-Subklassen immunologisch markiert werden. Diese Technik ist einzigartig darin, daß sie keine Zentrifugation umfaßt; außerdem erhält sie die Zellen in ausreichender Weise, so daß sie bei 4 ºC einen Tag aufbewahrt werden können und noch brauchbar für eine Flußanalyse sind. Durch Verwendung dieser Technik ist es z. B. möglich, T-Lymphozyten in (1) Helfer-Lymphozyten, unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers COULTER-CLONE T4-FITC, und (2) Suppressor-Lymphozyten, unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers COULTER-CLONE T8-FITC, einzuteilen.
Die durch die Techniken dieser Erfindung hergestellten Zellen sind außerdem für andere zytologische Präparationen geeignet, z. B. für Zentrifugalzytologie.
Die Technik der Erfindung minimiert die Konzentration des erforderlichen Saponin-Lysierungsreagenses und erlaubt folglich ein Fixieren mit einer begrenzten Menge Fixiermittel. Lysieren wird bei Raumtemperatur oder vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur, wie 42 ºC, durchgeführt, wodurch die Ery-throzytenmembran selektiv destabilisiert wird und die Lysierungsreaktion beschleunigt wird. Die Verwendung eines hypotonischen Puffers, der hauptsächlich aus Kaliumsalzen besteht, begünstigt ebenfalls die Lyse.
Man hat herausgefunden, daß die Menge des verwendeten Saponins unter vergleichbaren Lysebedingungen verringert werden kann, wenn die Temperatur erhöht wird. So kann die Rückstandsmenge von Saponin in Präparationen, die nicht zentrifugiert werden, durch Erhöhung der Temperatur des Lysierungsreagenses minimiert werden.
Bifunktionelle oder vernetzende Fixiermittel, wie z. B. Glyoxal, Glutaraldehyd, Carbodiimid, Succinaldehyd, Mirsky's Reagens und dergleichen, sind für die Verwendung in dem Fixierungsreagens geeignet. Mirsky's Reagens besteht hauptsächlich aus einer unreinen Präparation von Glyoxal, das aus der chemischen Behandlung von Sacchariden stammt. Glyoxal wird besonders in dem Fixierungsreagens bevorzugt, weil es nicht fluoresziert. Dies ist ein Vorteil, wenn man die Fluoreszenz der Antikörper-bindenden Zellen später in dem Verfahren bestimmt.
Die Erfindung ist nicht auf Fluoreszenzmessungen beschränkt, sondern es kann auch eine Adsorptionsmessung durchgeführt werden, wie in "Defined Immunofluorescence and Related Cytochemical Methods" von D.Y. Mason, Z. Abdulaziz und B. Falini, Annuals of the New York Academy of Science, Band 420, Seiten 127 bis 138 (1983) beschrieben.
Das Verfahren der Erfindung kann mit den zusätzlichen physikalischen Messungen der Gleichstrom- und Wechselstrom-Impedanz verwendet werden. Die Messungen können in Verbindung mit den zuvor erwähnten Lichtstreuungsmessungen oder anstelle von ihnen verwendet werden.
Die fixierten Blutzellen sind stabil, wenn sie bei etwa 2 ºC bis 4 ºC vor dem Lichtstreuungsverfahren kalt aufbewahrt werden. In einer Laborstudie wurde nachgewiesen, daß Proben 24 Stunden lang nach der Lyse stabil waren. Durch Verwendung des COULTER-CLONE-Antikörpers T8-FITC betrug der Prozentsatz an positiven Zellen z. B. 20,3 ± 1,0 unmittelbar nach der Probenpräparation, 20,3 ± 0,6 zwanzig Stunden nach der Lyse und 20,0 ± 0,3 vierundzwanzig Stunden nach der Lyse.
Zentrifugation und Entfernen des Flüssigkeitsüberstandes zwischen den Verfahrensschritten ist vorteilhaft, da dadurch Zelltrümmer in signifikanter Weise verringert und überschüssiger lose gebundener Antikörper entfernt werden. Zentrifugation hat jedoch den Nachteil, da sie den Erhalt einer absoluten Zahl der vorhandenen Zellen tatsächlich ausschließt und unter manchen Bedingungen einen selektiven Zellverlust zur Folge haben kann. Obwohl Zentrifugation Teil eines halbautomatischen Systems sein kann, führt sie eine beträchtliche Komplexität in ein vollkommen automatisches System ein.
Eines der Hauptprobleme bei der Entwicklung des vorliegenden Reagenssystems liegt darin, daß die Probenherstellung für ein Flußzytometer, wie z. B. ein EPICS-System, anders als für einen Standard-Hämatologie-Analysator, wie dem COULTER®- Model S-Serieninstrument, asynchron ist. Die Zeit zwischen der letzten Probenherstellung und Messung kann im Bereich zwischen etwa unmittelbar bis zu dem nächsten Tag liegen.
Ein anderes Problem ist die Wahl einer geeigneten Kontrolle. Die hervorragende Spezifität von monoklonalen Antikörpern führt in einigen Fällen, z. B., wenn Fluorescein-Maus-Immunglobulin G (Maus IgG-FITC) als Kontrolle verwendet wird, zu einer Überbestimmung der Hintergrundfluoreszenz. Entweder eine Vorinkubation und/oder eine gleichzeitige Inkubation mit nicht-markiertem Antikörper blockiert die nicht spezifischen Bindungsstellen, und dadurch kann in vielen Fällen die Notwendigkeit einer Kontrolle entfallen.
Proben, die einen erfindungsgemäß hergestellten Antikörper enthalten, können durch Verwendung von Romanowsky-Farbstoff hergestellt werden. Es ist außerdem möglich, im Falle von Fluoreszenzstudien, die Zellen mit zwei Farbstoffen zu färben, wie z. B. Dichlorfluorescin und 4,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI). Andere herkömmliche Farbstoffe schließen Mithromycin und Acridin Orange ein.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen bestimmte Methoden und Verfahren, die in der Erfindung verfolgt werden.

Beispiel 1

Zellpräparation: Die Lysierungs- und Fixierungsreagenzien werden bei Raumtemperatur, etwa 24 ºC, hergestellt.
1. 100 ul Phosphat-gepufferte Saline (PBS) werden in ein 16 · 100 Röhrchen gegeben und anschließend 100 ul Gesamtblut. Die Röhrcheninhalte werden dann vorsichtig durch Wirbeln gemischt.
2. 5 ug monoklonaler COULTER-CLONE-T11-Antikörper werden dann dem gleichen Röhrchen zugegeben und vorsichtig gemischt. Das Röhrchen wird dann bei Raumtemperatur, etwa 24 ºC, zwanzig Minuten unter gelegentlichem Schütteln gehalten.
3. Die Probe wurde, da dies ein indirektes Fluoreszenzverfahren war, zweimal durch Zentrifugation mit 4 ml PBS gewaschen. Die Probe wurde dann mit 85 ug Fluorescein- Ziege-Anti-Maus-Antikörper behandelt und 20 Minuten inkubiert, und wie zuvor mit 4 ml PBS gewaschen.
4. Die Zellen wurden in 1 ml einer Lösung suspendiert, die aus 3 g NaCl und 1 g NaHCO&sub3; und Wasser auf einen Liter bestand.
5. 100 ul Lysierungsreagens, das aus 24 g Saponin, 4,0 NaCl, 1 g Sorbinsäure und Wasser auf einen Liter bestand, wurden dann dem Röhrchen zugegeben, das das Blut enthielt, einschließlich den indirekt markierten T-Lym-phozyten, und kontinuierlich acht Sekunden lang gerührt.
6. Am Ende der 8-Sekunden-Lyse wurden 1000 ul des Fixierungsreagenses der lysierten Probe zugegeben. Dieses Fixierungsreagens bestand aus: 6,0 g NaCl, 22 g Glutaraldehyd, mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht.
7. Die Probe, die indirekt mit monoklonalem Antikörper markiert, lysiert und dann fixiert wurde, muß mit dem Flußzytometer innerhalb von 15 Minuten analysiert werden, wegen der Entwicklung von Glutaraldehyd-induzierter Autofluoreszenz. Eine Filtration der Probe vorzugsweise durch ein 37-um-Sieb ist wünschenswert.
Probenanalyse: Die Proben werden mit dem COULTER-EPICS-V- Einzellaser, Flußzytometersystem analysiert. Die Systemkonfiguration wird, wie hier erklärt, festgesetzt. Der Laser emittiert 500 mw einer Strahlung von 488 nm. Die bevorzugte Filterkonfiguration ist eine 515-Interferenz, die als ein Blockierfilter für grüne Fluoreszenz wirkt, ein 488 nm-dichroitischer Spiegel und ein ND1-Filter für Rechtwinkel- Lichtstreuung und ein ND1-Filter für Vorwärtswinkel-Lichtstreuung. Die Daten werden mit einem Computersystem analysiert, wie z. B. in dem COULTER MDADATM oder E.A.SY.1®. Die drei gemessenen Parameter sind Log-Fluoreszenz, Flachwinkel- Lichtstreuung und Log-Rechtwinkel-Lichtstreuung. Dieses Analyseverfahren wird auch für jedes der folgenden Beispiele verwendet.

Beispiel 2

Zellpräparation: Die Lysierungs- und Fixierungsreagenzien werden bei 37 ºC hergestellt. Die Reagenzien können mit einer Verschlußkappe versehen in einem Wasserbad während des Verfahrens stehengelassen werden.
1. Ein 100 ul Portion Markierungs-Verdünnungsmittel, bestehend aus 1,0 g NaN&sub3;, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,31 g K&sub2;HPO&sub4; und 3,73 g KCl, mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht, wird in ein 16 · 100 Röhrchen gegeben, und anschließend werden 100 ul Gesamtblut hinzugegeben.
Die Röhrcheninhalte werden dann vorsichtig durch Wirbeln gemischt.
2. 10 ug eines nicht-spezifischen, unmarkierten Maus-Antikörpers werden zugegeben, um jede nicht-spezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers zu blockieren.
3. 1 ug monoklonaler COULTER-CLONE-T4-FITC-Antikörper wird dem selben Röhrchen zugegeben und vorsichtig gemischt. Das Röhrchen wird dann in ein Wasserbad, das auf 37 ºC gehalten wird, fünf Minuten unter gelegentlichem Rühren gestellt.
4. 100 ul eines Lysierungsreagenses, das aus 4 g Saponin, 1,75 g NaCl, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,31 g K&sub2;HPO&sub4; und 2,24 g KCl besteht und mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht worden ist, werden dann dem Röhrchen, das Blut und Antikörper enthält, zugegeben und kontinuierlich in dem Wasserbad eine Minute gerührt.
5. Am Ende der 1-Minuten-Lyse werden 500 ul eines Fixierungsreagenses der lysierten Probe zugegeben, vorsichtig gemischt und in dem Wasserbad bei 37 ºC für weitere fünf Minuten unter gelegentlichem Mischen gehalten. Dieses Fixierungsreagens besteht aus 11,7 g NaCl, 0,43 g Calciumgluconat, 21 g Glyoxal, 220 g Dimethylsuloxid und 25 g Carbowax 1450, mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht.
Zu diesem Zeitpunkt ist das Gesamtblut mit monoklonalem Antikörper markiert, lysiert und dann fixiert worden. Es ist nun fertig für die Analyse mit dem EPICS-Flußzytometer. Filtrieren der Probe, vorzugsweise durch ein 37-um-Sieb ist wünschenswert. Die Proben werden dann bei etwa 2 ºC auf Eis stabilisiert, wenn nötig, wenigstens 5 Minuten vor der Probenanalyse. Die Analyse erfolgt, wie am Ende von Beispiel 1 angegeben.
Übereinstimmend mit dem oben erwähnten Verfahren, jedoch durch Ersetzen des monoklonalen COULTER-CLONE-Antikörpers T4-FITC von Beispiel 1 durch jeden der folgenden monoklonalen COULTER-CLONE-Antikörper T8-FITC; T11-FITC; B1-FITC; Mo2-FITC wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. In jedem Fall ist die Leukozyten-Subklasse, die markiert ist, der Leukozyt, der spezifisch für den verwendeten Antikörper ist.

Beispiel 3

Zellpräparation: Die Lysierungs- und Fixierungsreagenzien werden bei 24 ºC hergestellt. Die Reagenzien können mit einer Verschlußkappe versehen in einem Wasserbad während des Verfahrens stehengelassen werden.
1. 100 ul eines Markierungs-Verdünnungsmittels, bestehend aus 1,0 g NaN&sub3;, in einem Liter ISOTON®-Plus-Verdünnungsmittel werden in ein 16 · 100 Röhrchen gegeben und anschließend 100 ul Gesamtblut. Die Röhrcheninhalte werden dann vorsichtig durch Wirbeln gemischt.
2. Der monoklonale COULTER-CLONE-Antikörper T4-FITC wird dann in einer Menge von 1 ug in das selbe Röhrchen gegeben, vorsichtig gemischt und dann in ein Teströhrchengestell fünf Minuten bei Raumtemperatur (24 ºC) unter gelegentlichem Rühren gestellt.
3. 1000 ul Lysierungsreagens, bestehend aus 0,5 g Saponin, 3,72 g KCl, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4; und 1,31 g K&sub2;HPO&sub4;, mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht, werden dann dem Röhrchen, das Blut und Antikörper enthält, zugegeben, 30 Sekunden leicht gewirbelt und fünf Minuten in ein Gestell bei Raumtemperatur (24 ºC) gestellt, wobei jede Minute vorsichtig gemischt wird.
4. Am Ende der 5-Minuten-Lyse werden 1000 ul des Fixierungsreagenses, das aus 12,6 g NaCl, 220 g Dimethylsulfoxid, 200 ml Mirsky's-Reagens und 600 ml ISOTON- Plus-Verdünnungsmittel besteht, der lysierten Probe zugegeben, vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur (etwa 24 ºC) für weitere fünf Minuten unter gelegentlichem Mischen gehalten. Mirsky's Reagens ist käuflich bei Mirsky's National Diagnostics, Somerville, New Jersey erhältlich
Zu diesem Zeitpunkt ist das Gesamtblut mit monoklonalem Antikörper markiert, lysiert und dann fixiert worden. Es ist jetzt fertig für die Analyse mit dem EPICS-Flußzytometer. Filtrieren der Probe vorzugsweise durch ein 37-um-Sieb, ist wünschenswert.
Die Proben werden dann auf Eis stabilisiert, wenn nötig, wenigstens fünf Minuten vor der Probenanalyse und, wie am Ende von Beispiel 1 angegeben, analysiert.

Beispiel 4

Zellpräparation: Die Lysierungs- und Fixierungsreagenzien werden bei 42 ºC hergestellt. Die Reagenzien können mit einer Verschlußkappe versehen, in einem Wasserbad während des Verfahrens stehengelassen werden.
1. 100 ul eines Markierungs-Verdünnungsmittels, bestehend aus 1,0 g NaN&sub3; in einem Liter ISOTON-Plus-Verdünnungsmittel, werden in ein 16 · 100 Röhrchen gegeben und anschließend 100 ul Gesamtblut. Die Röhrcheninhalte werden dann vorsichtig durch Wirbeln gemischt.
2. 4 ug des monoklonalen COULTER-CLONE-Antiköpers T4-FITC werden dem gleichem Röhrchen zugegeben, vorsichtig gemischt und dann in ein Wasserbad, das bei 42 ºC gehalten wird, fünf Minuten unter gelegentlichem Rühren gestellt.
3. Das Lysierungsreagens, bestehend aus 24 g Saponin, 4,0 Nacl, 1,0 g Sorbinsäure und Wasser, um einen Liter zu ergeben, wird hergestellt. Zehn ml dieses Lysierungsreagenes werden dann mit einem 1 Lysierungsverdünnungsmittel verdünnt, das aus 1,31 g K&sub2;HPO&sub4; und 1,36 g KH&sub2;PO&sub4; in destilliertem Wasser besteht. 1000 ul dieser Mischung werden dem Röhrchen, das Blut und Antikörper enthält zugegeben, und das Röhrchen wird kontinuierlich in dem Wasserbad eine Minute gerührt.
4. Am Ende einer 30-Sekunden-Lyse werden 1000 ul des Fixierungsreagenses, bestehend aus 12,6 g NaCl, 200 ml Mirsky's Reagens, 220 g Dimethylsulfoxid und 600 ml ISOTON-Plus-Verdünnungsmittel und mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht, der lysierten Probe zugegeben, vorsichtig gemischt und in dem Wasserbad bei 42 ºC weitere fünf Minuten unter gelegentlichem Mischen gehalten.
Zu diesem Zeitpunkt ist das Gesamtblut mit monoklonalem Antikörper markiert, lysiert und dann fixiert worden. Es ist fertig für die Analyse mit dem EPICS-Flußzytometer. Filtrieren der Probe, vorzugsweise durch ein 37-um-Sieb, ist wünschenswert.
Die Proben werden dann auf Eis stabilisiert, wenn nötig, wenigstens fünf Minuten vor der Probenanalyse und, wie am Ende von Beispiel 1 angegeben, analysiert.

Beispiel 5

Zellpräparation: Die Lysierungs- und Fixierungsreagenzien werden bei 37 ºC hergestellt. Die Reagenzien können mit einer Verschlußkappe versehen in einem Wasserbad während des Verfahrens stehengelassen werden.
1. Eine 100-ul-Portion Markierungs-Verdünnungsmittel, bestehend aus 1,0 g NaN&sub3;, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,31 g K&sub2;HPO&sub4; und 3,73 g KCl und mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht, wird in ein 16 · 100 Röhrchen gegeben und anschließend werden 100 ul Gesamtblut dazugegeben. Die Röhrcheninhalte werden dann vorsichtig durch Wirbeln gemischt.
2. 10 ug eines nicht-spezifischen, unmarkierten Maus-Antikörpers werden zugegeben, um jede nicht-spezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers zu blockieren.
3. Ein Mikrogramm des monoklonalen COULTER-CLONE-Antikörpers T8-FITC wird dem gleichen Röhrchen zugegeben und vorsichtig gemischt. Das Röhrchen wird dann in ein Wasserbad, das bei 37 ºC gehalten wird, fünf Minuten unter gelegentlichem Rühren gestellt.
4. 100 ul eines Lysierungsreagenses, bestehend aus 4 g Saponin, 1,75 NaCl, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,31 g K&sub2;HPO&sub4; und 2,24 g KCl und mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht, werden dann dem Röhrchen, das Blut und Antikörper enthält, zugegeben und kontinuierlich eine Minute in dem Wasserbad gerührt.
5. Am Ende der eine Minute-Lyse werden 500 ul eines Fixierungsreagenses der lysierten Probe zugegeben, vorsichtig gemischt und weitere fünf Minuten in dem Wasserbad bei 37 ºC unter gelegentlichem Mischen gehalten. Das Fixierungsreagens besteht aus 11,7 g NaCl, 0,43 g Calciumgluconat, 21 g Glyoxal, 220 g Dimethylsulfoxid und 25 g Carbowax 1450, mit Wasser auf ein Volumen von einem Liter gebracht.
Zu diesem Zeitpunkt ist das Gesamtblut mit monoklonalem Antikörper markiert, lysiert und dann fixiert worden. Es ist jetzt fertig für die Analyse mit dem EPICS-Flußzytometer, ausgestattet mit dem COULTER-CVA, unter Verwendung der Prinzipien, vorgeschlagen für den AMAC III (vgl. R.C. Leif et al, Clinical Chemistry 23, 1492-8 (1977); R.A. Thomas et al, J. Histochemistry and Cytochemistry, Band 25, Nr. 77, Seiten 827 bis 835 (1977)). Die Bezeichnung COULTER "CVA" bedeutet "Zellvolumenzusatz" und bedeutet einfach ausgedrückt, daß das Elektronen-Zellanalysegerät unter Verwendung des bekannten Coulter-Prinzips des besonderen Nachweises verwendet und in ein Flußzytometer integriert wurde. Ein derartiges Multiparameterinstrument wurde im Handel gezeigt. Filtrieren der Probe, vorzugsweise durch ein 37-um-Sieb, ist notwendig. Die Proben werden auf Eis stabilisiert, wenn nötig, wenigsten fünf Minuten lang vor der Probenanalyse. Die gemessenen Parameter waren Vorwärtswinkel-Lichtstreuung, Rechtwinkel- Lichtstreuung, Fluorescein-Immunofluorescenz und Elektronen- Zellvolumen.

Beispiel 6

Zellpräparation: Die Lysierungs- und Fixierungsreagenzien werden bei 42 ºC hergestellt. Die Reagenzien werden mit einer Verschlußkappe versehen in einem Wasserbad während des Verfahrens stehengelassen.
1. 100 ul des Markierungs-Verdünnungsmittels, bestehend aus 1 g NaN&sub3;, in 1 Liter ISOTON-Plus-Verdünnungsmittel werden in ein 16 · 100 Röhrchen gegeben und anschließend 100 ul des Gesamtbluts. Die Inhalte werden dann vorsichtig unter Wirbeln gemischt.
2. 4 ug des monoklonalen COULTER-CLONE-Antikörpers T4-FITC werden dann in das gleiche Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wird vorsichtig gemischt und dann in ein Wasserbad, das bei 42 ºC gehalten wird, fünf Minuten unter gelegentlichem Rühren gestellt.
3. 100 ul Lysierungsreagens, bestehend aus 0,4 g Saponin, 0,05 g Sorbinsäure, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,31 g K&sub2;HPO&sub4;, 3,72 g KCl und Wasser, um einen Liter zu ergeben, werden dann dem Röhrchen, das Blut und Antikörper enthält, zugegeben und kontinuierlich in dem Wasserbad 30 Sekunden gerührt.
4. Am Ende der 30-Sekunden-Lyse werden 1000 ul eines Fixierungsreagenses, bestehend aus 12,6 g NaCl, 220 g Dimethylsulfoxid, 200 ml Mirsky's Reagens und 600 ml ISO- TON-Plus-Verdünnungsmittel, der lysierten Probe zugegeben, vorsichtig gemischt und in dem Wasserbad bei 42 ºC weitere fünf Minuten unter gelegentlichem Mischen stehengelassen.
Zu diesem Zeitpunkt ist das Gesamtblut mit monoklonalem Antikörper markiert, lysiert und dann fixiert worden. Es ist nun für eine Analyse mit dem EPICS-Flußzytometer fertig. Filtrieren der Probe, vorzugsweise durch ein 37-um-Sieb, ist wünschenswert. Die Proben werden dann auf Eis stabilisiert, wenn nötig, wenigstens fünf Minuten vor der Probenanalyse und, wie in Beispiel 1 angegeben, analysiert.

Beispiel 7

Zellpräparation: Die Lysierungs- und Fixierungsreagenzien werden bei 37 ºC hergestellt. Die Reagenzien können mit einer Verschlußkappe versehen in einem Wasserbad während des Verfahrens stehengelassen werden.
1. 100 ul eines Markierungs-Verdünnungsmittels, bestehend aus 1,0 g NaN&sub3;, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,31 g K&sub2;HPO&sub4; und 3,73 g KCl und mit Wasser auf ein Volumen von 1 Liter gebracht, werden in ein 16 · 100 Röhrchen gegeben und anschließend 100 ul Gesamtblut. Die Röhrcheninhalte werden dann vorsichtig durch Wirbeln gemischt. Dazu werden dann 10 ul einer Färbelösung, bestehend aus 0,025 g 4,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) in 10 ml absolutem Ethanol, gegeben.
2. 10 ug eines unspezifischen unmarkierten Maus-Antikörpers werden dazugegeben, um jede nicht-spezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers zu blockieren. Das Röhrchen wird vorsichtig gemischt und dann in ein Wasserbad, das bei 37 ºC gehalten wird, fünf Minuten unter gelegentlichem Rühren gestellt.
3. 1 ug des monoklonalen COULTER-CLONE-Antikörpers T8-FITC wird in das selbe Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wird vorsichtig gemischt und dann in ein Wasserbad, das bei 37 ºC gehalten wird, fünf Minuten unter gelegentlichem Rühren gestellt.
4. Dem Röhrchen, das die Färbelösung, Blut und Antikörper enthält, werden 100 ul Lysierungsreagens zugegeben. Dieses Reagens besteht aus 4 g Saponin, 1,75 g NaCl, 1,36 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,31 g K&sub2;HPO&sub4;, 2,24 g KCl und Wasser, um ein Volumen von einem Liter zu ergeben. Nachdem das Reagens zugegeben ist, wird das Röhrchen kontinuierlich eine Minute im Wasserbad gerührt.
5. Am Ende der eine Minute-Lyse werden 500 ul eines Fixierungsreagenses, bestehend aus 11,7 g Nacl, 0,43 g Calciumgluconat, 21 g Glyoxal, 220 g Dimethylsulfoxid, 25 g Carbowax 1450 und Wasser, um einen Liter zu ergeben, der lysierten Probe zugegeben, vorsichtig gemischt und in dem Wasserbad bei 37 ºC weitere fünf Minuten unter gelegentlichem Mischen stehengelassen.
Zu diesem Zeitpunkt ist das Gesamtblut mit dem monoklonalen Antikörper T8-FITC und DAPI markiert, lysiert und dann fixiert worden. Es ist nun für die Bereitung durch Zentrifugalzytologie fertig. Die Proben werden auf Eis stabilisiert, wenn nötig, wenigstens fünf Minuten vor der Probenanalyse.
6. Ein Standardobjektträger wird mit einer Poly-d-lysin- Lösung, bestehend aus 50 mg Poly-d-lysin mit einem Molekulargewicht von etwa 700,000, hergestellt, indem der Objektträger in die Lösung getaucht wird und dann auf einem Objektträger-Trockner, der bei 60 ºC gehalten wird, getrocknet wird.
7. Ein paar Leif-Zentrifugalzytologie-Becher (US-Patent 4,250,830) wird zusammengebaut und die lysierte Blutprobe fünf Minuten bei 1,500 min&supmin;¹ zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird entfernt und die Probe dreimal mit dem Markierungs-Verdünnungsmittel gewaschen.
8. Der flüssige Überstand wird entfernt, und die Zellen in dem Markierung-Verdünnungsmittel werden auf dem Objektträger mit einem Deckglas bedeckt. Der Objektträger ist nun für eine mikroskopische Untersuchung mit Quecksilberdampf-Ultraviolettanregung für DAPI und sichtbarer Anregung für FITC bereit.
Wie man aus den vorausgegangenen Beispielen sehen kann, können die relativen Volumina der Blutprobe von 50 bis 100 ul, des Lysierungsreagenses von 100 bis 1000 ul und des Fixierungsmittel von 500 bis 1000 ul variieren. Die Konzentrationen des Lysierungsreagenses von 0,24 bis 4 g/L und des Fixierungsmittels von 0,66 g/L bis 40 g/L sind umgekehrt proportional zu ihren Volumina und müssen heraufgesetzt werden, wenn das Volumen aller zuvor zugegebener Reagenzien erhöht wird. Die Saponinmenge von 0,24 bis 4,0 g/L ist ebenfalls umgekehrt proportional sowohl zur Temperatur von 24 ºC bis 60 ºC als auch zur Zeitdauer der Lyse von 38 Sekunden bis 5 Minuten. Die Menge des Fixierungsmittels ist ebenfalls proportional, ob die Probe für eine längere Zeit aufbewahrt werden soll oder sofort für Morphologie verwendet wird. Für eine Langzeitaufbewahrung ist eine maxiale Fixierung notwendig, für den sofortigen Gebrauch ist jedoch oft eine minimale Fixierung vorzuziehen.
Es wird verstanden, daß die hier dargelegten erklärenden Ausführungen Beispiele der Prinzipien der Erfindung darstellen, daß jedoch verschiedene Alternativen für den Fachmann bestehen, die nicht über den Schutzbereich der Erfindung hinausgehen.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von Klassen und vorzugsweise auch von ausgewählten Subklassen von Leukozyten im Gesamtblut, umfassend:

Markierung von Leukozyten mittels markierter, für Antigen-Determinanten auf der Zelloberfläche spezifischer Antikörper, und

Behandlung der Probe mit einem Lysierungsreagens, gekennzeichnet durch

Behandlung der Probe mit einem Saponin enthaltenden Lysierungsreagens für eine vorbestimmte Zeit und unter angegebenen Temperaturbedingungen derart, daß die Erythrozyten lysiert werden, und

Behandlung der lysierten Probe mit einem vernetzenden Fixierungsreagens für eine vorbestimmte Zeit und unter angegebenen Temperaturbedingungen derart, daß die physikalischen Eigenschaften und vorzugsweise auch die morphologischen Eigenschaften der Leukozyten beibehalten werden, und

Identifizierung der Klassen und vorzugsweise auch der ausgewählten Subklassen der Leukozyten unter Verwendung von Flußzytometrie und/oder Mikroskop Morphologie.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin jeder der markierten Antikörper aus einem an ein Fluorochrom gebundenen Antikörper besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin eine Kombination von physikalischen Bestimmungen zur Isolierung von Leukozytenklassen durchgeführt wird, und worin die Fluoreszenzverteilung jeder Klasse bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin mindestens eine der physikalischen Bestimmungen eine Bestimmung von Lichtstreuung, elektronischer Impedanz, einer Kombination aus Vorwärtswinkel- und Rechtwinkel-Lichtstreuung oder einer Kombination aus elektronischer Impedanz und Rechtwinkel-Lichtstreuung ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Leukozyten durch Morphologie klassifiziert und durch Fluoreszenzintensität subklassifiziert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, worin das Fixierungsreagens Glutaraldehyd enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, worin das Fixierungsreagens einen nicht-fluoreszierenden Dialdehyd als den Wirkstoff enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, worin das Lysierungsreagens Saponin in einer Konzentration von etwa 0,24 g pro Liter bis etwa 4 g pro Liter, oder von etwa 0,2 g pro Liter bis etwa 1,14 g pro Liter in der lysierten Probe enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, worin die Lysierungstemperatur etwa 24ºC bis etwa 42ºC beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, worin die Lysierungszeit 8 sec bis etwa 5 min ist.

11. Reagenssystem zur Verwendung bei einer Gesamtblutprobe zur Identifizierung von Klassen und vorzugsweise auch von ausgewählten Subklassen von Leukozyten, umfassend:

markierte, für Antigen-Determinanten auf der Zelloberfläche spezifische Antikörper zur Markierung von Leukozyten,

ein Lysierungsreagens zur Behandlung der Probe für eine vorbestimmte Zeit und unter angegebenen Temperaturbedingungen, enthaltend eine Menge von Saponin, die zur Lysierung der Erythrozyten ausreichend ist, die Leukozyten im wesentlichen jedoch intakt läßt, und

ein Fixierungsreagens zur Behandlung der lysierten Probe für eine vorbestimmte Zeit und unter angegebenen Temperaturbedingungen, enthaltend ein Vernetzungsreagens in solcher Menge, daß die physikalischen Eigenschaften und vorzugsweise auch die morphologischen Eigenschaften der Leukozyten beibehalten werden, um die Klassen und vorzugsweise auch die ausgewählten Subklassen von Leukozyten durch Zytometrie und/oder Mikroskop-Morphologie zu identifizieren.

12. Reagenssystem nach Anspruch 11, worin das Fixierungsreagens Glutaraldehyd enthält.

13. Reagenssystem nach Anspruch 11, worin das Fixierungsreagens einen nicht-fluoreszierenden Dialdehyd als den Wirkstoff enthält.

14. Reagenssystem nach einem der Ansprüche 11-13, worin das Lysierungsreagens Saponin in einer Konzentration von etwa 0,24 g pro Liter bis etwa 4 g pro Liter, oder von etwa 0,2 g pro Liter bis etwa 1,14 g pro Liter in der lysierten Probe enthält.

15. Reagenssystem nach einem der Ansprüche 11-14, worin Antikörper mit einem Fluorochrom zur Markierung der Leukozyten verbunden sind.

16. Verwendung eines Reagenssystems, umfassend:

(I) ein Lysierungsreagens, enthaltend Saponin zur Lysierung von Erythrozyten in einer Gesamtblutprobe, während Leukozyten im wesentlichen intakt bleiben, wobei Klassen und vorzugsweise auch Subklassen von Leukozyten mittels spezifischer Antikörper markiert worden sind, und

(II) ein Fixierungsreagens, enthaltend ein Vernetzungsreagens zur Beibehaltung der physikalischen Eigenschaften und vorzugsweise auch der morphologischen Eigenschaften der Leukozyten in der Probe,

in der Herstellung einer Probe zur Identifizierung von Klassen und vorzugsweise auch von Subklassen von Leukozyten durch Flußzytometrie und/oder Mikroskop- Morphologie.

17. Verwendung nach Anspruch 16, worin das Fixierungsreagens Glutaraldehyd enthält.

18. Verwendung nach Anspruch 16, worin das Fixierungsreagens einen nicht-fluoreszierenden Dialdehyd als den Wirkstoff enthält.

19. Verwendung nach einem der Ansprüche 16-18, worin mindestens ein Farbstoff zur Anfärbung der Leukozyten verwendet wird.

20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16-19, worin das Lysierungsreagens Saponin in einer Konzentration von etwa 0,24 g pro Liter bis etwa 4 g pro Liter, oder von etwa 0,2 g pro Liter bis etwa 1,14 g pro Liter in der lysierten Probe enthält.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 16-20, worin an ein Fluorochrom gebundene Antikörper zur Markierung der Leukozyten verwendet werden.