DE3783928T2

DE3783928T2 - Verfahren zur immunoassay.

Info

Publication number: DE3783928T2
Application number: DE8787302427T
Authority: DE
Inventors: Gerald John Allen; Roger David Philo
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Biochem Immunosystems (ndgesd Staates D LLC
Priority date: 1986-03-21
Filing date: 1987-03-20
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2007-03-21
Also published as: DE3783928D1; EP0238353A3; US5108896A; ES2053532T3; GR3007359T3; EP0238353B1; EP0238353A2; ATE85434T1; GB8607101D0; JPS62284262A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Immunoassay-Verfahren von Antigenen und Kits zur Durchführung solcher Verfahren. Insbesondere betrifft sie Immunoassay-Methoden unter Verwendung von Enzymmarkierungen (im folgenden als Enzym-Immunoassays bezeichnet), wodurch zwei Antigene gleichzeitig in einer einzigen Probe bestimmt bzw. untersucht werden.
Der Ausdruck "Antigen", wie er hier verwendet wird, soll so verstanden werden, daß er sowohl permanent antigenes Species (beispielsweise Proteine, Peptidhormone, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) einschließt als auch Haptene, welche unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können (einschließlich beispielsweise Narkotika, Hypnotika, Analgetika, kardiovaskuläre Arzneimittel, Vitamine, Nicht-Peptidhormone und Metaboliten davon, Antibiotika, Pestizide und Zucker).
Radioimmunoassays, welche gleichzeitig zwei verschiedene Analyte in einer einzigen Probe messen können, sind seit mehreren Jahren zugänglich geworden. Das Prinzip dieser Dualanalyt- oder "Combo"-Assays ist, daß zwei übliche Assays bzw. Bestimmungen gleichzeitig in dem gleichen Reaktionsgefäß durchgeführt werden, wobei die Zweikomponenten-Assays unterschiedliche Radionuklidmarkierungen verwenden, welche voneinander durch ihre unterschiedlichen Energiespiegel unterschieden werden können. Geeignete Paare von Radionukliden, welche verwendet wurden, umfassen ¹²&sup5;I/¹³¹I und ¹²&sup5;I/&sup5;&sup7;Co. Solche Dual-/Radio-Immunoassays bieten ausgeprägte Vorteile hinsichtlich Zweckmäßigkeit, Geschwindigkeit des Erhalts von Ergebnissen, Laboratoriumsdurchsatz, usw. und wurden in weitem Maße auf solchen Gebieten akzeptiert, wo es Routinepraxis ist, zwei Analyte in einer einzigen Probe zu messen (z. B. Vitamin B&sub1;&sub2; und Folat zur Differentialdiagnose gewisser Anämien). Jedoch leiden diese Versuche bzw. Bestimmungen unter den gleichen innewohnenden Nachteilen wie alle Untersuchungen unter Verwendung kurzlebiger Radionuklide als Markierungen. Diese schließen ein kurze Lagerbeständigkeit, Aussetzen des Benutzers der Bestrahlung und das Erfordernis für spezielle Einrichtungen und Probleme mit der Beseitigung des Abfalls.
Die Verwendung von nicht-radioaktiven Markierungen überwindet diese Probleme und gegenwärtig sind Enzymmarkierungen der meiste normalerweise verwendete Ersatz für Immunoassays. Für Enzyme, die in "Combo"-Assays verwendet werden sollen, ist es notwendig, zwei geeignete Enzym-Substratpaare festzustellen, welche nicht nur die Kriterien erfüllen, die für Enzym-Immunoassays notwendig sind (Fähigkeit an einen der Reaktanten konjugiert zu werden mit geringem oder keinem Verlust an Enzym oder immunologischer Aktivität, Freiheit von Überlagerung durch die Probe oder die Untersuchungsbedingungen, etc.), welche jedoch unter gewissen Bedingungen während der Immunoreaktion nicht gegenseitig aufeinander einwirken und gleichzeitig getrennte Substratumwandlungen katalysieren können, um Produkte zu erzeugen, welche unabhängig voneinander gemessen werden können, entweder durch direktes Überwachen ihrer Erzeugung oder durch Überwachen der Entfernung von Substrat während der Inkubationszeit.
Blake et al. berichteten in Clinical Chemistry (1982), 28, 1469-1473, über die Entwicklung eines Dualanalyt-Enzym-Immunoassays für die zwei Haptenhormone Thyroxin (T&sub4;) und Tr&ijlig;odthyronin (T&sub3;), was die Verwendung von alkalischer Phosphatase und β-Galactosidase als Enzymmarkierungen und Phenolphthaleinmonophosphat und o-Nitrophenyl-β-galactosid (o-NPBG) als jeweilige Substrate einschließt. Bei dieser Untersuchung bzw.
Bestimmung konkurrieren zuerst unmarkiertes T&sub3; und T&sub4; mit T&sub3;-β-Galactosidase-Konjugat bzw. T&sub4;-alkalische Phosphatase-Konjugat zur Bindung an ein Antikörperreagens umfassend T&sub3;- und T&sub4;-spezifische Antikörper. Die gebundenen Fraktionen der zwei Enzymmarkierungen werden durch eine zweite Antikörperausfällung getrennt und nach Waschen wird die Ausfällung wieder in einer Enzymsubstratlösung suspendiert, die Phenolphthaleinmonophosphat und o-Nitrophenyl-β-galactosid enthält. Die Mengen an den zwei Enzymmarkierungen werden dann aufeinanderfolgend in einem Zweistufen-Inkubationsprotokoll bestimmt. Da die zwei Enzymreaktionen eher aufeinanderfolgend als gleichzeitig durchgeführt werden, ist diese Untersuchung nicht ein richtiger "Combo"-Immunoassay. Es wurde jedoch nun gefunden, daß es tatsächlich machbar ist, echte "Combo" (Kombinations)-Immunoassays unter Verwendung von zwei Enzymmarkierungen durchzuführen.
Die Enzymmarkierungen (und daher indirekt die Antigene) können durch direkte Überwachung der Produkte der Enzym-katalysierten Substratumwandlungen quantativ bestimmt werden. Alternativ können die Enzymmarkierungen durch Überwachung der Entfernung von Substrat während der Inkubationsperiode quantitativ bestimmt werden.
Alkalische Phosphatase und β-Galactosidase sind gegenwärtig besonders bevorzugt zur Verwendung als Markierungen in üblichen Enzym-Immunoassays in erster Linie weil sie leicht an andere Proteine z. B. Antikörper geknüpft werden können, ohne wesentlichen Verlust an Aktivität und Reaktionen katalysieren, welche zur Bildung gefärbter Produkte führen. Es wurde nun gefunden, daß es unter gewissen Bedingungen möglich ist, echte "Combo" (Kombinations)-Enzym-Immunoassays unter Verwendung alkalischer Phosphatase und β-Galatosidase als die beiden Enzymmarkierungen durchzuführen.
Das optimale pH für die Hydrolyse von Phenolphthaleinmonophosphat durch alkalische Phosphatase ist 9,8. In Gegenwart einer hohen Konzentration (z. B. etwa 1 M) Diethanolamin kann das pH jedoch auf 8,6 ohne Verlust an Aktivität vermindert werden.
β-Galactosidase hat ein pH-Optimum von 7,4 für p-Nitrophenylβ-D-galactosid (p-NPBG), obzwar in einer einzigen Versuchsanordnung unter Verwendung normaler Substratkonzentrationen (bis zu etwa 5 mM) das pH auf 8,6 mit nur geringem Verlust (etwa 20%) an Aktivität erhöht werden kann. Jedoch wurde gefunden, daß in dem gleichen Versuchssystem, jedoch etwa 1 M Diethanolamin enthaltend-die Aktivität von β-Galactosidase fast gänzlich aufgehoben wird. Die Kinetik der Inhibierung von alkalischer Phosphatase durch Diethanolamin ist komplex, jedoch ist der Haupteffekt ein kompetitiver mit der Michaelis-Konstante (Km) der β-Galactosidase für p-NPBG in Anwesenheit von 1 M Diethanolamin, welche von 66 um auf 21 mM geändert wird. Es wurde jedoch ebenfalls gefunden, daß durch Erhöhung der Konzentration von β-NPBG bei pH 8,6, selbst in Anwesenheit von etwa 1 M Diethanolamin, eine wesentliche Aktivität von β-Galactosidase erreicht werden kann. Eine wesentliche Aktivität von β-Galactosidase wird auch erhalten, wenn das gleiche Reaktionsmedium verwendet wird, jedoch die p-NPBG durch o-NPBG ersetzt wird.
So wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Dualanalyt-Enzym-Immunoassay zur Bestimmung von zwei Antigenen in einer einzigen flüssigen Probe geschaffen, wobei die beiden Immunoreaktionen gleichzeitig ausgeführt werden und wobei die Enzym/Substratpaare β-Galactosidase/Nitrophenyl-β- D-galactosid (p- und/oder o-) und alkalische Phosphatase/Phenolphthaleinmonophosphat in dem Enzymreaktionsschritt verwendet werden, wobei die Enzymreaktionen bei einem pH zwischen 7 und 10 in Anwesenheit von Diethanoamin durchgeführt werden unter Verwendung einer Konzentration von Nitrophenyl-β-D-galactosid die ausreicht, daß die Inhibierung von β-Galactosidase durch das Diethanolamin im wesentlichen ausgeglichen wird derart, daß die zwei Enzymreaktionen gleichzeitig ablaufen.
Die Umwandlung von Phenolphthaleinmonophosphat zu Phenolphthalein durch alkalische Phosphatase kann durch Messung des Absorptionsvermögens bei 554 nm überwacht werden, während die Umwandlung von p-NPBG zu p-Nitrophenol oder o-NPBG zu o-Nitrophenol durch β-Galactosidase durch Messung des Absorptionsvermögens bei 404 nm überwacht werden kann, wobei eine Korrektur für das niedrige Absorptionsvermögen von Phenolphthalein bei dieser Wellenlänge gemacht wird.
Die Produkte der beiden gleichzeitig ablaufenden Enzymreaktionen können gleichzeitig überwacht werden unter Verwendung eines Spektrophotometers in Diodenartanordnung, jedoch müssen in einem konventionellen Spektrophotometer die O.D.-Messungen bei 404 nm und 554 nm notwendigerweise getrennt werden.
Die Konzentration an Diethanolamin, die in dem Enzymreaktionsmedium vorliegt, kann eingestellt werden, um die Signale ins Gleichgewicht zu bringen, die von den zwei Enzymen erhalten werden, da eine Verminderung der Diethanolaminkonzentration die Aktivität der alkalischen Phosphatase senken und die Aktivität der β-Galactosidase steigern wird und eine Erhöhung der Konzentration an Diethanolamin die gegenteiligen Effekte haben wird. Im allgemeinen wird die angewandte Konzentration an Diethanolamin im Bereich von 0,25 M bis 1 M liegen. Die Signale können auch ausgeglichen werden durch Einstellung des pH-Werts des Reaktionsmediums entweder um die Aktivität der alkalischen Phosphatase bei einem pH größer als 8,6 zu begünstigen oder die β-Galactosidaseaktivität bei einem pH weniger als 8,6 zu begünstigen. Der pH-Wert wird jedoch vorzugsweise zwischen 8,5 und 8,7 sein.
Es ist vorzuziehen, die Aktivitäten der zwei Enzyme unter Verwendung von Substratkonzentrationen von wenigstens dem 5- fachen des Km-Werts des entsprechenden Enzyms zu schätzen, so daß irgendwelche kleinen Schwankungen in der Substratkonzentration die Geschwindigkeit der Enzym-katalysierten Reaktion nicht wesentlich beeinflussen. Es ist ganz besonders bevorzugt, p-NPBG als Substrat für die β-Galactosidasemarkierung zu verwenden, vorzugsweise bei einer Konzentration von etwa 50 mM. So können beispielsweise die Mengen der zwei Markierungen, welche aus der Analysenmischung in dem Trennungsschritt entfernt werden, zweckmäßig bestimmt werden durch Inkubation in Gegenwart einer Substratpufferlösung bei einem pH von etwa 8,6, die ursprünglich 0,25 M bis 1 M Diethanolamin, 3 bis 10 mM Phenolphthaleinmonophosphat und etwa 50 mM p- Nitrophenyl-β-D-galactosid umfaßte.
In einem solchen Immunoassay können entweder ganze Antikörper verwendet werden oder mindestens einer der Antikörperreagentien kann Fragmente von Antikörpern, welche eine Antigenbindungsstelle haben, enthalten. Es wird vorausgesetzt, daß der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird, in seinem Bereich umfaßt:
a) Irgendwelche der verschiedenen Klassen oder Unterklassen von Immunoglobulin, z. B. IgG oder IgM, stammend von irgendwelchen üblicherweise verwendeten Tieren, z. B. Schafe, Kaninchen, Ziegen oder Mäuse;
b) monoklonale Antikörper; und
c) Fragmente von Antikörpern, monoklonal oder polyklonal, wobei die Fragmente solche sind, welche die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, d. h. Fragmente ohne den Fc-Teil (z. B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) oder die sogenannten "Halbmolekül"-Fragmente, welche durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen erhalten werden, welche die schweren Hauptkettenkomponenten in dem intakten Antikörper verbinden.
Die Verfahren zur Herstellung von Antigen-bindenden Fragmenten von Antikörpern sind in der Fachwelt gut bekannt und werden hier nicht beschrieben. Die Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind ebenfalls gut bekannt (vgl. beispielsweise Galfre G. & Milstein c. (1981) "Preparation of Monclonal Antibodies: Strategies and Procedures" in Methods in Enzymology, 73, 1-46).
Die Immunoassays der vorliegenden Erfindung sind besonders vorteilhaft zur Untersuchung von Paaren von Antigenen, welche zusammen in physiologischen Proben gefunden werden, z. B. Humanserumproben oder Urinproben erhalten von gesunden oder kranken Patienten. Solche Enzym-Immunoassays sind beispielsweise erwünscht zur Untersuchung von Paaren von Hormonen einschließlich beispielsweise T&sub4; (Thyroxin)/T&sub3; (Tr&ijlig;odthyronin), LH (lutenisierendes Hormon)/FSH (Follikel-stimulierendes Hormon) und T&sub4;/TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon).
Ein Dualanalyt-Enzym-Immunoassay gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise umfassen zwei gleichzeitige 1- Stellen Enzym-immunometrische Assays, vorzugsweise von dem indirekten Verknüpfungstyp, der in der parallelen veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 177 191 (im folgenden als 1-Stellen-IEMA bezeichnet) beschrieben ist, gleichzeitige 2-Stellen Enzym-immunometrische Assays, vorzugsweise von dem indirekten Verknüpfungstyp analog zu dem radioimmunometrischen Assay, der in der parallelen veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 105 714 (im folgenden als 2-Stellen-IEMA bezeichnet) beschrieben ist, oder ein 1-Stellen Enzym-immunometrischer Assay gleichzeitig mit einem 2-Stellen Enzym-immunometrischen Assay. β-Galactosidase und alkalische Phosphatase können zweckmäßig an Antikörper konjugiert sein zur Verwendung in solchen Dualanalyt-Enzym-Immunoassays mittels eines heterobifunktionellen Reagens (vgl. beispielsweise (Ishikawa et al. in J. Immunoassay, 4, 209-327 (1983)).
Ein 1-Stellen Enzym-immunometrischer Assay ist geeignet zur Bestimmung eines Antigens, das ein oder mehrere Epitopen hat. In einem üblichen 1-Stellen Enzym-immunometrischen Assay konkurriert das untersuchte Antigen (im folgenden als "Ligand" bezeichnet) mit einem Ligandenanalogen (d. h. ein Reagens, welches die gleichen komplexierenden Eigenschaften wie der Ligand hat, wobei der Ausdruck "Ligananaloges" in seinem Bereich eine bekannte Menge des untersuchten Liganden einschließt) für den Enzym-markierten Antikörper und nach Beendigung der komplexierenden Reaktion wird das Ligandenanaloge mit dem gebundenen markierten Antikörper von der Versuchsmischung abgetrennt. Die Menge des Ligandenanalogen, welches mit dem markierten Antikörper bindet, wird umgekehrt proportional zu der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden sein. Gewöhnlich wird das Ligandenanaloge auf einem festen Träger immobilisiert, um den Abtrennungsschritt zu erleichtern. Nach der Abtrennung des festen Trägers (zusammen mit dem Ligandenanalogen und einem Anteil der markierten Komponente) aus der Versuchsmischung, nachdem die Komplexierungsreaktion aufgetreten ist, wird der Mengenanteil der markierten Komponente, welche an das Ligandenanaloge komplexiert wurde, bestimmt und die Menge des Liganden dadurch errechnet.
In einem verbesserten 1-Stellen Enzym-immunometrischen Assay des Typs, der in der veröffentlichten europäischen Anmeldung 177 191 offenbart ist, wird das Ligandenanaloge nicht direkt an den festen Träger gebunden. Statt dessen wird das Ligandenanaloge an ein Reagens X konjugiert, z. B. ein Hapten, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), und die feste Phase hat daran konjugiert einen Bindungspartner, spezifisch für das Reagens X. Ein 1-Stellen-IEMA für das Hapten-Hormon Thyroxin (T&sub4;), worin das Ligandenanaloge T&sub4;-FITC ist, ist schematisch in Fig. 1 erläutert.
Ein bevorzugter Dualanalyt-Enzym-Immunoassay gemäß der vorliegenden Erfindung, worin die Teil-Assays (component assays) zwei 1-Stellen-IEMA sind, wird daher umfassen das Bebrüten einer Mischung von
a) der flüssigen Probe (enthaltend zwei Analytliganden jedes mit einem oder mehreren Epitopen),
b) eine oder mehrere Populationen von alkalische Phosphatasemarkierten Antikörpermolekülen spezifisch für den ersten Analytliganden,
c) eine oder mehrere Populationen von β- Galactosidase-markierten Antikörpermolekülen spezifisch für den zweiten Analytliganden,
d) ein Ligandenanaloges des ersten Analytliganden konjugiert an ein Reagens X (dieses Reagens ist als freies Reagens in der Mischung nicht vorhanden), und
e) ein Ligandenanaloges des zweiten Analytliganden konjugiert an das genannte Reagens X;
Abtrennen nach einer geeigneten Inkubationszeit des Teils, der die Komponenten (d) und (e) enthält, von dem Gemisch mittels einer festen Phase, welche einen Bindungspartner spezifisch für das Reagens X trägt; Bebrüten dieser festen Phase oder der flüssigen Phase in Anwesenheit von p-Nitrophenyl-β- D-galactosid, Phenolphthaleinmonophosphat und 0,25 M bis 1 M Diethanolamin bei einem pH von etwa 8,6, wobei die Konzentration des p-Nitrophenyl-β-D-galactosids ausreichend ist, um die Inhibierung der β-Galactosidase durch das Diethanolamin im wesentlichen auszuschalten; und Überwachen der Produktion von Phenolphthalein und p-Nitrophenol.
Ein solcher Dual-Enzymimmunoassay kann beispielsweise zweckmäßig verwendet werden, um gleichzeitig T&sub4; und T&sub3; in einer einzigen Probe zu untersuchen bzw. bestimmen.
In einem üblichen 2-Stellen-enzymimmunometrischen Test (gewöhnlich bezeichnet als Sandwich-Enzymimmunoassay) wird der Ligand der zwei oder mehr Epitopen haben muß, unlöslich gemacht durch Reaktion mit einem unmarkierten Antikörper, der an eine feste Phase konjugiert ist und zur Reaktion gebracht mit einem Enzym-markierten Antikörper, der auf ein anderes (vorzugsweise in räumlichem Abstand) Epitop des Liganden gerichtet ist. Die Menge des markierten Antikörpers, die aufgrund der Komplexierungsreaktion immobilisiert wird, ist direkt proportional zu der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden.
Verbesserte 2-stellen-enzymimmunometrische Tests vom Indirekt- Verknüpfungstyp (2-Stellen IEMAs) verwenden zwei lösliche Antikörper-Reagentien, die auf zwei verschiedene Epitope des Liganden gerichtet sind, wobei ein lösliches Antikörper-Reagens Enzym-markierte Antikörpermoleküle umfaßt. Die verwendete feste Phase ist konjugiert an ein weiteres Reagens, das in der Lage ist, die nicht-markierten Antikörper spezifisch nicht-kovalent an den Liganden zu binden. Diese Antikörper können beispielsweise zweckmäßig an ein Reagens X konjugiert sein. Der Trennungsschritt wird dann vollzogen durch Verwendung einer festen Phase konjugiert an einen spezifischen Bindungspartner für Reagens X. Ein solcher 2-Stellen-enzymimmunometrischer Assay vom indirekten Verknüpfungstyp ist graphisch in Fig. 2 dargestellt.
Ein bevorzugter Dualanalyt-Enzymimmunoassay gemäß der vorliegenden Erfindung, worin die Teil-Assays (componentassays) zwei 2-Stellen-IEMAs sind, umfaßt das Bebrüten eines Gemisches von
a) der flüssigen Probe (enthaltend zwei Analytliganden mit mehr als einem Epitop),
b) einer oder mehreren Populationen von alkalische Phosphatase-markierten Antikörpermolekülen spezifisch für den ersten Analytliganden,
c) einer oder mehreren Populationen von β-Galactosidasemarkierten Antikörpermolekülen spezifisch für den zweiten Analytliganden,
d) ein Reagens umfassend Antikörper für den ersten Analytliganden konjugiert an ein Reagens X (dieses Reagens ist nicht als freies Reagens in dem Gemisch vorhanden),
e) ein Reagens umfassend Antikörper für den zweiten Analytliganden konjugiert an das genannte Reagens X, und
f) ein Reagens, das an Reagens X durch nicht-kovalente Bindung zu binden vermag, das jedoch nicht direkt zu der Komponente (a) oder den Komponenten (b) und (c) bindbar ist, wobei dieses Reagens (f) an einen feste Phase-Träger gebunden ist;
Abtrennen der Feststoff-Fraktion aus der flüssigen Fraktion nach einer geeigneten Bebrütungsdauer; Bebrüten der abgetrennten festen Phase oder flüssigen Phase in Gegenwart von p-Nitrophenyl-β-D-galactosid, Phenolphthaleinmonophosphat und 0,25 M bis 1 M Diethanolamin bei einem pH von etwa 8,6, wobei die Konzentration des p-Nitrophenyl-β-D-galactosids ausreichend ist, um die Inhibierung der β-Galactosidase durch das Diethanolamin im wesentlichen auszuschalten; und Überwachen der Produktion von Phenolphthalein und p-Nitrophenol.
Ein Beispiel für ein Paar von Liganden, für die ein solcher Dualanalyt-Enzymimmunoassay gemäß der Erfindung besonders erwünscht ist, sind die Hormone LH (lutenisierendes Hormon) und FSH (Follikel-stimulierendes Hormon).
Für gewisse Paare von Liganden, z. B. T&sub4; und TSH, kann es besonders erwünscht sein, einen Dualanalyt-Enzymimmunoassay gemäß der Erfindung zu bewirken, der aus einem 1-Stellen-IEMA gleichzeitig mit einem 2-Stellen-IEMA besteht. Ein bevorzugter Dualanalyt-Enzymimmunoassay dieses Typs umfaßt das Bebrüten eines Gemisches von
a) der flüssigen Probe (enthaltend zwei Analytliganden, wobei mindestens ein Analytligand mehr als ein Epitop hat),
b) einer oder mehreren Populationen von alkalische Phosphatase-markierten Antikörpermolekülen spezifisch für einen Analytliganden,
c) einer oder mehreren Populationen von β-Galactosidasemarkierten Antikörpermolekülen spezifisch für den zweiten Analytliganden,
d) einem Ligaiidenanalogen; von einem der Analytliganden konjugiert an ein Reagens X (das genannte Reagens ist als freies Reagens in dem Gemisch nicht anwesend),
e) einem Reagens umfassend Antikörper zu dem Analytliganden, für das die Komponente (d) nicht ein Ligandenanaloges konjugiert an dieses Reagens X ist, wobei der Analytligand, für den das Reagens (e) spezifisch ist, mehr als ein Epitop hat, und
f) einem Reagens, das an Reagens X durch nicht-kovalente Bindung zu binden vermag, das jedoch nicht direkt bindbar an Komponente (a) oder die Komponenten (b) und (c) ist, und dieses Reagens (f) an einen feste Phase-Träger gebunden ist;
Abtrennen der Festkörper-Fraktion aus der flüssigen Fraktion nach einer geeigneten Bebrütungsdauer; und Bestimmen der Mengen der zwei Enzym-Markierungen in einer der genannten Fraktionen wie vorstehend beschrieben.
Durch den Ausdruck "nicht-kovalente Bindung", wie er hier verwendet wird, ist immunologische Bindung gemeint wie in einer Antikörper:Antigen- oder Antikörper:Hapten-Bindung oder nichtimmunologische feste Verbindung (bonding) wie zwischen einem spezifischen Bindungsprotein und seinem Liganden, z. B. wie bei der Wechselwirkung zwischen Protein A und dem Fc-Teil eines Antikörpers oder die Wechselwirkung zwischen Avidin und Biotin.
Bei einem bevorzugten Dualanalyt-Enzymimmunoassay gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend beschrieben, worin die Teil-assays (component assays) zwei 1-Stellen-IEMAs, zwei 2-Stellen-IEMAs oder ein 1-Stellen-IEMA und ein 2-Stellen-IEMA ist, ist es besonders zweckmäßig für das Reagens X ein Hapten zu sein, beispielsweise ausgewählt aus Fluoresceinderivaten (z. B. Fluoresceinisothiocyanat), Rhodaminisothiocyanat, 2,4-Dinitrofluorbenzol, Phenylisothiocyanat und Dansylchlorid und für die feste Phase an einen Antikörper spezifisch für das ausgewählte Hapten konjugiert zu sein. Speziell bevorzugt als Reagens X ist FITC, in welchem Falle Anti-FITC-Antikörper kovalent an den festen Träger geknüpft ist. Ein Antiserum zu FITC kann leicht in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Immunisierung von Schafen mit FITC konjugiert an Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin (keyhole limpet haemocyanin). Die Kopplung des Antiserums an den festen Träger kann betroffen sein beispielsweise durch das Verfahren von Axen et al., (Nature 214, 1302-1304 (1967)). die Verwendung des Bindungspaares Avidin/Biotin ist ebenfalls sehr bevorzugt. Zweckmäßig kann die feste Phase magnetisierbare Teilchen, beispielsweise magnetisierbare Celluloseteilchen, enthalten (vgl. Forrest and Rattle "Magnetic Particle Radioimmunoassay" in "Immunoassays for Clinical Chemistry", S. 147-162, Verl. Hunter and Corrie, Churchill Livingstone, Edinburgh (1983)).
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung werden Kits von Reagentien zur Durchführung des Assayverfahrens gemäß der Erfindung vorgesehen. Ein solches Kit für einen bevorzugten Dualanalyt-Enzymimmunoassay, wie vorstehend beschrieben, worin die Teil- bzw. Beispiels-assays zwei 1-Stellen-IEMAs, zwei 2-Stellen-IEMAs oder ein 1-Stellen-IEMA und ein 2-Stellen-IEMA hat, kann beispielsweise geeignete Komponenten (b), (c), (d) und (e) enthalten und eine feste Phase, welche einen Bindungspartner spezifisch für das Reagens X trägt.
Wegen der Zweckmäßigkeit der Verwendung können zwei oder mehr der Komponenten (b), (c), (d) und (e) in einem einzigen Reagens kombiniert werden. Eine oder mehrere dieser Komponenten können in lyophilisierter Form geliefert werden.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern.

Beispiel

Ein gleichzeitiger Dualanalyt-Enzymimmunoassay für LH und FSH, worin die Teil- bzw. Beispiels-Assays zwei indirekt-Verknüpfungs-Sandwich-immunometrische Assays sind.

(i) Herstellung der monoklonalen Antikörper

Monoklonale Antikörper für LH und FSH wurden aus Maus-Ascitesflüssigkeit durch das Verfahren erhalten, das von Köhler und Milstein in Nature, 256 (1975), 495-497, beschrieben wurde. Antikörper von individuellen Hybridoma-Zellinien wurden dem Screening unterworfen, um solche zu identifizieren, die Antikörper zu diskreten antigenen Determinanten erzeugen. Solche Antikörper mit den höchsten Affinitäten für die in Frage stehenden Antigene wurden zur Verwendung in dem Assay ausgewählt.

(ii) Herstellung der Antikörper-Reagentien

(a) Anti-LH-alkalische Phosphatase

Eine Population von monoklonalen Antikörpern für LH wurde mit dem Enzym alkalische Phosphatase folgendermaßen markiert. 0,16 ml N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl-9-cyclohexan-1- carboxylat (SMCC) (60 mM in Dimethylformamid-DMF) wurde zu 1,6 ml alkalischer Phosphatase (2 mg/ml in 50 mM Natriumborat, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid, pH 7,6) gegeben, und während einer Stunde bei 30ºC inkubiert. Das Enzym wurde durch Durchleiten durch eine mittlere Sephadex- (Warenzeichen) G-25-Säule (1·35 cm) abgetrennt, die mit 0,1 M Tris, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid, pH 7,0 äquilibriert war.
Das gereinigte Enzym wurde bei +4ºC aufbewahrt, bis es benötigt wurde.
16,3 ul N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) (25 mM in Ethanol) wurde zu 1 ml Anti-LH-monoklonalem Antikörper (3 mg/ml in 200 mM Natriumpropionat, pH 6,0) gegeben und während 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet. Der Antikörper wurde abgetrennt durch Durchleiten durch eine verfügbare Sephadex (Warenzeichen) G-25-Säule (PD-10), äquilibriert in 200 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,5. Dithiothreitol (1 M) wurde zu dem Antikörper (1/20 des zugesetzten Antikörpervolumens) zugefügt und während 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Antikörper wurde entsalzen unter Verwendung einer mittleren Sephadex (Warenzeichen) G-25-Säule (1·35 cm) äquilibriert in 200 mM Natriumpropionat, pH 6,0.
Antikörper und alkalische Phosphatase hergestellt wie oben wurden in äquimolarem Verhältnis vermischt und während 24 Stunden bei 4ºC konjugieren gelassen. Das erhaltene Konjugat wurde gereinigt durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer TSK 3000 SW-Säule, äquilibriert 200 mM Natriumpropionat, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid bei pH 6,0.

(b) Anti-LH-FITC

Eine zweite Population von monoklonalen Antikörpern gerichtet auf ein unterschiedliches Epitop von LH wurde mit FITC markiert. Die Konjugation von FITC an diese zweiten Population von monoklonalen Antikörpern wurde vollzogen durch Reaktion von 200 ug EITC (Sigma London Chemical Co., England) mit 5 mg Antikörper in 1,4 ml Natriumbicarbonatpuffer, 0,2 M, pH 9,0 während 18 Stunden bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde gereinigt durch Gelfiltration an superfeinem Sephadex (Warenzeichen) G-50 und ergab ein Produkt, das im Durchschnitt 6 Moleküle FITC pro Antikörpermolekül einverleibt hatte.

(c) Anti-FSH-β-galactosidase

150 ul SPDP (25 mM in Ethanol) wurden zu 9,4 ml Anti-FSH- Antikörper bei 100 ug/ml in 0,2 M Natriumpropionatpuffer bei pH 6,0 gegeben und bei Raumtemperatur während 30 Minuten bebrütet. Der entstandene Antikörper wurde dann gereinigt durch Hinunterleiten durch eine HPLC-TSK 3000 SW-Säule äquilibriert in Natriumpropionatpuffer (0,02 M, pH 6,0). Der so erhaltene Antikörper wurde dann mit einer äquimolaren Konzentration von β-Galactosidase gemischt und über Nacht bei 4ºC bebrütet, vor der Reinigung auf einer TSK 4000-Säule äquilibriert in Natriumpropionatpuffer (0,2 M, pH 6,0).

(d) Anti-FSH-FITC

Eine zweite Population von monoklonalen Antikörpern gerichtet auf ein unterschiedliches Epitop von FSH wurde konjugiert an FITC unter Verwendung der gleichen Methode wie sie zur Herstellung des Anti-LH-FITC-Konjugats verwendet wurde.

(e) Herstellung von "Antikörper-Reagens-Cocktail"

Ein "Reagens-Cocktail" wurde hergestellt, bestehend aus Anti- FSH-Antikörper konjugiert an β-Galactosidase (5 ug/ml), Anti- FSH-Antikörper konjugiert an FITC (1,25 ug/ml), Anti-LH-Antikörper konjugiert an alkalische Phosphatase (375 ng/ml) und Anti-LH-Antikörper konjugiert an FITC (250 ng/ml), aufbereitet in Assaypuffer (100 mM Tris/HCl-Puffer enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (Fraktion V), 0,2% Schafserum, 0,2% Natriumazid, 100 mM Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid bei pH 8,0).

(iii) Herstellung des Festphasenreagens

Dieses Material umfaßte Anti-FITC-polyklonale Antikörper kovalent gebunden an magnetisierbare Celluloseteilchen.
Anti-FITC war ein übliches polyklonales Antiserum, erhalten durch Immunisierung von Schafen mit FITC konjugiert an Schlüsselloch-Schneckenhaemocyanin (engl. keyhole limpet haemocyanin) Die magnetisierbaren Celluloseteilchen waren eine Zusammensetzung von Cellulose enthaltend etwa 50% schwarzes Eisenoxid (Fe&sub3;O&sub4;) mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 3 um (Mikron) (vgl. Forrest und Rattle, "Magnetic Particle Radioimmunoassay" in "Immunoassays for Clinical Chemistry", S. 147-162, Verl. Hunter and Corrie, Churchill Livingstone, Edinburgh (1983)). Anti-FITC-Antiserum wurde kovalent gekoppelt an die magnetisierbaren Celluloseteilchen nächstfolgend Cyanbromid-Aktivierung der Cellulose gemäß dem Verfahren von Axen et al. (Nature 214, 1302-1304 (1967)). Das Antiserum wurde bei einem Verhältnis von 2 ml Antiserum zu 1 Gramm magnetisierbarer fester Phase gekoppelt.
Die feste Phase wurde auf 5 mg/ml in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,1% Natriumazid, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V, 0,25% Tween 20 und 0,5% Methocell verdünnt.

(iv) Herstellung des Substratpuffers

Der Substratpuffer bestand aus 1 M Lösung Diethanolamin enthaltend 150 mM NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 3 mM Phenophthaleinmonophosphat und 50 mM p-Nitrophenyl-β-D-galactosid bei pH 8.6.

(v) Herstellung der Stopp-Lösung

Die Stopp-Lösung wurde hergestellt durch Einstellung einer Lösung enthaltend 200 mM Na&sub2;CO&sub3;, 20 mM Na&sub3;PO&sub4; und 300 mM EDTA auf pH 12 und dann Zugabe von NaOH auf 150 mM.

(vi) LH/FSH-Versuchsprotokoll

100 ul Probe und 200 ul Antikörper-Reagens-Cocktail wurden vermischt, einem starken Wirbel unterworfen und bei 37ºC während 20 Minuten bebrütet, wonach 200 ul Anti-FITC-Festphase (5 mg/ml) zugesetzt wurde und kräftig gewirbelt wurde. Darauf folgte eine weitere 10-minütige Bebrütung, dann wurde die feste Phase magnetisch sedimentiert und der Überstand verworfen. Die feste Phase aus magnetischen Teilchen wurde dreimal gewaschen durch Zugabe von 500 ul Waschpuffer (10 mM Tris/HCl enthaltend 0,9% Natriumchlorid bei pH 8,6), Wirbelbehandlung und magnetische Abtrennung und anschließend Abdekantieren des Überstandes. Nach der dritten Wasch- und Dekantationsstufe wurde die feste Phase während 2 Minuten entwässert. Nach Zugabe von 300 ul Substratlösung wurden die Röhrchen bei 37ºC während 35 Minuten bebrütet und dann wurde 1 ml Stopp-Lösung zugesetzt.
Nach magnetischem Sedimentieren der festen Phase während mindestens 15 Minuten wurde die Konzentration von LH aus A&sub5;&sub5;&sub4; des Überstandes berechnet und die Konzentration des FSH aus A&sub4;&sub0;&sub4; des Überstandes, nach Korrektur für Absorptionsvermögen des Phenolphthaleins bei 404 nm.

(vii) Ergebnisse

In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse, welche erhalten wurden für Proben enthaltend sowohl LH als auch FSH unter Verwendung des "Combo"-Assays verglichen mit den Ergebnissen, welche durch Messen von LH und FSH getrennt in den gleichen Proben unter Verwendung von Amerlex RIA-Kits (Amersham International plc) erhalten wurden. Die Standardkurven für LH und FSH, wenn sie gleichzeitig bestimmt wurden unter Verwendung des "Combo"-Assays sind in den Fig. 3 bzw. 4 angegeben. Tabelle 1 LH (mIU/ml) Combo Amerlex FSH (mIU/ml) Fortsetzung Tabelle 1

Beispiel 2

Gleichzeitiger Dualanalyt-Enzymimmunoassay für T&sub4; und TSH

In diesem Beispiel wurde ein 1-Stellen-Indirektverknüpfung- Enzymimmunoassay für T&sub4;, wie schematisch in Fig. 1 erläutert, kombiniert mit einem 2-Stellen-Indirektverknüpfungs- Enzymimmunoassay (d. h. ein indirekter Verknüpfungs-Sandwich- Immunoassay), wie schematisch in Fig. 2 erläutert.

(i) Herstellung der monoklonalen Antikörper

Monoklonale Antikörper zu T&sub4; und TSH wurden aus Mausascitesflüssigkeit durch das von Kohler und Milstein in Nature 256, (1975), 495-497, berichtete Verfahren erhalten. Antikörper aus individuellen Hybridoma-Zellinien wurden dem Screening unterworfen, um solche zu identifizieren, die Antikörper für diskrete antigene Determinanten produzieren. Solche Antikörper mit den höchsten Affinitäten für die in Frage stehenden Antigene wurden zur Verwendung in dem Versuch ausgewählt.

(ii) Herstellung der Antikörper-Reagentien

Zwei Populationen von monoklonalen Antikörpern gerichtet auf verschiedene Epitope von TSH wurden mit alkalischer Phosphatase unter Verwendung der gleichen Methode wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, markiert, um das Anti-LH-alkalische Phosphatase-Konjugat herzustellen. Die Bindung des einen alkalische Phosphatase-markierten monoklonalen Antikörpers an TSH störte nicht die Bindung des anderen Enzymmarkierten monoklonalen Antikörpers.
Eine Population von monoklonalen Antikörpern zu T&sub4; wurde mit β-Galactosidase markiert und eine weitere Population von Anti-TSH monoklonalen Antikörpern, gerichtet auf ein drittes Epitop von TSH, wurde an FITC konjugiert unter Verwendung der gleichen Methoden wie in Beispiel 1 (ii).

(iii) Herstellung von FITC-T&sub4;

Das Konjugat FITC-T&sub4; wurde hergestellt und gereinigt nach der Methode von Smith in FEBS Letters 77, 25 (1977).

(iv) Herstellung des Festphasen-Reagens

Wie in Beispiel 1 (iii)

(v) Herstellung des Substratpuffers

wie in Beispiel 1 (iv)

(vi) Herstellung der Stopp-Lösung

wie in Beispiel 1 (v)

(vii) Herstellung der Assay-Reagentien

Ein Cocktail von Reagentien (Reagens A) wurde hergestellt, bestehend aus FITC-T&sub4; (10,5 pM), Anti-TSH-Antikörper konjugiertan PITC (5 ug/ml), Anti-TSH-Antikörper konjugiert an alkalische Phosphatase (1 ug/ml) und 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (1,5 mg/ml) in Assaypuffer (100 mM Tris/HCl- Puffer), enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (Fraktion V), 0,2% Schafserum, 0,2% Natriumazid, 100 mM Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid bei pH 8,0).
Das zweite Reagens (Reagens B) bestand aus Anti-T&sub4;-Antikörper konjugiert an β-Galactosidase (7,61 ug/ml) in Assaypuffer.

(viii) T&sub4;/TSH-Versuchsprotokoll

Zu 100 ul Probe wurden 200 ul Reagens A und 100 ul Reagens B zugegeben. Nach kräftiger Verwirbelung wurde der Assay während 20 Minuten bei 37ºC bebrütet und anschließend wurden 200 ul Anti-FITC-Festphase (5 mg/ml) zugesetzt. Nach einer 5-minütigen Bebrütung bei 37ºC wurde der Assay magnetisch abgetrennt und der Überstand durch Dekantieren entfernt. Die magnetische Teilchen-Festphase wurde dreimal durch Zugabe von 500 ul Waschpuffer (10 mM Tris/HCl) enthaltend 0,9% Natriumchlorid bei pH 8,6) gewaschen, stark verwirbelt und magnetisch abgetrennt, gefolgt von Abdekantieren des Überstands. Nach dem dritten Wasch- und Dekantationsschritt wurde die feste Phase während 2 Minuten drainiert. Nach Zugabe von 300 ul Substratlösung wurden die Röhrchen 20 Minuten bei 37ºC bebrütet und dann wurde 1 ml Stopp-Lösung zugesetzt. Die Absorptionsvermögen bei 554 und 404 nm wurden gemessen, nachdem die Teilchen während wenigstens 15 Minuten magnetisch sedimentiert worden waren.

(ix) Ergebnisse

Die Ergebnisse, welche erhalten wurden bei Verwendung des T&sub4;/TSH-"Combo"-Assays -zur gleichzeitigen Messung von T&sub4; und TSH in Blutserumproben von menschlichen Hypothyroid-, Euthyroid- und Hyperthyroid-Patienten sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Patienten-Typ T4 (ng/ml) TSH (uTU/ml) Hypothyroid Euthyroid Hyperthyroid
Standardkurven für T&sub4; und TSH, wenn sie gleichzeitig unter Verwendung des "Combo"-Assays bestimmt wurden, sind in den Fig. 5 bzw. 6 angegeben.
Weitere Proben von 88 Patienten wurden auf T&sub4; und TSH untersucht unter Verwendung des T&sub4;/TSH-"Combo"-Assays und auch getrennt auf T&sub4; unter Verwendung eines Amerlex T4 RIA-Kits (Amersham International plc) und getrennt für TSH unter Verwendung eines 2-Stellen-immunoradiometrischen Assay-Kits (IRMA-Kit; Serono Diagnostics Limited).
Fig. 7 zeigt einen Vergleich der "Combo"-Assay-TSH-Ergebnisse und IRMA-TSH-Ergebnisse für alle 88 Proben. Die Fig. 8 und 9 zeigen einen Vergleich der TSH-Ergebnisse erhalten mit dem "Combo"-Assay und IRMA-Assay für 0 bis 10 uU/ml bzw. 0 bis 20 uU/ml Proben.
Ein Vergleich der T&sub4;-Werte, erhalten unter Verwendung des "Combo"-Assays und Amerlex T&sub4; RIA-Kits für alle 88 Proben ist in Fig. 10 gezeigt.

Claims

1. Dualanalyt-Enzymimmunoassay zur Bestimmung von zwei Antigenen in einer einzigen flüssigen Probe, wobei die zwei Immunoreaktionen gleichzeitig durchgeführt werden und die Enzym/Substratpaare β-Galactosidase/Nitrophenyl-β-D-Galactosid (p- und/oder o-) und alkalische Phosphatase/Phenolphthalein-monophosphat in dem Enzymreaktionsschritt verwendet werden, welcher die Durchführung der Enzymreaktionen bei einem pH zwischen 7 und 10 in Gegenwart von Diethanolamin umfaßt, wobei eine Konzentration von Nitrophenylβ-D-galactosid verwendet wird, die ausreicht, um die Hemmung der β-Galactosidase durch das Diethanolamin im wesentlichen auszugleichen, so daß die zwei Enzymreaktionen gleichzeitig vor sich gehen.

2. Immunoassay wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Diethanolaminkonzentration in dem Bereich von 0,25 M bis 1 M ist.

3. Immunoassay wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, wobei der Enzymreaktionsschritt bei einem pH zwischen 8,5 und 8,7 durchgeführt wird.

4. Immunoassay wie in Anspruch 3 beansprucht, welcher umfaßt das Bebrüten eines Gemisches aus

a) der flüssigen Probe (enthaltend zwei Analytliganden jeweils mit einem oder mehreren Epitopen),

b) einer oder mehreren Populationen von alkalische Phosphatasemarkierten Antikörpermolekülen spezifisch für den ersten Analytliganden,

c) einer oder mehreren Populationen von β-Galactosidase-markierten Antikörpermolekülen spezifisch für den zweiten Analytliganden,

d) einem Liganden-Analogen des ersten Analytliganden konjugiert an ein Reagens X (dieses Reagens ist nicht als freies Reagens in dem Gemisch anwesend), und

e) einem Liganden-Analogen des zweiten Analytliganden konjugiert an dieses Reagens X;

Abtrennen, nach einer geeigneten Bebrütungsdauer, des die Komponenten (d) und (e) enthaltenden Teils aus dem Gemisch mittels einer festen Phase, die einen für das Reagens X spezifischen Bindungspartner trägt; Bebrüten dieser festen Phase oder der flüssigen Phase in Gegenwart von p-Nitrophenyl-β-D-galactosid, Phenolphthalein-monophosphat und 0,25 M bis 1 M Diethanolamin bei einem pH von etwa 8,6, wobei die Konzentration des p-Nitrophenyl-β-D-galactosids ausreichend ist, um die Inhibierung der β-Galactosidase durch das Diethanolamin im wesentlichen auszugleichen; und Überwachen der Produktion von Phenolphthalein und p-Nitrophenol.

5. Immunoassay wie in Anspruch 3 beansprucht, weicher umfaßt das Bebrüten eines Gemisches aus

a) der flüssigen Probe (enthaltend zwei Analytliganden mit mehr als einem Epitop),

b) einer oder mehreren Populationen alkalische Phosphatase-markierten Antikörpermolekülen spezifisch für den ersten Analytliganden,

d) einem Reagens umfassend Antikörper zu dem ersten Analytliganden konjugiert an ein Reagens X (dieses Reagens ist als freies Reagens in dem Gemisch nicht anwesend),

e) einem Reagens umfassend Antikörper zu dem zweiten Analytliganden konjugiert an das genannte Reagens X, und

f) einem Reagens, befähigt zur Bindung an das Reagens X durch nicht-kovalente Bindung, das jedoch zu der Komponente (a) oder zu den Komponenten (b) und (c) nicht direkt bindungsfähig ist, wobei dieses Reagens (f) an einen Festphasenträger gebunden ist;

Abtrennen, nach einer geeigneten Bebrütungsdauer, der Feststofffraktion von der flüssigen Fraktion; Bebrüten der abgetrennten festen Phase oder flüssigen Phase in Gegenwart von p-Nitrophenylβ-D-galactosid, Phenolphthalein-monophosphor und 0,25 M bis 1 M Diethanolamin bei einem pH von etwa 8,6, wobei die Konzentration des p-Nitrophenyl-β-D-galactosids ausreichend ist, um die Inhibierung der β-Galactosidase durch das Diethanolamin im wesentlichen auszugleichen; und Überwachen der Produktion von Phenolphthalein und p-Nitrophenol.

6. Immunoassay wie in Anspruch 3 beansprucht, umfassend das Bebrüten eines Gemisches aus

a) der flüssigen Probe (enthaltend zwei Analytliganden, wobei wenigstens ein Analytligand mehr als ein Epitop hat),

b) einer oder mehreren Populationen von alkalische Phosphatasemarkierten Antikörpermolekülen spezifisch für einen Analytliganden,

d) einem Liganden-Analogen des einen der Analytliganden konjugiert an ein Reagens X (dieses Reagens ist als freies Reagens in dem Gemisch nicht anwesend),

e) einem Reagens umfassend Antikörper zu dem Analytliganden, für den Komponente d) nicht ein Ligandenanaloges konjugiert an dieses Reagens X ist, wobei der Analytligand, für den das Reagens e) spezifisch ist, mehr als ein Epitop hat, und

f) einem Reagens, das zur Bindung an das Reagens X durch nichtkovalente Bindung fähig ist, das jedoch zur Komponente (a) oder den Komponenten (b) und (c) nicht direkt bindungsfähig ist, wobei dieses Reagens (f) an einen Festphasenträger gebunden ist;

Abtrennen, nach einer geeigneten Bebrütungsdauer, der Feststofffraktion von der flüssigen Fraktion; Bebrüten der abgetrennten festen Phase oder flüssigen Phase in Gegenwart von p-Nitrophenylβ-D-galactosid, Phenolphthalein-monophosphat und 0,25 M bis 1 M Diethanolamin bei einem pH von etwa 8,6, wobei die Konzentration des p-Nitrophenyl-β-D-galactosids ausreichend ist, um die Inhibierung der β-Galactosidase durch das Diethanolamin im wesentlichen auszugleichen; und überwachen der Produktion von Phenolphthalein und p-Nitrophenol.

7. Immunoassay wie in einem der Ansprüche 3, 4, 5 oder 6 beansprucht, wobei der Enzymreaktionsschritt in Gegenwart einer Substratpufferlösung bei einem pH von etwa 8,6 durchgeführt wird, welche anfänglich 0,25 M bis 1 M Diethanolamin, 3-10 mM Phenolphthaleinmonophosphat und etwa 50 mM p-Nitrophenyl-β-D-galactosid umfaßt.

8. Kit von Reagentien zur Durchführung eines Immunoassays wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht.

9. Kit von Reagentien zur Durchführung eines Immunoassays wie in einem der Ansprüche 4, 5, 6 oder 7 beansprucht, welches umfaßt eine oder mehrere Populationen von alkalische Phosphatase-markierten Antikörpern, eine oder mehrere Populationen von β-Galactosidasemarkierten Antikörpern, eine feste Phase konjugiert an einen spezifischen Bindungspartner für Reagens X und ein oder mehrere weitere geeignete Reagentien.