DE69221668T2

DE69221668T2 - Gerät zur Zellenanalyse im Urin

Info

Publication number: DE69221668T2
Application number: DE69221668T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Nakamoto; Tokuhiro Okada
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1991-05-14
Filing date: 1992-05-14
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2012-05-15
Also published as: EP0515099B1; JPH05322885A; US5325168A; EP0515099A1; CA2068480A1; AU1622592A; JP3213334B2; DE69221668D1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die ein Flußzytometer zum Klassifizieren und Zählen von Zellen wie weißen Blutkörperchen, roten Blutkörperchen, epithelischen Zellen, Harnzylindern und Bakterien, die im Urin enthalten sind, verwendet.
Eine Überprüfung eines Urininhalts ist seit langem ausgeführt worden und ist noch von großer Wichtigkeit. Beispielsweise kann ein Überprüfungstest für einen Nierenausfall auf Grundlage der Anwesenheit von roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen, epithelischen Zellen, Harnzylindern und Bakterien im Urin ausgeführt werden. Eine Messung von roten Blutkörperchen ist hinsichtlich einer Bestimmung wichtig, ob eine Blutung in dem Trakt von dem Glomerulus zu der Harnröhre der Niere aufgetreten ist. Das Auftreten von weißen Blutkörperchen wird als ein mögliches Anzeichen einer Nierenstörung, beispielsweise Pyelonephritis, angesehen und eine Erfassung davon ist zur Frühentdeckung einer Entzündung und einer Infektion wichtig. Ferner können durch eine Untersuchung einer Harnzylinder- und Erythrozyten-Morphologie Vermutungen über den Ursprung einer derartigen Entzündung und Infektion, nämlich über die anormalen Teile des Körpers, angestellt werden.
In dieser Beschreibung wird das Wort "Zelle" als ein gattungsgemäßer Ausdruck für ein rotes Blutkörperchen (Erythrozyte), eine epithelische Zelle, einen Harnzylinder und ein Bakterium verwendet.
Herkömmliche Verfahren zum Analysieren von Zellen im Urin umfassen (a) eine Sichtüberprüfung auf Grundlage eines Mikroskops, und (b) eine automatische Messung unter Verwendung einer Kombination einer flachen umhüllten Strömung und einer Bildverarbeitungstechnologie.
Das Verfahren (a) beinhaltet ein Zentrifugieren einer Urinprobe, ein Vorbereiten einer Gleitprobe der Sedimentmaterie und ein Beobachten, Klassifizieren und Zählen von Zellen unter einem Mikroskop.
Das Verfahren (b), ein Beispiel davon ist in der Beschreibung der offengelegten japanischen Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 57-500995 oder der USP 4,338,024 offenbart, beinhaltet die Verwendung einer Videokamera zum Einfangen eines Bildes einer Urinprobe, die veranlaßt wird, als eine extrem flache Strömung innerhalb einer Umhüllungslösung, die als eine äußere Schicht verwendet wird, zu fließen, und einen Vorgang, bei dem das erhaltene Standbild einer Bildverarbeitung ausgesetzt wird, wodurch die Bilder der Zellen in der Probe extrahiert und angezeigt werden.
Jedoch weisen beide voranstehenden Verfahren gewisse Nachteile auf. Insbesondere bringt ein Verfahren (a), welches auf einem Mikroskop basiert, beträchtliche Arbeitsvorgänge für derartige Vorbehandlungen mit sich, beispielsweise eine zentrifugische Trennung und eine Färbung. Zusätzlich können Zellen bei dem Zentrifugierungsprozeß beschädigt werden und es bestehen Abweichungen in der Konzentration zwischen einzelnen Proben.
Weil die Vorrichtung, die ein Verfahren (b) verwendet, sich auf eine Bildverarbeitung stützt, weist sie selbst hohe Kosten auf und die Verarbeitungsgeschwindigkeit ist gering. Ferner zeigt der Vorteil einer Automation, die von der Vorrichtung des Verfahrens (b) erzielt wird, die Bilder lediglich aufgrund einer groben Klassifizierung der abgebildeten Komponenten auf Grundlage von ihrer Größe an und es ist erforderlich, daß von einer Person ein Klassifizierungsprozeß ausgeführt wird, während die Anzeige betrachtet wird. Somit ist die automatische Klassifizierung und Zählung von Zellenkomponenten nicht möglich.
Da die gemäß der Verfahren (a) und (b) gemessene Urinprobenmenge sehr klein ist, besteht ein Nachteil darin, daß Harnzylinder, deren Entdeckung sehr wichtig ist, in der Urinprobe nicht entdeckt werden können. Insbesondere ist die geringe Häufigkeit der Anwesenheit eines Harnzylinders derart, daß gewöhnlicherweise nur mehrere zehn davon pro Milliliter vorhanden sind.
Da die Typen von Komponenten in dem Urinsediment zahlreich sind und sich in der Größe zwischen einzelnen Proben beträchtlich unterscheiden und der Grad einer Zellenbeschädigung als groß angesehen wird, besteht ein anderes Problem darin, daß eine Analyse eines Urinsediments unter Verwendung einer Flußzytometrie als unmöglich angesehen wird.
Das US-Patent Nr. 4661913 offenbart eine Flußvorrichtung und ein Verfahren für die Erfassung von Partikeln in einer Probe. In einer Fluidflußströmung werden Partikel bewegt, im wesentlichen jeweils einzeln getrennt. Ein Beleuchtungsstrahl wird auf Partikel in der Strömung gerichtet und ein Datenwert, der jedem Partikel zugeordnet ist, wird erfaßt, wenn sie durch den Strahl gehen. Der Datenwert wird mit einem gespeicherten Datenwert, der für eine Klasse von Partikeln erfaßt wird, verglichen. Als Ergebnis einer Übereinstimmung von jeweiligen Daten wird eine Bestimmung durchgeführt, daß Partikel von einer unbekannten Klasse zu der eingerichteten Klasse gehören. Eine Bakterienklassifikation im menschlichen Urin ist beispielsweise unter Verwendung eines PCM-Verfahrens (Hauptkomponenten-Verfahren oder Principle Component Method).
Rev. Sci. Instrum. 55 (9), 1375-1399, (1984), offenbart einen Review-Artikel, der die Flußzytometrie betrifft. Zellenproben, die mit Propidium Iodiolen (nuklearer DNA) und FITC (Zytoplasma) gefärbt sind, werden bei einer konstanten F: Flußgeschwindigkeit analysiert. Die Technik wird als "Flugzeit" ("time of flight") bezeichnet, da die Zeit gemessen wird, die ein Partikel benötigt, um einen schmalen Laserstrahl von Anregungslicht zu durchkreuzen.
Demzufolge möchte die vorliegende Erfindung die vorangehenden Unzulänglichkeiten verbessern und ihre Aufgabe besteht darin, eine Vorrichtung zum Analysieren von Zellen im Urin bereitzustellen, bei der eine große Urinprobenmenge unter Verwendung einer Flußzytometrie analysiert werden kann, die Anzahl von verschiedenen Zellen (Erythrozyten, roten Blutkörperchen), Leukozyten (weißen Blutkörperchen), epithelischen Zellen, Harnzylindern und Bakterien etc.), in der Probe erfaßt werden, stark erhöht werden kann, um eine genauere Analyse von Zellen im Urin zu ermöglichen, der Prozeß zur Aufnahme der Urinprobe in die Vorrichtung zum Anzeigen der analytischen Ergebnisse vollständig automatisiert werden kann, um die Notwendigkeit für einen menschlichen Eingriff zu beseitigen, die Verarbeitungsgeschwindigkeit erhöht werden kann und die Kosten der Vorrichtung niedrig gehalten werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die voranstehende Aufgabe durch Bereitstellen einer Vorrichtung zum Analysieren von Zellen im Urin wie in den Ansprüchen 1,3 definiert, gelöst.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen, in denen gleiche Bezugszeichen die gleichen oder ähnliche Teile überall in den Figuren davon bezeichnen.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 ein Blockschaltbild, welches die Anordnung der Hauptelemente eines optischen Systems zeigt, das die vorliegende Erfindung verkörpert;
Fig. 2 ein Blockschaltbild, welches die Hauptkomponenten einer elektrischen Schaltung darstellt, die die vorliegende Erfindung verkörpert;
Fig. 3 ein Flußdiagramm, welches einen Betrieb der Ausführungsform darstellt;
Fig 4 ein Flußdiagramm, welches einen Betrieb zum Analysieren von roten Blutkörperchen gemäß der Ausführungsform darstellt;
Fig. 5 ein Flußdiagramm, welches einen Betrieb zum Analysieren von weißen Blutkörperchen gemäß der Ausführungsform darstellt;
Fig. 6 ein Flußdiagramm, welches einen Betrieb zum Analysieren von epithelischen Zellen gemäß der Ausführungsform darstellt;
Fig. 7 ein Flußdiagramm, welches einen Betrieb zum Analysieren von Harnzylindern gemäß der Ausführungsform darstellt;
Fig. 8 ein Flußdiagramm, welches einen Betrieb zum Analysieren von Bakterien gemäß der Ausführungsform zeigt;
Fig. 9 ein Wellenformdiagramm, bei dem (a) eine Ausgangswellenform eines Signals eines vorwärts gestreuten Lichts von einem roten Blutkörperchen darstellt und (b) eine Ausgangswellenform eines Signals eines Vorwärts-Fluoreszenzlichts von einem roten Blutkörperchen ist;
Fig. 10 ein Wellenformdiagramm, bei dem (a) eine Ausgangswellenform eines Signals eines vorwärts gestreuten Lichts von einem weißen Blutkörperchen darstellt und (b) eine Ausgangswellenform eines Signals eines Vorwärts-Fluoreszenzlichts von dem weißen Blutkörperchen darstellt;
Fig. 11 ein Wellenformdiagramm, bei dem (a) eine Ausgangswellenform eines Signals eine vorwärts gestreuten Lichts einer epithelischen Zelle darstellt und (b) eine Ausgangswellenform eines Signals eine Vorwärts-Fluoreszenzlichts der epithelischen Zelle darstellt;
Fig. 12 ein Wellenformdiagramm, bei dem (a) eine Ausgangswellenform eines Signals eines vorwärts gestreuten Lichts von einem Bakterium darstellt und (b) eine Ausgangswellenform eines Signals eines Vorwärts- Fluoreszenzlichts von dem Bakterium darstellt;
Fig. 13 ein Wellenformdiagramm, bei dem (a) eine Ausgangswellenform eines Signals eines vorwärts gestreuten Lichts von einem Harnzylinder darstellt und (b) eine Ausgangswellenform eines Signals eines Vorwärts-Fluoreszenzlichts von dem Harnzylinder darstellt; und
Fig. 14 Streuungsdiagramme darstellt, bei denen (a) ein Streuungsdiagramm einer Intensität eines seitlich gestreuten Lichts und einer Fluoreszenz-Licht-Intensität ist, (b) ein Streuungsdiagramm einer Fluoreszensz-Licht Intensität und eines Zelldurchmessers ist, und (c) ein Streuungsdiagramm einer Streulicht-Intensität und eines Zellendurchmessers ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform einer Vorrichtung zum Analysieren von Zellen im Urin gemäß der vorliegenden Ausführungsform wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
Fig. 1 ist ein Blockschaltbild, welches die Anordnung der Hauptelemente eines optischen Systems zeigt, das die vorliegende Erfindung verkörpert. Wie in Fig. 1 gezeigt umfaßt das optische System eine Lichtquelle 1, die aus einem Argonionenlaser gebildet ist, an einem Ende des Systems, eine Flußzelle 2, eine Sammellinse 5, die zwischen der Lichtquelle 1 und der Flußzelle 2 vorgesehen ist, einen Fotomultiplizierer (Fotomultiplier) 6 an dem anderen Ende des Systems, eine Sammellinse 7, eine Lichtabschirmung 8, einen dichroitischen Spiegel 9 und ein Filter 10, welches zwischen der Flußzelle 2 und dem Multiplizierer 6 vorgesehen ist, und eine Linse 12, die zwischen dem dichroitischen Spiegel 9 und einer Fotodiode 11 vorgesehen ist. Eine Urinprobe fließt in der Flußzelle 2 von einer an der Flußzelle angebrachten Düse 3. Eine Bezugszahl 15 bezeichnet einen Strahlenstopper.
Fig. 2 ist ein Blockschaltbild, welches die Hauptkomponenten einer elektrischen Schaltung darstellt, die die vorliegende Erfindung verkörpert.
Die Schaltungsanordnung aus Fig. 2 ist in einen Signalverarbeitungsabschnitt 19 und einen Datenverarbeitungsabschnitt 20 aufgeteilt. Ein Ausgangssignal von der Fotodiode 11 ist mit einem Verstärker 21 in dem Signalverarbeitungsabschnitt 19 verbunden und der Ausgang des Verstärkers 21 ist mit einer DC (Gleichstrom)- Wiederherstellungseinrichtung 22 verbunden. Der Ausgang der DC-Wiederherstellungseinrichtung 22 ist mit einer Spitzenwert-Halteschaltung 23 verbunden, deren Ausgang mit einer Analog-/Digitalwandlerschaltung (nachstehend einfach als "A/D-Wandler" bezeichnet) 24 verbunden ist.
Der Ausgang des Fotomultiplizierers ist mit einem Verstärker 26 in dem Signalverarbeitungsabschnitt 19 verbunden, dessen Ausgang mit einer DC (Gleichstrom)- Wiederherstellungseinrichtung 27 verbunden ist. Der Ausgang der letzteren ist mit einer Spitzenwert-Halteschaltung 28 verbunden, deren Ausgang mit einem A/D- (Analog-/Digital) Wandler 29 verbunden ist.
Ferner ist eine Schwellwertschaltung 30 mit einer Digital- /Analog-Wandlerschaltung (nachstehend einfach als "D/A- Wandler" bezeichnet) 31 verbunden, deren Ausgang mit dem Referenzeingang eines Komparators 32 verbunden ist. Der Ausgang der DC-Wiederherstellungseinrichtung 22 ist mit dem Komparator 32 an seinem anderen Eingangsanschluß verbunden, nämlich dem Anschluß, dessen Eingang mit der Referenz verglichen werden soll. Der Ausgang des Komparators 32 ist mit einem Impulsbreitenzähler 33 verbunden, dem ein Taktsignalausgang von einer Taktsignal-Erzeugungsschaltung 34 als ein Eingang eingegeben wird. Der Ausgang der DC- Wiederherstellungseinrichtung 22 ist ferner mit einer Steuerschaltung 35 verbunden. Die letztere erzeugt einen Steuersignalausgang, der mit den A/D-Wandlern 24, 29 und dem Impulsbreitenzähler 33 verbunden ist.
Die Ausgänge der A/D-Wandler 24, 29 und der Ausgang des Impulsbreitenzählers 33 sind mit einer Steuerschaltung 40 zum Steuern eines Lese-/Schreibbetriebs verbunden. Ein Triggersignal T ist mit der Steuerschaltung 40 und einem Zähler 41 verbunden. Eine Speicherschaltung 42 zum Speichern von Daten, die einzelne Zellen anzeigen, ist mit der Steuerschaltung 40 verbunden. Die Speicherschaltung 42 ist über die Steuerschaltung 40 mit einer Datenanalysierschaltung 43 verbunden, die Zellen klassifiziert und zählt. Der Ausgang des Zählers 41 ist ebenfalls mit der Datenanalysierschaltung 43 verbunden. Eine Speicherschaltung 45, die das Steuerprogramm der Vorrichtung, Zellendurchmesser- Umwandlungswerte, Zellen-Beurteilungswerte, etc. speichert, und ein Zähler 46, der die Anzahl jedes Zellentyps zählt, sind mit der Datenanalysierschaltung 43 verbunden.
Die Fig. 3 bis 8 sind Flußdiagramme, die den Betrieb der elektrischen Schaltungsordnung gemäß dieser Ausführungsform darstellen. Auf diese Flußdiagramme wird später Bezug genommen.
Der Betrieb, der die Ausführungsform der Erfindung, die wie voranstehend aufgeführt, konstruiert ist, charakterisiert, wird nachstehend beschrieben.
Die ursprüngliche Lösung der Urinprobe enthält in einer Hinzumischung ein erstes Reaktionsmittel, welches eine spezifische Farbe enthält, und ein zweites Reaktionsmittel zur Stabilisation von pH und des osmotischen Drucks.
Die sich ergebende Urinprobenmischung, die das Reaktionsmittel enthält, wird von der Düse 9 ausgegeben und ein umhüllter Fluß wird gebildet, in dem eine Umhüllungslösung veranlaßt wird, entlang des Umfangs der Urinströmung zu fließen. Infolge dessen fließen Zellen 13 (rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, epithelische Zellen, Harnzylindern und Bakterien, etc.) in der Urinprobe in einer geordneten Anordnung wie in einer einzelnen Datei durch eine schmale Zone an dem Mittenabschnitt der Flußzelle 2, wie in Fig. 1 gezeigt. Das Laserlicht von der Lichtquelle 1 wird durch die Sammellinse 5 zusammengefaßt, um so die schmale Flußzone der Flußzelle mit einem elliptischen Strahlfleck, der in der Richtung eines Flusses schmal und in der Richtung senkrecht zu der Flußrichtung breit ist, beleuchtet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Messung von Zellen im Urin, nämlich Komponenten eines Urinsediments. Um ausführlichere Information von der Gruppe von Zellen, die von Urin geführt werden, zu erhalten, sollte die Dicke der schmalen Flußzone im Vergleich mit den Größen der Zellen verhältnismäßig klein eingestellt werden. Hinsichtlich der Dimensionen des bestrahlenden elliptischen Strahlflecks an dem verengten Abschnitt der Probenströmung ist ein geeigneter Wert für die untergeordnete Achse der Ellipse 1-20 µm. Es reicht aus, die Hauptachse der Ellipse groß genug zu machen, so daß sie sich vollständig über die Breite der schmalen Probenströmung in der schmalen Flußzone erstreckt.
Somit werden die Zellen 13 in der schmalen Probenströmung mit dem Laserlicht bestrahlt. Transmittiertes Laserlicht, welches durch die Flußzelle intakt getreten ist, ohne auf die Zellen aufzutreffen, wird von einem Strahlstopper 15 abgeblockt. Vorwärts gestreutes Licht und Vorwärts-Fluoreszenzlicht, welches von einer bestrahlten Zelle unter einem schmalen Winkel emittiert wird, wird von der Sammellinse 7 gesammelt und das gesammelte Licht tritt durch ein Pinhole 16 der Abschirmung 8. Fast sämtliches vorwärts gestreutes Licht und Vorwärts-Fluoreszenzlicht, welches somit von der Zelle 13 emittiert wird, kommt an dem dichroitischen Spiegel 9 an. Das Fluoreszenzlicht, dessen Wellenlänge größer als diejenige des gestreuten Lichts ist, wird intakt von dem dichroitischen Spiegel 9 bei einer hohen Rate transmittiert und Streulicht wird durch das Filter 10 entfernt, wonach das Fluoreszenzlicht erfaßt und in ein elektrisches Signal durch den Fotomultiplizierer 6 umgewandelt wird, von dem ein Vorwärts-Fluoreszenzlichts ausgegeben wird. In der Zwischenzeit wird das gestreute Licht von dem dichroitischen Spiegel 9 bei einer hohen Rate reflektiert, wonach das Licht von der Linse 12 gesammelt und von der Fotodiode 11 in ein elektrisches Signal umgewandelt wird, von der ein Signal eines vorwärts gestreuten Lichts ausgegeben wird.
Ausgangswellenformen des Signals für das vorwärts gestreute Licht von der Fotodiode 11 und Ausgangswellenformen des Signals des Vorwärts-Fluoreszenzlichts von dem Fotomultiplizierer 6 sind wie in den Wellenformdiagrammen aus den Fig. 9 bis 13 dargestellt, in denen die Zeit auf der horizontalen Achse und die Spannung auf der vertikalen Achse aufgetragen ist.
In Fig. 9 zeigt (a) die Ausgangswellenform eines Signals für vorwärts gestreutes Licht von einem roten Blutkörperchen und (b) zeigt eine Ausgangswellenform eines Signals für Vorwärts Fluoreszenzlicht von einem roten Blutkörperchen. Da rote Blutkörperchen eine geringe Größe und eine regelmäßige Gestalt aufweisen, wird ein Signal S&sub1; für das vorwärts gestreute Licht mit einer einzelnen Spitze erhalten. Da jedoch ein rotes Blutkörperchen keinen Kern besitzt, kann es nicht mit einer Farbe gefärbt werden und deshalb wird Fluoreszenzlicht S&sub2; nicht erfaßt.
Fig. 10 (a) zeigt eine Ausgangswellenform eines Signals für das vorwärts gestreute Licht von einem weißen Blutkörperchen und (b) zeigt eine Ausgangswellenform eines Signals für ein Vorwärts-Fluoreszenzlicht von einem weißen Blutkörperchen. Weiße Blutkörperchen sind groß, aber sie sind genauso groß oder geringfügig größer als rote Blutkörperchen und ein Signal S&sub3; für ein vorwärts gestreutes Licht ähnlich zu dem Signal S&sub1; für ein vorwärts gestreutes Licht wird erfaßt.
Jedoch wird aufgrund der Anwesenheit eines Kerns auch ein Signal S&sub4; eines Vorwärts-Fluoreszenzlichts erfaßt.
In Fig. 11 zeigt (a) die Ausgangswellenform eines Signals eines vorwärts gestreuten Lichts von einer epithelischen Zelle und (b) zeigt eine Ausgangswellenform eines Signals eines Vorwärts-Fluoreszenzlichts von einer epithelischen Zelle. Epithelische Zellen existieren in einer großen Vielfalt von Größen von groß bis klein, aber sie besitzen eine kleine Dicke und eine komplizierte Gestalt und einen komplizierten inneren Aufbau. Infolge dessen zeigt ein erhaltenes Signal S&sub5; eines vorwärts gestreuten Lichts eine große Breite und eine komplizierte Wellenform auf. Da die Nebenachse des Strahlflecks des Beleuchtungslichts kleiner als der Durchmesser einer epithelischen Zelle ist, reflektiert die erhaltene Signalwellenform die Größe, Gestalt und den inneren Aufbau der Zelle. Im Vergleich mit dem Signal S&sub1; für ein vorwärts gestreutes Licht des roten Blutkörperchens und dem Signal S&sub3; des vorwärts gestreuten Lichts des weißen Blutkörperchens weist das Signal S&sub5; des vorwärts gestreuten Lichts der epithelischen Zelle keinen Spitzenwert auf, der im Verhältnis zu der großen Breite des Signals so hoch ist. Der Grund dafür besteht darin, daß, da die Zellendicke klein ist, sämtliches Beleuchtungslicht nicht gestreut wird; das heißt, ein Teil davon durch die Zelle transmittiert wird. Ferner weist ein erhaltenes Signal S&sub6; eines Vorwärts-Fluoreszenzlichts auch eine große Breite und eine komplizierte Wellenforn auf. Der Abschnitt der Wellenforn, an dem eine Signalstärke sehr hoch ist, stellt die Stelle des Kerns an. Epithelische Zellen besitzen eine große Menge Zytoplasma, welches ebenfalls einen geringen Grad von Fluoreszenz emittiert.
In Fig. 12 zeigt (a) die Ausgangswellenform und eines vorwärts gestreuten Lichtsignals von einem Bakterium (b) zeigt eine Ausgangswellenform eines Vorwärts- Fluoreszenzlicht-Signals von einem Bakterium. Da Bakterien im Vergleich mit Blutzellen und dergleichen klein sind, werden ein kleines Signal S&sub7; des vorwärts gestreuten Lichts und ein Signal S&sub8; eines Vorwärts-Fluoreszenzlichts erfaßt.
In Fig. 13 zeigt (a) die Ausgangswellenform eines Signals des vorwärts gestreuten Lichts eines Harnzylinders und (b) zeigt eine Ausgangswellenform eines Signals für eine Vorwärts- Fluoreszenzlicht von dem Harnzylinder. Da ein Harnzylinder eine Größe in der Größenordnung von 100 bis mehreren hundert Micrometern aufweist, wird ein Signal S&sub9; des vorwärts gestreuten Lichts und ein Signal S&sub1;&sub0; eines Vorwärts- Fluoreszenzlichts mit einer sehr großen Breite erhalten.
Somit erzeugt der Fotomultiplizierer 6 ein Vorwärts- Fluoreszenzlicht-Signal für jede der Vielfalt von in der Urinprobe enthaltenen Zellen. Jedes Vorwärts- Fluoreszenzlicht-Signal wird von dem Verstärker 26 in dem Signalverarbeitungsabschnitt 19 verstärkt und das verstärkte Signal wird an die DC-Wiederherstellungseinrichtung 27 angelegt, die DC-Komponenten entfernt und den Amplitudenabschnitt (den Abschnitt des Vorwärts- Fluoreszenzlicht-Signals) extrahiert. Das sich ergebende Signal des Vorwärts-Fluoreszenzlichts, von dem die DC- Komponenten entfernt worden sind, wird an die Spitzenwert- Halteschaltung 28 angelegt, die den Spitzenwert des Signals erfaßt. Der erfaßte Spitzenwert wird von dem A/D-Wandler 29 in einen digitalen Wert umgewandelt und dieser Wert wird als ein Datenwert ausgegeben, der die Intensität eines Vorwärts- Fluoreszenzlichts anzeigt.
Die Fotodiode 11 erzeugt ein Signal des vorwärts gestreuten Lichts für jede der Vielfalt von Zellen, die in der Urinprobe enthalten sind. Jedes vorwärts gestreute Lichtsignal wird von dem Verstärker 21 in dem Signalverarbeitungsabschnitt 19 verstärkt und das verstärkte Signal wird an die DC- Wiederherstellungseinrichtung 22 angelegt, die DC-Komponenten entfernt und den Amplitudenabschnitt (nämlich den Abschnitt des Signals des vorwärts gestreuten Lichts) extrahiert. Das sich ergebende Signal des vorwärts gestreuten Lichts, von dem die DC-Komponenten entfernt worden sind, wird an die Spitzenwert-Halteschaltung 23 angelegt, die den Spitzenwert des Signals erfaßt. Der erfaßte Spitzenwert wird von dem A/D- Wandler 24 in einen digitalen Wert umgewandelt und dieser Wert wird als ein Datenwert ausgegeben, der die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts anzeigt. Das sich ergebende Signal des vorwärts gestreuten Lichts, von dem die DC- Komponenten entfernt worden sind, wird an den Vergleichs- Eingangsanschluß des Komparators 32 angelegt.
Um die Effekte einer Verunreinigung, beispielsweise Staubartikel, die in der Urinprobe enthalten sind, zu beseitigen, wird die Schwellwertschaltung 30 vorher auf einen geeigneten Schwellwert eingestellt. Dieser Wert wird von dem D/A-Wandler in einen analogen Wert umgewandelt und ein Spannung, die den analogen Wert anzeigt, wird an den Referenzeingangsanschluß des Komparators 32 angelegt. Nur ein Signal des vorwärts gestreuten Lichts, welches den Schwellwert überschreitet, wird von dem Komparator 32 in der Form einer Rechteckwelle ausgegeben. Dieses Rechteck- Wellensignal läuft in den Impulsbreitenzähler 33, der das Taktsignal von dem Taktsignalgenerator 34 für die Dauer der Rechteckwelleneingabe zählt. Infolge dessen wird das Signal des vorwärts gestreuten Lichts in einen Impulsbreiten- Datenwert umgewandelt, der von dem Impulsbreitenzähler 33 ausgegeben wird. Zu dieser Zeit geht der Ausgang der DC- Wiederherstellungseinrichtung 22 in die Steuerschaltung 35, die fortfährt, den Anfang und das Ende des Signals des vorwärts gestreuten Lichts zu erfassen und die Dauer der Impulsbreitenzählung, die von dem Impulsbreitenzähler 33 durchgeführt wird, zu steuern. Demzufolge ist jedes Element von Impulsbreitendaten ein Datenwert, der dem Zellendurchmesser jeder erfaßten Zelle entspricht. Ferner wird das voranstehend erwähnte Steuersignal von der Steuerschaltung 35 auch an die A/D-Wandler 24 und 29 angelegt und die A/D-Wandler 24 und 29 geben jeweils Daten, die die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts anzeigen und Daten, die die Intensität des Vorwärts-Fluoreszenzlichts anzeigen, für jede einzelne Zelle aus, wie voranstehend beschrieben.
Gemäß der Erfindung wird unter Verwendung von Latex- Partikeln eines bekannten Partikeldurchmessers eine Messung durchgeführt, bevor eine Urinprobe gemessen wird. Dann werden aus den Impulsbreitendaten, die von dieser vorläufigen Messung der Latex-Partikel gewonnen werden, und dem bekannten Durchmesser dieser Partikel Umwandlungswerte für den Zweck einer Umwandlung der voranstehend erwähnten Impulsbreitendaten in Partikeldurchmesser berechnet und die Umwandlungswerte werden dann in der Speicherschaltung 45 vorher als Durchmesser-Umwandlungswerte gespeichert.
Ferner werden die roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen, epithelischen Zellen, Harnzylinder und Bakterien, die in einer Urinprobe enthalten sind, tatsächlich gemessen und die Charakteristiken jeder Zelle, die statistisch auf Grundlage dieser tatsächlichen Messungen entschieden werden, werden in der Speicherschaltung 45 als Zellenbeurteilungswerte der in der nachstehenden Tabelle gezeigten Art gespeichert. TABELLE
In der Tabelle sind die Zellendurchmesser Werte, die auf eine tatsächliche Messung der roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen, epithelischen Zellen, Harnzylindern und Bakterien in einer Urinprobe unter Verwendung eines Mikroskops statistisch bestimmt werden. Die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts beinhaltet oder reflektiert eine Vielzahl von Informationselementen, beispielsweise eine Zellengröße, eine Dichte und eine Oberflächenkonfiguration. Es gibt Zellen (epithelische Zellen), für die die Intensität von gestreutem licht hoch ist, Zellen, (rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, Harnzylindern und einige epithelische Zellen), für die die Intensität mittel ist und Zellen (Bakterien), für die die Intensität gering ist. Die Intensität des Fluoreszenzlichts ist Information, die proportional zu der DNA-Menge ist. Es gibt Zellen (weiße Blutkörperchen, epithelische Zellen und Harnzylinder, in denen Zellen eingeschlossen sind), für die die Intensität von Fluoreszenzlicht hoch ist, Zellen (Bakterien), für die die Intensität mittel ist und Zellen (Bakterien, weiße Blutkörperchen, Hyalin-Harnzylinder), für die die Intensität gering ist. Der Grund der geringen Fluoreszenz-Intensität von GlasHarnzylinder besteht darin, daß diese keine DNA enthalten. Obwohl Bakterien DNA enthalten, besitzen die Zellen zusätzlich eine kleine Größe und deshalb ist die Menge des DNA-Inhalts im Vergleich mit anderen Zellen gering. Die Intensität von Fluoreszenzlicht ist ebenfalls mittel oder gering.
Unter diesen Bedingungen werden die Elemente der Intensitätsdaten des vorwärts gestreuten Lichts, die Intensitätsdaten des Vorwärts-Fluoreszenzlichts und Impulsbreitendaten, die zu jeder Zelle gehören, auf einer Zellen-für-Zellen-Basis in der Speicherschaltung 42 immer dann gespeichert, wenn das Triggersignal T, welches bei jedem Zellenvorbeifluß erzeugt wird, in den Datenverarbeitungsabschnitt 20 geht. Der Impulsbreitendatenwert wird durch den Datenanalysator 43 auf Grundlage der voranstehend erwähnten Zellendurchmesser- Umwandlungswerte in einen Zellendurchmesser-Datenwert umgewandelt und der erhaltene Zellendurchmesser-Datenwert wird in der Speicherschaltung 42 gespeichert. Der Zähler 41 zählt die Zellen in einer aufeinanderfolgenden Weise. Dieser Betrieb wird ausgeführt, bis die gesamte Urinprobe durch die Flußzelle 2 geströmt ist. Die Speicher- und Zählvorgänge werden im Schritt 51 in dem Flußdiagramm aus Fig. 3 ausgeführt. Wenn die gesamte Urinprobe durch die Flußzelle 2 geströmt ist, wird die Gesamtanzahl von Zellen, die in der Urinprobe erfaßt werden, in dem Zähler 41 gehalten und und die Elemente der Intensitätsdaten des vorwärts gestreuten Lichts, die Intensitätsdaten des Vorwärts-Fluoreszenlichts und Zellendurchmesserdaten, die zu jeder in der Urinprobe erfaßten Zelle gehören, werden in der Speicherschaltung 42 gespeichert.
Unter diesen Bedingungen liest der Datenanalysator 43 die Daten für alle Zellen aus der Speicherschaltung 42 aus und erzeugt dann verschiedene Streuungsdiagramme (a), (b) und (c), die in dem oberen Teil von Fig. 14 gezeigt sind (Schritt 52) und zeigt diese an. Eine Betrachtung der Streudiagramme aus Fig. 14 ermöglicht dem Benutzer, auf einen Blick zu beurteilen, ob die Ergebnisse einer Urinanalyse normal oder anormal sind. Zusätzlich kann der Benutzer leicht überprüfen, ob die Streuungsdiagramme aus Fig. 14 Muster einer anomalen Probe anzeigen. Wenn die probe normal ist, werden fast keine Zellen in dem Streuungsdiagramm erscheinen. In Fig. 14 ist (a) ein Streuungsdiagramm der Streulichtintensität und der Fluoreszenzlichtintensität, (b) ein Streuungsdiagramm der Fluoreszenzlichintensität und des Zellendurchmessers und (c) ein Streuungsdiagramm der Streulichtintensität und des Zellendurchmessers.
Jedes Element von Zellendaten wird aus der Speicherschaltung 42 (Schritt 53) ausgelesen und jede Zelle wird von dem Datenanalysator 43 entsprechend der Zellenbeurteilungsdaten in dem Speicher 45 analysiert. Wenn insbesondere der Datenwert, der den Durchmesser der gelesenen Zelle anzeigt, 3 - 10µm ist, der Datenwert der Streulichtintensität mittel ist und der Datenwert der Fluoreszenzintensität gering ist, dann wird beurteilt, daß die Zelle ein rotes Blutkörperchen ist (Schritte 54 - 58). Wenn beurteilt wird, daß eine Zelle ein rotes Blutkörperchen ist, inkrementiert der Zähler 46 den Zählwert der roten Blutkörperchen (Schritt 59). Wenn die Zelle kein rotes Blutkörperchen ist, wird beurteilt, daß sie eine andere Zelle ist (Schritt 50).
Wenn ein Datenwert, der den Durchmesser der Zelle anzeigt, die als eine andere Zelle beurteilt wird, 3 - 15 µm ist, der Datenwert der Streulichtintensität mittel ist und der Datenwert der Fluoreszenzintensität hoch ist, dann wird beurteilt, daß die Zelle ein weißes Blutkörperchen ist (Schritte 60 - 64). Wenn beurteilt wird, daß die Zelle ein weißes Blutkörperchen ist, inkrementiert der Zähler 46 den Zählwert für weiße Blutkörperchen (Schritt 65). Wenn die Zelle kein weißes Blutkörperchen ist, wird beurteilt, daß sie eine andere Zelle ist (Schritt 66).
Wenn der Datenwert, der den Durchmesser der Zelle anzeigt, die als eine andere Zelle beurteilt wird, 15 - 150 µm ist, der Datenwert der Streulichtintensität hoch oder mittel ist und der Datenwert der Fluoreszenzintensität hoch ist, dann wird beurteilt, daß die Zelle eine epithelische Zelle ist (Schritte 68 - 72). Wenn beurteilt wird, daß eine Zelle eine epithelische Zelle ist, inkrementiert der Zähler 46 den Zählwert für epithelische Zellen (Schritt 73). Wenn die Zelle keine epithelische Zelle ist, wird beurteilt, daß sie eine andere Zelle ist (Schritt 74).
Wenn der Datenwert, der den Durchmesser der Zelle anzeigt, die als eine andere Zelle beurteilt wird, größer als 100 µm ist, der Datenwert der Streulichtintensität mittel ist und der Datenwert der Fluoreszenzintensität gering oder hoch ist, dann wird beurteilt, daß die Zelle ein Harnzylinder ist (Schritte 75 - 79). Wenn beurteilt wird, daß eine Zelle ein Harnzylinder ist, dann inkrementiert der Zähler 46 den Zählwert für Harnzylinder (Schritt 80). Wenn die Zelle nicht ein Harnzylinder ist, wird beurteilt, daß sie eine andere Zelle ist (Schritt 81).
Wenn beurteilt wird, daß der Datenwert, der den Durchmesser der Zelle anzeigt, die als eine andere Zelle beurteilt wird, 1 - 3 µm ist, der Datenwert der Streulichtintensität gering ist und der Datenwert der Fluoreszenzintensität mittel oder gering ist, dann wird beurteilt, daß die Zelle ein Bakterium ist (Schritte 82 - 86). Wenn beurteilt wird, daß eine Zelle ein Bakterium ist, inkrementiert der Zähler 46 den Zählwert für Bakterien (Schritt 87). Wenn die Zelle kein Bakterium ist, wird beurteilt, daß sie eine andere Zelle ist (Schritt 88). Eine Zellenanalyse wird für alle erfaßten Zellen ausgeführt (Schritt 89), der Zählwert für rote Blutkörperchen, der Zählwert für weiße Blutkörperchen, der Zählwert für epithelische Zellen, der Zählwert für Harnzylinder und der Zählwert für Bakterien pro Mikroliter der Urinprobe werden berechnet und die berechneten numerischen Werte werden zusammen mit dem Zellenzählwert unter den Streudiagrammen aus Fig. 14 angezeigt (Schritt 90). Somit können die Ergebnisse einer höchst genauen Urinanalyse erhalten werden.
Obwohl die vorangehende Ausführungsform dargestellt worden ist, wobei ein Vorwärts-Streulicht und ein Vorwärts- Fluoreszenzlicht als ein Beispiel verwendet wurden, sollte es offensichtlich sein, daß gleichermaßen gute Ergebnisse unter Verwendung von seitlich gestreutem Licht oder Seitenfluoreszenzlicht genauso erhalten werden können. Soweit erforderlich kann die Anzeige allein auf die verschiedenen Zellenzählungen ohne eine Bereitstellung einer Anzeige der Streudiagramme aus Fig. 14 beschränkt werden.
Die oben beschriebene Vorrichtung der Erfindung ist so ausgelegt, daß gestreutes licht und Fluoreszenzlicht von einzelnen Zellen in einer Urinprobe durch eine Flußzytometrie erfaßt wird, ein Datenwert, der eine Streulichtintensität anzeigt und ein Datenwert, der eine Fluoreszenzlichtintensität anzeigt, aus dem Streulicht und Fluoreszenzlicht erhalten wird, das gestreute Licht in Impulsignale umgewandelt wird und Impulsbreiten in Daten umgewandelt werden, die einen Zellendurchmesser entsprechend bekannter Zellendurchmesser anzeigen. Ferner werden Daten einer tatsächlichen Messung, die die Charakteristiken von jeder Zelle darstellen, in dem Speicher vorher als Zellenbeurteilungswerte gespeichert und der Datenwert, der die erfaßten Zellen anzeigt, wird gemäß dieser Zellenbeurteilungswerte analysiert.
Infolge dessen können Zellen, die in einer Urinprobe enthalten sind, in rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, epithelische Zellen, Harnzylinder und Bakterien etc. automatisch klassifiziert werden.
Ferner können alle Zellen, die in der Urinprobe erfaßt werden, gezählt und angezeigt werden, genauso wie die Zählwerte der einzelnen Zellentypen in der Urinprobe.
Da viele offensichtlich stark abweichende Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ohne Abweichen von dem Grundgedanken und dem Umfang davon durchgeführt werden können, versteht es sich von selbst, daß die Erfindung nicht auf die spezifischen Ausführungsformen davon, außer wie in den beigefügten Ansprüchen definiert, beschränkt ist.

Claims

1. Vorrichtung zum Analysieren von Zellen (13) im Urin, umfassend:

- eine erste Einrichtung (1-12) zum Bestrahlen einer verengten Zone (2), durch welche verschiedene Zellen (13), die in einer Urinprobe enthalten sind, in einer einzelnen Aufreihung fließen, mit Licht und Erfassen von gestreutem Licht und Fluoreszenzlicht, welches von einzelnen Zellen (13) emittiert wird, wobei die einzelnen Zellen (13) mit einer Färbung, gefärbt worden sind, so daß eine DNA spezifisch eine Fluoreszenz emittieren wird:

- eine erste fotoelektrische Umwandlungsschaltung (21, 22) zum Umwandeln des gestreuten Lichts, welches von der ersten Einrichtung erfaßt wird, in einen elektrischen Signalausgang;

- eine zweite fotoelektrische Umwandlungsschaltung (26, 27) zum Umwandeln des Fluoreszenzlichts, welches von der ersten Einrichtung erfaßt wird, in einen elektrischen Signalausgang;

- eine zweite Einrichtung (23, 24) zum Erzeugen eines Datenwerts einer Streulichtintensität auf Grundlage des elektrischen Signalausgangs von der ersten fotoelektrischen Umwandlungsschaltung;

- eine dritte Einrichtung (28, 29) zum Erzeugen eines Datenwerts einer Fluoreszenzlichtintensität auf Grundlage des elektrischen Signalausgangs von der zweiten elektrischen umwandlungsschaltung;

- eine vierte Einrichtung (31-35) zum Umwandeln des elektrischen Signalausgangs von der ersten fotoelektrischen Umwandlungsschaltung in Impulsbreitendaten;

- eine fünfte Einrichtung (40-43) zum Umwandeln der Impulsbreitendaten, die von der vierten Einrichtung erhalten werden, in Zelldurchmesserdaten;

- eine Speichereinrichtung (45), in der Zellendurchmesserinformation, Streulichtintensitäts-Information und Fluoreszenzlichtintensitäts-Information vorher als Zellenbeurteilungswerte gespeichert werden, wobei Zellenbeurteilungswerte Charakteristiken von verschiedenen Typen von Zellen anzeigen und statistisch bei der Ausführung von einer tatsächlichen Messung von verschiedenen Zellen im Urin erhalten werden, wobei die Zellenbeurteilungswerte niedrige, mittlere und hohe Pegel für eine Streulichtintensität und eine Fluoreszenzlichtintensität der verschiedenen Typen von Zellen bereitstellen; und

- eine sechste Einrichtung (40-43) zum Klassifizieren und Zählen von Zellen (13) in der Urinprobe auf Grundlage der Zellenbeurteilungswerte, so daß:

a) eine Zelle (13) als ein rotes Blutkörperchen klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität der zweiten Einrichtung mittel ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichintensität niedrig ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 3 - 10µm ist;

b) eine Zelle (13) als ein weißes Blutkörperchen klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität der zweiten Einrichtung mittel ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichtintensität hoch ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 3 - 15 µm ist;

c) eine Zelle (13) als ein Epithel klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität der zweiten Einrichtung mittel oder hoch ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichintensität hoch ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 15 - 150 µm ist;

d) eine Zelle (13) als ein Harnzylinder klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität der zweiten Einrichtung mittel ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichtintensität niedrig oder hoch ist und der Zellendurchmesser-Datenwert größer als 100 µm ist ; und

e) eine Zelle (13) als ein Bakterium klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität der zweiten Einrichtung niedrig ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichtintensität niedrig oder mittel ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 1 - 3 µm ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, ferner umfassend eine siebte Einrichtung (46) zum Anzeigen von Zellenklassifikationen und Zellenzählwerten, die von der sechsten Einrichtung erhalten werden.

3. Verfahren zum Analysieren von Zellen (13) im Urin, umfassend die folgenden Schritte:

- Bestrahlen einer verengten Zone (2), durch die in einer Urinprobe enthaltene verschiedene Zellen (13) in einer einzelnen Aufreihung fließen, mit Licht;

- Erfassen von Streulicht und Fluoreszenzlicht, welches von einzelnen Zellen (13) emittiert wird, wobei die einzelnen Zellen (13) mit einer Färbung gefärbt worden sind, so daß eine DNA spezifisch eine Fluoreszenz emittieren wird;

- Umwandeln des in dem Erfassungsschritt erfaßten Streulichts in einen elektrischen Signalausgang unter Verwendung einer ersten fotoelektrischen Umwandlungsschaltung (21, 22);

- Umwandeln des in dem Erfassungsschritt erfaßten Srteulichts in einen elektrischen Signalausgang unter Verwendung einer ersten elektrischen Umwandlungsschaltung (21, 22);

- Erzeugen eines Datenwerts der Streulichtintensität auf Grundlage des elektrischen Signalausgangs von der ersten elektrischen Umwandlungsschaltung;

- Erzeugen eines Datenwerts einer Fluoreszenzlichtintensität auf Grundlage des elektrischen Signalausgangs von der zweiten elektrischen Umwandlungsschaltung;

- Erzeugen eines Impulsbreitendatenwerts von dem elektrischen Signalausgang von der ersten elektrischen Umwandlungsschaltung;

- Umwandeln des Impulsbreitendatenwerts in einen Zellendurchmesser-Datenwert;

- Bereitstellen einer Speichereinrichtung (45), in der Zellenbeurteilungswerte vorher gespeichert worden sind, wobei die Zellenbeurteilungswerte eine Zellendurchmesser-Information, eine Streulichtintensitäts-Information und eine Fluoreszenzlichtintensitäts-Information umfassen, wobei die Zellenbeurteilungswerte Charakteristiken von verschiedenen Typen von Zellen (13) anzeigen und statistisch durch Ausführen einer tatsächlichen Messung von verschiedenen Zellen im Urin erhalten worden sind, wobei die Zellenbeurteilungswerte niedrige, mittlere und hohe Pegel für eine Streulichtintensität und eine Fluoreszenzlichtintensität der verschiedenen Typen von Zellen (13) bereitstellen; und

- Klassifizieren und Zählen jeder Zelle (13) in der Urinprobe auf Grundlage der Zellenbeurteilungswerte, so daß:

a) eine Zelle (13) als ein rotes Blutkörperchen klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität mittel ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichintensität niedrig ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 3 - 10µm ist;

b) eine Zelle (13) als ein weißes Blutkörperchen klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität mittel ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichtintensität hoch ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 3 - 15 µm ist;

c) eine Zelle (13) als ein Epithel klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität mittel oder hoch ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichintensität hoch ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 15 - 150 µm ist;

d) eine Zelle (13) als ein Harnzylinder klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität mittel ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichtintensität niedrig oder hoch ist und der Zellendurchmesser-Datenwert größer als 100 µm ist ; und

e) eine Zelle (13) als ein Bakterium klassifiziert wird, wenn der Datenwert der Streulichtintensität niedrig ist, der Datenwert der Fluoreszenzlichtintensität niedrig oder mittel ist und der Zellendurchmesser-Datenwert 1 - 3 µm ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, ferner umfassend den Schritt, bei dem Zellenklassifikationen, die in dem Klassifizierungsschritt erhalten werden, und Zellenzählwerte, die in dem Zählschritt erhalten werden, angezeigt werden.