DE68914252T2

DE68914252T2 - Verfahren zur Bestimmung eines Antigens.

Info

Publication number: DE68914252T2
Application number: DE68914252T
Authority: DE
Inventors: Eiji Ishikawa
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1989-11-08
Publication date: 1994-08-04
Anticipated expiration: 2009-11-09
Also published as: EP0368273A2; EP0368273B1; CA2002470A1; EP0368273A3; DE68914252D1; US5236830A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Analyseverfahren für ein Antigen, insbesondere ein Analyseverfahren für ein Antigen, welches die Analyse von niedermolekularen Antigenen (einschließlich Haptenen) mit hoher Sensitivität erlaubt.
Die Analyse von Antigenen in Biokomponenten, insbesondere jenen in humanen Körperflüssigkeiten, ist sehr wichtig in klinischen Situationen. Sie wird in endokrinologischen Untersuchungen durch Hormonbestimmung, Krebsdiagnose, quantitative Bestimmung von Medikamenten und anderen Zwecken umfassend benutzt.
Mikrobestimmung von Antigen, wie vorstehend erwähnt, ist konventionell durch Immunoanalyseverfahren wie z. B. RIA, EIA und FIA erzielt worden.
Die Immunoanalyseverfahren können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden, eine die auf dem kompetitiven Verfahren beruht und die andere, die auf dem Sandwichverfahren beruht.
Die Immunoanalyse wurde zuerst als RIA, basierend auf dem kompetitiven Verfahren von Yallow et al, eingeführt. Das kompetitive Verfahren ist ein Analyseverfahren, das sich die Hemmung des Bindens des markierten Antigens an den Antikörper durch das zu analysierende Antigen zunutze macht. Wenn die Menge des markierten Antigens und des zugefügten Antikörpers wächst wird die Hemmung durch eine kleine Menge des zu analysierenden Antikörpers nicht mehr nachweisbar. Wenn die Menge des zugegebenen markierten Antigens und des Antikörpers verkleinert wird, verringert sich das Verhältnis von an den Antikörper gebundenem, markiertem Antigen und stellt so eine Begrenzung dar. Aus diesem Grunde beträgt die Nachweisgrenze normalerweise ungefähr 1 fmol (10&supmin;¹&sup5; mol).
Auf der anderen Seite ist das Sandwichverfahren ein Analyseverfahren, in dem das zu analysierende Antigen mit beiden, einem Antikörper beschichtetem Träger und einem markierten Antikörper, in einem Sandwich-Zustand gebunden wird. Da der überschüssige Anteil des markierten Antikörpers durch Waschen des Träger nach Verwenden von großen Mengen des trägergebundenen Antikörpers, der an das Antigen bindet, und des markierten Antikörpern entfernt werden kann, ist die Nachweisgrenze 100 bis 1000 mal höher als im kompetitiven Verfahren und erlaubt so die Analyse im amol-Bereich (10&supmin;¹&sup8; mol). Es ist seit kurzem üblich geworden, Proteinhormone, wie z. B. TSH und hCG, durch die als ELISA und IRMA bekannten Sandwichverfahren zu analysieren.
Analyseverfahren, die das vorstehende Sandwichverfahren verwenden, sind in der EP-A-0 236 606 und EP-A-0 303 229 (die letztere zitiert unter Art. 54(3) EPÜ) offenbart, im einzelnen umfassen diese Analyseverfahren die Schritte:
- Binden des Antigens an einen Träger mit Hilfe eines Antikörpers gegen das Antigen und dann Trennen des Trägers von der Testlösung,
- Dissoziieren des Antigen-Antikörperkomplexes von dem Träger, und
- Analysieren des Antigen-Antikörperkomplexes durch das Sandwichverfahren.
Es treten jedoch einige Begrenzungen im Sandwichverfahren bezüglich meßbarer Antigene auf. Insbesondere benötigen die Antigene, die durch das Sandwichverfahren analysiert werder sollen zusammen zumindest zwei epitope Stellen, an welchen das Antigen an die Antikörper binden kann, und niedermolekulare Antigene können durch das Sandwichverfahren nicht analysiert werden.
Selbst wenn das Antigen theoretisch durch das Sandwichverfahren meßbar ist, ist es in einigen Fällen schwierig, zwei Antikörper gegen die zwei epitopen Stellen zu erhalten und in anderen Fällen, selbst wenn zwei Antikörper gegen die zwei epitopen Stellen erhalten werden können, können hochtiter Antikörper nur für eine epitope Stelle erhalten werden, welches eine hochsensitive Analyse verhindert.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Analyseverfahren für ein Antigen mit hoher Sensitivität bereitzustellen, das auf den charakteristischen Merkmalen des Sandwichverfahrens beruht, unter Verwendung nur eines Antikörpers gegen eine einzelne epitope Stelle, insbesondere ein Verfahren, welches die Analyse von niedermolekularen Antigenen (Haptenen) wie z. B. Peptiden, Steroiden und Medikamenten, die niemals durch das konventionelle Sandwichverfahren analysiert worden sind, zu ermöglichen, mit einer Empfindlichkeit, die so hoch wie die des Sandwichverfahrens ist.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat gefunden, daß die Verwendung eines Antigens, das vorher mit einer funktionellen Gruppe oder Marker modifiziert wurde, es möglich macht, das Antigen in der Testlösung direkt, unter Verwendung eines Antikörpers gegen eine einzelne epitope Stelle, wie im konventionellen Sandwichverfahren zu analysieren, und daß sogar, wenn der Antikörper nur eine epitope Stelle aufweist, es möglich ist, das Antigen mit viel höherer Sensitivität als die des kompetitiven Verfahrens zu bestimmen, was in der Vollendung der Erfindung gipfelte.
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung ein Analyseverfahren für ein Antigen, umfassend die folgenden Verfahrensschritte (A), (B), (C) und (D):
(A): Binden des zu analysierenden Antigens in der Testlösung mit einer funktionellen Gruppe, die so ist, daß eine Substanz spezifisch mit dieser Gruppe binden kann, oder mit einem Marker, der als ein Marker in einem Immunoassay dienen kann, unter Ausbilden eines modifizierten Antigens;
(B): Binden des modifizierten Antigens mit Hilfe eines Antikörpers gegen das Antigen an einen Träger und dann Abtrennen des Trägers von der Testlösung;
(C): umfassend die folgenden Verfahrensschritte (a) oder (b): (a) Dissoziieren des modifizierten Antigens von dem Träger oder
(b) Dissoziieren des modifizierten Antigen-Antikörper- Komplexes, der das modifizierte Antigen und den Antikörper gegen das Antigen umfaßt, von dem Träger; und
(D): Analysieren des modifizierten Antigens oder des modifizierten Antigen-Antikörper-Komplexes des Verfahrensschrittes (C) durch das Sandwich-Verfahren oder durch Verwenden des Markers.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figuren 1, 2 und 4 zeigen die Standardkurven von Analysen für ein Antigen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen erhalten.
Fig. 3 zeigt die Standardkurve einer Analyse für ein Antigen durch das konventionelle Verfahren wie im Vergleichsbeispiel erhalten.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend in der Reihenfolge der Verfahrensanordnung beschrieben.

Verfahrensschritt (A)

Ein Verfahren, um ein modifiziertes Antigen in der Testlösung zu erhalten.
Beispiele der Testlösung umfassen Körperflüssigkeiten wie z. B. Serum, Plasma, zerebrospinale Flüssigkeit, Speichel und Urin und Pufferlösungen, die das zu analysierende Antigen enthalten. Alle Substanzen haben eine epitope Stelle oder im wesentlichen alle Antigene, die durch konventionelle Immunoassayverfahren meßbar sind, können analysiert werden.
Beispiele des zu analysierenden Antigen umfassen Proteinhormone wie z. B. schilddrüsenstimmulierendes Hormon (TSH) und Human- Choriongonadotropin (hCG); Plasmaproteine, wie z. B. Fibrin- Abbauprodukte (FDP) und C-reaktives Protein (CRP); carcino- embryonale Proteine, wie z. B. α-Fetoprotein (AFP) und carcino- embryonales Antigen (CEA); und Haptene wie z. B. Angiotensin I, Vasopressin, Somatostatin, atriales natriuretisches Hormon, Endoserin, luteinisierendes Hormon-freisetzendes Hormon (LH-RH), Kassinin und andere Peptide, Progesteron, Testosteron, Cortison und andere Steroide, vollständiges Thyroxin (T&sub4;), Triiodthyronin (T&sub3;), Katecholamin und Digoxin. Als Haptene klassifizierte Antigene sind wünschenswert für die vorliegende Erfindung. Insbesonders wünschenswerte Antigene sind Peptide, die eine Aminogruppe in ihrer molekularen Struktur aufweisen.
Jede funktionelle Gruppe kann verwendet werden, solange eine Substanz existiert, die spezifisch mit der funktionellen Gruppe spezifisch bindet und die Testlösung im wesentlichen keine funktionelle Gruppe oder Substanz enthält, die mit der funktionellen Gruppe spezifisch bindet. Beispiele solcher funktionellen Gruppen umfassen Haptene, wie z. B. die Dinitrophenylgruppe, Trinitrophenylgruppe und Fluoresceingruppe und Biotinyl.
Jeder Marker kann verwendet werden, solange er der Immunoanalyse dient. Beispiele solcher Marker schließen Enzyme, radioaktive Substanzen, lumineszente Substanzen, fluoreszierende Substanzen und Metallverbindungen ein.
Beispiele von geeingneten Enzymen schließen Peroxidase, β-D- Galactosidase und Alkaliphosphatase ein. Beispiele von geeigneten radioaktiven Substanzen schließen Jod und Wasserstoff, Beispiele von geeigneten Fluoreszenzsubstanzer schließen Fluoreszeinisothiocyanat ein. Beispiele von geeigneten Lumineszenzsubstanzen schließen Akridiniumsalze ein.
Als Marker, der direkt an das Antigen gebunden wird, ist die Verwendung von radioaktiven Stubstanzen, Lumineszenzsubstanzen, Fluoreszenzsubstanzen, etc. bevorzugt.
Beispiele des Verfahrens des Bindens einer funktionellen Gruppe oder Marker an das zu analysierende Antigen unter Ausbildung eines modifizierten Antigens umfassen das Verfahren, in welchem die funktionelle Gruppe oder Marker mit Hilfe einer chemischen Bindung unter Verwendung einer reaktiven Gruppe in dem Antigen gebunden wird.
Im Falle von Proteinhormonen ist die reaktive Gruppe in dem Antigen im allgemeinen eine -NH&sub2; Gruppe. Haptene weisen eine reaktive Gruppe zum Binden an ein Protein unter Ausbildung eines Antikörpers auf. Solche reaktiven Gruppen sind bei der chemischen Bindung beteiligt. Beispiele solcher Gruppen umfassen die -NH&sub2;-Gruppe, -SH-Gruppe, -COOH-Gruppe und -CHO- Gruppe.
Wenn solch eine reaktive Gruppe in dem Antigen zum Binden einer funktionellen Gruppe oder Marker mit Hilfe einer chemischen Bindung verwendet wird, wird eine funktionelle Gruppe oder Markerverbindung, die eine andere reaktive Gruppe, die reaktiv mit der reaktiven Gruppe in dem Antigen ist oder die mit solch einer reaktiven Gruppe verbunden worden ist, verwendet. Die reaktive Gruppe mit der reaktiven Gruppe in dem Antigen bedeutet eine reaktive Gruppe, die mit der reaktiven Gruppe in dem Antigen auf im wesentlichen quantitative Weise reagiert. Beispiele solcher reaktiven Gruppen umfassen die N- Hydroxysuccinimidogruppe und Anhydride, wenn das Antigen eine -NH&sub2;-Gruppe als reaktive Gruppe aufweist und die Maleimidogruppe und Pyridyldisulfidogruppe, wenn das Antigen eine -SH-Gruppe als reaktive Gruppe aufweist.
Beispiele von Verbindungen für die Einführung solcher funktioneller Gruppen umfassen N-Sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido)hexanoat, 3-(N-Maleimido-propionyl)biotin, N- Succinimidyl-2,4-dinitrophenyl-5-aminocaproat, N&sup6;-Biotinyl-L- lysin Hydrazid und p-Diazobenzoylbiocytin.
Beispiele von Verbindungen für die Einfügung eines Markers umfassen N-Succinimidyl-3-(4-hydroxy-5-[¹²&sup5;I]iodophenyl) propionat, N-Hydroxysuccinimid, Acridiniumester, Europium(Eu³&spplus;) - und Chelatverbindungen.
Die Menge der Verbindung, die zu der Testlösung zum Zwecke des Einführens einer funktionellen Gruppe oder Marker hinzugefügt wird, sollte ausreichend sein, um die wirksame Reaktion der reaktiven Gruppe in dem Antigen in der Testlösung sicherzustellen, da die Testlösung Stoffe enthält (Verunreinigungen), die dieselbe reaktive Gruppe wie in dem Antigen, und auch dem zu analysierenden Antigen aufweist. Zugabe der Verbindung im Überschuß erhöht den Hintergrundwert und verringert demgemäß die Analysenempfindlichkeit.
Die Reaktionstemperatur beträgt normalerweise 0 bis 55 ºC, bei welcher keine Denaturierung in dem Antigen oder dem Protein in der Testlösung stattfindet, vorzugsweise 4 bis 40 ºC. Die Reaktionszeit beträgt normalerweise 10 min bis 48 h, vorzugsweise 30 min bis 12 h.
Vorzugsweise wird eine Verbindung, welche mit der reaktiven Gruppe in der Verbindung reagiert, nach der Vervollständigung der Reaktion hinzugefügt, um die Reaktivität der unreagierten funktionellen Gruppe oder der Verbindung zur Einführung eines Markers zu verringern. Beispiele der Substanzen umfassen Glycin im Falle von N-Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat und 2- Mercaptoethanol im Falle von 3-(N-Maleimidopropionyl)biotin.

Verfahrensschritt (B)

Ein Verfahren, um das multiplizierte Antigen mit Hilfe eines Antikörpers gegen das Antigen spezifisch an einen Träger zu binden und danach das modifizierte Antigen von der Testlösung zu trennen.
Zwei Verfahren sind zum Binden des modifizierten Antigens mittels eines Antikörpers gegen das Antigen an den Träger verfügbar. In dem ersten Verfahren wird der Antikörper gegen das Antigen an den Träger gebunden, gefolgt von der Reaktion mit dem modifizierten Antigen. In dem zweiten Verfahren wird das modifizierte Antigen und der Antikörper gegen das Antigen gemeinsam umgesetzt, gefolgt vom Binden an den Träger mit Hilfe des Antikörpers.
In dem zweiten Verfahren wird der Antikörper gegen das Antigen vorher mit einer funktionellen Gruppe gebunden, gefolgt von Reaktion des modifizierten Antigens und des Antikörpers unter Ausbildung eines modifizierten Antigen-Antikörperkomplexes. Die hierin verwendete funktionelle Gruppe sollte nicht identisch sein mit der im Verfahrensschritt (A) verwendeten funktionellen Gruppe. Eine Substanz, die spezifisch an die funktionelle Gruppe bindet, wird an einen Träger gebunden, gefolgt von Reaktion mit dem modifizierten Antigen-Antikörperkomplex.
Beispiele von Substanzen, die spezifisch mit der funktionellen Gruppe binden, umfassen Anti-Hapten spezifische Antikörper im Falle von Haptenen und Avidin und Streptoavidin im Falle von Biotin.
Der Antikörper gegen das zu analysierende Antigen kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden. Demgemäß wird das Antigen oder seine epitope Stelle einem Tier eingeimpft, um es für der Erhalt eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zu immunisieren. Wenn das Antigen oder seine epitope Stelle ein Hapten ist, wird die Immunisierung für den Erhalt des Antikörpers nach seinem Binden an ein Protein durchgeführt.
Jeder Träger kann, solange er in einem Immunoanalyseverfahren verwendet werden kann, verwendet werden. Beispiele des Trägers umfassen Polystyrol, Polyacryl, Teflon, Papier, Glas, Agarose usw. Es gibt keine bestimmte Einschränkung für ihre Form.
Beispiele des Verfahrens des Bindens des Antikörpers gegen das Antigen oder der Verbindung, die spezifisch mit der funktionellen Gruppe reagiert an den Träger, umfaßt das Verfahren, das in dem Sandwichverfahren verwendet wird, um einen Antikörper an einen Träger zu binden.
Nach Binden des modifizierten Antigens an den Träger wird der Träger von der Testlösung getrennt. Zu dieser Trennung kann jedes konventionelle Verfahren verwendet werden, das in Immunoanalyseverfahren mit einem Träger verwendet wird.
Vorzugsweise wird der Träger vor Fortschreiten von Verfahrensschritt (B) zu dem nachfolgenden Verfahrensschritt (C) gewaschen.
Dieses Waschen wird unter Bedingungen, die normalerweise im Sandwichverfahren verwendet werden, ausgeführt.

Verfahrensschritt (C)

Dies ist ein Verfahren zum Trennen des modifizierten zu analysierenden Antigens, wie es mit Hilfe des Antikörpers gegen das Antigen an den Träger gebunden ist, von den nicht spezifisch gebunden modifizierten Verunreinigungen.
Dissoziation des modifizierten Antigens von dem Träger kann durch Behandlung mit Säure, Alkali, konzentriertem anorganischen Salz oder anderen Verbindung erzielt werden
Diese Dissoziation wird normalerweise bei pH-Werten von unter 5, vorzugsweise zwischen 0,5 und 3,5, wenn eine Säure verwendet wird, bei einem pH-Wert von über 9, wenn ein ein Alkai verwenden wird und bei einer Salzkonzentration von über 2 M, wenn ein konzentriertes anorganischen Salz verwendet wird, erzielt. Diese Behandlung wird normalerweise bei einer Temperatur von 0 bis 45 ºC für 10 min bis zu einer großen Zahl von Stunden durchgeführt.
Wenn das zweite Verfahren in Verfahrensschritt (B) verwendet wird, ist es möglich, den modifizierten Antigen- Antikörperkomplex, der das modifizierten Antigen und den Antikörper gegen das Antigen umfaßt, durch Zugeben einer Substanz, die dieselbe Stelle, wie die an den Antikörper gebundene funktionelle Gruppe aufweist, von dem Träger zu dissoziieren.
Es wird z. B. eine Dinitrophenylaminosäure (z. B. Dinitrophenyllysin), falls die funktionelle Gruppe Dinitrophenyl ist, und Biotin, falls die funktionelle Gruppe Biotinyl ist, verwendet.
Wenn die funktionelle Gruppe mit Hilfe einer -S-S-Bindung an den Antikörper gebunden ist, kann der modifizierte Antigen-Antikörperkomplex unter Verwendung eines Reagenz, welches die -S-S- Bindung bricht, dissoziiert werden.

Verfahrensschritt (D)

Dies ist ein Verfahren, um das modifizierte Antigen oder den modifizierten Antigen-Antikörperkomplex, umfassend das modifizierte Antigen und den Antikörper gegen das Antigene die im Verfahrensschritt (C) dissoziiert wurden, zu analysieren Dieser Verfahrensschritt kann mit bekannten Verfahren, einschließlich dem Immunokomplex-Transferverfahren durchgeführt werden.
So wird, um ein Beispiel zu nennen, in dem ersten Verfahren, wenn das dissoziierte modifizierte Antigen ein mit einer funktionellen Gruppe gebundenes Antigen ist, das modifizierte Antigen durch das Sandwichverfahren unter Verwendung einem Trägers, an den eine Substanz, die spezifisch mit der funktionellen Gruppe bindet und der Marker gebundene Antikörper gegen das Antigen (Markerantikörper) gebunden ist, analysiert.
Messen im Sandwichverfahren kann durch Reaktion mit dem Träger nach Reaktion mit dem Markerantikörper oder durch Reaktion mit dem Antikörper nach Reaktion mit dem Träger oder durch simultane Reaktion des Trägers und des Markerantikörpers ausgeführt werden.
In dem zweiten Verfahren wird das modif zierte Antigen mit Hilfe des Antikörpers gegen das Antigen auf dieselbe Art und Weise wie im Verfahrensschritt (B) an den Träger gebunden, und dies wird gefolgt von Analyse unter Verwendung der funktionellen Gruppe oder Marker in dem modifizierten Antigen.
Wenn die Analyse unter Verwendung der funktionellen Gruppe bewirkt wird, wird eine Substanz, die spezifisch mit der funktionellen Gruppe bindet, zwischen der Marker markierten Substanz und dem Träger durch das Sandwichverf ahren analysiert. Beispiele der Marker markierten Substanzen umfassen Konjugate von Enzymen und Avidin oder Enzymen und Streptavidin.
In anderen Verfahren als in dem ersten Verfahren ist es auch möglich, das modifizierte Antigen, das mit der funktionellen Gruppe mit einer Marker markierten Substanz, die spezifisch mit der funktionellen Gruppe bindet, gebunden ist, umzusetzen und dann die Reaktion zur Umwandlung zu einem Marker markierten modifizierten Antigen vor Verfahrensschritt (D) auszuführen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend ausführlicher mittels der folgenden Arbeitsbeispiele beschrieben, die vorliegende Erfindung ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Pufferlösung

Als Lösung A wurde eine 0,01 M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1 M Natriumchlorid und 1 g/l Rinderserum-Albumin enthielt, hergestellt.

Herstellung von Kaninchen-Anti-Angiotensin I Antiserum

Ein Angiotensin I-Rinderserum-Albuminkonjugat wurde durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von Glutaraldehyd hergestellt.
Kaninchen wurden mit diesem Angiotensin I-Rinderserum-Albuminkonjugat durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von Freud'schem kompletten Adjuvans immunisiert, um Kaninchen-Anti- Angiotensin I Antiserum zu erhalten.

Herstellung von IgG, F(ab')&sub2;, Fab

IgG, durch Aussalzen mit Natriumsulfat unter Verwendung von DEAE Zellulose, F(ab')&sub2;, durch Pepsinverdauen von IgG und Fab' durch Reduktion von F(ab')&sub2;, wurden jeweils durch ein bekanntes Verfahren [Ishikawa et al.: Journal of Immunoassay, 4, 209 (1983)] hergestellt.

Herstellung von Angiotensin I-Sepharose 4B

Angiotensin I (0,5 mg) wurde an aktivierter CH-Sepharose 4B (0,15g) gemäß der Vorschrift von Pharmacia insolubilisiert.

Herstellung von affinitätsgereinigter Kaninchen-Anti- Angiotensin I Fab'-peroxidase

Kaninchen-Anti-Angiotensin I Fab' wurde mit Peroxidase in einem bekannten Verfahren [Haschida et al.: Journal of Applied Biochemistry, 6, 56 (1984)] unter Verwendung von N-Succinimidyl- 6-maleimidohexanoat als Verknüpfungsmittel markiert.
Die Kaninchen-Anti-Angiotensin I Fab'-peroxidase wurde in einem bekannten Verfahren unter Verwendung einer angiotensinen I- Sepharose 4B Säule [K-H. Ruan et al.: Clinical Chimica Acta, 147, 167 (1985)] affinitätsgereinigt, in welchem die Elution bei pH 2,5 durchgeführt wird.

Herstellung von Biotinyl-nichtspezifischem Kaninchen IgG

Biotinyl nichtspezifisches Kaninchen IgG wurde in einer bekannten Reaktion zwischen Maleimid-nichtspezifischen Kaninchen IgG und N-Biotinyl-2-mercaptoethylamin hergestellt [Kono et al.: Journal of Clinical Laboratory Analysis, 2, 19 (1988)].

Herstellung einer Festphase mit unlöslich gemachtem Protein

Ein Polystyrolball mit unlöslich gemachtem Kaninchen-Anti- Angiotensin I oder Biotinyl nichtspezifischem Kaninchen IgG wurde durch physikalische Adsorption an einen Polystyrolball von 3,2 mm Durchmesser (hergestellt durch Precision Plastic Ball Co., Chicago) durch ein bekanntes Verfahren [Ishikawa et al.: Scandinavian Journal of Immunology, 8 (Supple. 7), 43 (1978)] unter Verwendung einer Kaninchenanti-Angiotensin I IgG Lösung (0,1 g/l) oder Biotinyl-nichtspezifisches Kaninchen IgG Lösung (0,1 g/l) hergestellt.
Eine Streptavidinlösung (0,1 g/l) wurde mit dem Polystyrolball, der unlöslich gemachte Biotinyl nichtspezifisches Kaninchen IgG enthielt, bei 30 ºC für 4 Stunden unter Erhalt eines mit Streptovidin in solubilisiertem Polystyrolballes umgesetzt.

Herstellung von Plasma

7 ml Blut wurde von einem normalen Menschen in einem eisgekühlten Probenröhrchen, das 10,5 mg Dinatriumetylendiamin-tetraacetat (EDTA) enthielt, gesammelt und wurde bei 4 ºC zum Plasma abtrennen zentrifugiert. Das Plasma wurde in einer Mischung mit einem gleichen Volumen von einer 0,16 mM Phosphatpufferlösung, pH 4,6, die 4 mM 8-Hydroxyquinolin und einem Angiotensin I umwandelden Enzyminhibitor enthielt, unter Eiskühlung 20 min inkubiert und dann mit einer 0,1 M Natriumkarbonatpufferlösung, pH 9,1, die 4-mM EDTA enthielt, 12,5fach verdünnt.

Herstellung von Standardlösungen

0,56 mg Angiotensin I wurde in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst. Diese Lösung wurde mit einer 0,1 M Natriumkarbonatpufferlösung, pH 8,5, die 0,16 mM 8-Hydroxyquinolin, 4 mM EDTA und 1 g/l Rinderserum-Albumin enthielt, verdünnt, um verschiedene Konzentrationen von Standardlösungen herzustellen.

Analyse von Angiotensin I

50 ul des Plasmas oder der Standardlösung wurde in Mischung mit 3 ul Dimethylformamidlösung, die 80 mM Sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido)hexanoat enthielt, bei 30 ºC eine Stunde inkubiert und dann mit 7 ul 1 M Glycin-Natriumhydroxid, pH 8,5 bei 30 ºC 1 h inkubiert und dies wurde von der Zugabe von 90 ul einer 10 mM Natriumphosphatpufferlösung, pH 6,0, die 1 g/l Rinderserum- Albumin, 0,1 M Natriumchlorid, 1 g/l Natriumazid und 4 mM EDTA enthielt, gefolgt.
Diese 150 ul Reaktionsmischung wurde mit dem Polystyrolball mit dem unlöslich gemachten Kaninchen-Anti-Angiotensin I bei 20 ºC über Nacht inkubiert. Nach Inkubation wurde die Reaktionsmischung enfernt und der Polystyrolball wurde 2 mal mit 2 ml einer 10 mM Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und dies wurde durch Inkubation in Gegenwart von 100 ul der Pufferlösung A und 20 ul 1 M Salzsäure bei 30 ºC für 1 h gefolgt.
Nach dem Entfernen des Polystyrolballs wurde die Inkubationsmischung durch Zugabe von 10 ul einer 1 M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,0, und 20 ul 0,9 M Natriumhydroxyd neutralisiert. Dann wurden 20 ul Pufferlösung A, die die affinitätsgereinigte Kaninchenanti-Angiotensin I Fab'- Peroxidase enthielt (500 fmol) hinzugefügt, und dies wurde von Inkubation bei 20 ºC für 3 h und bei 4 ºC über Nacht gefolgt. Zwei Polystyrolbälle mit insolubilisiertem Streptavidin wurden dann hinzugefügt, und dies wurde von Inkubation bei 20 ºC für 4 h unter Schütteln der Inkubationsmischung gefolgt.
Nach Entfernen der Reaktionsmischung wurden die Polystyrolbälle auf dieselbe Weise wie vorstehend gewaschen. Die Aktivität der an die Polystyrolbälle gebundenen Peroxidase wurde dann fluorometrisch bei 30 ºC über eine Zeitspanne von 1 h durch ein bekanntes Verfahren [Imagawa et al.: Analytical Letters, 16 (B19), 1509 (1983)] unter Verwendung von 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure als Substrat bestimmt. Die Intensität der Fluoreszenz wurde unter Verwendung einer 0,2 mg/l Chininlösunq in 0,05 M Schwefelsäure als Referenzsubstanz analysiert.
Die Analysenergebnisse an den Standardlösungen sind in Fig. 1 gezeigt. Die Nachweisgrenze betrug l3 fg (10 amol). Wenn 2 ul Plasma verwendet wurden, war eine Analyse bis zu 6,5 ng/l möglich.
Drei unterschiedliche Konzentrationen von Angiotensin I (63 bis 6400 ng/l) wurden zu zwei Plasmaproben (Angiotensin Konzentration 56 und 102 ng/l) und die Wiedergewinnung von Angiotensin I betrug 85 bis 104 %.
Der Varianzkoef fizient innerhalb der Analyse bei 13 verschiedenen Probenkonzentrationen (56-5558 ng/l) wurde als 1,8 - 10 % (n=5) bestimmt.
Die Nachweisgrenze ist über 80 mal niedriger als in dem konventionellen kompetitiven Verfahren.

Beispiel 2

Dieselben Verfahren wie in Beispiel 1 wurden zum Herstellen einer Pufferlösung, IgG, F(ab')&sub2;, Fab', Kassinin-Sepharose 4B, affinitätsgereinigter Kaninchen-Anti-Kassinin Fab'-peroxidase, Biotinyl-nichtspezifisches Kaninchen IgG und Festphase mit unlöslich gemachtem Protein verwendet.

Herstellung von Kaninchen-Anti-Kassinin Antiserum

Ein Kassinin-Rinderserum-Albuminkonjugat wurde durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von S-Acetylmercaptosuccinanhydrid und m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester hergestellt.
Kaninchen wurden mit dem Kassinin-Rinderserum-Albuminkonjugat durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von Freud'schem kompletten und nichtkomplettem Adjuvans immunisiert, um Kaninchen-Anti-Kassininin Antiserum zu erhalten.

Herstellung von Plasma

7 ml Blut wurden von einer Ratte in einem eisgekühlten Teströhrchen, das 10,5 mg Dinatriumethylendiamitetraessigsäure (EDTA) enthielt, gesammelt und wurde bei 4 ºC zum Abtrennen des Plasmas zentrifugiert. Dieses Blutplasma wurde vor dem Assay mit einer 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,5, die 4 mM EDTA enthielt, 25-fach verdünnt.

Herstellung von Standardlösungen

1,0 mg Kassinin wurde in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst Diese Lösung wurde mit einer 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,5, die 4 mM EDTA und 1 g/l Rinderserumalbumin enthieltverdünnt, um die verschiedenen Konzentrationen dem Standardlösungen zu erhalten.

Kassininanalyse

50 ul des Plasmas oder der Standardlösung wurde in Mischung mit 3 ul Dimethylformamidlösung, die 53 mM Sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido)hexanoat enthielt, bei 30 ºC eine Stunde inkubiert und dann mit 7 ul 1 M Glycin-Natriumhydroxid, pH 8,0 bei 30 ºC 1 h inkubiert, gefolgt von der Zugabe, die von 90 ul einer 10 mM Natriumphosphatpufferlösung, pH 6,0, die 1 g/l Rinderserum- Albumin, 0,1 M Natriumchlorid, 1 g/l Natriumazid und 4 mM EDTA enthielt.
Diese 150 ul Reaktionsmischung wurden mit dem Polystyrolball mit dem unlöslich gemachten Kaninchen-Anti-Kassinin bei 20 ºC über Nacht inkubiert. Nach Inkubation wurde die Reaktionsmischung enfernt und der Polystyrolball wurde 2 mal mit 2 ml einer 10 mM Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und dies wurde durch Inkubation in Gegenwart von 100 ul der Pufferlösung A und 20 ul Salzsäure bei 30 ºC für 1 h gefolgt.
Nach Entfernen des Polystyrolballs wurde die Inkubationsmischung durch Zugabe von 10 ul einer 1 M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,0, und 20 ul 0,9 M Natriumnydroxyd neutralisiert. Dann wurden 20 ul Pufferlösung A, die die affinitätsgereinigte Kaninchen- Anti-Kassinin Fab'-Peroxidase enthielt (50 fmol) hinzugefügt, gefolgt von Inkubation bei 20 ºC für 3 h und bei 4 ºC über Nacht. Zwei Polystyrolbälle mit insolubilisiertem Streptavidin wurden dann hinzugefügt, gefolgt von Inkubation bei 20 ºC für 4 h unter Schütteln der Inkubationsmischung.
Nach Entfernen der Reaktionsmischung wurden die Polystyrolbälle auf dieselbe Weise wie vorstehend gewaschen. Die Aktivität der an die Polystyrolbälle gebundenen Peroxidase wurde dann fluorometrisch bei 30 ºC über eine Zeitspanne von 1 h durch ein bekanntes Verfahren [Imagawa et al.: Analytical Letters, 16 (B19), 1509 (1983)] unter Verwendung von 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure als Substrat bestimmt. Die Intensität der Fluoreszenz wurde unter Verwendung einer 0,2 mg/l Chininlösung in 0,05 M Schwefelsäure als Referenzsubstanz analysiert.
Die Analyseergebnisse an den Standardlösungen sind in Fig. 2 gezeigt. Die Nachweisgrenze betrug 130 fg (100 amol). Wenn 2 ul Plasma verwendet wurden, war eine Analyse bis zu 65 ng/l möglich.
Drei unterschiedliche Konzentrationen von Kassinin (650 - 19500 ng/l) wurden zum Plasma gegeben; die Wiedergewinnung von Kassinin betrug 101 - 119 %. Der Variantskoeffizient innerhalb der Analyse bei 6 verschiedenen Probenkonzentrationen (840-26700 ng/l) wurde als 7,9 - 13 % (n=5) bestimmt.

Vergleichsbeispiel 1

Pufferlösung

Als Pufferlösung B wurde eine 0,05 M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,15 M Natriumchlorid, 0,1 % Gelatine und 0,02 % Natriumazid enthielt, hergestellt.

Kaninchen-Anti-Kassinin Antiserum

Dasselbe Antiserum wie in Beispiel 2 wurde verwendet.

Herstellung von ¹²&sup5;I-tyrosiniertem Kassinin

N-terminal tyrosiniertes Kassinin wurde in einem bekannten Verfahren unter Verwendung von Na¹²&sup5;I und Chloramin T unter Erhalt von ¹²&sup5;I-tyrosiniertem Kassinin markiert. Die spezifische Radioaktivität des ¹²&sup5;I-tyrosiniertem Kassinin betrug 11 uCi/ug.

Herstellung von Standardlösungen

0,5 mg Kassinin wurde in 1 ml einer 0,1 M Boratpufferlösung, pH 8,5, gelöst, und diese Lösung wurde mit Pufferlösung B verdünnt, um die verschiedenen Konzentrationen von Standardlösungen zu erhalten.

Radioimmunoanalyse für Kassinin

100 ul jeder Standardlösung wurden mit 200 ul Kaninchen-Anti- Kassinin Antiserumlösungen, 1000fach verdünnt mit Pufferlösung B, 100 ul (10000 cpm) ¹²&sup5;I-tyrosinierter Kassininlösung in Pufferlösung B und 200 ul Pufferlösung B bei 4 ºC für 18 h inkubiert.
200 ul einer Suspension in Pufferlösung B enthaltend 0,25 % Dextran T-70 und 2,5 % Aktivkohle (Norit A) wurde dann hinzugefügt. Die erhaltene Mischung wurde 15 min bei 4 ºC stehengelassen und dann bei 3000 U/min 20 min zentrifugiert. Die Radioaktivität des Überstandes wurde unter Verwendung eines γ- Zählers bestimmt.
Die Analyseergebnisse der Standardlösungen sind in Fig. 3 gezeigt. Die Nachweisgrenze betrug 100 pg (75 fmol). Die Nachweisgrenze der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel 2, ist 750 mal niedriger als die in einem konventionellen kompetitiven Verfahren, wie in Vergleichsbeispiel 1, erhaltene.

Beispiel 3

Puffer

Die gewöhnlich verwendeten Puffer waren 10 mmol/l Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, der 0,1 mol/l NaCl und 1 g/l Rinderserum-Albumin (kristallisiert, Miles Laboratories, Ltd. Elkhart, Indiana USA) (Puffer A) und 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 der 0,1 mol/l NaCl, 1 g/l Rinderserum-Albumin und 1 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Puffer C).

Herstellung von Kaninchen-Anti-Arginin Vasopressin Antikörper

Anti-Arginin Vasopressinserum wurde in männlichen weißen Neuseelandkaninchen durch acht intrakutane Injektionen von Arginin Vasopressin-Rinderthyroglobulinkonjugaten bei 2-3 wöchentlichen Intervallen gezogen. Arginin Vasopressin (5 mg, Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan) wurde mit Rinderthyroglobulin (50 mg, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) durch das Carbodiimidverfahren [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 80, 134 - 144 (1972)] unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (Calbiochem-Behring, La Jolla, California, USA) konjugiert. Zur Injektion wurde das Konjugat in Kochsalzlösung (0,4 mg/ml) mit einem gleichen Volumen von Freud'schem kompletten Adjuvans (Miles Laboratories, Inc.) emulgiert. Die Menge des injizierten Konjugats betrug 0,2 mg pro Kaninchen. Blut wurde 13 d nach der letzten Immunisierung gesammelt und das Antiserum bei -20 ºC gelagert.
IgG, F(ab')&sub2; und Fab' wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt. Die Menge an IgG und seinen Fragmenten wurde aus der Absorbtion bei 280 nm berechnet.

Arginin Vasopressin-Sepharose 4B

Arginin Vasopressin (0,61 mg) wurde mit aktivierter CH-Sepharose 4B (0,17g, Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gemäß der Vorschrift von Pharmacia gekoppelt.

Affinitätsgereinigte Anti-Arginin Vasopressin Fab'- Peroxidasekonjugate

Anti-Arginin Vasopressin Fab' wurde mit Meerrettichperoxidase (Grade I, Re (Grade I, RZ-3,0, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, BRD)) unter Verwendung von N-Succinimidyl-6- maleimidohexanoat (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) durch ein bekanntes Verfahren [Hashida et al., Journal of Applied Biochemistry (vorstehend erwähnt)] konjugiert.
Das Konjugat wurde gemäß einem bekannten Verfahren [Ruan et al., Clinica Chimica Acta, 147, 167 - 172 (1985)] durch Elution von einer Arginin Vasopressin-Sepharose 4B-Säule bei pH 2,5 affinitätsgereinigt.

Proteinbeschichtete Polystyrolbälle

Polystyrolbälle (3,2 mm im Duchinesser, Immunochemical Co., Okayama, Japan) wurden mit Kaninchen-Anti-Arginin Vasopressin IgG (0,1 g/l) gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 beschichtet. Biotinyl-nichspezifisches Kaninchen IgG, Biotinyl nicht- spezifisches Kaninchen IgG-beschichtete Polystyrolbälle und Streptavidin-beschichtete Polystyrolbälie wurden, wie in Beispiel 1 erwähnt, hergestellt. Die Protein beschichteten Polystyrolbälle wurden in Puffer A enthaltend 1 g/l NaN&sub3; bei 4 ºC gelagert.

Verdünnung von Urinproben und Arginin Vasopressin

Urinproben wurden als erste Morgenabgaben von gesunden Testpersonen im Alter von 22 bis 35 Jahren erhalten und wurden zwanzigfach mit Puffer C verdünnt.
Arginin Vasopressin (0,61 mg) wurde in 0,5 ml 0,2 mol/l Essigsäure gelöst und mit Puffer C verdünnt.

Analyse von Arcinin Vasopressin

Biotinylierung wurde auf zwei verschiedenen Wegen durchgeführt. (1) Direkte Biotinylierung. Ein 100 ul Aliquot des verdünnten Arginin Vasopressins oder des verdünnten Urins wurde mit 10 ul von 66 mmol/l N-Hydroxysuccinimidobiotin (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, California, USA) in Dimethylsulfoxid 1 h bei 20 ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktionsmischung mit 10 ul 1 mol/l Glycin-NaOH, pH 7,0, 30 min bei 20 ºC inkubiert, gefolgt von Zugabe von 30 ul von Puffer C, der 5 g/l NaN&sub3; enthielt.
(2) Indirekte Biotinylierung. --- Ein 100 ul Aliquot des verdünnten Arginin Vasopressins oder des verdünnten Urins wurde mit 5 ul von 63 mmol/l N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (Dojindo Lab.) in Dimethylsulfoxid 1 h bei 20 ºC inkubiert. Nach Inkubation wurde die Reaktionsmischung mit 5 ul von 99 mmol/l Glutathion (reduzierte Form, Dojindo Lab.) in 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 1 mmol/l EDTA enthielt, 1 h bei 20 ºC und nachfolgend mit 5 ul von 138 mmol/l N- Hydroxysuccinimidobiotin (Zymed Lab., Inc.) in Dimethylsulfoxid 1 h bei 20 ºC inkubiert. Schließlich wurden 5 ul von 2 mol/l Glycin-NaOH, pH 7,0, hinzugefügt, und die Inkubation wurde 30 min bei 20 ºC fortgeführt, gefolgt von Zugabe von 30 ul von Puffer C, der 5 g/l NaN&sub3; enthielt. Die vorstehenden Verfahren sind in dem folgenden Diagramm zusammengefaßt.
Die biotinylierte Mischung (150 ul) wurde mit 2 Anti-Arginin Vasopressin IgG-beschichteten Polystyrolbällen bei 4 ºC über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Polystyroibälle durch Zugabe und Aufsaugen von 2 ml 10 mmol/l Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 mol/l NaCl enthielt, gewaschen und wurden mit einer Mischung aus 100 ul von Puffer A, der 1 mmol/l EDTA enthielt, und 20 ul von 1 mol/l HCl 1 h bei 4 ºC inkubiert. Nach Entfernern der Polystyrolbälle wurde die verbliebene Lösung durch Zugabe einer Mischung aus 10 ul 1 mol/l Natriumphosphat puffer, pH 7,0 und 20 ul 1 mol/l NaOH neutralisiert. Die neutralisierte Mischung wurde mit affinitätsgereinigten Anti- Arginin Vasopressin Fab'-Peroxidasekonjugat (200 fmol) und nichtspezifischen Kaninchen F(ab')&sub2; (0,1 mg) in 20 ul Puffer A bei 4 ºC über Nacht inkubiert. Nachfolgend wurden zwei Streptavidin-beschichtete Polystyrolbälle hinzugefügt und die Inkubation wurde 5 h bei 4 ºC fortgeführt Nach Entfernung der Reaktionsmischung wurden die Polystyrolbälle zweimal wie vorstehend beschrieben gewaschen und die Peroxidaseaktivität, die an die Polystyrolbälle gebunden war, wurde bei 30 ºC für 60 min unter Verwendung von 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure als Substrat gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 analysiert. Fluoreszenzintensität wurde relativ zu 0,2 mg/l Chinin in 50 mmol/l H&sub2;SO&sub4; unter Verwendung von 320 nm als Anregung und 405 n'n als Emission mit einem Shimadzu Fluorophotometer (RF-510, Shimadzu Seisakusho, Ltd., Kyoto, Japan) analysiert.
Als Nachweisgrenze von Arginin Vasopressin wurde die minimale Menge von Arginin Vasopressin angenommen, die eine gebundene Peroxidaseaktivität ergab, die deutlich über dem von nichtspezifisch Gebundenem in Abwesenheit von Arginin Vasopressin lag. Die Anwesenheit eines signifikanten Unterschiedes vom Hintergrund wurde durch den t-Test (p< 0,001, n=5) bestätigt.
(1) Im Fall der direkten Biotinylierung betrug die Nachweisgrenze von Arginin Vasopressin 54 fg (50 amol)/Röhrchen (Figur 4, offene Kreise).
(2) Im Falle der indirekten Biotinylierung betrug die Nachweisgrenz von Arginin Vasopressin durch indirekte Biotinylierung 11 fg (10 amol)/Röhrchen (Figur 4, geschlossener Kreis). Dies war 23 bis 400fach niedriger als die, die vorher für den kompetitiven Radioimmunoassay [Morton et al., Journal oJ Endocrinology 65 411-424 (1975)] [Granzer et al., Acta Endocrinologica, 106 317-329 (1984)] und den kompetitiven Enzymimmunoassay [Uno et al., Experimentia 38 786-787 (1982) beschrieben war. Der Analysebereich von Arginin Vasopressin im Urin betrug 2 - 2,000 ng/l unter Verwendung von 5 ul Proben.
Die Wiedergewinnung von Arginin Vasopressin, das zu den Urinproben hinzugefügt worden war, betrug 86,4 ± 7,6 (SD) % (Bereich 77-101 %; n=18), falls Arginin Vasopressin in zwei verschiedenen Spiegeln (20 und 80 ng/l) zu 9 Urinproben (5 ul), die 6,6 - 63,5 ng/l Arginin Vasopressin enthielten, hinzugefügt wurde. Die Analysegenauigkeit wurde bei 14 verschiedenen Arginin Vasopressinspiegeln über einen Bereich von 6,6 - 117,3 ng/l, die mit und ohne Zugabe von Arginin Vasopressin zu Urinproben hergestellt wurden, untersucht. Der Koeffizient der Inneranalysevariation betrug 3,0 - 12,6 % (n=5).
Indirekte Biotinylierungstechniken, welche die Möglichkeit der sterischen Hinderung ausschließen könnten, die durch Biotinreste, die ziemlich nahe zu den epitopen Stellen von Arginin Vasopressin gebunden sind, hervorgerufen wird, könnten die Nachweisgrenze des Peptids im Vergleich zur direkten Biotinylierung 5-fach erniedrigen. Dies deutet an, daß Haptene mit Aminogruppen auf ähnliche Weise mit hoher Sensitivität ebenfalls analysiert werden können.
Wie vorstehend erwähnt, erlaubt die vorliegende Erfindung Analyse von Antigenen mit hoher Sensitivität, beruhend auf den charakteristischen Merkmalen des Sandwichverfahrens unter Verwendung eines Antikörpers gegen eine einzelne epitope Stelle und erlaubt ebenfalls die Analyse von niedermolekularen Substanzen, die niemals durch das konventionelle Sandwichverfahren analysiert wurden, mit sehr viel höherer Sensitivität als konventionelle kompetitive Verfahren und auch das Sandwichverfahren.

Claims

1. Analyseverfahren für ein Antigen, umfassend die folgenden Verfahrensschritte (A), (B), (C) und (D):

(A): Binden des zu analysierenden Antigens in der Testlösung mit einer funktionellen Gruppe, die so ist, daß eine Substanz spezifisch mit dieser Gruppe binden kann, oder mit einem Marker, der als ein Marker in einem Immunoassay dienen kann, unter Ausbilden eines modifizierten Antigens;

(B): Binden des modifizierten Antigens mit Hilfe eines Antikörpers gegen das Antigen an einen Träger und dann Abtrennen des Trägers von der Testlösung;

(C): umfassend die folgenden Verfahrensschritte (a) oder (b): (a) Dissoziieren des modifizierten Antigens von dem Träger oder

(b) Dissoziieren des modifizierten Antigen-Antikörper- Komplexes, der das modifizierte Antigen und den Antikörper gegen das Antigen umfaßt, von dem Träger; und

(D): Analysieren des modifizierten Antigens oder des modifizierten Antigen-Antikörper-Komplexes des Verfahrensschrittes (C) durch das Sandwich-Verfahren oder durch Verwenden des Markers.

2. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, worin das zu analysierende Antigen ein niedermolekulares Antigen ist.

3. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, worin das zu analysierende Antigen ein Hapten ist.

4. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, worin das zu analysierende Antigen eine -NH&sub2;-Gruppe als reaktive Gruppe aufweist.

5. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach Beendigung des Verfahrensschrittes (A) die Reaktivität der unreagierten funktionellen Gruppe oder der Verbindung für die Einfügung des Markers beseitigt wird.

6. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß Verfahrensschritt (B) durch Binden des Antikörpers gegen das Antigen an den Träger, gefolgt von Reaktion mit dem modifizierten Antigen, durchgeführt wird.

7. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Verfahrensschritt (B) durch Reagieren des modifizierten Antigens mit dem Antikörper gegen das Antigen gefolgt von Binden an den Träger, mit Hilfe des Antikörpers durchgeführt wird.

8. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Fortschreiten von Verfahrensschritt (B) zu Verfahrensschritt (C) der mit dem modifizierten Antigen verbundene Träger gewaschen wird.

9. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, worin in Schritt (C) das modifizierte Antigen von dem Träger dissoziiert wird.

10. Analyseverfahren für ein Antigen gemäß Anspruch 1, umfassend die folgenden aufeinander folgenden Schritte (A), (B'), (C') und (D'):

(A) Direktes Binden des zu analysierenden Antigens in der Testlösung mit einer funktionellen Gruppe, die so ist, daß eine Substanz spezifisch mit dieser Gruppe binden kann, oder mit einem Marker, der als ein Marker in einem Immunoassay dienen kann, unter Ausbilden einem modifizierten Antigens;

(B') Binden eines Antikörpers gegen das Antigen mit einer funktionellen Gruppe, die anders ist als die in Schritt (A) verwendete funktionelle Gruppe, Reagieren des Antikörpers mit dem modifizierten Antigen unter Ausbilden eines modifizierten Antigen-Antikörper-Komplexes, Binden des Komplexes an einen Träger mit Hilfe einer Substanz, die spezifisch an die funktionelle Gruppe bindet, und dann Abtrennen des Trägers von der Testlösung,

(C') Dissoziieren des modifizierten Antigen-Antikörper-Komplexes von dem Träger durch Hinzugeben einer Substanz, die die gleiche Bindungsstelle wie die an den Antikörper in Schritt (B') gebundene funktionelle Gruppe aufweist, und

(D') Analysieren des modifizierten Antigen-Antikörperkomplexes aus (C') durch das Sandwich-Verfahren oder durch Verwenden des Markers.