DE102005060057A1

DE102005060057A1 - Sandwich-Immunoassay für kleine Haptenmoleküle

Info

Publication number: DE102005060057A1
Application number: DE200510060057
Authority: DE
Inventors: Karl Heinz Dr. Kellner
Original assignee: Kellner Karl-Heinz Dr; Immundiagnostik AG
Current assignee: Kellner Karl-Heinz Dr; Immundiagnostik AG
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2007-06-28

Abstract

Sandwich-Immunoassay für die Bestimmung kleiner Haptenmoleküle, an die nur ein Antikörper binden kann, umfassend die Verfahrensschritte in der angegebenen Folge:
(i) Zusetzen zu einer Probe, in die zu bestimmenden Haptenmoleküle vorliegen, eines stöchiometrischen Überschusses eines reaktiven Detektions- und Derivatisierungsmittels, beinhaltend eine chemisch reaktive Gruppe, einen Spacer und eine Detektionsgruppe, das sich mit den zu bestimmenden Haptenmolekülen quantitativ umsetzt, so dass man eine Analytverbindung erhält, in der das kleine Hapten über einen Spacer mit einer Detektionsgruppe verknüpft ist;
(ii) Bereitstellen von spezifischen ersten Fänger-Antikörpern gegen das Hapten, fakultativ gebunden an einer festen Phase, Zusammenbringen der Probe mit der Analytverbindung mit den spezifischen ersten Fänger-Antikörpern, und Herstellen eines Komplexes aus Analytverbindung und erstem Antikörper, fakultativ gebunden an einer festen Phase;
(iii) Zusammenbringen des Komplexes aus erstem Antikörper und Analytverbindung mit einem Bindeprotein, das spezifisch an die Detektionsgruppe bindet, und
(iv) Detektieren der Menge an Bindeprotein, das an dem...

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft einen Sandwich-Immunoassay für kleine Haptenmoleküle und ein Bestimmungsverfahren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele kleine Haptenmoleküle sind für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung. Beispiele für physiologisch wichtige kleine Haptene sind verschiedene natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, physiologische Amine, Katecholamine; cholergene Amine; Oligopeptide und kleine Peptidhormone wie Vasopressin, Oxytocin, Angiotensin-I, Triiodothyronin und Thyroxin.
Ihre Konzentration in Proben wie Blut, Serum oder Plasma wird zumeist durch einen kompetitiven Immunoassay bestimmt. Hierbei wird der Probe eine bekannte Menge derivatisiertes oder markiertes Tracerhapten zugesetzt und dann die Probe mit Anti-Hapten-Antikörpern zusammengebracht, so dass die nativen Haptenmoleküle in der Probe und der Tracer um die Bindung an den Anti-Hapten-Antikörpern konkurrieren. Die Menge an gebundenem Tracer wird dann immunologisch durch markierte Sekundärantikörper bestimmt. Je mehr natives Hapten beziehungsweise Analyt in der Probe vorhanden ist, desto weniger Tracer kann binden und aus dieser Abnahme wird über eine Vergleichsreihe die Konzentration des Analyten in der Probe ermittelt.

US 4 818 683 (Morel et al.) beschreibt einen kompetitiven Immunoassay für den Nachweis von Monoaminen und cholergene Aminen. Hierzu werden die kleinen Haptenmoleküle quantitativ in höhermolekulare immunogene Derivate derivatisiert. Die Derivatisierung erfolgt bei primären oder sekundären Amingruppen in der Regel über aktivierte Ester wie N-Hydroxysuccinimid oder ein anderes Acylierungsreagens. Die resultierenden Derivate sind immunogener als die nicht-acylierten Spezies und leichter zu bestimmen. In dem beschriebenen Immunoassay wird die Konzentration von acyliertem Hapten schließlich wieder indirekt über die Menge an gebundenem Tracer gemessen. Es gibt Hunderte von Verfahren, größere und kleinere Haptene durch Kopplung mit weiteren Gruppen immunogener zu machen, siehe beispielsweise Ellman GL, Arch. Biochem. Biophys. 74 (1958) 443-450; Riddles PW, Anal. Biochem. 94 (1979) 75-81; Muckerheide A et al., J. Immunol. 138 (1987) 833; Apple RJ et al, J. Immunol. 140 (1987) 3290; Domen PJ, J. Immunol. 139 (1987) 3195).

Die Menge an asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) im Serum oder Plasma ist ein wichtiger Prognosewert bei Patienten mit Arteriosklerose, koronarer Herzerkrankung, peripherer arterieller Verschlusskrankheit, Hypertonie, Herzinsuffizienz, Hypercholesterinämie, Nierenerkrankungen oder Diabetes mellitus. Die ADMA-Bestimmung erfolgt einerseits durch chromatographische Verfahren wie Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), da strukturell sehr ähnliche, in ihrer Funktion aber verschiedene Isomere ADMA und SDMA zu untersuchen sind. Die Messung mittels HPLC ist nachteilig, da sehr zeit- und personalintensiv, und weil sie eine aufwändige Probenvorbereitung erfordert. Andererseits wurde jüngst ein einfach zu handhabender Enzymimmunoassay für ADMA entwickelt und validiert (Schulze F et al., Clin. Chem. Lab. Med. (2004) 42:1377-1383; Böger RH et al, Clin. Chem. Lab. Med. (2003) 41:1467-1472; Böger RH et al., Atherosclerosis (1998) 136:67-77. Dieser kompetitive Assay erlaubt jedem Labor, das über ein Mikrotiterplatten-Lesegerät verfügt, die ADMA-Messung in humanem Serum oder Plasma vorzunehmen. Die Kreuzreaktivitäten mit anderen im Plasma vorhandenen Analyten wie Monomethylarginin, SDMA und L-Arginin sind vernachlässigbar gering.

Kompetitive Immunoassays haben aber den Nachteil, dass bei niedriger Analytkonzentration die Konzentration an gebundenen Sekundärantikörpern der Null-Referenz von einer mangels Kompetition kaum verringerten Konzentration gebundener Sekundärantikörper unterschieden werden muss. Bei niedriger Analytkonzentration ist daher die Messgenauigkeit stark beeinträchtigt. Es wäre besser, wenn der Analyt direkt in der Probe bestimmt werden könnte. Für kleine Moleküle beziehungsweise Haptene können aber keine Sandwich-Immunoassays aufgebaut werden, weil die Moleküle für die Bindung von zwei Antikörpern zu klein sind. Zwar versucht man für diese Moleküle direktmessende anti-idiotypische Immunoassays aufzubauen, wobei der Sekundärantikörper den Hapten-Fängerantikörper-Komplex und das Hapten selbst erkennt, jedoch wurde kein derartiger Test bislang marktreif.

Für Angiotensin-II wurde ein Quasi-Sandwichaufbau realisiert, indem das Hapten nach der Bildung des Hapten-Fängerantikörper-1-Komplexes über einen Spacer kovalent an den Antikörper gebunden wird. Danach wird der Hapten-Fängerantikörper-Komplex so gebrochen, dass das Hapten nur über den Spacer an den Primär- beziehungsweise Fängerantikörper gebunden ist. Es kann dann in einem zweiten Schritt mit einem markierten Primärantikörper das kovalent gebundene Hapten detektiert werden; siehe EP 0 139 552 . Dieses Verfahren kann nicht auf andere Haptene übertragen werden.

Es ist Aufgabe der Erfindung, einen Immunoassay für kleine Haptenmoleküle wie ADMA zur Verfügung zu stellen, welcher die Nachteile des Stands der Technik nicht aufweist und der insbesondere bei kleinen Analytkonzentrationen sehr genaue Messergebnisse liefert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Die Erfindung betrifft also einen Sandwich-Immunoassay für die Bestimmung kleiner Haptenmoleküle, an die im wesentlichen nur ein Antikörper binden kann. Diese werden für das Prinzip des Sandwich-Immunoassay vorbereitet, in dem zu einer Probe, die zu bestimmende Haptenmoleküle enthält, ein stöchiometrischer Überschuss eines Detektions- und Derivatisierungsagens zugesetzt wird. Dieses reaktive Agens enthält eine chemisch reaktive Gruppe, einen Spacer und eine Detektionsgruppe, das sich mit den zu bestimmenden Haptenmolekülen quantitativ umsetzt, so dass man eine Analytverbindung erhält, in der das kleine Hapten über einen Spacer mit einer Detektionsgruppe verknüpft ist. Es folgt ein Bereitstellen von spezifischen ersten Fänger-Antikörpern gegen das Hapten, fakultativ gebunden an einer festen Phase, das Zusammenbringen der Probe mit der Analytverbindung mit den spezifischen ersten Fänger-Antikörpern, das Herstellen eines Komplexes aus Analytverbindung und erstem Antikörper, fakultativ gebunden an einer festen Phase; das Zusammenbringen des Komplexes aus erstem Antikörper und Analytverbindung mit einem Bindeprotein, das spezifisch an die Detektionsgruppe bindet, und das Detektieren der Menge an Bindeprotein, das an dem Komplex aus erstem Antikörper und Analytverbindung gebunden ist.

Das zu bestimmende kleine Haptenmolekül enthält bevorzugt eine primäre oder sekundäre Aminogruppe. Das chemisch reaktive Detektionsagens enthält dann eine esteraktivierende oder eine acylierende Gruppe. Enthält das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine einfache Keto- oder Aldehydgruppe, besitzt das chemisch reaktive Detektionsagens eine Hydrazin- oder eine Carbodiimid-Gruppe. Enthält das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine SH-Gruppe, so kann diese mit einer Maleinimid-Gruppe derivatisiert werden. Bevorzugt enthält das chemisch reaktive Detektionsagens eine N-Hydroxysuccinimid-Gruppe und ist beispielsweise Biotin-X-NHS (Biotin-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester) oder Biotin-(X)_1-5-NHS, wobei X 7-Aminocapronsäure oder ein Spacer mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen ist.

Die Detektionsgruppe ist bevorzugt ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Desthiobiotin, substituierten und derivatisierten Aminosäuren, Oligopeptiden, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Avidin, Streptavidin, Protein-A, Protein-G und dergleichen. Das kleine Haptenmolekül kann sein: natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin; physiologische Amine, Serotonin, Histamin; Katecholaminen, Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine; cholergene Aminen, Adrenalin; Oligopeptide und kleine Peptidhormonen mit bis zu 12 Aminosäuren; Nonapeptide, Vasopressin Oxytocin; Dekapeptide, Angiotensin-I; Oktapeptide, Angiotensin-II; T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin); Steroide, Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Bestimmung von ADMA in Plasma, Serum oder Blut; die Bestimmung von Pregnenolon in Plasma, Serum oder Blut; und die Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivität in Plasma, Serum oder Blut. Die Erfindung umfasst ferner Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend einen Chemikaliensatz für die Derivatisierung des kleinen Haptens, Antikörper und/oder Bindeprotein, sowie einen Chemikaliensatz für die Detektion.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den beiliegenden Zeichnungen. Es zeigt:
1 Reaktionsschema für die Kopplung von ADMA mit Biotin-(ε-aminocapronsäure)₂-N-hydroxysuccinimidester; der Einfachheit halber ist nur eine Spacergruppe gezeigt;
2 das Diagramm einer Eich- und Standardkurve für die Kopplung von ADMA mit einem esteraktivierten Biotin-X-X-NHS und den Nachweis des Konjugats mit einem Sandwich-Immunoassay;
3 Reaktionsschema für die Hydrazinkopplung von Pregnenolon mit Biotin-6-Aminocaproylhydrazin.
4a-c Reaktionsschemata für den Nachweise der Diaminooxidase-Aktivität.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Kleine Haptene gemäß der Erfindung sind Moleküle, die so klein sind, dass sie nicht gleichzeitig zwei Antikörper binden können. In Oligopeptiden sind für ein spezifisches Hapten beziehungsweise eine spezifische Antikörperbindungsstelle in der Regel mindestens fünf Aminosäuren erforderlich, bei zyklischen oder verzweigten Peptiden in manchen Fällen sogar mehr. Oligopeptide, die erfindungsgemäß kleine Haptenmoleküle darstellen, besitzen somit zumeist weniger als 12 Aminosäuren, in der Regel weniger als 10 Aminosäuren. Typische Vertreter für Moleküle, die nur einen Antikörper binden können und somit kleine Haptene im Sinne der Erfindung darstellen, sind natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren wie asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), symmetrisches Dimethylarginin, L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin und dergleichen; physiologische Amine wie Serotonin, Histamin, und dergleichen; Katecholamine wie Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine und dergleichen; cholergene Amine wie Adrenalin; und kleine Oligopeptide beziehungsweise kleine Peptidhormone wie die Nonapeptide Vasopressin und Oxytocin, das Dekapeptid Angiotensin-I und oder das Oktapeptid Angiotensin-II, T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin), Steroide wie Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron, und allgemein Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1200 Dalton. Zu den kleinen Haptenmolekülen gehören die meisten Cholesterin-Abkömmlinge und Derivate, da diese in der Regel weniger als zwei Antikörperbindungsstellen besitzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassays werden die Haptenmoleküle in der Probe beispielsweise durch eine Acylierung quantitativ zu einem Moleküle mit zwei Haptenen derivatisiert. Hierzu wird bevorzugt ein Derivatisierungsreagens gewählt, das über einen Spacer mit einer Gruppe gekoppelt ist, die durch einen markierten Sekundärantikörper oder ein Bindeprotein eindeutig und mit hoher Selektivität nachgewiesen werden kann. Ein bevorzugtes Derivatisierungsreagens für diesen Zweck ist beispielsweise D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-Spacer-NHS), wobei mehrere N-Aminocapron-Spacer vorhanden sein können. Besonders bevorzugt ist ein Biotin-Spacer-NHS-Derivatisierungsreagens mit zwei gekoppelten Aminocapronsäure-Spacereinheiten. Allgemein kann das Derivatisierungsreagens für Amino-Haptene folgende allgemeine Formel (I) besitzen R'-(CH₂)_n-(CONH)_m-(CH₂)_p-COOR (I)wobei R eine esteraktivierende Gruppe ist, n und p gleich oder verschieden sind und eine ganze Zahl von 0 bis 12, m gleich 0 bis 4 ist und R' ein Hapten ist, an das ein Antikörper oder ein Bindeprotein binden kann. Als esteraktivierende Gruppen werden bevorzugt N-Hydroxyestergruppen wie zum Beispiel die Hydroxysuccinimidylgruppe, Imidazolide, Pyridazolide, Aminoalkylcarbonsäuren, wobei die Alkylgruppe 2 bis 24 Kohlenstoffatome besitzen kann, oder aktivierte Arylestergruppen wie p-Nitrophenylester. Im Weiteren kann auch die Carboxylfunktion aktiviert werden, beispielsweise mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCCl). Aminogruppenhaltige Haptene können entweder in organischen Medien wie Dioxan oder Dimethylformamid (DMF) unter Zusatz von Triethylamin oder in Puffergemischen, bevorzugt Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 oder höher, mit einem Überschuss Derivatisierungsreagens umgesetzt werden. Ketogruppenhaltige Haptene hingegen werden bevorzugt mit einem Hydrazin-Derivatisierungreagens umgesetzt. SH-haltige Haptene können mit einem Maleinimido-Derivatisierungsreagens umgesetzt werden. Sowohl beim Hydrazin- als auch beim Maleinimido-Derivatisierungsreagens ist die reaktive Gruppe und die Haptengruppe durch einen Spacer der oben beschriebenen Art getrennt, so dass nach der Umsetzung die beiden Haptene voneinander getrennt durch Bindeproteine wie Antikörper, Avidin und Streptavidin gebunden werden können.
Der haptenspezifische Fängerantikörper ist bevorzugt auf der Festphase gebunden und bindet aus der derivatisierten Probe heraus das Hapten an der Oberfläche. Nicht-bindende Substanzen werden weggewaschen. Markierte Sekundärantikörper oder Bindeproteine werden zugegeben. Bevorzugtes Bindeprotein im Fall einer Biotin-Spacer-NHS-Markierung ist Peroxidase markiertes Streptavidin. Es kann aber auch ein anderes übliches Bindeprotein wie Avidin und dergleichen verwendet werden. Das Bindeprotein bindet an der Detektionsgruppe, wobei die Fängerantikörper-Haptenbindung erhalten bleibt. Der Nachweis erfolgt über die Detektion der Markierung. Die Markierung kann beispielsweise ein Enzym sein wie Peroxidase, ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Marker oder unter Umständen auch eine radioaktive Markierung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Analyt ein primäres oder sekundäres Monoamin wie asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), symmetrisches Dimethylarginin (SDMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin und dergleichen; physiologische Amine wie Serotonin, Histamin, und dergleichen; Katecholamine wie Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine und dergleichen; cholergene Amine wie Adrenalin; und kleine Oligopeptide beziehungsweise kleine Peptidhormone wie die Nonapeptide Vasopressin und Oxytocin, das Dekapeptid Angiotensin-I und oder das Oktapeptid Angiotensin-II, T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin). In einer anderen Ausführungsform wird der Analyt durch eine enzymatische Aktivität gebildet oder umgesetzt, mit einem Derivatisierungsreagens gemäß der Erfindung umgesetzt und dann in einem Sandwich-Immunoassay direkt nachgewiesen. Ein Beispiel für diese alternative Ausführungsform ist die Bestimmung der Plasma-Diaminooxidase-Aktivität. Hierbei im Stand der Technik zugesetztes Cadaverin oder Putrescin von der Plasma-DAO in 2,3,4-Trihydropyrrol beziehungsweise 2,3,4,5-Tetrahydropyridin umgewandelt und die DAO-Aktivität über die Edukte nachgewiesen. Statt Cadaverin kann auch 3-(2-Amino-ethyl)-pentan-1,5-diamin eingesetzt werden (siehe 4a). Das enzymatisch gebildete 2-(2,3,4,5-Tetrahydropyridin-4-yl)-ethylamin wird dann mit D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester umgesetzt und das resultierende Derivat in einem Sandwich-Immuno assay direkt nachgewiesen. Alternativ kann auch die Abnahme von eingesetztem Histamin, Cadaverin oder Putrescin bestimmt werden (siehe 4c).
Die Erfindung eignet sich auch für kleine Haptenmoleküle, die keine Amine sind. So können beispielsweise kleine Haptenmoleküle mit einer Ketogruppe mit einem spezifischen Hydrazin-Derivatisierungsreagens wie Biotin-6-aminocaprylhydrazin, Biotin-di(6-aminocapryl)hydrazin, Biotin-(6-aminocapryl)_n-hydrazin, wobei n gleich 1 bis 10 ist, umgesetzt werden. Geeignete Steroide für diesen Nachweis sind beispielsweise Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron, und allgemein Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1200 Dalton, wie die meisten Cholesterin-Abkömmlinge und Derivate.
1 zeigt das Reaktionsschema für die Koppelung von beispielsweise ADMA mit einem esteraktivierten Derivatisierungsreagens, wobei das Reagens selbst die notwendige weitere haptenische Gruppe, nämlich Biotin enthält. 2 zeigt eine typische Standardkurve bei der anschließenden Detektion durch eine standardisierte Farbreaktion mit Peroxidase gekoppelten Streptavidin und Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat. Alternative Substrate wären beispielsweise OPD (1,2-Phenyldiamin × 2 HCl), ABTS und andere. Die Ordinate zeigt die optische Dichte als Mittelwert von zwei Messungen bei 450 nm; die Abszisse die Konzentration an ADMA in μMol/L. 3 zeigt ein Reaktionsschema für die Kopplung von Pregnenolon mit hydrazinaktivierten Derivatisierungsreagens zur Koppelung der Pregnenolon-Gruppe mit einem weiteren Hapten, hier Biotin. Wenngleich diese Derivatisierungsreagenzien seit langem bekannt sind, wurden sie aber bislang nicht eingesetzt, um kleine Moleküle mit nur einem Hapten um ein weiteres Hapten zu vergrößern UND zwar zu dem Zweck, das so erweiterte Hapten direkt in einem Sandwich-Immunoassay zu bestimmen. Die Detektion niedrigkonzentrierter Steroidanalyten kann also über biotingekoppelte Konjugate erfolgen. Die Kopplung kann bei einfachen Ketogruppen, wie im Pregnenolon vorhanden, quantitativ durch eine Hydrazinkopplung mit einem aktivierten Biotin-Derivatisierungsreagens erfolgten. Es sind dann zwei Haptene (Biotin und Pregnenolon) über eine Spacergruppe miteinander gekoppelt. 4 ist ein Beispiel für die Bestimmung der Plasma-Diaminooxidase-Aktivität. Hierbei wird 3-(2-Aminoethyl)-pentan-1,5-diamin von Plasma-DAO zu 2-(2,3,4,5-Tetrahydro-pyridin-4-yl)-ethylamin oxidiert und zyklisiert, die resultierende zyklische Zwischenverbindung mit D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester derivatisiert und das resultierende Derivat in einem Sandwich-Immunoassay nachgewiesen.
BEISPIEL
Beispiel 1
Kopplung von ADMA mit Biotin-X-X-NHS
Es wurde jeweils 20 μL Probe (Serum, Standard beziehungsweise Kontrolle) in die Vertiefung einer 96er Mikrotiterplatte pipettiert; nachstehend auch Kopplungsplatte genannt. Die Probe wurde durch Zusatz von 60 μL 100 mM Carbonatpuffer, pH 9 auf der Kopplungsplatte konditioniert, und 20 μL 100 mM Biotin-X-N-Hydroxysuccinimid [Biotin-(ε-aminocapronsäure)₂-N-hydroxysuccinimidester] in Dimethylformamid zugesetzt und die Platte rotierend bewegt. Es lag im Reaktionsansatz ein etwa 10facher Überschuss an Acylierungsreagens vor bezogen auf die im Serum vorhandenen primären und sekundären Aminogruppen (ca. 2mM Aminosäuren, < 1 mM Amine, 5-10 mM Amin im Humanserumalbumin). Die Serumprobe wurde 45 Minuten bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Danach wurden dem Reaktionsansatz 300 μL Stopp- und Verdünnungspuffer (3 mM Ammoniumchlorid/1% BSA, pH 6,0) zugegeben und dann 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so dass sich bislang nichtumgesetztes Succinimid mit Ammonium abreagieren konnte und der pH für den ELISA zwischen 7,5 und 8 eingestellt war. Anschließend wurde 100 μL gekoppelte Haptenprobe in den Sandwich-Immunoassay eingesetzt.
Enzym-Linked-Immunoassay (ELISA)
Es wurde eine 96er Mikrotiterplatte mit Fängerantikörper (polyklonale Kaninchen-Anti-ADMA-Antikörper) in herkömmlicher Weise beschichtet. Hierzu wurde in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte jeweils 200 ng Anti-ADMA-Antikörper gegeben, gelöst in 100 μL 60 mM NaHCO₃, pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Anti-ADMA-AK-Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween-20) gewaschen.
Dann wurde 100 μL der Biotin-gekoppelten Haptenprobe (Serum, ADMA-Standard beziehungsweise Kontrolle) in Doppelbestimmung in die Vertiefungen der Anti-ADMA-Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte pipettiert, die Vertiefungen mit Folienstreifen abgedeckt, und entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht (15 bis 20 Stunden) bei 2 bis 8°C inkubiert. Die Haptenprobe wurde aus den Vertiefungen entnommen und die Wände der Vertiefungen erneut fünfmal mit 200 μL Waschpuffer und zwischendurch Ausklopfen auf saugfähigem Papier gewaschen. Die quantitative Bestimmung erfolgte mit 100 μL Peroxidase markiertem Streptavidin (1:1 000 verdünnt in Waschpuffer, entsprechend ca. 100 ng). Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden Streptavidin-Lösungen abgenommen und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Für die Farb reaktion wurden 100 μl Tetramethylbenzidin(TMB)-Substrat-Lösung (gebrauchsfertig von NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) in die Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur (18-26°C) im Dunkeln inkubiert. Nach 10 bis 25 Minuten wurde die Farbentwicklung durch Zugabe von 50 μl 2 M H₂SO₄ pro Vertiefung gestoppt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte sofort im Anschluss, wobei die Extinktion im Mikrotiterplatten-Photometer (ELISA-Reader) bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 nm (oder 690 nm) gemessen wurde. Übersteigt die Extinktion des höchsten Standards den Messbereich des Photometers, kann bei 405 nm gegen 620 nm (690 nm) nachgemessen werden. 2 zeigt die Ergebnisse einer typischen Eichkurve am ADMA-Standard. Die eingesetzten Standardkonzentrationen betrugen: 0,01 μM, 0,02 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM und 10 μM. Die Eichkurve ist stetig und im relevanten Messbereich nahezu linear (bei logarithmischen Maßstab), so dass auch geringe Konzentrationen exakt bestimmt werden können. Die physiologische Konzentration von ADMA im Serum beträgt normalerweise etwa 0,3 bis 5 μMol/L.
Beispiel 2
Kopplung von Pregnenolon mit Biotin-6-Aminocaprylhydrazin
Hierzu wurde jeweils 20 μL Probe (Serum, Standard bzw. Kontrolle) in eine vertiefung einer 96er Mikrotiterplatte, der Kopplungsplatte pipettiert. Die Probe wurde durch Zugabe von 60 μL 100 mM Phosphatpuffer, pH 7.5 konditioniert, 20 μL 10 mM Biotin-6-Aminocaprylhydrazin zugesetzt und die Platte rotierend bewegt. Es lag im Reaktionsansatz dann vor ein etwa 10-facher Überschuss an Derivatisierungsreagens bezogen auf die im Serum vorhandenen Aldehyd- und Ketogruppen. Die Probe wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Danach wurden dem Reaktionsansatz 300 μL Stopp- und Verdünnungspuffer (1 mM Aceton in Phosphatpuffer/1% BSA, pH 7.5) zugesetzt und der Ansatz 45 Minuten bei Raumtemperatur rotierend inkubiert, so dass nicht umgesetztes Hydrazinreagens abreagieren konnte. Schließlich wurde das Biotin gekoppelte Pregnenolon in einem Sandwich-Immunoassay (ELISA) analog Beispiel 1 direkt gemessen. Als Fänger-Antikörper wurden kommerzielle anti-Pregnenolon-Antikörper (Immundiagnostik AG, Bensheim, DE), erzeugt gegen ein weiteres Pregenolon-Derivat eingesetzt,
Beispiel 3
Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivität
Die DAO-Aktivität kann entweder über die Umsetzung von Histamin oder ersatzweise über Diaminverbindungen wie 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin, Cadaverin oder Putrescin erfolgen.
Bei der Umsetzung von Histamin ist in dem Assay bei einem Endvolumen von 250 μL enthalten: 100 μL 100 mM Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 50 μL 5 mM Histamin mit 5 mM Biotin-6-Aminocaproyl-hydrazin. Das von der DAO gebildete Histamin-Acetaldehyd wird in situ zur Analytverbindung umgesetzt, die dann über einen Sandwich-Immunoassay mit Hilfe von Peroxidase markiertem Streptavidin direkt nachgewiesen und gemessen wird (siehe 4b). Als Fänger-Antikörper wird ein polyklonaler Antikörper gegen ein anderes Histamin-Derivat eingesetzt.
Alternativ kann die Oxidation von Histamin über dessen Abnahme im Ansatz bestimmt werden. Dann ist in dem Assay bei einem Endvolumen von 250 μL enthalten: 100 μL 0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 25 μL 5 mM Histamin. Das Histamin wird zum Histamin-Acetaldehyd abgebaut. Verbliebenes Histamin wird nach Umsetzung mit Biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM Biotin-XX-NHS in DMF), Bindung an einen ersten Fänger-Antikörper auf einer festen Phase, und Nachweis über Peroxidase markiertes Streptavidin wie in Beispiel 1 in einem Sandwich-Immunoassay direkt gemessen (siehe 4c). Als Fänger-Antikörper wird ein polyklonaler Antikörper gegen ein anderes Histamin-Derivat eingesetzt.
In einer weiteren Alternative kann in dem Assayansatz bei einem Endvolumen von 250 μL enthalten sein: 100 μL 0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 25 μL Substrat (z.B. 5 mM 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin). Das resultierende zyklische Substrat wird mit Biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM Biotin-XX-NHS in DMF) wie in Beispiel 1 derivatisiert und in einem Sandwich-Immunoassay mit Peroxidase markiertem Streptavidin wie in Beispiel 1 bestimmt (siehe 4a). Als Fänger-Antikörper wird ein polyklonaler Antikörper gegen ein Derivat von 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin eingesetzt.

Claims

Sandwich-Immunoassay für die Bestimmung kleiner Haptenmoleküle, an die nur ein Antikörper binden kann, umfassend die Verfahrensschritte in der angegebenen Folge: (i) Zusetzen zu einer Probe, in die zu bestimmenden Haptenmoleküle vorliegen, eines stöchiometrischen Überschusses eines reaktiven Detektions- und Derivatisierungsmittels, beinhaltend eine chemisch reaktive Gruppe, einen Spacer und eine Detektionsgruppe, das sich mit den zu bestimmenden Haptenmolekülen quantitativ umsetzt, so dass man eine Analytverbindung erhält, in der das kleine Hapten über einen Spacer mit einer Detektionsgruppe verknüpft ist; (ii) Bereitstellen von spezifischen ersten Fänger-Antikörpern gegen das Hapten, fakultativ gebunden an einer festen Phase, Zusammenbringen der Probe mit der Analytverbindung mit den spezifischen ersten Fänger-Antikörpern, und Herstellen eines Komplexes aus Analytverbindung und erstem Antikörper, fakultativ gebunden an einer festen Phase; (iii) Zusammenbringen des Komplexes aus erstem Antikörper und Analytverbindung mit einem Bindeprotein, das spezifisch an die Detektionsgruppe bindet, und (iv) Detektieren der Menge an Bindeprotein, das an dem Komplex aus erstem Antikörper und Analytverbindung gebunden ist.
Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine primäre oder sekundäre Aminogruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine esteraktivierende oder eine acylierende Gruppe aufweist.
Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine einfache Keto- oder Aldehydgruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Hydrazingruppe aufweist.
Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine einfache Keto- oder Aldehydgruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Hydrazin- oder eine Carbodiimid-Gruppe aufweist.
Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine SH-Gruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Maleinimid-Gruppe aufweist.
Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 2, wobei das chemisch reaktive Detektionsmittel eine N-Hydroxysuccinimid-Gruppe aufweist.
Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 6, wobei das chemisch reaktive Detektionsmittel Biotin-X-NHS (Biotin-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester) oder Biotin-(X)_1-5-NHS ist, wobei X 7-Aminocapronsäure oder ein Spacer mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen ist.
Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, wobei das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Desthiobiotin, substituierten und derivatisierten Aminosäuren, Oligopeptiden, FITC, Avidin, Streptavidin.
Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, wobei das kleine Haptenmolekül ausgewählt ist aus natürlichen und nichtnatürlichen Aminosäuren, asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin; physiologischen Aminen, Serotonin, Histamin; Katecholaminen, Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine; cholergenen Aminen, Adrenalin; Oligopeptiden und kleine Peptidhormonen mit bis zu 12 Aminosäuren; Nonapeptiden, Vasopressin Oxytocin; Dekapeptiden, Angiotensin-I; Oktapeptiden, Angiotensin-II; T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin); Steroiden, Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron.
Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung von ADMA in Plasma, Serum oder Blut.
Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung von Pregnenolon in Plasma, Serum oder Blut.
Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung einer Enzymaktivität in Plasma, Serum oder Blut, wobei das in der Enzymreaktion umgesetzte Substrat ein kleines Hapten mit weniger als 1200 Dalton ist.
Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 12 zur Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivität in Plasma, Serum oder Blut.
Kit für einen Sandwich-Immunoassay nach einem der Ansprüche 1 bis 13, enthaltend einen Chemikaliensatz für die Derivatisierung des kleinen Haptens, Antikörper und/oder Bindeprotein, sowie einen Chemikaliensatz für die Detektion.