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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren und stabile wässerige
Reagenz-Zusammensetzungen zur schnellen Analyse für Reticulozyten.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung automatisierbare
Verfahren und stabile wässerige
Reagenz-Zusammensetzungen
zur raschen Analyse von Reticulozyten unter Verwendung von Lichtbrechungs-
und Fluoreszenzflusscytometrietechniken. Die Verfahren und stabilen
wässerigen
Reagenz-Zusammensetzungen erlauben die rasche Analyse von Reticulozyten,
die durch Zählung und
Reifegrad darstellbar sind, auf Multi-Parameter hematologischen
Instrumenten mit hohem Durchsatz. Das Verfahren erlaubt ebenfalls
die echt-Zeit Analyse von Reticulozyten und Zählungen von Zellen in Vollblut ("CBD"), einschließlich Zellkern-haltiger
roter Blutzellenzählungen
("NRBC"), ohne einen getrennten
Inkubationsschritt.
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HINTERGRUND
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Die roten Blutzellen ("RBC") treten in dem Blutstrom
normalerweise als Reticulozyten ein. Die Erythropoese beginnt mit
dem Erythroblasten und schreitet vor durch ungefähr fünf Generationen von intermediären, zellkernhaltigen
Zellen im Knochenmark und endet mit den Reticulozyten. Der Reticulozyt
ist eine unreife rote Blutzelle, welche weiterhin reticuläres Material
(ribosomale und messenger RNA) enthält, obwohl in diesem Entwicklungsschritt
die Zelle bereits den Zellkern abgestoßen hat.
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Unter den Bedingungen der Anemie
oder der Hypoxie kann dieses Verfahren verkürzt sein. Somit können unter
diesen Bedingungen Reticulozyten in einem frühereren Stadium als normal
in den Blutstrom eintreten. Diese frühen Reticulozyten werden durch
die zusätzliche
Menge von RNA erkannt, welche sie enthalten, sowie durch ihre größere Größe, ihre
niedrigeren Hemoglbingehalt und durch den größeren Zeitraum während dessen
sie als Reticulozyten im Blutstrom existieren.
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In dem frühen Dreißiger-Jahren differenzierten
L. Heilmeyer (Ztschr. Klin. Ned. 121: 361–379, 1932) Reticulozyten in
vier Altersgruppen gemäß der Menge
von Reticulum (vital färbbare
Substanz, die in den Reticulozyten enthalten ist), welche sie enthalten.
Traditionell enthält
Gruppe I 30 oder mehr Reticulum, Gruppe II enthält 15–30, Gruppe III enthält 3–15, und
Gruppe IV enthält
1–2 Reticulum.
Die normale Reticulozytenzahl liegt zwischen 0,5 bis 2,5% der RBC
Zählung
für Erwachsene
und von etwa 2,0 bis 6,0% der RBC Zählung für neugeborene Säuglinge.
Hinsichtlich der Altersgruppen wird beim normalen Erwachsenen die
Mehrzahl der Reticulozyten in Gruppe IV sein, und keine in Gruppe
I.
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Die Reticulozytenzahl ist ein Ausmaß der Produktion
roter Blutzellen. Sie ist somit nützlich bei der Diagnose und
Behandlung von Anemie. Historisch wurden die Reticulozytenzahlen
sehr eng verknüpft
mit der Etiologie und Einteilung der Anemien. Die Reticulozytenzahl
ist erhöht
bei hemolytischen Anemien, Pyruvatkenasemangel, Sichelzellanemie,
Thalassemien und vermindert bei der megaloblastischen Anemie, aplastischen
Anemie, und der allgemeinen Knochenmarksdysfunktion. Kürzlich wurde
die Reticulozytenzählung ebenfalls
verwendet, um die toxischen Wirkungen chemotherapeutischer Wirkstoffe
auf das Knochenmark zu beurteilen. Daher haben Hematologen einstimmig
die Reticulozytenzählung
und den Reticulozytenreifungsindex als sehr wertvolle Informationen
bewertet.
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Das am häufigsten verwendete Verfahren
zur Zählung
von Reticulozyten ist das manuelle mikroskopische Verfahren. Brilliant
Cresol blau wurde hauptsächlich
verwendet bis das neue Methylen Blau ("NMB") 1949
durch G. Brecher (Am. J. Clin. Pathol. 19: 895–896, 1949) eingeführt wurde.
Die neuste National Committee for Clinical Laboratory Standards
("NCCLS") Veröffentlichung
(NCCLS DOC. H44-P) beschreibt die NMB Färbung, in der ein identisches
Blutvolumen gemischt wird mit NMB Färbung und für etwa fünfzehn Minuten inkubiert wird,
damit der RNA gestattet wird, auszufällen. Blutausstriche werden
dann gemacht und die gefärbten
Reticulozyten werden mikroskopisch gezählt.
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Eine Miller Okularscheibe wird in
ein Okular eingesetzt. Die Fläche
des kleineren Quadrats, welche innerhalb des Okulars gesehen wird,
ist 1/9 der Fläche
des größeren Quadrats.
Die roten Blutzellen werden in dem kleineren Quadrat gezählt, wogegen
die Reticulozyten in dem größeren Quadrat
gezählt
werden. Zwanzig aufeinanderfolgende Felder werden gezählt und
der Prozentsatz der Reticulozyten wird berechnet, indem die Gesamtzahl
der Reticulozyten in dem größeren Quadraten
dividiert wird durch die Gesamtzahl der roten Blutzellen in den
kleinen Quatdraten nach Multiplikation mit 9. Der Nachteil des manuellen
Verfahrens, ist es das es arbeitsintensiv, ungenau, zeitaufwändig und
subjektiv ist.
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Viele Versuche wurden unternommen,
um diese Nachteile durch das Mittel der Fluss-cytometrischen Technologie
zu korrigieren. In den Achtziger-Jahren wurden Pyronin Y ("PY") und Acridin Orange
("AO") verwendet, um Reticulozyten
im Flußcytometer
zu färben
und zu zählen.
Verschiedene halb automatische, Fluss-cytometrische Verfahren sind
nur verfügbar
zur Zählung
von Reticulozyten aus einer Vollblutprobe. Bei jedem der existierenden
Verfahren wird ein Verdünner,
welcher einen organischen kationischen Farbstoff enthält, wie
zum Beispiel Auamin 0 ("AuO"), oder Thiazol Orange
("TO") verwendet, um die
RNA innerhalb der Reticulozyten zu färben. Während des Inkubationszeitraums
penetriert der Farbstoff langsam die Zellmembran und bindet an die
RNA innerhalb jedes Reticulozyten. Die Menge von erzeugten Signal
durch die gefärbten Reticulozyten,
wenn die Probe durch die Aufnahmezone hindurchtritt, ist im wesentlichen
proportional zu dem RNA Gehalt innerhalb jedes Reticulozyten. Ein
Flußcytometer,
welches mit der geeigneten Anregungslichtquelle und Emissionsnachweissystemen
ausgerüstet
ist, kann daher verwendet werden, um den Prozentsatz von Reticulozyten
in einer Vollblutprobe zu bestimmen.
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Allerdings gibt es viele-Problemquellen,
die die Automatisierung von Reticulozytenverfahren erschweren, insbesondere
falls die Vorrichtung ein hematologisches Multi-Parameter-System
ist. Die wichtigste ist, die Notwendigkeit eine gefärbte Probe "off-line" herzustellen. Dieser
Probenvorbereitungsschritt er fordert eine längere Inkubationszeit von mehreren
Minuten oder noch länger,
bevor der Farbstoff die Zelle penetriert hat, um die Reticulozyten
RNA ausreichend zu färben,
um die Probe von einem Flußcytometer
verarbeiten zu lassen. Zusätzlich
sind die Mehrzahl der Farbstoffe, die derzeit verwendet werden,
um RNA in Reticulozyten zu färben, instabil
in wässeriger
Lösung
und binden nicht nur an RNA und DNA sondern können auch an die Plastikröhren, Glasoberflächen, einschließlich der
Flußzelle
der Vorrichtung binden. Dies erfordert die lange und aufwändige Maßnahme des
Reinigens des kompletten Systems nach der Durchführung eines Tests.
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Das U.S. Patent 3,684,377 von Kaminsky,
et al., U.S. Patent 3,883,247 von Adams und das U.S. patent 4,336,029
von Natale, beschreiben alle die Verwendung von AO zur Färbung von
Reticulozyten. Obwohl AO hervorragende Eigenschaften zur Färbung von
Reticulozyten besitzt (es bindet an RNA und erzeugt eine rote Fluoreszenz),
bindet es ebenfalls an Plasma und erzeugt eine hohe Hintergrundprobenstromfluoreszenz, was
es erschwert, einen guten Rauschabstand ("S/N"-Abstand)
zu erzielen. Noch problematischer bei der Verwendung von AO in einem
Flußcytometer
ist die Neigung von AO an Plastikröhren und Oberflächen von
Flußzellen
zu binden, was zu den Nachweisproblemen hinzukommt. Weiterhin erfordern
die AO Verfahren 5 bis 7 Minuten Inkubation, welches ein zu langer
Zeitraum ist, um in die hematologischen Multi-Kanal-Analysatoren heutiger
Tage mit hohem Durchlauf integriert zu werden.
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Das U.S. Patent 4,707,451 von Sage,
Jr. beschreibt eine Reagenz-Zusammensetzung bestehend aus Thioflavin
T oder Chrysanilin. Die Farbstoffaufnahme durch die Reticulozyten
dauert etwa 7 Minuten bei diesem Verfahren und die Hintergrundfluoreszenz
ist zu hoch, um einen guten S/N-Abstand bei dem Nachweis von Gruppe
IV Reticulozyten zu erzielen.
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Das U.S. Patent 4,883,867 von Lee
et al. beschreibt einen Farbstoff zur Färbung von RNA und DNA. TO ist
ihr bevorzugter Farbstoff zur Reticulozytenanalyse und das Verfahren
erfordert eine minimale Inkubationszeit von 30 Minuten. Obwohl TO
eine hohe Nukleinsäurebindungsaffinität und Quantumertrag
besitzt, ist das Verhältnis
der Membranpenetration von TO sehr langsam (30 Minuten) und ist
somit ungeeignet zur Verwendung in einem klinischen hematologischen
Multi-Parameter-Instrument mit hohem Durchsatz.
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Das U.S. Patent 4,971,917 von Kuroda
beschreibt eine Reagenz-Zusammensetzung welche AuO und ein Carbonatsalz
enthält,
um die unspezifische Färbung
gereifter Erythrozyten zu reduzieren. Das U.S. Patent 4,985,176
beschreibt ein weiteres Reticulozytenfärbereagenz zur Fluß-cytometrischen
Anwendung, worin AuO eingebracht ist als ein bevorzugter Farbstoff,
und die Probeninkubationszeit zum Färben liegt irgendwo zwischen
30 Sekunden bis 20 Minuten. Die Nachteile zu der Verwendung von
AuO in einem Flußcytometer sind,
dass der Farbstoff, wie AO, eine Affinität nicht nur für DNA und
RNA aufweist, sondern auch für
verschiedene Arten von Plastik und Glasoberflächen, was es sehr schwierig
macht, die Verfahren in ein hematologisches Multi-Parameter-Instrument einzubringen.
TOA Medical Electronics Co., Ltd. haben es erreicht, ein AuO Verfahren
in ihren Sysmex® R-1000
und R-3000 automatischen
autonomen Reticulozytenanalysatoren einzubringen, waren jedoch nicht
in der Lage, das Verfahren in ihren hematologischen Multi-Parameter-Instrumente zu
implementieren, wie zum Beispiel dem NE8000 oder SE9000 Instrumenten.
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Das U.S. Patent 5,284,771 von Colella
et al. beschreibt ein Verfahren und eine Reagenz-Zusammensetzung,
welches die Be- handlung einer Vollblutprobe mit einer einzelnen
Reagenz-Zusammensetzung
umfasst, welches einen kationischen Farbstoff (Oxazin® 750) enthält, um RNA
in Reticulozyten zu färben
und einen zwitterionischen sphärischen
Wirkstoff zur Eliminierung des Ausrichtungsrauschens der flachen
Blutzellen umfasst, wenn das gefärbte
Produkt einem Fluß-cytrometischen
Lichtmesssystem ausgesetzt ist.
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Kürzlich
hat Miles Inc. das obige Verfahren in ihrem neuesten H*3® Hematologieinstrument
eingebracht. Dieses Instrument ist mit einem Helium/Neon ("HeNe") elektro-optischen
Nachweissystem ausgestattet und Oxazin® 750 Nukleinsäurefarbstoff
wird verwendet, um Reticulozyten zu färben während ein zwitterionisches
Tensid verwendet wird, um die roten Blutzellen und Reticulozyten
in eine sphärische
Form zu bringen zur Vorbereitung für volumetrische Messungen.
Das H*3® Reticulozytenverfahren
ist nur ein halb-automatisiertes Verfahren, welches die manuelle
Mischung des Blutes mit dem Reticulozytenreagenz erfordert, gefolgt durch
eine 15 minütige
off-line Inkubation. Die Sensitivität des Verfahrens beim Nachweis
von Gruppe IV Reticulozyten ist schlecht.
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Coulter Corporation haben ebenfalls
ein halbautomatisiertes Reticulozytenverfahren in ihre hematologischen
STKS® und
Maxim® Analysatoren
eingebracht. Coulter benennt seine Technologie: VCS (Volume, Conductivity
and Scatter; Volumen, Leitfähigkeit
und Streuung). Bei der Durchführung
von VCS wird eine Blutprobe zunächst
gemischt mit Coulter's
Retic Farbstoff (welcher NMB enthält). Die Mischung wird dann
bei Raumtemperatur für
5 Minuten inkubiert. Danach wird ein kleines Volumen der gefärbten Blutprobe
mit einer Aufhellungslösung
verdünnt,
welche Schwefelsäure
enthält.
Die Genauigkeit des Verfahrens leidet stark unter schlechter Sensitivität und einer
schlechten Auflösung
der roten Blutzellen. Dies ist eine Folge von Reticulozytenstroma
(lysiert durch die Aufhellungslösung),
weiteren Zellen-Debris und Trombozyten, welche Rauschen erzeugen,
was es sehr schwierig macht, die eigentlichen Signale zu differenzieren.
Nur verklumpte Trombozyten werden Signale erzeugen, welche größer sind
und welche daher nicht mit den Signalen interferieren werden, die
durch rote Blutzellen und Reticulozytenstroma erzeugt werden.
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Das U.S. Patent 4,981,803 von Kuroda
beschreibt ein Reagenz, welches AuO zur Reticulozytenzählung durch
Fluß-cytometrische
Verfahren enthält,
welche zwei Lösungen
umfasst, und zwar eine Lagerlösung zum
Färben,
in der ein Farbstoff (AuO) in einem nicht wässerigen Lösungsmittel aufgelöst ist,
und eine Pufferlösung,
welche die optimalen Färbebedingungen
für RNA
in Reticulozyten enthält.
Kuroda behauptet, dass durch die Kombination dieser beiden Lösungen kurz
vor der Färbung
eine stabile endgültige
Färbelösung für Reticulozytenzählung immer
erzielt werden kann. Die Probleme dieses Verfahrens sind zahlreich.
Am hervorstechendsten hat die Gruppe der nicht wässerigen Lösungs mittel, welche gewählt wurde,
(Ethylenglykol, Triethylenglykol, Diethylenglykol) einen hohen Brechungsindex.
Solche Brechungsindices machen sie ungeeignet zur Verwendung in
einem hematologischen Multi-Parameter-Analyzer. Dies ist eine Folge
der wässerigen Abgrenzlösung, welche
notwendig ist, (wie zum Beispiel Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) und
welche einen Brechungsindex von etwa 1,334 besitzt. Wie in dem Kuroda
Patent beschrieben, sind andere Lösungsmittel, wie zum Beispiel
Methanol, Ethanol oder Propanol (welche einen Brechungsindex in
der Nähe
der Kochsalzgrenzschicht haben) hoch volatil und sind somit ebenfalls
ungeeignet. Darüber
hinaus ist es technisch sehr schwierig, solche kleinen Mengen von
Lagerlösungen
mit großen
Mengen wässerigen
Puffers on-line zu mischen, wie dies durch diese Verfahrensweise
erfordert wird, um ein stabiles Reticulozytenreagenz zu erzielen.
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Somit bestand ein über längeren Zeitraum
ein Bedürfnis
für ein
schnelles und genaues Verfahren zur Reticulozytenanalyse, welches
in einem Flußcytometer
eingebracht werden kann oder in ein hematologichen Multi-Parameter-Analyzer
mit hohem Durchsatz, unter Verwendung eines Reagenz, welches in
einer wässerigen
Umgebung stabil ist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein Verfahren für die gleichzeitige Zählung von
CBCs und von Reticulozyten in einer Vollblutprobe, ohne das Bedürfnis für einen
getrennten Inkubationsschritt für
die Reticulozytenzählung,
wird bereitgestellt.
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Eine Ausführungsform stellt ein wässeriges,
Nukleinsäurefärbendes
Reagenz bereit, das eine Reticulozyten-färbende Menge eines asymmetrischen
Cyaninfarbstoffs umfasst, von etwa 20 mM bis etwa 60 mM einer Pufferlösung gewählt aus
der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Trispuffer,
und einer Farbstoff-stabilisierenden Menge eines nicht ionischen
Tensids, gewählt
aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholami,
n-Dodecyl-D-Maltosid, einem Polyoxypropylen-polyoxyethylenblock
Copolymer, n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid
und n-Decyl-D-glu copyranosid. Das Reagenz hat einen pH von etwa
6,0 bis etwa 8,0 und eine Osmolarität, eingestellt auf etwa 230
bis etwa 340 mOsm/l mit mono- oder divalenten Alkalisalzen, welche
nicht mit dem Cyaninfarbstoff interagieren oder in der wässerigen
Reagenzlösung
ausfallen.
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In einer weiteren Ausführungsform
wird ein Verfahren zur Zählung
von Reticulozyten bereitgestellt. Zunächst wird ein Aliquot einer
Vollblutprobe gemischt mit dem wässerigen,
Nukleinsäure-färbenden
Reagenz. Dieses Proben/Reagenzaliquot wird dann zu einer optischen
Flußzelle
zur Analyse transportiert, und zwar ohne dass das Aliquot getrennt
inkubiert wird. Während
die Zellen durch eine belichtete optische Flußzelle hindurch treten, im
wesentlichen eine Zelle an einem Zeitpunkt, werden die Lichtbrechungs-
und Fluoreszenzcharakteristika nachgewiesen und die Zählung der
Reticulozyten in der Probe wird daraus ermittelt.
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Eine weitere Ausführungsform liefert ein wässeriges,
Nukleinsäure-färbendes
Reagenz, das von etwa 0,1 μg/ml
bis etwa 0,3 μg/ml
eines Farbstoffes umfasst, gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16 und Syto
12 (alle erhältlich
von Molecular Probes, Eugene, OR), von etwa 40 mM bis etwa 60 mM Imidazolpuffer
und eine Farbstoff-stabilisierende Menge eines nicht ionischen Tensids
gewählt
aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholamid
und einem Polyoxypropylen-polyoxyethylen blockcopolymer, worin das
Reagenz einen pH von etwa 6,8 bis etwa 7,2 hat und eine Osmolarität eingestellt
auf etwa 280 bis etwa 310 mOsm/l mit einem mono-, oder divalenten
Alkalisalz gewählt
aus der Gruppe bestehend aus NaCl, KCl, LiCl, CaCl2,
MgCl2 und ZnCl2.
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In einer weiteren Ausführungsform
wird ein Verfahren zur gleichzeitigen Zählung für Reticulozyten und eine vollständige Blutzellzählung bereitgestellt.
Während
ein Aliquot einer Vollblutprobe hinsichtlich einer CBC Bestimmung
analysiert wird, wird ein zweites Aliquot der Probe gemischt mit
dem wässerigen
Nukleinsäure-färbenden
Reagenz und die Reticulozytenkomponente der Probe wird wie oben
beschrieben analysiert.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1a ist
eine zweidimensionale FRCScan® Darstellung
(Cytogramm) von Vorwärts-Brechung ("FSC") vs. grüne Fluoreszenz-("FL1")-Signale einer klinischen
Probe mit 5,63 Reticulozyten.
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1b ist
ein FL1 Histogramm der gesperrten roten Blutzellen-("RBC")-Population aus
der 1a.
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1c ist
ein FACScan® Cytogramm
von FSC vs. FL1 Signale einer klinischen Probe mit 2,63 Reticulozyten
und erhöhter
weißer
Blutzell-("WBC")-Population.
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1d ist
ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC Population aus der 1c.
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2a und 2b sind graphische Darstellungen
der Ergebnisse einer Zeitstudie, die eine FACScan® Instrument
durchgeführt
wurden.
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3a ist
ein FACScan® Cytogramm
von FSC vs. FL1 Signale einer klinischen Probe mit erhöhter Reticulozyten.
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3b ist
ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC Populationen der Blutprobe
aus der 3a.
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4a ist
ein Abbott Laboratories Hematologieanalyzercytogramm einer Probe
von normalen Blut, das die vier Dekaden log Intermediate Winkel
Lichtbrechung ("IAS") gegen die vier
Dekaden log FL1 zeigt.
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4b ist
ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC Population und Reticulozytenpopulation
aus der 4a. Das 1-fache Vergrößerung des
Histogramms zeigt den RBC Spitzenwert und die 5-fache Vergrößerung des
Histogramms zeigt die Reticulozyten-Population.
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5a ist
ein Abbott Laboratories Hematologieanalyzercytogramm von IAS vs.
FL1 einer klinischen Blutprobe mit sehr niedrigen Reticulozyten
aber erhöhten
WBC.
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5b ist
ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC und Reticulozytenpopulation
aus 5a. Sowohl die 1-
und 5-fache Vergrößerung des
Histogramms sind gezeigt.
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6a ist
ein Abbott Laboratories Hematologieanalyzer- cytogramm von IAS vs.
FL1 einer anti-koagulierten klinischen Blutprobe mit erhöhten Reticulozyten
(20,5) und WBC (96,4 Tausend/Liter) Niveaus.
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6b is t
ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC und Reticulozytenpopulation
aus der 6a. Sowohl die
1- und 5-fache Vergrößerung des
Histogramms sind gezeigt.
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7 ist
eine graphische Darstellung des Vergleichs von Reticulozytenergebnissen.
die durch die Ausführung
des National Committee for Clinical Laboratory Standards ("NCCLS") Verfahrens gegenüber einem
automatisiertem Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt wurden.
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8 ist
eine graphische Darstellung, die einen Vergleich von linearer Regressionsdaten
für Reticulozytenergebnisse
zeigt, die erzielt wurden durch Ausführung eines Thiazol orange
Färbeverfahrens
gegenüber
einem automatisierten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
zum Nachweis von Reticulozyten. Die gleichen klinischen Proben die
in der 7 gezeigt sind,
wurden für
diese Analyse verwendet.
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9 ist
eine graphische Darstellung der Linearität der prozentualen Reticulozyten,
die durch Ausführung
eines automatisierten Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung
gemessen wurden.
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10 ist
ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum der an RNR
gebundenenen proprietären
Cyaninfarbstoffe, Sybr 11 (Molecular Probes, Eugene, OR) in Anwesenheit
und unter Fehlen von verschiedenen nicht ionischen Tensiden. Die
Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für dreieinhalb Monate aufbewart.
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11 ist
ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum des an RNA
gebundenen Cyanin-proprietären
Farbstoffs, Sybr 11, welches vier-monatige Stabilität unter
Kühlbedingungen
zeigt.
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12 ist
ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum des an RNA
gebundenen proprietären
Cyaninfarbstoffs, Sybr 11, welches eine Stabilität bei drei-wöchiger erhöhter Temperatur
zeigt.
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13 ist
ein Zeit-Studien-Emission-Spektrum des RNA gebundenen proprietären Cyaninfarbstoffs, Sybr
16 (Molecular Probes, Eugene, OR) in Bis-Tris Puffer mit und ohne
1,0% Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer ("Pluronic® F127") und bei Raumtemperatur
für sechseinhalb
Monate gelagert.
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14 ist
ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum des an RNA
gebundenen proprietären
Cyaninfarbstoffs, Sybr 11 in unterschiedlichen Puffern mit 0,2%
Pluronic® F127.
Alle Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für sechs Wochen gelagert.
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15a ist
ein FACScan® Cytometer
zweidimensionales Darstellung von FSC vs. FL1 Signale.
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15b ist
das FL1 Histogramm der gesperrten roten Blutzellpopulation aus der 15a.
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15c ist
eine Zeitstudie durchgeführt
an den FACScan® Flußcytometer
ausgedruckt als Reticulozyten % von 15 Sekunden bis 4,0 Minuten.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung umfassen Verfahren und stabile wässerige Reagenziensysteme zur
schnellen und genauen Analyse einer Blutprobe hinsichtlich der Reticulozyten
durch Verwendung von Fluß-cytometrischen
Verfahrensweisen. Im allgemeinen betreffen diese Ausführungsformen
die schnelle und gleichzeitige Analyse von Reticulozyten und vollständigen Blutzellzählungen
("CBC"), einschließlich von
nukleierten roten Blutzellen ("NRBC"). Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
die Anwendung eines analytischen Instrumentes und eines Verfahrens
zur Analyse von Blut umfassen. Im allgemeine umfasst ein solches
analytisches Instrument einen automatisierten Impedanz-Analyzer.
In einem solchen automatisierten Instrument wird ein automatisierter
Lichtbrechung-Analyzer integriert mit dem automatisierten Impedanz-Analyzer
und ein automatisierter Fluoreszenz-Analyzer wird integriert mit
dem automatisiertem Lichtbrechung-Analyzer.
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Zum Zwecke dieser Offenlegung wird
ein automatisierter Analyzer unterschieden insofern, dass ein Bediener
nicht bei der Analyse der Probe eingreifen muss, das bedeutet, dass
nach dem der Bediener die Probe in den automatisierten Analyzer
einführt,
keine weitere Intervention des Bedieners erforderlich ist. Zusätzlich quantifiziert
und klassifiziert ein hematologischer Analyzer die Zellen in im
wesentlichen absoluten Ausdrücken.
Ein solcher Analyzer verwendet mindestens die elektrischen Impedanz
und die optischen Lichtbrechungseigenschaften der Zellen (oder beides),
um die Zellen hinsichtlich ihrer Größe und Form zu Klassifizieren.
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Implementationen der Erfindung können im
allgemeinen einen automatisierten hematologischen Analyzer mit einer
Steuerung verwenden, welcher die verschiedenen Analysatoren überwacht
und steuert, Daten aus den Analysatoren sammelt und ein Ergebnis
berichtet. Beispielhaft dargestellt, erlaubt die Integration des Analyzers
mit einer Steuerung einem Bediener, Daten über eine Vollblutprobe in die
Steuerung einzugeben. Der Bediener wählt mit Hilfe der Steuerung
eine Serie von Tests aus, die an der Vollblutprobe durchgeführt werden
sollen. Der Bediener stellt die Vollblutprobe den integrierten Analysatoren
in einer zentralisierten Probenverarbeitungsfläche bereit. Die Steuerung aktiviert
die Analysatoren, was den Analysatoren gestattet automatisch die
Analysen an der Vollblutprobe durchzuführen unter Anleitung der Steuerung.
Die Steuerung verwendet Daten, die aus den Analysatoren erzielt
werden, um ein Ergebnis zu formulieren. Die Steuerung liefert das
Ergebnis an den Bediener. Es sollte ebenfalls festgehalten werden,
dass keine Bedienerhandlung notwendig ist, nach dem die Vollblutprobe
den integrierten Analysatoren bereitgestellt wurde. Da die Vollblutprobenherstellung
vollständig
automatisiert ist, werden in einer bevorzugte Ausführungsform
herkömmliche
Hematologietests zunächst
durchgeführt,
worauf die inkubierten Probentests folgen. Da die Analysatoren mit
der Steuerung integriert sind, erzielt die Steuerung Daten sowohl
aus dem Hematologie-Analyzer und aus dem Flußcytometrie-Analyzer. Somit
ist die Steuerung in der Lage, eine kombinierte Patientenblutanalyse
an den Bediener zu liefern Während
spezifischer Ausführungsformen
der Erfindung im Detail beschrieben werden, um dieses Verständnis zu
vereinfachen soll festgestellt werden, dass andere Ausführungsformen
ebenfalls möglich
sind. Jegliche gewünschte
Kombination von Elementen der beschriebenen Ausführungsformen ist ebenfalls
möglich.
In einem Aspekt der Erfindung wird eine stabile wässerige
Reagenz-Zusammensetzung bereitgestellt. Dieses Reagenz umfasst folgendes:
einen asymmetrischen Cyaninfarbstoff, mit der Fähigkeit Reticulozyten zu färben, von
etwa 20 mM bis etwa 50 mM eines Puffers gewählt aus der Gruppe bestehend
aus Imidazolpuffer, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-perperazinethan-sulfonsäure ("Hepes") Puffer, Bis (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethan-sulfonsäure ("Bis-Tris") Puffer und Tris
Hydroxymethyl Amionmethan ("Tris") Puffer; ein pH
von etwa 6,0 bis etwa 8,0; eine Osmolarität eingestellt auf etwa 230
bis etwa 340 mOsm/L mit einem mono- oder divalenten Alkalisalz, und ein
nicht ionisches Tensid (von etwa 5 mg/dl bis etwa 1,0 g/dl abhängig von
dem Tensid), welches die Membrandurchdringung vereinfacht und den
Cyaninfarbstoff in einer wässerigen
isotonischen Lösung
stabilisiert. Vorzugsweise sind die Farbstoffe substituiert und
zeigen verstärkte
Fluoreszenz unter Bindung mit DNA oder RNA. Noch stärker bevorzugt
umfasst das Reagenz von etwa 0,1 μg/ml
bis etwa 0,3 μg/ml eines
zyklisch substituierten asymmetrischen Cyaninfarbstoffes.
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Ein weiterer Aspekt bringt mit sich
Verfahren für
den raschen und kontinuierlichen Nachweis zur Zählung von Reticulozyten und
CBC Differenzialen, unter Verwendung des vorliegenden erfinderischen
Reagenziensystems. Solche Verfahren sind einzigartig aufgrund der
besonderen Abwesenheit des Bedürfnisses
einen getrennten Inkubationsschritt bereitzustellen. Die minimale
erforderliche Inkubationszeit von etwa 10 bis 60 Sekunden ist alles
was notwendig ist.
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Eine solche Ausführungsform ist ein Verfahren
zur Zählung
von Reticulozyten aus einer Vollblutprobe während gleichzeitig ein getrenntes
Aliquot der Probe differenziert wird, um eine vollständige Blutzell
("CBC") Analyse zu erhalten.
Dieses Verfahren umfasst das Leiten einer oder mehrerer Aliquote
der Probe in verschiedenen Positionen innerhalb eines automatischen
Analyzers zur Analyse und Differenzierung, während ein Reticulozyten-Aliquot der Probe
mit einem färbenden
Reagenz kombiniert wird. Dieses Reagenz umfasst eine Reticulozyten
färbende
Menge eines asymmetrischen Cyaninfarbstoffes, von etwa 20 mM bis
etwa 60 mM einer Pufferlösung,
gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris
Puffer und eine Farbstoffstabilisierende Menge eines anionischen
Tensids gewählt
aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glukon-amidopropyl]cholamid,
n-Dodecyl-D-Maltosid,
einem Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer, n-Tetradecyl-D-Maltosid,
Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid
worin das Reagenz einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0 hat und eine
Osmolarität eingestellt
auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem mono- oder divalenten
Alkalisalz, welches nicht mit dem Cyaninfarbstoff interagiert oder
in der wässerigen
Reagenzlösung
ausfällt
wie zum Beispiel NaCl, KCl, LiCl, CaCl2,
MgCl2 und ZnCl2.
Das kombinierte Reagenzien/Reticulozytenaliquot wird dann in eine
optische Sendezone eines automatischen Analysators geleitet. Danach
wird das Reagenzien/Reticulozytenaliquot durch eine beleuchtete
Sendezone hindurchgeleitet, im wesentlichen eine Zelle zu einem
Zeitpunkt, um Fluoreszenz und Lichtbrechungsereignisse zu bewirken.
Diese Ereignisse werden detektiert und die Anzahl von Reticulozyten,
die in der Probe vorhanden sind, wird daraus bestimmt.
-
Die asymmetrischen Farbstoffe, welche
anwendbar sind mit dem Reagenziensystem gemäß der vorliegenden Erfindung
haben im allgemeinen die folgenden Charakteristika:
- 1. Absorptionsmaximum: 488 + 20 nm
- 2. Hohe Nukleinsäurebindungsaffinität
- 3. Hohe Kontenertrag: ≥0,1
- 4. Einen molaren Extinktionscoeffizienten: ≥10,000
- 5. Fluoreszenzverstärkung
nach Bindung von RNA oder DNA: ≥20
- 6. Membran Permeationsgeschwindigkeit: <2 Minuten
-
Üblicherweise
sind die Farbstoffe, die bei diesem erfinderischen wässerigen
Reagenz verwendet werden, und Reticulozytenzählungsverfahren hoch instabil
in wässerigen
Umgebungen. Die Stabilitätsdaten
für verschiedene
in dieser Klasse getestete Farbstoffe sind in den 10 bis 14 gezeigt.
-
Eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung umfasst von etwa 0,05 μg/ml
bis etwa 0,5 μg/ml Sybr
11, ein proprietärer
Farbstoff, vertrieben durch Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR),
von etwa 20 mM bis etwa 50 mM Imidazolpuffer und von etwa 5 mg/dl
bis etwa 20 mg/dl N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholamid ("BIGCHAP"), von etwa 0,02
bis etwa 0,055% Proclin® 300
(5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on
+ 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on).
Der pH wird eingestellt auf von etwa 6,8 bis etwa 7,2 mit 1 N HCl
und die Osmolarität eingestellt
mit NaCl von etwa 270 bis etwa 310 mOsm/l.
-
Ein Hauptinhaltsstoff des Reagenziensystems
ist der Farbstoff. Eine solche Klasse von Farbstoffen sind asymmetrische
Cyaninfarbstoffe wie jene beschrieben in WO94/24213, "ZYKLISCH -ASYMMETRISCHE FARBSTOFFE". Zusätzlich zeigen
die in dieser Erfindung verwendeten Farbstoffe verstärkte Fluoreszenz
bei Bindung an DNA oder DNA. Solche nützlichen Farbstoffe müssen ebenfalls
eine hohe Bindungsaffinität
an RNA und DNA haben und einen hohen Quantumertrag. Es wird vorausgesetzt,
dass eine Mehrzahl von asymmetrischen Cyaninfarbstoffen, welche
die Charakteristika, die hierin beschrieben und beansprucht sind,
zeigen, verwendet werden können.
Einige der Beispiele für
solche Farbstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf
Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16, ebenfalls erhalten von Molecular Probes,
Inc. (Eugene, OR) ("MPI"). Weitere asymmetrische
Cyaninfarbstoffe wie zum Beispiel Syto 12, ebenfalls von MPI, sind
ebenfalls nützlich bei
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung. Syto 12 soll ein neutraler asymmetrischer
Cyaninfarbstoff sein, welcher ein substituiertes Benzazoliumringsystem
umfasst, angeheftet an eine Methinbrücke an ein Pyridin- oder Chinolinringsystem.
-
Ein weiterer Inhaltsstoff des Reagenziensystems
ist ein Puffer, dessen pKa von etwa 6,0 bis etwa 8,0 ist, und welcher
fähig ist,
die erforderliche (zur Färbung
von RNA oder DNA) Konzentration des Cyaninfarbstoffes in einer wässerigen
Lösung
zu halten über
einen verlängerten
Zeitraum. Solche Puffer sollten nicht mit den Cyaninfarbstoffen
oder den nicht ionischen verwendeten Tensiden bei der Ausführung dieser
Erfindung reagieren, um den Farbstoff zu stabilisieren. Beispielhafte
Puffer umfassen Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris.
-
Ein weiterer Inhaltsstoff des Reagenziensystems
ist ein nicht ionisches Tensid. Abhängig von dem Tensid oder der
Kombination von nicht ionischen Tensiden, welche verwendet werden,
sollte die Konzentration von etwa 5 mg/dl bis etwa 1 g/dl sein.
Das oder die Tensid e) scheinen die Geschwindigkeit der Cyaninfarbstoffpermeation
durch die Zellmembran (innerhalb 30 Sekunden) zu verstärken. Zusätzlich werden
die Löslichkeit
und die Stabilität
des Cyaninfarbstoffes in einer isotonischen wässerigen Lösung durch das Tensid verstärkt. Ein
solches Tensid oder solche Tenside sollten jedoch nicht den Cyaninfarbstoff
ausfällen
oder mit ihrem Reagieren oder rote Blutzellen lysieren, und zwar
selbst bei den niedrigen Konzentrationen. Beispiele solcher Tenside
sind, sind jedoch nicht beschränkt
auf, BIGCHAP, n-Dodecyl-D-Maltosid, Polyoxypropylen-polyoxyethylen
Blockcopolymer ("Pluronic® F127"), n-Tetradecyl-D-Maltosid,
Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid.
-
Ein weiterer Inhaltsstoff des Reagenziensystems
ist ein mono- oder divalentes Alkalisalz, um die Osmolarität der Reagenzie
von etwa 230 mOsm/l bis etwa 340 mOsm/l einzustellen, um die Lyse
von roten Blutzellen, einschließlich
der Reticulozyten oder der weißen
Zellen zu verhindern. Solche Salz sollten nicht mit einem der Cyaninfarbstoffe
reagieren oder in Lösung
ausfallen. Beispiele für
solche Salze umfassen NaCl, KCl, LiCl, CaCl2,
MgCl2, ZnCl2 und
weitere.
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Ein fakultativer Inhaltsstoff ist
ein Konservierungsstoff, um mikrobielles Wachstum in des Reagenz
zu verhindern. Ein solcher Konservierungsstoff sollte die Lichbrechung
oder Fluor reszenzaussendungseigenschaften der Zellen oder gefärbten Zellen
nicht verändern.
Beispiele solcher Konservierungsstoffe umfassen Proclin® 300, Proclin® 150, Natriumazid
und andere.
-
Unter Verwendung des oben beschriebenen
Reagenziensystems ist die schnelle Analyse von Reticulozyten in
einem Flußcytometer
oder anderen automatisierten hematologischen Analysatoren möglich. In
einer Ausführungsform
werden 5 μl
einer Vollblutprobe gemischt mit 1,0 ml des Reagenziensystems, welches
hierin offenbart und beansprucht ist und die Probenreagenzmischung
wird durch ein kommerziell verfügbares
Flußcytometer
innerhalb 30 bis 60 Sekunden von Mischen hindurchgeleitet und mit
so wenig wie (10) zehn Sekunden. Die 1a bis 1d zeigen die Ergebnisse
eines solchen Verfahrens unter Verwendung einer Vollblutprobe hergestellt
wie beschrieben in Beispiel 1. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung gestattet die schnelle und quantitative Analyse von Reticulozyten
in einem automatisierten Multi-Parameter-Hematologie-Analyzer. Die
U.S. Patentanmeldung Seriennr. 08/283,379, betitelt "VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR
DURCHFÜHRUNG
EINER AUTOMATISCHEN ANALYSE",
eingereicht am 1. August 1994, legt einen automatisierten hematologischen
Analyzer offen, welcher unter anderen den axialen Lichtverlust eines
Lichtbrechungssignals ("ALL") und intermediäre Winkel-Lichtbrechung
("IAS") verwendet, sowie
die Detektion verschiedener fluoreszierender Signale, um dem Instrument
zu gestatten, automatisch zwischen Zellen und Subklassen von Zellen
aus einer Vollblutprobe zu differenzieren.
-
Insgesamt wird jedoch ein Verfahren
zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung das Mischen einer Vollblutprobe mit einem
Reagenz zur Färbung
der DNA jeglicher vorhandener Reticulozyten umfassen, das Hindurchleiten
der Mischung, im wesentlichen mit einer Zelle zu einem Zeitpunkt,
durch eine beleuchtete optische Flußzelle, die Detektion des gebrochenen
Lichts und der daraus ausgesendeten Fluoreszenz und die Bestimmung
der Menge von Reticulozyten, die in der Probe vorhanden sind, und
zwar ohne das Unterwerfen der Proben/Reagenzmischung einem getrennten
Inkubationsschritt oder Zeitraum. Eine Reagenzie gemäß dieser
Erfindung umfasst von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 0,3 μg/ml eines,
asymmetrischen Cyaninfarbstoffs; von etwa 20 mM bis etwa 60 mM eines
Puffers gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris, und Tris
Puffer; von etwa 5 mg/dl bis etwa 1, 0 g/dl eines nicht ionischen
Tensids, abhängig
von dem Tensid oder der Kombination von Tensiden, und das Reagenz
hat einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0; und eine Osmolarität eingestellt
bis etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem mono- oder divalenten
Alkalisalz.
-
Um eine Vollblutprobe hinsichtlich
des Prozentsatzes sowie auch den Absolutzahlen von Reticulozyten
auf dem oben beschriebenen Multi-Parameter-Hematologie-Analyzer
zu analysieren, werden etwa 18,75 μl einer Vollblutprobe über eine
Probenaspirationssonde in eine RBC Schale abgelegt, welche etwa
7856 μl einer
Verdünner/Abtrennlösung (eine
isotonische Kochsalzlösung)
enthält
und die Flüssigkeiten
werden gemischt. Die verdünnte
Probe wird dann zu einer abgetrennten Impedanzöffnung transportiert, um elektronisch die
absoluten RBC Zählungen
der Probe zu bestimmten (siehe Details der Instrumentenkalibration
zur RBC Analyse in U.S. Patent Applikationsseriennr. 08/283,379,
betitelt "VERFAHREN
UND VORRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG
VON AUTOMATISIERTEN ANALYSEN",
eingereicht am 1. August 1994. In der Zwischenzeit werden etwa 200 μl der verdünnten Probe
in einen anderen Behälter
("Reticulozyten
empfangende Schale") überführt, welcher
600 μl des
Reagenz der vorliegenden Erfindung enthält, wo sie gemischt wird. Die
vorbereitete (gemischte) Probe wird dann zu der abgetrennten optischen
Flußzelle
zum Nachweis transportiert. Der Messprozess beginnt sobald der Zellstrom
durch die Flußzelle
hindurch tritt, im wesentlichen eine Zelle zu einem Zeitpunkt, in
einem laminaren fließenden
Probenstrom umflossen durch ein Verdünner/Abtrennlösung. Das
Volumen wird bestrahlt mit einem Lichtstrahl und wird in den zwei
Dimensionen begrenzt, die in normaler Ausrichtung zu der Flußachse stehen,
durch den hydrodynamisch gebündelten
Zellstrom, und in der Dimension, die parallel zu der Flußachse steht,
durch den vertikalen Strahlengürtel
des Laserstrahls, welcher etwa 17 Mikron beträgt. Bei Durchführung dieses
Testes ist die Probenflußrate
etwa 2,0 μl
pro Sekunde und das entsprechende beleuchtete Fühlvolumen des RBC und Reticulozytenprobenstroms
entspricht ungefähr
einen elliptischen Zylinder mit den Dimensionen von etwa 80 × 5 × 17 Mikron.
Die 17 Mikron-Dimension wird gemessen entlang der Achse des Zylinders.
-
Zu diesem Punkt, und wie gezeigt
in den zweidimensionalen Eigenschaftenabstand von IAS und FL1 in
dem Cytogramm aus der 4a wird
das Vorhandensein einer Zelle bestimmt durch eine intermediäre Winkelbrechungsphotodiode,
welche Licht in einem 3° bis
10° Konus
detektiert und eine photomultiplier Röhre ("PMT"),
welche grüne
Fluoreszenz detektiert, FL1. Wenn Zellen durch das zuvor erwähnte beleuchtete
Volumen hindurchtreten, werden Pulse erzeugt und durch diese Detektoren
gemessen. Die Amplituden der Pulse werden dann gefiltert, verstärkt, digitalisiert
und in Listen-Modus in den entsprechenden zweidimensionalen Eigenschaftenraum
von ihrer IAS und FL1 gespeichert. Die Zellen werden 8 Sekunden
lang gezählt.
Bei der Flußrate
und dem Verdünnungsverhältnis, das
oben beschrieben ist, und mit einem normalen menschlichen RBC Zählung von
5 Millionen pro Mikroliter von Blutvolumen, wäre die entstehende Ereigniszählrate 5950
pro Sekunde. Die Algorithmen werden dann auf den Listen-Modusdaten
des zuvor erwähnten
Eigenschaftenraums von IAS und FL1 verwendet und die folgenden Parameter
werden innerhalb von 20 Sekunden Berechnungszeit gemessen:
- 1. RBC Filter: weiße Blutzellen (WCB) und Trombozyten
werden ausgeschlossen durch das Abtrennen der RBC Population, einschließlich Reticulozyten,
jedoch unter Ausschluss von WBC und Trombozyten.
- 2. Der Prozentsatz von Reticulozyten: Die abgetrennten RBC Population
wird erneut analysiert gemäß der Größe ihrer
FL1 Signale. Eine lange Anpassung wird angewendet auf das FL1 Histogramm,
um den Bereich zu definieren, welcher zu reifen RBC gehört und die
Zellen deren FL1 Signale oberhalb des Bereiches liegen, werden als
Reticulozyten bezeichnet. Reticulozytenprozent wird berechnet durch
das Teilen der Zählung
von Reticulozyten durch die gesamte RBC Zählung.
- 3. Die absolute Reticulozytenzählung: Erzielt durch die Multiplikation
des Prozentsatzes von Reticulozyten mit der, absoluten RBC Zählungen
der Probe aus den CBC Modus.
- 4. Reticulozyten Reifungsindex ("RMI"):
RMI wird ausgedrückt
als der Prozentsatz von Reticulozyten deren FL1 Signale mehr als
eine (1) Standardabweichung ("S.
D.") oberhalb der
mittleren Fluoreszenz einer normal Reticulozytenpopulation liegt.
-
Eine solche Beschreibung ist rein
zur Bequemlichkeit und keinesfalls ist der Ausdruck des RMIs gemäß der vorliegenden
Erfindung beschränkt
auf die hierin beschriebenen Algorithmen.
-
Die folgenden Beispiele zeigen die
Ergebniszusammensetzungen und Verfahren, die die gleichen verwenden
für die
schnelle Analyse von Reticulozyten und der Verwendung von Lichtbrechungs- und Fluoreszenzfluß cytometrischen
Techniken. Es soll verstanden werden, dass die folgenden Beispiel
rein für
darstellende Zwecke dienen und nicht den Schutzumfang dieser Erfindung
in irgendeiner Art und Weise einschränken sollen.
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Beispiel 1
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Fünf
(5) Mikroliter einer chemischen Probe wurden gemischt mit 1,0 ml
des Reagenz, das 50 mM Imidazolspuffer, pH eingestellt mit 1 N HCl
auf 8, 0 + 0, 1, 6, 4 g/l NaCl, 0, 1 Mikrogramm pro ml von Sybr
14 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), 0,2% Pluronic® F127 und
0,03% Proclin® 300
umfasste. Die Proben/Reagenzmischung wird dann innerhalb von 30–60 Sekunden
durch ein FACScan® Flußcytometer
(Becton Dickinson & Co.)
hindurchgeleitet, um die Geschwindigkeit der Membran-Permeation
durch den Farbstoff in der Reagenz-Zusammensetzung zu bestimmen. 1a ist eine zweidimensionale
Darstellung der Vorwärtsstreuung
(FSC) vs. grüne
Fluoreszenz (FL1) Signale; 1b ist das FL1 Histogramm der begrenzten
roten Zellenpopulation, was die gefärbte Reticulozytenpopulation
rechts von der reifen Blutzellpopulation offenlegt. 1c und 1d zeigen
die Ergebnisse einer zweiten klinischen Probe dargestellt in einer ähnlichen
Art und Weise wie die 1a bzw. 1b.
-
Beispiel 2
-
2a ist
eine Zeitstudie die an den FACScan® Flußzytometer durchgeführt wurde
ausgedrückt
als Reticulozyten % über
einen verlängerten
Zeitraum (von 30 Sekunden bis 30 Minuten) und 2b ist ausgedruckt als
die Reticulozyten mittlerer FL1. Wie aus den Figuren ersichtlich
erreicht der Prozentsatz der Reticulozyten einen stabilen Zustand
innerhalb 30 Sekunden und die Färbungsintensität erreicht
etwa 80% des Spitzenwertes innerhalb von 30 Sekunden. Eine solche
schnelle Färbung
durch die Mittel der vorliegenden Erfindung erlaubt das Einbringen
des Verfahrens und des Reagenz, das hierin offenbart sind, in automatisierte
hematologische Anahyzer, so wie auch Flußcytometer, ohne das Bedürfnis für getrennte
Inkubationsausrüstung
oder Verfahren.
-
Beispiel 3
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Fünf
(5) Mikroliter einer klinischen Probe mit etwa 15% Reticulozyten
wurden gemischt mit 1,0 ml der Reagenzie gemäß der vorliegenden Erfindung
bestehend aus 50 mM Imidazolpuffer, pH eingestellt mit 1 N HCl auf
7,0 + 0,1, 6,4 g/l NaCl, 0,2 Mikrogramm/ml Sybr 11 (Molecular Probes,
Inc., Eugene, OR), 0,2% Pluronic® F127
und 0,03 Proclin® 300.
Die Probe/Reagenzmischungen wurden dann auf einen FACScan® Flußcytometer
innerhalb 30 Sekunden durchgeführt,
um den Prozentsatz der Reticulozyten in den Proben zu bestimmen. 3a ist eine zweidimensionale
Darstellung der FSC gegen die FL1 Signale und 3b ist das FL1 Histogramm der begrenzten
roten Blutzellpopulation. Wie die Daten zeigen, sind weiße Blutzellen
und Trombozyten gut getrennt von den roten Blutzellen und der Reticulozytenpopulation,
die FL1 Intensität
der gefärbten
Reticulozyten ist so, dass die Definition des Bereiches der Reticulozyten
in dem FL1 Histogramm der roten Blutzellen leicht ist für die quantitative
Analyse der Reticulozytenkonzentration in einer Blutprobe.
-
Beispiel 4
-
Für
dieses Beispiel wurde ein automatisierter hematologischer Multi-Paratmeter-Analyzer
mit hohem Durchsatz (US Patentanmeldungsseriennr. 08/283,379, betitelt
als "VERFAHREN UND
VORRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG
VON AUTOMATISIERTER ANALYSE",
eingereicht am 1. August 1994) verwendet. 18,75 μl einer EDTA-antikoagulierten
Vollblutprobe von einem normalen Menschen wurden mittels einer Probenaspirationssonde
in die RBC-Schale abgeführt,
der etwa 7856 μl
einer Verdünner/Abtrennlösung enthielt
(eine isotonische Phosphatpufferkochsalzlösung) und gemischt. Die verdünnte Probe
wurde dann zu einer abgetrennten Impedanzöffnung transportiert, um die
absolute rote Blutzellzählung
der Probe zu bestimmen. Gleichzeitig wurden etwa 200 Mikroliter
der verdünnten
Vollblutprobe in die Reticulozyten-Schale übergeleitet, die 600 Mikroliter
des Reagenz der vorliegenden Er- findung enthielt. Dieses Reagenz
bestand aus 50 mM Imidazolpuffer, pH eingestellt mit 1 N HCl auf
7,0 + 0,1, 6,4 g/l NaCl, 0,2 μg/ml
Sybr 11, 10 mg pro ml BIGCHAP, 0,03% Proclin® 300. Die Proben/Reagenzmischung
wurde dann zu der abgetrennten optischen Flußzelle zur Lichtbrechung und
Fluoreszenzbestimmung transportiert. Der Nachweisprozess des Systems
wurde zuvor oben beschrieben und der gesamte Inhalt des U.S. Patent
Seriennr. 08/283,379, benannt "VERFAHREN
UND VORRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG
AUTOMATISIERTER ANALYSE" und
eingereicht am 1. August 1994. Die Übertragungszeit für den Transport
der Probe/Reagenzmischung kann so gering sein, wie zehn (10) Sekunden.
Die RBC Population einschließlich
Reticulozyten wird beschränkt
auf den IAS vs. FL1 Cytogramm (4a)
und das FL1 Histogramm der beschränkten RBC Population (4b) wird für Reticulozytenzählungen
und RMI Messungen verwendet. Die 1 × Darstellung des FL1 Histogramm
wird so bemessen, um den Spitzenwert der RBC Population zu zeigen
und die 5 × Darstellung
zeigt die Reticulozytenpopulation. Diese Ergebnisse zeigen, dass
es möglich
ist, eine Probe hinsichtlich der Reticulozyten zu analysieren, während gleichzeitig
eine CBC Analyse bestimmt wird, und ohne das Bedürfnis für zusätzliche Inkubationsausrüstung oder Verfahren,
oder off-line Vorbereitungsschritte.
-
Beispiel 5
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Eine klinische Probe mit einer geringen
Konzentration von Reticulozyten und erhöhten weißen Blutzellen (WBC) – wie durch
Referenzverfahren bestimmt – wird
mittels einer Aspirationsonde in die RBC-Schale des Instrumentes
abgelagert, das in US Patentanmeldungsseriennr. 08/283,379 baschreiben
wurde, die etwa 7856 μl
einer Verdünner/Abtrennlösung (einer
isotonischen Kochsalzlösung)
enthält,
und wird gemischt. Die verdünnte
Probe wird dann zu der abgetrennten Impedanzöffnung transportiert, um die
absoluten RBC Zählungen
der Probe zu bestimmen. In der Zwischenzeit werden etwa 200 Mikroliter
der verdünnten
Probe in die Reticulozyten-Schale transportiert, welche 600 Mikroliter
des Reagenz der vorliegenden Erfindung enthält, bestehend aus 50 mM Imidazolpuffer,
pH eingestellt mit 1 N HCl auf 7,0 + 0,1, 6;4 g/l NaCl, 0,2 Mikrogramm
pro 1,0 ml Sybr 11, 0,2% Pluronic® F127
und 2,5 mg/dl n-Dodecyl-D-Maltosid, 0,03% Proclin® 300 und
gemischt.
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Die Proben/Reagenzmischung wurde
dann zu der abgetrennten opti schen Flußzelle 100 zum Nachweis transportiert.
Der Nachweisprozess des Systems wurde bereits umbeschrieben. Die
RBC Population einschließlich
der Reticulozyten wird begrenzt an dem IAS vs. FL1 Cytogramm (5a) und das FL1 Histogramm der
begrenzten RBC Population (5b)
wird verwendet für
Reticulozytenzählungen
und RMI Messungen (retikulare Zählungen
waren zu niedrig, um einen RMI für
diese Probe zu berechnen). Die 5b FL1
Histogramme werden so vergrößert, um
sowohl den RBC Populationsspitzenwert (1-fache Darstellung) und
die Reticulozytenpopulation (5-fache Darstellung) zu zeigen. Keine
nachweisbare Reticulozytenpopulation ist in dieser Probe nachweisbar.
-
Beispiel 6
-
Für
dieses Beispiel wurde eine klinische Probe mit erhöhten Reticulozyten
(20% wie in einem Referenzverfahren bestimmt) und erhöhten WBC
(96 k/l) verwendet. Die Probe wurde verarbeitet wie in Beispiel
4 beschrieben. Die Ergebnisse sind in den 6a und 6b gezeigt.
Wie die Daten zeigen, schließt
die vorliegende Erfindung genau WBC und Trombozyten aus und ist
in der Lage sowohl abgedunkelte wie helle Reticulozyten zu identifizieren
und zu zählen.
Das System erzeugte einen erhöhten
RMI Wert von 69,2% an dieser Probe unter Verwendung des oben beschriebenen
Algorithmus.
-
Beispiel 7
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Siebenundsiebzig (77) klinische Proben
wurden mit einem Multi-Paratmeter-Hematologie-Analyzer mit hohem
Durchsatz wie in Beispiel 4 beschrieben untersucht, und ebenfalls
mit einem FACScan® Flußcytometer
wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht, allerdings unter Verwendung
eines Thiazol orange (TO) Verfahrens, welches eine 30 minütige Inkubation
bei Raumtemperatur erfordert (U.S. Patent 4,883,867). Das NCCLS
Referenzverfahren (siehe Stand der Technik Abschnitt für Details)
wurde ebenfalls an jeder Probe durchgeführt. Dann wurden die Ergebnisse
der vorliegenden, inkubationsfreien, erfinderischen Verfahrens verglichen
mit jenen der TO und NCCLS Ergebnisse. Die linearen Regressionsplots
sind dargestellt in den 7 und 8. Wie die Daten zeigen,
korrelieren die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung gut sowohl
mit dem NCCLS mikroskopischen Verfahren (R = 0,982, Gefälle = 1,05,
Y-Treffpunkt = 0,002) und dem TO Verfahren (R = 0,986, Gefälle = 0,964,
Y-Treffpunkt = 0,005).
-
Beispiel 8
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Zwei EDTA-anti-koagulierte Hasenblutproben
wurden erzielt, eine von einem normalen Hasen (Probe Nr. 1) und
eine andere von einem Hasen mit Reticulozytose (Probe Nr. 2). Probe
Nr. 1 enthielt 1,9% Reticulozyten und Probe Nr. 2 enthielt über 90%
Reticulozyten. Die Linearitätsproben
wurden hergestellt gemäß dem folgenden
Protokoll:
- 1. RBC Konzentration beider Proben
wurde eingestellt auf 3,5 + 0,05 M/L.
- 2. Sechs (6) Niveaus von Linearitätsproben wurden hergestellt
durch Mischung der beiden Proben wie in der Tabelle unterhalb gezeigt:
- 3. Die Proben wurden mit dem Hematologieanalyzer der U.S. Patentanmeldungsseriennr.
08/283,379 analysiert.
- 4. Die theoretischen Werte für
Reticulozyten % und absolute Zählung
pro μl wurden
berechnet gemäß der folgenden
Gleichung:
Theoretische visuelle % der Probe = [(n/1,5) × A%] +
[(m/1,5) × B%] × 100 worin:
n
= Volumen der Probe 1 in der Linearitätsprobe
m = Volumen der
Probe 2 in der Linearitätsprobe
1,5
= Gesamtvolumen der Linearitätsprobe
A%
= optische % in der unteren Probe Nr. 1
B% = optische % in
der unteren Probe Nr. 2
Theoretische optische absolut Zahl
= [(n × A#)
+ (m × B#)]/1,5 × theoretische
optische % der Probe, worin:
n = Volumen von Probe 1 in der
Linearitätsprobe
m
= Volumen von Probe 2 in der Linearitätsprobe
1,5 = Gesamtvolumen
der Linearitätsprobe
A#
= optische # in der unteren Probe Nr. 1
B# = optische # in
der unteren Probe Nr. 2
- 5. Die Linearitätskurve
wurde dargestellt unter Verwendung der Abszisse der theoretischen
Werte und die Ordinate für
die Werte erzielt aus den Multi-Paratmeter-Hematologie-Instrument.
-
Die Ergebnisse sind in der 9 dargestellt. Die Daten
zeigen, liefern das Verfahren und die Reagenzien der vorliegenden
Erfindung eine lineare Antwort bis zu einer Reticulozytenkonzentration
von 90%.
-
Beispiel 9
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Die Stabilität verschiedener Reagenzien
hergestellt der vorliegenden Erfindung bei denen verschiedene Tenside
beurteilt wurden, sind in den 10–14 gezeigt. Dies wird erzielt
durch den Zusatz von RNA zu den Reagenzien und das Untersuchen der
Emission-Spektren der Cyaninnukleinsäuren, die an RNA gebunden sind,
mit einem HITACHI F4500® Instrument
(Anregung 488 nm) gemäß dem folgenden
Protokoll:
- 1. RNA (Kalbsleber RNA, Sigma Cat.
Nr. R7251) Lösungen
(1 mg/ml) wurden in entionisiertem Wasser hergestellt.
- 2. 100 μl
von jeder RNA Lagerlösung
wurden zugesetzt zu 1,6 ml eines Testreagenz gemäß der vorliegenden Erfindung
und gemischt.
- 3. Das Emission-Spektrum der Cyaninnukleinsäurefärbung gebunden an RNA wurde
dann von 450 nm bis 650 nm mit einem HITACHI F4500® Instrument
(Anregung 488 nm) gescannt. Die volle Skala für RNA gebundenen Cyaninfarbstoff
wird auf 2,000 für
alle Testreagenzien eingestellt.
-
Beispiel 10
-
10 ist
das Emission-Spektrum des an RNA gebundenen Sybr 11 Farbstoffs (Molecular
Probes, Inc., Eugene, OR) in 50 mM Imidazolpuffer hergestellt wie
beschrieben in Beispiel 4, außer
dass 5 unterschiedliche Tenside beurteilt wurden hinsichtlich ihrer
Wirksamkeit bei der Stabilisierung des Cyaninfarbstoffes, Sybr 11
in einer wässerigen
Lösung.
Sämtlichen
Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für einen Zeitraum für 3,5 Monaten
gelagert. Ausgehend von dem höchsten
Spitzenwert:
- A = BIGCHAP (10 mg%);
- B = Maltosid (5 mg%);
- C = Pluronic® F127
(0,2%);
- D = Cholinsäure,
kein Salz (10 mg%);
- E = Zusatz eines Tensids;
- F = Octansäure,
kein Salz (10 mg%).
-
Wie die Daten zeigen, sind BIGCHAP,
Maltosid und Pluronic® F127
sehr wirksam bei der Erhaltung des Farbstoffes in einer wässerigen
gepufferten Lösung
während
Cholinsäure,
Natriumsalz und Octansäure, Natriumsalz
dies nicht waren. Tatsächlich
verkürzte
der Zusatz von Octansäure
zu der Reagenzie die Lagerzeit des Farbstoffes.
-
Beispiel 11
-
11 ist
das Emission-Spektrum des RNA gebundenen Cyaninfarbstoffes, Sybr
11, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, mit BIGCHAP oder
Pluronic® F127
Tensiden und gelagert bei 4°C
für 4 Monate. Ausgehend
von dem höchsten
Spitzenwert:
- A = frisch hergestellte Kontrollreagenzie;
- B = BIGCHAP (10 mg%);
- C = Pluronic® F127
(0,2%);
- D = Pluronic® F127
(1,0%);
- E = kein Tensid.
-
Wie in der Figur gezeigt, ist keine
signifikante Verschlechterung des Farbstoffes in der vorliegenden Erfindung
während
des 4-monatigen Testzeitraums.
-
Beispiel 12
-
12 ist
das Emission-Spektrum des RNA gebundenen Cyaninfarbstoffes, Sybr
11, welcher eine drei (3) wöchige
erhöhte
Temperaturstabilität
bei dem Reagenz der vorliegenden Erfindung mit 5 mg% BIGCHAP zeigt.
Die Testreagenzien wurden hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben
und ein RNA Zusatz wurde hergestellt gemäß dem Protokoll von Beispiel
9. Ausgehend von dem höchsten
Spitzenwert:
- A = 4°C;
- B = 25°C;
- C = 37°C;
- D = 45°C.
-
Wie die Daten zeigen, führt der
Zusatz des nicht ionischen Tensids BIGCHAP zu einer geeigneten wässerigen
gepufferten Lösung
zu einer verringerten Sensitivität
des Cyaninfarbstoffes gegenüber
erhöhten Temperaturen,
und macht diesen somit stabiler.
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Beispiel 13
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13 ist
das Emissionspektrum des RNA gebundenen Sybr 16 in Bis-Tris Puffer
mit und ohne 1,0% Pluronic® F127.
Die Reagenzien wurden hergestellt wie beschrieben in Beispiel 4,
außer
dass der Imidazolpuffer ersetzt wurde durch einen Bis-Tris Puffer
und Sybr 11 wurde ersetzt durch Sybr 16 Farbstoff (Molecular Probes,
Inc., Eugene, OR) und bei Raumtemperatur für 6,5 Monate gelagert.
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Ausgehend von dem höchsten Spitzenwert:
- A = Sybr 16 Reagenz mit 1,0% Pluronic® F127;
- B = Sybr 16 in Bis-Tris Puffer ohne ein Tensid;
- C = Sybr 16 in Imidazolpuffer ohne ein Tensid;
- D = Sybr 16 in Glycyl-Clycinpuffer mit 1,0% Pluronic® F127.
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Die Ergebnisse zeigen, dass die Stabilisierung
dieses Zellenfarbstoffes eine geeignete Kombination eines Puffers
und eines Tensids erfordert.
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Beispiel 14
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14 ist
das Emission-Spektrum des RNA gebundenen Sybr 11 Cyaninfarbstoffes
in verschiedenen Puffern, zusammen mit 0,2% Pluronic® F127. Sämtliche
Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für sechs Wochen gelagert.
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Ausgehend von dem höchsten Spitzenwert:
- A = Trispuffer;
- B = Bis-Tris Puffer;
- C = Imidazol;
- D = Hepespuffer;
- E = Glycyl-Glycinpuffer;
- F = Phosphatpuffer.
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Wie diese Daten zeigen, konservieren
Tris, Bis-Tris und Imidazolpuffer den Farbstoff gut, wogegen Glycyl-Glycin
und Phosphatpuffer dies nicht tun.
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Beispiel 15
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Fünf
(5) Mikroliter einer normalen Probe mit etwa 2,3% Reticulozyten
wurden gemischt mit 1,0 ml des Reagenz gemäß der vorliegenden Erfindung
bestehend aus 50 mM Trispuffer, pH eingestellt auf 1 N HCl auf 7,0
+ 0,1, Osmolarität
eingestellt auf 290 mOsm/l mit NaCl, 0,2 μg/ml Syto 12 (Molecular Probes,
Inc., Eugene, OR), 0,2% Pluronic® F127
und 0,03 Proclin® 300.
Die Proben/Reagenzmischung wurden auf einem FACScan® Flußcytometer
innerhalb von 15 Sekunden durchgeführt, um den Prozentsatz von
Reticulozyten in der Probe zu bestimmen. 15a zeigt das FACScan® Cytometer zweidimensionale
Display der FSC gegen FL1 Signale; und 15b zeigt das FL1 Histogramm der beschränkten roten
Blutzellenpopulation. 15c ist
eine Zeitstudie durchgeführt
auf den FACScan® Flußcytometer
ausgedrückt
als Reticulozytenprozent von 15 Sekunden bis 4,0 Minuten. Wie in
den Figuren ersichtlich, trennt das RBC + Reticulozytenfenster klar
die Reticulozyten von den Trombozyten und weißen Blutzellen und die Reticulozytenfärbung ist
so schnell, dass der Prozentreticulozyten das stabile Stadium innerhalb
von 15 Sekunden erreicht. Eine solche rasche Färbung erlaubt die Einbringung
des Nachweises in automatisierte hematologische Analyzer sowie auch
in Flußcytometer.