DE68923800T2

DE68923800T2 - Vorrichtung und verfahren zur bestimmung eines analyten in einer flüssigen probe mittels folgereaktionen.

Info

Publication number: DE68923800T2
Application number: DE68923800T
Authority: DE
Inventors: Hans Berger; Harvey Buck; Fern Delacroix
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1988-12-08
Filing date: 1989-12-06
Publication date: 1996-03-14
Anticipated expiration: 2009-12-07
Also published as: ES2078333T3; EP0447492A4; WO1990006511A1; DE68923800D1; EP0447492A1; US5079174A; CA2004878C; AU4827990A; CA2004878A1; EP0447492B1; ATE126354T1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die brauchbar ist zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe unter Verwendung eines viergliedrigen oder "quarternären" Komplexes, der den Analyt einschließt, einen kompletten monoklonalen Antikörper, der an den Analyten bindet, ein markiertes Fab-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, das ebenfalls an den Analyten bindet, wobei diese beiden aus der gleichen Tierspezies erhalten werden, sowie einen an eine feste Phase gebundenen Antikörper, der monoklonal sein kann oder nicht und der an den Fc- Teil eines monoklonalen Antikörpers bindet, aber nicht an dessen Fab-Teil.

Hinterarund und Stand der Technik

Die Bildung von Sandwiches aus Antigen und Antikörper und deren Verwendung in Immunoassays wird schon über 15 Jahre lang angewandt. Die Fachwelt hat zwei unterschiedliche Trends auf diesem Gebiet erlebt. Der erste Trend ging in Richtung auf die Bildung von ternären Komplexen, d.h., Komplexen der Form Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2;*, wobei Ab&sub2;* irgendeine Markierung trägt. Der spätere Trend geht hin zu Multikomponentensystemen, gewöhnlich guarternären, wobei bisweilen jedoch fünf oder mehr Komponenten beteiligt sind. In der Diskussion des Standes der Technik wird diese Unterscheidung beibehalten.

I. Die Bildung ternärer Komplexe

Die Patentliteratur enthält viele Beispiele für Erfindungen auf diesem Gebiet. Ein älteres Beispiel für einen solchen Assay ist zu finden bei Schuurs et al., US-Patent Nr. 3 654 090 (1972), was nicht nur als historischer Hintergrund von Nutzen ist, sondern auch für das Verständnis einiger Schlüsselbereiche auf diesem Gebiet.
Schuurs et al. lehren den Nachweis eines Antigens unter Verwendung eines an eine feste Phase gebundenen Antikörpers gegen ein Epitop oder eine Bindungsstelle des Antigens sowie eines löslichen, enzymmarkierten Antikörpers, der an einen zweiten Teil des Antigens bindet. Bei der bei Schuurs et al. offenbarten Methode wird die Enzymmarkierung nach Bildung des Sandwichs aus gebundenem Antikörper, Antigen und markiertem Antikörper bestimmt. Dies geschieht entweder in fester Phase oder in flüssiger Phase durch Zugabe eines Substrats für die Enzymmarkierung. Gewöhnlich erzeugt die Enzym/Substrat-Reaktion eine Farbe oder eine Farbänderung, die sich bei "Ja/Nein"-Tests erkennen läßt oder quantifiziert werden kann, wenn die vorhandene Substanzmenge bestimmt werden soll.
Was bei Schuurs et al. fehlt, ist eine Erörterung der monoklonalen Antikörper oder der Antikörperfragmente, und dies ist nicht überraschend, da die Einreichung des Patentes von Schuurs et al. 1968 erfolgte und die Erteilung 1972, d.h., viel früher als der Durchbruch in der Hybridom-Technik, der nach der Entwicklung der Köhler-Nilstein-Methode zur Herstellung monoklonaler Antikörper einsetzte.
Schuurs et al. erhielten 1974 noch ein anderes Patent, US- Patent Nr. 3 791 932, das sich wiederum mit Sandwich-Assays befaßte. Dieses Patent beschreibt einen sogenannten "vorwärtsgerichteten" Sandwich-Immunoassay. Bei dieser Art von Assay ist eine bestimmte Reihenfolge von Schritten einzuhalten, d.h., die zu prüfende Probe wird zunächst mit dem unlöslichen Bindungspartner zusammengebracht, und man läßt die Reaktion zwischen beiden bis zur Vollständigkeit ablaufen. Die Festphasenkomplexe werden von der Lösung abgetrennt, und der zweite, eine Enzymmarkierung enthaltende Bindungspartner wird dann der festen Phase zugegeben. Nach Bindung an den Komplex wird die Enzymkonzentration in Anlehnung an die vorstehend erwähnten Standardmethoden bestimmt. Wiederum werden keine monoklonalen Antikörper oder Antikörperfragmente erwähnt.
Ling lehrt in US-Patent Nr. 3 867 517 (1975), daß Enzyme nicht die einzige Markierung sind, die sich bei Sandwich- Assays anwenden lassen. Dieses Patent beschreibt einen vorwärtsgerichteten Sandwich-Assay unter Verwendung eines radioaktiven Antikörpers als Markierung. Bei der radioaktiven Markierung handelt es sich um ¹²&sup5;I, ein Standard-Radioisotop. Die Radiomarkierung von Antikörpern ist eine Standardtechnik, setzt aber das Vorhandensein der passenden Aminosäuren im Antikörpermolekül zum Binden des radioaktiven Iods voraus. Ansonsten hält die Narkierung nicht.
Schuurs et al. erhielten 1977 noch ein weiteres Patent, US- Patent Nr. 4 016 043. Dieses Patent beansprucht, eine einfachere Version grundlegender Sandwich-Assays zu lehren. Es lehrt die Verwendung einer unlöslichen Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion und einer markierten Probe der gleichen Komponente. Bei dieser Methode wird vorausgesetzt, daß das nachzuweisende Antigen zwei identische Epitope aufweist. Des weiteren wird durch Verwendung zweier identischer Rezeptoren die Anwendung "simultaner" Assays ausgeschlossen, die nachstehend erörtert werden. Als Konsequenz ergibt sich daraus, daß der Schuurs '043-Assay eine so lange Zeit wie 60 Stunden bis zum Abschluß dauern kann. In klinischen oder diagnostischen Laboratorien ist diese erforderliche lange Zeit unannehmbar.
Piasio et al., US-Patent Nr. 4 098 876 (1978), lehren einen "reversen" Sandwich-Assay. Dieses Patent ist von Bedeutung, da es zum ersten Mal zeigte, daß die zu bestimmende Komponente zuerst an den löslichen, markierten Antikörper gebunden werden konnte und dann an den immobilisierten Antikörper. Auch war es insofern eine Verbesserung als ein Waschgang vermieden wurde, was bedeutet, daß bei der Durchführung des Assays Zeit gespart wurde. Piasio et al. lehren, daß ihr Assay im Idealfall in weniger als einer halben Stunde vollendet ist. Dieses Musterbeispiel für ein System konnte in ihren Beispielen nicht verwirklicht werden, aber die Zeit war wesentlich kürzer als die vorstehend erörterten 60 Stunden bei Schuurs et al.. Ein deutlicher Nachteil dieser Methode ist, daß dabei enorme Mengen an immobilisiertem Antikörper benötigt werden.
Bei Niswender, US-Patent Nr. 4 048 298 (1977), handelt es sich in Wirklichkeit nicht um einen Sandwich-Assay, sondern um eine Erfindung, bei der ein immobilisierter Antikörper verwendet wurde, um einen anderen Antikörper zu binden. Dieses Patent lehrt eine interessante Abart älterer kompetitiver Immunoassays. Niswender bringt einen an eine feste Phase gebundenen Antikörper mit der zu analysierenden Probe sowie mit einem zweiten radiomarkierten Antikörper zusammen, der an den ersten bindet, aber nicht an die zu bestimmende Komponente. Die Folge davon ist, daß es dem Untersuchenden ermöglicht wird, eine vorhandene Substanz zu bestimmen, indem festgestellt wird, wieviel radiomarkierter Antikörper an die feste Phase bindet.
Dieses Patent zeigt, daß Antikörper auch an andere Antikörper und nicht nur an Antigene binden können. Diese Eigenschaft ist von Bedeutung bei neueren Assays, von denen einige nachstehend erörtert werden.
Schwarzberg, US-Patent Nr. 4 235 689 (1980), erkannte, daß Antikörper zwei unterschiedliche Teile besitzen, den Fc- Teil oder die "konstante" Region, und den Fab-Teil, welcher der Teil des Antikörpers ist, der an ein Epitop bindet. Schwarzberg stellte Komplexe von markierten, an einen Liganden wie etwa ein Polypeptid gebundenen Fab-Fragmenten her. Dieser Komplex wird dann bei sogenannten "kompetitiven" Assays verwendet. Nicht beschrieben sind Festphasenbindung oder Sandwich-Assays.
Jeong et al., US-Patent Nr. 4 244 940 (1981), lehren einen "simultanen" Sandwich-Immunoassay. Ein solcher Assay erfordert ein Antigen mit verschiedenen Epitopen, weil aus Gründen, auf die vorstehend eingegangen wurde, zwei verschiedene Antikörper oder Rezeptoren verwendet werden müssen.
Bei Jeong et al. wird ersichtlich, daß der Stand der Technik 1981 vorwärtsgerichtete, reverse und simultane Assays lehrte, wobei stets ternäre Komplexe (d.h., Komplexe aus drei Spezies) gebildet wurden. Die Fachwelt hatte begonnen, die Verwendung von Fab-Fragmenten als "Linker"-Molekül (Schwarzberg) zu erkennen, doch wurden diese nicht als wesentlicher Teil eines Iimtunoassay-Systeis verwendet, auch wurden keine monoklonalen Antikörper verwendet.
Diese Gedanken wurden beide in Patenten gelehrt, die 1983 ausgegeben wurden. David et al., US-Patent Nr. 4 376 110 (1983), überwand das Vorurteil in der Fachwelt, daß monoklonale Antikörper nicht "haftfähig" genug seien, d.h., unzureichende Affinität für die Verwendung in Sandwich-Assays besäßen. David et al. lehren, daß sich alle drei Formen ternärer Sandwich-Assays mit monoklonalen Antikörpern durchführen lassen, solange sie beide Affinitäten von wenigstens 10&sup8; l/mol aufweisen. Moussebois et al. lehren in US-Patent Nr. 4 397 060 (1983), daß sich ein Agglutinationsassay durchführen läßt unter Verwendung von Fab-Fragmenten, die an einen festen Träger gebunden sind. Dieses Patent zeigt abermals, daß Fab-Fragmente nicht als Partner in Immunoassays betrachtet wurden, auch wenn monoklonale Antikörper selbst nunmehr verwendet wurden.
Gallati et al., US-Patent Nr. 4 467 031 (1984), lehrt einen spezifischen Sandwich-Assay zur Bestimmung von carcino-embryonalem Antigen (CEA). Das zentrale Merkmal dieser Erfindung war die Verwendung unterschiedlicher Salzkonzentrationen zur Verbesserung der Komplexbildung. Es handelt sich um einen "vorwärtsgerichteten" Sandwich-Assay, wie der Begriff hierin definiert ist, und es wird die Möglichkeit der Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern bei dem Assay erörtert. Es ist ersichtlich, daß auch dies ein ternärer Komplex ist und daß kein Fab-Fragment verwendet wird.
Woods et al., US-Patent Nr. 4 469 787 (1984), lehren einen Sandwich-Assay, bei dem das Binden einer Markierung an den Fc-Teil eines zweiten Antikörpers erforderlich ist. Die Markierung ist nicht direkt am zweiten Antikörper gebunden, vielmehr halten Woods et al. ihre Erfindung damit aufrecht, daß die Markierung an den Fc-Teil des Antikörpers gebunden wird, nachdem sich der ternäre Komplex gebildet hat. Dies geschieht, um eine gegenseitige Beeinflussung zwischen der Markierung und dem immobilisierten ersten Antikörper zu verhindern.
Das US-Patent Nr. 4 486 530 (1984), das ausgegeben wurde an David et al. und eine Teilweiterbehandlung (CIP) des vorstehend erörterten US-Patents Nr. 4 376 110 darstellt, lehrt wiederum ternäre Sandwiches monoklonaler Antikörper und ihren Nachweis. Dieses Patent trägt zum Fachgebiet bei, indem es zeigt, daß Sandwich-Assays in homogener Phase durchgeführt werden können, d.h., ohne Phasentrennung. Dies wird durchgeführt, indem die monoklonalen Antikörper-Komponenten des ternären Komplexes mit Markierungen versehen werden, die nicht reagieren, solange sie nicht durch das "Haftmittel" eines multiepitopischen Antigens zusammengebracht werden.
Carro et al., US-Patent Nr. 4 522 922 (1985), kombinieren Sandwich-Assays mit einer älteren Form von Immunoassays, dem sogenannten "Präzipitationstest". Diese Erfindung lehrt die Bildung eines ternären Sandwichs, gefolgt von Zugabe eines Fällungsmittels, um den Komplex aus der Lösung auszufällen. Dies ist ein Radioimmunoassay, bei dem polyklonale Antiseren eingesetzt werden.
Die neuesten Patente auf diesem Gebiet zeigen Modifikationen des grundlegenden Sandwich-Prinzips. Petska lehrt in US-Patent Nr. 4 623 621 (1986), daß ein oligomeres Protein gemessen werden kann durch Verwendung eines an eine feste Phase gebundenen monoklonalen Antikörpers, der spezifisch ist für ein Epitop, das einmal am repetitiven Proteinteil des Moleküls vorhanden ist. Nach dem Binden an die feste Phase wird eine zweite Probe des gleichen monoklonalen Antikörpers, nunmehr markiert, gebunden. Wiederum wird ein ternärer Komplex gebildet, jedoch mit kompletten Antikörpern, und simultanes Analysieren ist nicht möglich.

II. Die Bildung mehrgliedriger Komplexe

Das früheste Beispiel für ein quarternäres System zeigt US- Patent Nr. 4 343 896, ausgegeben an Wolters et al.. Dieses Patent, das auf einer 1976 eingereichten Offenbarung beruht, lehrt den an eine feste Phase gebundenen Komplex Ab&sub1;- Ab&sub2;-Ag-Ab&sub3;*. Eine wesentliche Einschränkung beim Patent von Wolters ist, daß Ab&sub2; und Ab&sub3;* aus verschiedenen Tierspezies stammen. Der Grund dafür ist der, daß Ab&sub1; gegen die konstante Region, d.h., den "Fc"-Teil von Ab&sub2; gerichtet sein muß. Alle Antikörper einer speziellen immunologischen Klasse, die von der gleichen Tierspezies stammen, weisen identische Fc-Teile auf. Wären Ab&sub2; und Ab&sub3; von der gleichen Tierspezies, so lehrte das Fachwissen, daß man nicht nur Ab&sub1;-Ab&sub2;-Ag-Ab&sub3;*, sondern auch Ab&sub1;-Ab&sub3;* erhielte, die beide an die feste Phase bänden, wodurch sich gegenseitige Beeinflussung und falsche Resultate ergäben.
Axen et al., US-Patent Nr. 4 469 796 (1984), lehrt, daß mehr als drei Komponenten an einer Immunreaktion beteiligt sein können, doch der einzige gelehrte vierteilige Komplex ist ein an eine feste Phase gebundener Komplex von Ag-Ab&sub1;- Ab&sub2;-Ab&sub3;*. Bemerkenswert ist, daß in der in Spalte 1, Zeile 41-60 gegebenen Beschreibung der Reaktionspartner Fab-Fragmente von Axen et al. nie erwähnt werden.
Tanswell et al., US-Patent Nr. 4 624 930 (1986), lehren Komplexe aus vier Komponenten, wobei ein erster und ein dritter Rezeptor in Lösung an das Antigen binden, während ein zweiter Festphasen-Antikörper an den ersten Antikörper bindet. Tanswells Lehre bezieht sich allgemein auf die Verwendung eines Doppelantikörpersystems, und monoklonale Antikörper werden nicht speziell offenbart.
Forrest et al., US-Patent Nr. 4 659 678 (1987), geht über die vorstehend erörterte vierteilige Bindung hinaus und bildet tatsächlich einen pentavalenten Komplex aus Antikörper-Hapten-Antikörper-Antigen-Antikörper. Das Schwanzende des Komplexes ist ein radioaktiv markierter Antikörper. Wenigstens ein Antikörper muß ein monoklonaler Antikörper sein.
Forrest et al. geben eine recht umfangreiche Beschreibung der Vorteile und Nachteile von Assays, bei denen mehrgliedrige Komplexe gebildet werden. Die Lösung der z.B. in Spalte 2, Zeilen 1-5 ausgeführten Probleme besteht in der Verwendung eines an eine feste Phase gebundenen mAb, um einen Komplex aus Ab-Ag-Fab* zu binden. Das einzige Mal, wo ein an eine feste Phase gebundener mAb verwendet wird, um den Komplex mAb&sub2;-Ag-Fab* zu binden, ist es bei Forrest allerdings erforderlich, daß der mAb&sub2; an ein anderes Antigen gebunden wird, so daß der Festphasen-Komplex mAb&sub1;-Ag&sub2;-mAb&sub2;- Ag&sub1;-Fab* gebildet wird. Es muß in diesem Zusammenhang jedoch klar sein, daß "Ag&sub2;" tatsächlich für einen Linker steht, da mAb&sub2; keine Bindungsstellen für zwei verschiedene Ags besitzen kann.
In US-Patent Nr. 4 891 313, übertragen an die Rechtsnachfolger dieser Anmeldung, werden eine Vorrichtung und eine Methode unter Beteiligung quarternärer Immunoassays beschrieben. Die Vorrichtung ist für die Anwendung der Methode angepaßt, bei der ein Analyt mit einem Rezeptor-Paar zusammengebracht wird, insbesondere einem markierten monoklonalen Antikörper oder einem markierten Fragment (z.B. einem Fab- oder Fab'-Fragment), einem zweiten nichtmarkierten monoklonalen Antikörper und einem an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der ein Antikörper sein kann. Die beiden Antikörper, die nicht an eine feste Phase gebunden sind, stammen aus der gleichen Tierspezies. Diese Komponenten werden kombiniert, um eine quarternäre Sandwich-Struktur zu bilden.
Quarternäre Strukturen ergeben höhere Empfindlichkeit; allerdings gibt es beim guarternären Assay ein Problem, und diese Offenbarung befaßt sich mit der Lösung dieses Problems.
Bei der Durchführung von Immunoassays wird im allgemeinen mit Körperflüssigkeiten wie etwa Blut und Urin gearbeitet. Diese sind keine idealen Systeme für die immunologische Analyse, da sie natürliche Substanzen enthalten, die die gewünschte Bindung zwischen dem Analyt und dem markierten Rezeptor oder "Konjugat" stören. Diesbezüglich siehe Boscato et al., Clin. Chem. 34(11), 27-33 (1988); europäische Patentschrift 83 869. Diese Störung führt zu fehlerhaften und falschen Ergebnisse bei der Diagnose, Schwangerschaftsbestimmung etc..
Bei Vorrichtungen im Stand der Technik, die zur Durchführung von Immunoassays zur Verfügung stehen, wird dieses Problem nicht angegangen. Diese Vorrichtungen sind so ausgestaltet, daß der markierte Rezeptor in das Medium eingebracht wird, das den zu bestimmenden Analyten enthält, wobei die störenden Substanzen noch vorhanden sind.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, die zur Durchführung von Assays brauchbar ist, wobei das Problem der Störung durch Substanzen, die von Natur aus zu der zu analysierenden Probe gehören, beseitigt wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Methode zur Durchführung von diagnostischen Assays der hierin beschriebenen Art ohne Störung durch native Substanzen bereitzustellen.
Wie diese und weitere Aufgaben der Erfindung gelöst werden, ist aus der folgenden Offenbarung ersichtlich.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Figur 1 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Figur 2 zeigt eine zweite Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung, die brauchbar ist zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, umfassend
(i) eine erste Zone, enthaltend einen unmarkierten ersten Rezeptor, der in einer flüssigen Probe löslich ist und der spezifisch an den zu bestimmenden Analyten bindet;
(ii) eine zweite Zone, enthaltend einen immobilisierten zweiten Rezeptor, der an Komplexe aus dem zu bestimmenden Analyten und dem unmarkierten ersten Rezeptor über den unmarkierten ersten Rezeptor bindet, wobei ein erster Teil der zweiten Zone mit der ersten Zone in Kontakt ist, so daß ein Fließen von Flüssigkeit und Komplexen aus Analyt und unmarkiertem ersten Rezeptor von der ersten Zone in die zweite Zone ermöglicht wird;
(iii) eine dritte Zone, enthaltend einen markierten dritten Rezeptor, der an den Analyten, aber nicht an den unmarkierten ersten Rezeptor bindet, wobei ein erster Teil der dritten Zone mit einem zweiten Teil der zweiten Zone in Kontakt ist, um ein Fließen von Flüssigkeit von der dritten Zone in die zweite Zone und Binden des markierten Rezeptors an die Analytenkomponente aus immobilisierten Komplexen von Analyt und unmarkiertem Rezeptor zu ermöglichen;
(iv) eine Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag, die sich an einem ersten Ende der Vorrichtung befindet, wobei die Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag keinen Rezeptor enthält, in Kontakt ist mit einem zweiten, separaten Teil der dritten Zone, und nicht mit der zweiten Zone in Kontakt ist;
eine Abflußzone, die sich an einem zweiten Ende der Vorrichtung und gegenüber der Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag befindet, wobei die Abflußzone mit der zweiten Zone in Kontakt ist, um das Fließen von Flüssigkeit von der zweiten Zone in die Abflußzone zu ermöglichen; und
(vi) mit der Maßgabe, daß die erste Zone und die dritte Zone nicht in Kontakt miteinander stehen, und wobei der zu bestimmende Analyt mit dem unmarkierten ersten Rezeptor in der ersten Zone unter Bildung eines Komplexes aus Analyt und unmarkiertem ersten Rezeptor reagiert, der in die zweite Zone fließt, wobei der immobilisierte zweite Rezeptor an den Komplex aus Analyt und unmarkiertem ersten Rezeptor über den ersten Rezeptor bindet, der markierte dritte Rezeptor durch Kontakt mit einer Flüssigkeit, die durch die Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag und in die dritte Zone fließt, aus der dritten Zone herausgelöst wird, wobei der markierte dritte Rezeptor in die zweite Zone fließt, um den Komplex aus Analyt und unmarkiertem Rezeptor über den Analyt zu binden, und Flüssigkeit in die Abflußzone fließt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend das Zusammenbringen der Probe mit der wie vorstehend beschriebenen Vorrichtung, wobei die Probe in der ersten Zone mit einem ersten Rezeptor zusammengebracht wird, der spezifisch an den Analyten unter Bedingungen bindet, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem ersten Rezeptor und dem Analyten in der Lösung begünstigen, Zusammenbringen der Komplex-enthaltenden Lösung in der zweiten Zone mit einem an eine feste Phase gebundenen zweiten Rezeptor, der spezifisch an den ersten Rezeptor unter Bedingungen bindet, die das Binden des Komplexes an die feste Phase begünstigen, Verdrängen der flüssigen Probe aus der festen Phase mit einer Verdrängungslösung und Zusammenbringen des an eine feste Phase gebundenen Komplexes mit einem dritten markierten Rezeptor, der an den Analyten bindet, aber nicht an den ersten oder zweiten Rezeptor, um diesen dritten Rezeptor an sich zu binden, und Bestimmen der Markierung, entweder an den Komplex gebunden oder nicht gebunden, als Angabe für den Analyten in der Probe.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer wie vorstehend beschriebenen Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe.
Die Vorrichtung dieser Erfindung ist eine solche, die angepaßt ist für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, unter Beseitigung von Störungen durch andere Komponenten der Probe. Die Vorrichtung ist speziell für die Verwendung bei guarternären Sandwich-Immunoassays angepaßt.
Eine Bezugnahme auf die Abbildungen ist hilfreich für das Verständnis der Vorrichtung wie auch der Methode der Erfindung. Betrachtet man Figur 1, so umf aßt die Vorrichtung einen Träger 1, der inert ist und der im wesentlichen dazu dient, daß er die anderen Merkmale der Vorrichtung aufnimmt. Es wird eine erste Zone 2 bereitgestellt, die sich auch als der "erste Docht" der Erfindung beschreiben läßt. Diese erste Zone 2 ist für die Aufnahme der Probe angepaßt. Diese erste Zone 2 enthält einen ersten Rezeptor, etwa einen Antikörper oder einen biotinylierten Antikörper, der spezifisch an den zu bestimmenden Analyten bindet. Dieser erste Rezeptor ist nicht an eine feste Phase gebunden und läßt sich aus der ersten Zone 2 entfernen, wenn Probe zugesetzt wird. Er soll als "Einfang"-Rezeptor bezeichnet werden.
Die erste Zone 2 steht in wenigstens teilweisem Flüssigkeitskontakt mit einer zweiten Zone 3, die einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor oder "Matrix"-Rezeptor enthält. Dieser an eine feste Phase gebundene Rezeptor kann irgendeine aus einer Reihe von Substanzen sein, etwa ein Antikörper, Protein A, ein Avidin/Streptavidin-System und so weiter. Allerdings muß dieser Rezeptor an den Einfangrezeptor der ersten Zone binden.
Die Vorrichtung umfaßt auch eine dritte Zone 4, und durch diese dritte Zone 4 ist die Erfindung definiert. Die dritte Zone 4 enthält den konjugierten Rezeptor, etwa einen markierten Antikörper oder Antikörperfragment. Relativ zur ersten Zone 2 ist sie so positioniert, daß, wenn die Probe auf die erste Zone aufgebracht wird, die Probe nicht mit der dritten Zone 4 in Berührung kommt. Somit sind erste Zone 2 und dritte Zone 4 durch eine für Flüssigkeiten undurchlässige Barriere 5 getrennt, die verhindert, daß das Konjugat der dritten Zone 4 in die erste Zone diffundiert. Die Vorrichtung zeigt eine Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag 6, die in teilweisem Flüssigkeitskontakt mit der dritten Zone 4 steht. Die Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag 6 ist getrennt von der ersten Zone 2 gezeigt, obwohl dies nicht von grundlegender Bedeutung ist. Diese Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag 6 ermöglicht das Auftragen einer Flüssigkeit, die das Konjugat verdrängt, da dies durch die Probe nicht geschieht.
Bei der Durchführung des Assays wird eine zu analysierende Probeflüssigkeit der ersten Zone 2 zugesetzt. Jeder Einfangrezeptor, der an den zu bestimmenden Analyten bindet, wird den Analyten, unter Bildung eines Rezeptor/Analyt- Komplexes komplexieren, der in der Flüssigkeit enthalten ist. Flüssigkeiten - aufgrund ihrer Beschaffenheit -fließen, so daß die den Komplex enthaltende Flüssigkeit sich weiter durch die Vorrichtung bewegt.
Die Flüssigkeit bewegt sich dann in die zweite Zone 3, die den Matrix-Rezeptor enthält. Dieser Rezeptor bindet an den vorher in die erste Zone eingebrachten Einfangrezeptor und immobilisiert sowohl die Komplexe als auch den nicht komplexierten ersten Rezeptor.
Bei Vorrichtungen im Stand der Technik wird an diesem Punkt das markierte Konjugat eingebracht. Entweder wird das markierte Konjugat in die erste Zone oder in die Festphasenzone eingebracht. In beiden Fällen wird das Konjugat eingebracht, während die Probeflüssigkeit mitsamt ihren natürlichen, störenden Substanzen vorhanden ist.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist dies jedoch nicht der Fall. Durch die undurchlässige Barriere 5 wird der Kontakt der Probe mit der dritten Zone "4", die das Konjugat enthält, ausgeschlossen. Somit erreicht die Probe die Matrix ohne das Konjugat, und das Komplexieren an der Festphase findet statt.
Das Einbringen des Konjugats geschieht dann nach einem von mehreren alternativen Schemata. Eine Möglichkeit besteht beispielsweise darin, eine "Waschung" wie etwa einen Puffer, destilliertes Wasser oder eine Fließlösung an der Probenauftragzone 2 aufzubringen. Diese Waschung nimmt den gleichen Weg wie die Probe, doch führen ihre normale Fließfähigkeit und ihre relative Indifferenz zur Verdrängung der Probenflüssigkeit aus der Matrix, ohne Beeinflussung der an die feste Phase gebundenen Komponenten. Sobald dies bewerkstelligt ist, kann z.B. eine Lösung in die Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag 6 eingebracht werden. Diese flüssige Lösung gelangt nun in die dritte Zone 4 und trägt das Konjugat in die zweite Zone 3, wo es sich ohne irgendwelche Störungen durch native Substanzen, die nun natürlich abgetrennt sind, mit dem Analyten verbindet.
Die Waschlösung ist zwar eine Möglichkeit, doch ist es nicht der einzige Weg, die Abführung der Probenlösung zu bewerkstelligen. Es wurde gefunden, daß, wenn man den Waschschritt wegläßt, die Front der Konjugat enthaltenden Lösung die zu analysierende flüssige Probe ebenso durch die Vorrichtung "drückt", ehe das Konjugat die zweite Zone erreicht. Somit ist es zwar wichtig, die flüssige Probe weiter in der Vorrichtung weiterzubewegen, doch gibt es mehrere Möglichkeiten, dies zu bewerkstelligen.
Sobald das Konjugat in Kontakt mit der zweiten Zone 3 gekommen und von dort abgeflossen ist, wird die Messung der Markierung im Konjugat erforderlich. Die Messung kann nach vielen verschiedenen Verfahren vor sich gehen. Es sind verschiedene Markierungen bekannt, die de facto ein erfaßbares Signal ergeben. Zu den Beispielen für diese gehören metallische Teilchen wie etwa Gold oder Stoffe, die ohne weitere Wechselwirkung ein erf aßbares Signal abgeben, etwa fluoreszierende, radioaktive oder chemilumineszierende Stoffe.
Ebenfalls als Markierungen in Betracht gezogen werden solche Stoffe, die mit anderen unter Bildung eines Signals reagieren, sei es kolorimetrisch, fluoreszierend etc.. Eine beispielhafte, in der Fachwelt wohlbekannte Art von Markierungssystem ist das "Enzym/Substrat"-System. Bei diesen Systemen ist die Markierung z.B. ein Enzym, das mit einem Substrat reagiert. Die Reaktion ergibt ein Produkt mit einer eindeutigen Farbe, Farbänderung oder irgendeiner anderen wahrnehibaren Eigenschaft.
Ist die Markierung eine solche, die von sich aus ein Signal erzeugt, so ist es selbstverständlich nicht nötig, ein Hilfsmittel zum Einbringen eines Reaktionspartners, etwa eines Substrats, für die Markierung bereitzustellen. Somit betrifft die folgende Diskussion diejenigen Systeme, bei denen eine Markierung verwendet wird, die zur Erzeugung eines Signals eines Reaktionspartners bedarf. Bei der Vorrichtung ist keine der speziell offenbarten Ausführungsformen erforderlich, doch stellen sie beispielhaft verschiedene Möglichkeiten dar, um Markierung und Reaktionspartner zusammenzubringen.
Figur 1 zeigt eine Option, bei der ein Merkmal 8 bereitgestellt ist, das einen Reaktionspartner oder ein Substrat getrennt von der Matrix 3 enthält, während Figur 2 eine Anordnung zeigt, bei der Reaktionspartner oder Substrat und die Matrix "vereinigt" sind.
Bei der Vorrichtung ist jedoch keine Substratdiffusionszone erforderlich, da das Substrat zugesetzt werden kann, nachdem die Komplexbildungsreaktionen in ihrer Gesamtheit abgelaufen sind. Der Substratauftrag kann z.B. durch Eindrücken einer das Substrat enthaltenden Struktur auf die zweite Zone vor sich gehen oder durch Auftragen auf die erste Zone in der Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag, nachdem die Komplexierung vor sich gegangen ist, unter Verwendung einer Vorrichtung wie der beispielsweise in US-Patent Nr. 4 665 023 beschriebenen.
Zu den für den Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Materialien können viele verschiedene Substanzen gehören. Die Zonen sollten absorptionsfähig für Flüssigkeiten sein und gute Kapillarität besitzen. Zu den Beispielen für verwendbare Materialien gehören saugfähiges Papier, Nitrocellulose-Papier, Schwämme, polymere Folien etc.. Es können sowohl faserige als auch nichtfaserige Materialien verwendet werden.
Wie bereits vorstehend erwähnt, kann es sich bei den verschiedenen Rezeptoren um eine Reihe von Stoffen handeln. Bei einer Ausführungsform ist das Konjugat ein Fab- oder Fab'-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, das eine Enzymmarkierung trägt, und der Einfangrezeptor ist ein zweiter, kompletter monoklonaler Antikörper, der aus der gleichen Spezies stammt wie das Konjugat-Beispiel. Zu den anderen möglichen Rezeptoren gehören polyklonale Antikörper. Der Matrixrezeptor oder an eine feste Phase gebundene Rezeptor wird nach irgendeiner Standardmethode für diesen Zweck immobilisiert, etwa durch Bromcyan-Fixierung. Der immobilisierte Rezeptor ist vorzugsweise ein Antikörper, der an den Fc-Teil des Einfang-Antikörpers bindet, kann aber ebensogut eine andere Substanz sein, etwa Protein A oder Biotin, wenn der Einfang-Antikörper ein Avidin-Molekül an sich gebunden aufweist.
Ein Rückblick auf diese Diskussion zeigt, daß die Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten bereitstellt, bei dem der Analyt mit einem ersten Rezeptor zusammengebracht wird unter Bildung von Komplexen aus diesen, gefolgt vom Zusammenbringen der Komplexe mit einem zweiten, an eine feste Phase gebundenen Rezeptor. Hierauf wird der dritte Rezeptor, da. Konjugat, an den festphasengebundenen Komplex gebunden. Die Bestimmung von gebundenem oder ungebundenem Konjugat ermöglicht die Untersuchung des Analyten.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Experimente wurden durchgeführt unter Vergleich der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung und Methode mit der Vorrichtung und der Methode, die in dem US-Patent Nr. 4 891 313 der Erfinder beschrieben ist.
Es wurden zwei Vorrichtungen hergestellt, bei denen die meisten Komponenten identisch waren. Im einzelnen handelte es sich bei der Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag "6" für beide Vorrichtungen um ein Stück Tuch aus Viskoseschwamm (Kalle, Wiesbaden), geschnitten auf 3,0 cm mal 0,6 cm. Die zweite Zone 3 war aufgebaut aus einem Stück Papier 3512 (Schleicher & Schüll), das mit Bromcyan aktiviert wurde. Schaf-Antimaus-Fc-Antikörper wurden an das Papier gekuppelt, und dieses wurde auf 1,2 cm mal 0,6 cm geschnitten. Bei der Sperrfolie 5 handelte es sich um ein Stück aus doppelseitigem Klebeband, 1,0 cm mal 0,6 cm (3m). Die Abflußzone 9 war aufgebaut aus einem Stück Papier D-28, 5,0 cm mal 0,6 cm (Whatman).
Die Vorrichtungen unterschieden sich jedoch im Aufbau der ersten Zone 2 und dem in der dritten Zone 4 imprägnierten Material. Unter Anwendung der hierin beschriebenen Erfindung war insbesondere die erste Zone 2 ein Stück Papier 4210 (Kalff), geschnitten auf 1,6 cm mal 0,6 cm, das imprägniert war mit 10 ul einer Lösung von 1 ug monoklonalem Antikörper für hCG in 0,3% Tween 20 (Phosphat-gepufferte Salzlösung, ph 7,2). Die Vorrichtung in Anlehnnung an US- Patentanmeldung Nr. 146 574 war im Gegensatz zur Erfindung imprägniert mit 10 ul einer Lösung, enthaltend 1 ug des gleichen monoklonalen Antikörpers, aber auch 0,2 Einheiten eines Konjugats aus einem Fab-Fragment eines zweiten monoklonalen Antikörpers gegen hCG, konjugiert mit β -Galactosidase, sowie 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Bei der Erfindung war die dritte Zone ein Stück Papier 4210, geschnitten auf 2,5 cm mal 0,6 cm. Ein Teil der zweiten Zone wurde mit einer ersten Lösung imprägniert, die 10 ul 10% Polyvinylalkohol (Mowiol 4-88, Hoechst) und 0,4 mg des β-Galactosidase-Substrats Methoxynaphtholgalactosid (1:1- Mischung aus DMSO und Wasser) enthielt. Der mit dem Substrat imprägnierte angrenzende Teil der Zone wurde mit einer zweiten Lösung (10 ul) imprägniert, die 0,3 Einheiten eines Konjugats aus einem Fab-Teil eines monoklonalen Antikörpers gegen hCG, konjugiert mit β-Galactosidase, und 20 ug Phenylethylthiogalactosid in einer Lösung von PBS/BSA/Tween enthielt. Das zweite Galactosid ist ein β -Galactosidase-Hemmer.
Wichtig ist es, anzumerken, daß bei der Erfindung die beiden vorstehend angegebenen Lösungen in die zweite Zone so imprägniert werden, daß sie nach dem Trocknen einander benachbart sind, sich aber nicht berühren.
Bei der Vorrichtung in Anlehnung an US-Patent Nr. 4 891 313 war die zweite Zone von gleicher Größe wie bei der Erfindung, war aber nur mit der vorstehend erwähnten 4-Methoxynaphtholgalactosid-Lösung imprägniert.
In der Zusammenschau lassen sich dann die Unterschiede bei den Vorrichtungen anhand folgender Tabelle zusammenfassen: TABELLE Erfindung Stand der Technik Erste Zone Zweite enthält einen Antikörper Erster Teil: Substrat; Zweiter und Hemmer. Teile berühren sich nicht enthält zwei, einer markiert, nur Markierung,
Die Vorrichtungen wurden dann unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebandes auf einer weißen Polyester-Trägerfolie zusammengesetzt. Der Aufbau der Komponenten zu Teststreifen geschah in Anlehnung an Standardmethoden, die in der Fachwelt wohlbekannt sind, und deshalb sollen hier keine Einzelheiten angegeben werden.
Mit beiden Streifentypen wurden dann Assays durchgeführt, unter Verwendung eines Kontrollsystems, wobei eines 0 mIU/ml hCG enthielt und das andere 250 mIU/ml. Zusätzlich wurde eine Fließlösung hergestellt, enthaltend 50 mmol/l Natriumphosphat, 0,03% Tween 20, 150 mmol/l NaCl, 2 mmol/l NaBO&sub3; (Natriumperborat, ein Peroxidase-Substrat) und 10 U/ml Meerrettichperoxidase.
Bei der Durchführung der Assays wurden 150 ul Probe auf die erste Zone aufgetragen, wonach 850 ul Fließlösung am Auftragepunkt 6 aufgetragen wurden. Die Farbentwicklung wurde dann in der dritten Zone beobachtet. Die erwartete Farbe ist ein dunkles Blau, erzeugt durch die Reaktion des Enzymsubstrats und der β-Galactosidase.
Die Ergebnisse der Assays wurden ausgewertet unter Verwendung eines Macbeth-Reflexionsspektrometers, und die ΔE- Werte für die Testflächen wurden relativ zu einem einfachen weißen Papierstreifen aufgezeichnet. hCG-Konzentration Stand der Technik Erfindung 0 mIU/ml 250 mIU/ml
Bei diesen Einheiten ist eine Differenz von 1,0 in vernünftiger Weise unterscheidbar, und eine Differenz von 2,0 ist klar unterscheidbar. Die Wertedifferenz, insbesondere bei der 250 mIU/ml enthaltenden Probe, zeigt, wie effektiv die hierin beschriebene Vorrichtung und Methode zur Beseitigung von Störungen beim Assay ist. Das als Ansprechen auf den Analyten erzeugte Signal ist weitaus klarer, stärker und genauer.

Claims

1. Vorrichtung, die brauchbar ist zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, umfassend

(i) eine erste Zone, enthaltend einen unmarkierten ersten Rezeptor, der in einer flüssigen Probe löslich ist und der spezifisch an den zu bestimmenden Analyten bindet;

(ii) eine zweite Zone, enthaltend einen immobilisierten zweiten Rezeptor, der an Komplexe aus dem zu bestimmenden Analyten und dem unmarkierten ersten Rezeptor über den unmarkierten ersten Rezeptor bindet, wobei ein erster Teil der zweiten Zone mit der ersten Zone in Kontakt ist, so daß ein Fließen von Flüssigkeit und Komplexen aus Analyt und unmarkiertem ersten Rezeptor von der ersten Zone in die zweite Zone ermöglicht wird;

(iii) eine dritte Zone, enthaltend einen markierten dritten Rezeptor, der an den Analyten, aber nicht an den unmarkierten ersten Rezeptor bindet, wobei ein erster Teil der dritten Zone mit einem zweiten Teil der zweiten Zone in Kontakt ist, um ein Fließen von Flüssigkeit von der dritten Zone in die zweite Zone und Binden des markierten Rezeptors an die Analytenkomponente aus immobilisierten Komplexen von Analyt und unmarkiertem Rezeptor zu ermöglichen;

(iv) eine Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag, die sich an einem ersten Ende der Vorrichtung befindet, wobei die Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag keinen Rezeptor enthält, in Kontakt ist mit einem zweiten, separaten Teil der dritten Zone, und nicht mit der zweiten Zone in Kontakt ist;

eine Abflußzone, die sich an einem zweiten Ende der Vorrichtung und gegenüber der Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag befindet, wobei die Abflußzone mit der zweiten Zone in Kontakt ist, um das Fließen von Flüssigkeit von der zweiten Zone in die Abflußzone zu ermöglichen; und

(vi) mit der Maßgabe, daß die erste Zone und die dritte Zone nicht in Kontakt miteinander stehen, und wobei der zu bestimmende Analyt mit dem unmarkierten ersten Rezeptor in der ersten Zone unter Bildung eines Komplexes aus Analyt und unmarkiertem ersten Rezeptor reagiert, der in die zweite Zone fließt, wobei der immobilisierte zweite Rezeptor an den Komplex aus Analyt und unmarkiertem ersten Rezeptor über den ersten Rezeptor bindet, der markierte dritte Rezeptor durch Kontakt mit einer Flüssigkeit, die durch die Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag und in die dritte Zone fließt, aus der dritten Zone herausgelöst wird, wobei der markierte dritte Rezeptor in die zweite Zone fließt, um den Komplex aus Analyt und unmarkiertem Rezeptor über den Analyt zu binden, und Flüssigkeit in die Abflußzone fließt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, des weiteren umfassend eine Substratauftragzone, wobei die Substratauftragzone in wenigstens teilweisem Flüssigkeitskontakt mit der zweiten und dritten Zone steht.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Einrichtung zum Flüssigkeitsauftrag in Flüssigkeitskontakt mit der ersten und dritten Zone steht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Substratauftragzone in teilweisem Flüssigkeitskontakt mit der zweiten Zone steht.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung eine Substratauftragzone umfaßt, die sich in einer Klappeinrichtung in der Vorrichtung befindet, die den Kontakt zwischen der Substratauftragzone und der zweiten Zone ermöglicht.

6. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend das Zusammenbringen der Probe mit der Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Probe in der ersten Zone mit einem unmarkierten ersten Rezeptor zusammengebracht wird, der spezifisch an den Analyten unter Bedingungen bindet, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem ersten Rezeptor und dem Analyten in der Lösung begünstigen, Zusammenbringen der Komplex enthaltenden Lösung in der zweiten Zone mit einem an eine feste Phase gebundenen zweiten Rezeptor, der spezifisch an den ersten Rezeptor unter Bedingungen bindet, die das Binden des Komplexes an die feste Phase begünstigen, Verdrängen der flüssigen Probe aus der festen Phase mit einer Verdrängungslösung und Zusammenbringen des an eine feste Phase gebundenen Komplexes mit einem dritten markierten Rezeptor, der an den Analyten bindet, aber nicht an den ersten oder zweiten Rezeptor, um diesen dritten Rezeptor an sich zu binden, und Bestimmen der Markierung, entweder an den Komplex gebunden oder nicht gebunden, als Angabe für den Analyten in der Probe.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Verdrängungslösung den dritten Rezeptor enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Verdrängungslösung eine Waschlösung ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei wenigstens einer der ersten, zweiten und dritten Rezeptoren ein Antikörper ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der zweite Rezeptor Protein A ist.

11. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der zweite Rezeptor Avidin/Streptavidin ist und der erste Rezeptor biotinyliert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der zweite Rezeptor ein Antikörper ist.

13. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der dritte Rezeptor ein Fab- oder F(ab')&sub2;-Fragment ist.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper monoklonal ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Fragment ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers ist.

16. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Markierung chromophor, fluoreszierend oder radioaktiv ist.

17. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Markierung ein Enzym ist.

18. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe.