DE3852797T2

DE3852797T2 - Hoch empfindlicher Immunoassay.

Info

Publication number: DE3852797T2
Application number: DE19883852797
Authority: DE
Inventors: Eiji Ishikawa
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-08-11
Filing date: 1988-08-09
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2008-08-10
Also published as: EP0303229A3; EP0303229A2; EP0303229B1; CA1326814C; DE3852797D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein hochempfindliches Immunoassayverfahren, insbesondere auf ein ultrahochempfindliches Immunoassayverfahren für antigenspezifische Antikörper oder antigene Substanzen.
Ein Assay auf Antikörper wird weitverbreitet bei Untersuchungen auf Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen usw. angewandt und es ist bei Untersuchungen auf Autoimmunerkrankungen usw. wichtig, um die Komponente zu bestimmen, die bereits einen Antigen-Antikörper-Komplex in einer Testlösung gebildet hat.
Außerdem ist ein Assay auf Biokomponenten, insbesondere antigene Substanzen in der Körperflüssigkeit von Menschen, bei klinischen Zuständen sehr wichtig. Ein Antigen-Assay wird weitverbreitet auf verschiedene Untersuchungen angewandt, wie etwa endokrine Untersuchungen durch Messung von Hormonen, krebsdiagnostische Untersuchungen und infektionsdiagnostische Untersuchungen.
Eine derartige Mikrobestimmung auf Antikörper oder antigene Substanzen beruht herkömmlicherweise auf einem Immunoassay. In den letzten Jahren sind Verfahren unter Verwenden eines festen Trägers in Immunoassays weitverbreitet verwendet worden. Beispiele derartiger Verfahren schließen auf einer Sandwichtechnik beruhende Verfahren, wie etwa ELISA und IRMA, und auf einer kompetitiver Proteinbindungsanalyse beruhende Verfahren, wie etwa das Zweiter-Antikörper-Festphasenverfahren, ein.
Die herkömmlichen Immunoassayverfahren werden in zwei Gruppen aufgeteilt: eine umfaßt Verfahren, bei denen jeder spezifische Antikörper oder Antigen in der Probe auf einem an einen festen Träger gebundenen Antigen oder Antikörper eingefangen und mittels eines markierten Anti-Immunglobulin-Antikörpers oder markierten Antikörpers (Technik 1) geprüft wird, die andere Gruppe umfaßt Verfahren, bei denen jeder spezifische Antikörper auf einem mit einem Anti-Immunglobulin-Antikörper überzogenen Träger eingefangen und mittels eines markierten Antigens geprüft wird (Technik 2).
Als Beispiel der Anwendung von Technik 1 gibt es einen Bericht über eine Studie eines Assays auf Human-Anti-Insulin-Antikörper von L. J. Nell et al., [Diabetes, 34, 60, (1985)], bei dem die Testlösung einem insulingebundenen, festen Träger zugesetzt wurde und der gebundene Human-Anti-Insulin-Antikörper mittels eines enzymmarkierten Anti-Human-Immunglobulin-Antikörpers bestimmt wurde. Als Beispiel von Technik 2 gibt es einen Bericht über eine Studie eines Assays auf Anti-Toxoplasma-IgM-Antikörper von A. M. Johnson et al., [Pathology, 17, 586 (1985)], bei dem eine mit einem Anti-IgM-Antikörper überzogene, feste Phase verwendet wurde.
Bei Technik 1 ist normalerweise eine große Menge nicht-spezifisches Immunglobulin in der Testlösung enthalten und es wird an die feste Phase unter Bewirken eines Bindens des markierten Immunglobulin-Antikörpers nicht-spezifisch adsorbiert; deshalb besitzt Technik 1 den Nachteil, daß die Assay-Empfindlichkeit als Ergebnis der Zunahme des Hintergrundwerts abnimmt.
Ferner war im Fall eines Assays auf antigene Substanzen die Assay-Empfindlichkeit durch den Hintergrundwert eingeschränkt, welcher der markierten Komponente zuzuschreiben war, die auf dem festen Träger nicht spezifisch adsorbiert war, und dies stellt eine Beschränkung für einen hochempfindlichen Assay dar.
Bei Technik 2 besteht eine Beschränkung bei der Fähigkeit des Einfangens von Immunglobulin des mit einem Anti-Immunglobulin- Antikörper überzogenen festen Trägers. Eine Zunahme der Trägerfähigkeit führt zu einer Zunahme beim Hintergrundwert. In jedem Fall ist es schwierig, eine hohe Empfindlichkeit zu erhalten.
Weiter beschreibt die EP-A-0 236 606 ein Verfahren zum Durchmustern von Plasma- oder Serumproben auf spezifische, in Immunkomplexen vorliegende antigene Marker, wobei das Verfahren:
das Führen der Probe durch eine Immunoadsorbenssäule, die zum spezifischen Binden von Immunkomplexen befähigt ist; Waschen der Säule unter Entfernen aller ungebundener Substanzen; Eluieren der gebundenen Immunkomplexe aus der Säule unter Bilden eines Eluats; Aussetzen des Eluats einem Festphasenrezeptor, der zum spezifischen Binden der Immunkomplexe befähigt ist und Aussetzen der an die feste Phase gebundenen Immunkomplexe einem auf die antigenen Marker spezifischen Markierungssystem umfaßt.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf
ein hochempfindliches Immunoassayverfahren zum Prüfen auf eine Zielsubstanz, bei der es sich um eine zu prüfende antigene Substanz oder einen zu prüfenden spezifischen Antikörper handelt, in einer Testlösung, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte (A), (B), (C) und (D) umfaßt:
(A) Hinzufügen zu der Testlösung
(1) einer oder mehrerer aktiver Komponenten, die mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen konjugiert sind, wobei die aktiven Komponenten in der Lage sind, an die Zielsubstanz zu binden, und die funktionellen Gruppen in der Lage sind, an die reaktiven Gruppen an einem festen Träger in Verfahrensschritt (A) und gegebenenfalls an einem festen Träger in Schritt (C) zu binden, unter Bildung eines Immunokomplexes, der aus der Zielsubstanz und einer aktiven Komponente zusammengesetzt ist; sowie Hinzufügen
(2) des ersten festen Trägers mit wenigstens einer reaktiven Gruppe, die in der Lage ist, an die funktionellen Gruppen zu binden, unter Bindung des Immunokomplexes an den ersten festen Träger;
(B) Dissoziieren des Immunokomplexes von dem ersten festen Träger;
(C) Hinzufügen eines zweiten festen Trägers mit einer reaktiven Gruppe, die in der Lage ist, an den Immunokomplex zu binden, zu dem in Schritt (B) abdissoziierten Immunokomplex unter Bildung eines Immunokomplexes, der an den zweiten festen Träger gebunden ist; sowie
(D) Prüfen auf den Komplex, der an den zweiten festen Träger gebunden ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 bis 3 sind graphische Darstellungen, welche die Ergebnisse eines Assays auf Insulin-Antikörper durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung und durch ein herkömmliches Verfahren zeigen.
Figur 4 bis 6 sind graphische Darstellungen, welche die Ergebnisse eines Assays auf einen Anti-Thyroglobulin-Antikörper durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung und durch ein herkömmliches Verfahren zeigen.
Figur 7 und 8 sind graphische Darstellungen, welche die Ergebnisse für Human-TSH beziehungsweise Human-GH zeigen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Beschreibung von Verfahren (A)

Beispiele von Testlösungen des Assays schließen Körperflüssigkeiten, wie etwa Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Speichel und Urin, und Antikörper- und Antigen-haltige Puffer ein. Spezifische, zu prüfende Antikörper schließen im wesentlichen alle Antikörper ein, die durch herkömmliche Immunoassay-Verfahren erfolgreich geprüft worden sind. Beispiele derartiger Antikörper schließen Auto-Antikörper wie etwa einen Anti-Nukleus-Antikörper, Anti-DNA-Antikörper, Anti-ENA-Antikörper, rheumatoider Faktor, Anti-Erythrozyten-Antikörper, Anti-Mitochondrien-Antikörper, Anti-Muskel-Antikörper, Anti-Thyroid-Antikörper (Anti-Mikrosom-Antikörper, Anti-Thyroglobulin-Antikörper, Anti-TSH-Rezeptor-Antikörper), Anti-Insulin-Antikörper, Anti-Insulin-Rezeptor-Antikörper und Anti-Acetylcholin-Rezeptor-Antikörper; Antikörper gegen Viren oder Mikroorganismen; Antikörper gegen Proteinzubereitungen wie etwa Interferon und menschliches Wachstumshormon, und Allergen-Antikörper bei allergischen Erkrankungen. Diese Antikörper können selbst dann geprüft werden, wenn sie sowohl in Form eines Immunkomplexes oder eines Komplexes mit gebundenem Protein als auch in freier Form in der Testlösung vorliegen.
Wenn der Gegenstand des Assays ein spezifischer Antikörper ist, sind die aktiven Komponenten die nachstehenden Komponenten 1 oder Komponente 1 und 2.
1. Antigen. Der Ausdruck Antigen bedeutet hier eine Komponente wie etwa ein spezifisches Antigen oder einen idiotypischen Antikörper, die mit dem zu prüfenden Antikörper eine Antigen-Antikörper-Reaktion hervorruft.
2. Eine Komponente, die mit dem vorgenannten Antigen eine Antigen-Antikörper-Reaktion hervorruft (z.B. Antigene mit einem Epitop, das sich von dem des zu prüfenden Antikörpers unterscheidet).
Zu prüfende antigene Substanzen schließen alle Substanzen ein, die eine antigene Stelle besitzen, d.h. im wesentlichen alle Substanzen, die durch ein herkömmliches Immunoassay-Verfahren erfolgreich geprüft worden sind. Beispiele derartiger Substanzen schließen Enzyme wie etwa γ-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTP), alkalische Phosphatase und Glycosyltransferase; Proteinhormone wie etwa Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH), Luteinisierungshormon (LH), humanes Choriongonadotropin (hCG), Insulin, Sekretin und Wachstumshormon (GH); Plasmaproteine wie etwa Fibrindegradationsprodukt (FDP), C-reaktives Protein (CRP), α&sub1;- saures Glykoprotein (α&sub1;-AGP), α&sub1;-Anti-Trypsin (α&sub1;-AT), α&sub2;-Plasminhemmer (α&sub2;-PI), β&sub2;-Mikroglobulin (β&sub2;-MG) und Immunglobuline; carcinoembryonale Proteine wie etwa α-Fetoprotein (AFP), carcinoembryonales Antigen (CEA) und Ferritin; Zellen wie etwa Lymphozyten, Viren und Mikroorganismen; Zelloberflächenantigene und Haptene wie etwa Digoxin, Thyroxin, Triiodtyrosin, Cortisol und Prostaglandin. Diese Antigene können selbst dann geprüft werden, wenn sie sowohl in Form eines Immunkomplexes oder eines Komplexes mit gebundenem Protein als auch in freier Form in der Testlösung vorliegen.
Wenn der Gegenstand des Tests eine antigene Substanz ist, ist die aktive Komponente die nachstehende Komponente 1 oder Komponente 1 und 2.
1. Antikörper. Antikörper bedeutet hier entweder ein monoklonaler Antikörper oder polyklonaler Antikörper, der durch Immunisieren von Tieren mit dem zu prüfenden Antigen oder einer mit der des Antigens identischen Antigenerkennungsstelle durch ein bekanntes Verfahren erhalten wurde.
2. Eine mit dem vorgenannten Antikörper eine Antigen-Antikörper-Reaktion verursachende Komponente (z.B. Antigene, Anti-Antikörper).
Diese aktiven Komponenten können normalerweise zusammen mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen verwendet werden, die an der Komplex-Träger-Bindung in Verfahren (A) und/oder Verfahren (C) teilnehmen.
Beispiele der funktionellen Gruppen schließen Haptene wie etwa eine Dinitrophenylgruppe und Trinitrophenylgruppe; Biotin und andere Antikörper und Antigene als das zu prüfende Antigen oder der entsprechende Antikörper ein. Die Haptene und das Biotin könne alle über eine -S-S-Bindung gebunden sein.
Die bevorzugten funktionellen Gruppen sind diejenigen, deren Bindung mit dem festen Träger nicht durch irgendeine Komponente der Testlösung in Verfahren (A) gehemmt wird, von denen unwahrscheinlich ist, daß sie durch Waschen entfernt werden und welche die Dissoziation des Komplexes von dem festen Träger in Verfahren (B) erleichtern. Die bevorzugten funktionellen Gruppen, welche am Binden in Verfahren (C) beteiligt sind, sind diejenigen, welche den in Verfahren (B) dissozierten Komplex wirksam an einen anderen festen Träger binden.
Weiterhin kann wenigstens eine dieser aktiven Komponenten mit einem für den Assay in Verfahren (D) verwendeten Marker markiert verwendet werden; insbesondere ist im Fall, daß eine antigene Substanz geprüft wird, ein Marker daran gebunden.
Jede Substanz kann als Marker verwendet werden, solange sie zur Messung in einem Immunoassay verwendet werden kann. Beispiele derartiger Substanzen schließen Enzyme, radioaktive Substanzen, lumineszierende Substanzen, fluoreszierende Substanzen und Metallverbindungen ein.
Beispiele verwendbarer Enzyme schließen Peroxidase, β-D-Galactosidase und alkalische Phosphatase ein; Beispiele verwendbarer radioaktiver Substanzen schließen Iod und Wasserstoff ein; Beispiele verwendbarer fluoreszierender Substanzen schließen Fluoreszeinisothiocyanat ein und Beispiele verwendbarer lumineszierender Substanzen schließen Acridiumsalze ein.
Das Binden dieser funktionellen Gruppen und Marker an die aktive Komponente kann durch einen löslichen Träger vermittelt werden, der keines der Verfahren (A) bis (D) beeinflußt. Eine derartige Vermittlung ist besonders bevorzugt, wenn die aktive Komponente von niedrigem Molekulargewicht ist. Beispiele des löslichen Trägers schließen nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, Rinderserumalbumin und Dextran ein.
Zum Markerbinden kann jedes Verfahren zum Binden eines Markers an einen Antikörper oder ein Antigen in den herkömmlichen Immunoassays verwendet werden.
Ein fester Träger, der mit dem Komplex gebunden ist, welcher den in der Testlösung zu prüfenden, spezifischen Antikörper oder die antigene Substanz und aktive Komponenten enthält kann normalerweise wie folgt hergestellt werden:
Verfahren (a): das Verfahren, bei dein ein Komplex gebildet wird, der den in der Testlösung zu prüfenden, spezifischen Antikörper oder die antigene Substanz und aktive Komponenten enthält, wonach der Komplex an einen festen Träger gebunden wird.
Verfahren (b): Das Verfahren, bei dem der Komplex auf einem festen Träger gebildet wird.
Die Bildung eines einen Antikörper oder ein Antigen und aktive Komponenten umfassenden Komplexes wird durch Hinzufügen einer oder mehrerer aktiver Komponenten zu der Testlösung erreicht. Es ist bevorzugt, daß zwei oder mehrere aktive Komponenten verwendet werden und daß die aktive(n) Komponente(n), die an eine oder mehrere funktionelle Gruppen gebunden werden soll(en) und die aktive(n) Komponente(en), die mit einem Marker markiert werden soll(en), getrennt verwendet werden.
Zur Komplexbildung werden Bedingungen verwendet, die zu einer gewöhnlichen Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet werden. Der Komplex wird üblicherweise bei 0 bis 45ºC über einen Zeitraum von mehreren bis zu einigen Dutzend Stunden, vorzugsweise bei 20 bis 37ºC über einen Zeitraum von 1 bis 6 Stunden, gebildet. Der auf diese Weise gebildete Komplex wird an einen festen Träger gebunden.
Als fester Träger kann jede Substanz verwendet werden, die in einem herkömmlichen Irnmunoassayverfahren verwendet worden ist. Beispiele derartiger Substanzen schließen Polystyrol, Polyacryl, Teflon, Papier, Glas und Agarose ein. Weiterhin kann der feste Träger jede Gestalt besitzen.
Der feste Träger muß eine reaktive Gruppe zum Binden des in Verfahren (A) gebildeten Komplexes an den festen Träger oder zum Bilden des Komplexes an den festen Träger besitzen.
Als an den festen Träger zu bindende reaktive Gruppe kann jede reaktive Gruppe, die an den Komplex gebunden werden kann, verwendet werden, solange sie an den zu prüfenden Antikörper oder das Antigen, die aktive Komponente, die funktionelle Gruppe, den Marker oder die sich aus der Komplexbildung ergebende immunaktive Stelle binden kann. Die bevorzugten reaktiven Gruppen sind diejenigen, welche zur leichten Dissoziation des Komplexes in Verfahren (B) befähigt sind.
Beispiele derartiger reaktiver Gruppen schließen gewöhnliche, der funktionellen Gruppe entsprechende reaktive Gruppen ein. Wenn zum Beispiel
1) die funktionelle Gruppe ein Hapten wie etwa eine Dinitrophenylgruppe oder Trinitrophenylgruppe ist, schließen Beispiele dazu entsprechende Antikörper ein,
2) die funktionelle Gruppe Biotin ist, schließen Beispiele Avidin und Streptoavidin ein, und
3) die funktionelle Gruppe ein durch eine -S-S-Bindung vermitteltes Antigen oder Antikörper ist, schließen Beispiele den entsprechenden Antikörper oder das Antigen ein.
Das Binden der reaktiven Gruppe an den festen Träger wird durch ein bekanntes Verfahren der Herstellung eines festen Trägers für einen Immunoassay erreicht.
Zum Binden des Komplexes an den festen Träger werden Bedingungen verwendet, die normalerweise zu dem vorgenannten Immunoassay mittels eines festen Trägers verwendet werden.
Das Verfahren, bei dem aktive Komponenten und ein fester Träger gleichzeitig der Test lösung unter Bilden eines Komplexes auf dem Träger hinzugefügt werden, nämlich das Verfahren (b), ist erwünscht, weil es eine Verfahrensvereinfachung gestattet.

Beschreibung von Verfahren (B)

Der mit dem in (A) erhaltenen Komplex gebundene feste Träger wird dem Verfahren (B) üblicherweise nach dem Waschen unterzogen.
Zum Waschen des mit dem Komplex gebundenen festen Trägers werden Bedingungen verwendet, die normalerweise für Immunoassays unter Verwenden eines festen Trägers verwendet werden.
Es ist bevorzugt, daß der Komplex dissoziiert wird, ohne in zu zersetzen. Wenn die Komplex-Träger-Bindung auf einer Antigen- Antikörper-Reaktion beruht, ist es möglich, den Komplex mittels Säure, Alkali, einer hohen Konzentration an anorganischem Salz usw. durch Einstellen der Bindungskonstanten für die Antigen- Antikörper-Reaktion unter die Bindungskonstante für die Komplexbildung zu dissoziieren.
Das bevorzugte Verfahren des Abdissoziierens des Komplexes von dem festen Träger ohne den Komplex zu zersetzen, ist eine Substanz mit der zu der an der Komplex-Träger-Bindung beteiligten funktionellen Gruppe identischen reaktiven Stelle zuzusetzen.
Wenn die funktionelle Gruppe zum Beispiel Dinitrophenyl ist, wird eine Dinitrophenylaminosäure (z.B. Dinitrophenyllysin) verwendet; wenn die funktionelle Gruppe Biotin ist, wird Biotin verwendet und wenn die funktionelle Gruppe ein über eine -S-S- Bindung gebundenes Antigen, Antikörper, Hapten oder Biotin ist, wird ein zum Aufbrechen der -S-S-Bindung befähigtes Reagens verwendet.

Beschreibung des Verfahrens (C)

Als fester Träger werden die in der Beschreibung des Verfahrens (A) erwähnten Substanzen verwendet.
Als an den festen Träger gebundene reaktive Gruppe kann jede reaktive Gruppe verwendet werden, die an den Komplex gebunden werden kann, solange sie zum Binden an den zu prüfenden Antikörper oder Antigen, die aktive Komponente, die funktionelle Gruppe, den Marker oder die aus der Komplexbindung sich ergebende immunoaktive Stelle befähigt ist.
Bevorzugte reaktive Gruppen schließen sowohl reaktive Gruppen ein, die zum Binden an das zu prüfende Antigen oder Antikörper, die aktive Komponente, den Marker oder die aus der Komplexbindung sich ergebende immunoaktive Stelle befähigt sind, als auch die in Beschreibung des Verfahrens (A) erwähnten reaktiven Gruppen ein.
Reaktive Gruppen, die an das zu prüfende Antigen oder Antikörper oder die aktive Komponente durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion gebunden werden können, sind besonders bevorzugt, weil sie das Weglassen eines Verfahrens zur Einführung einer funktionellen Gruppe gestatten.
Was die Wahl der reaktiven Gruppe betrifft, ist es notwendig, den Komplex aus der Lösung, in welcher der Komplex von dem festen Träger in Verfahren (B) abdissoziiert worden ist, abzutrennen, wenn die verwendete reaktive Gruppe dieselbe wie in Verfahren (A) verwendete ist. Zum Weglassen dieses Trennverfahrens ist es bevorzugt, daß eine von der in Verfahren (A) verwendeten verschiedene reaktive Gruppe verwendet wird. In einem solchen Fall ist es möglich, das Dissoziationsverfahren (B) und das Verfahren (C) zum Binden an den Träger gleichzeitig auszuführen.
Zum Binden des Komplexes an den festen Träger werden Bedingungen verwendet, die normalerweise für den vorgenannten Immunoassay mittels eines festen Trägers wie im Fall von Verfahren (A) verwendet werden.
Was die vorgenannten Verfahren (B) und (C) betrifft können sie wie notwendig wiederholt werden.
Der mit dem Komplex gebundene feste Träger wird dem nächsten Verfahren (D) üblicherweise nach dem Waschen unterzogen.
Zum Waschen des festen Trägers werden Bedingungen verwendet, die normalerweise für einen Immunoassay mittels eines festen Trägers verwendet werden.

Beschreibung des Verfahrens (D)

Zum Messen des Komplexes auf dem festen Träger wird ein bekanntes Verfahren eingesetzt. Zum Beispiel kann der zu prüfende Antikörper oder antigene Substanz, die aktive Komponente, funktionelle Gruppe, Marker und die sich aus der Komplexbildung ergebende immunoaktive Stelle verwendet werden.
Beispiele verwendbarer Verfahren schließen das Verfahren ein, bei dem ein Antikörper, der mit einem Enzym, radioaktiven Substanz, fluoreszierenden Substanz usw. gegen den zu prüfenden Antikörper oder antigene Substanz, die aktive Komponente oder funktionelle Gruppe in dem Komplex markiert ist, zugesetzt wird, anschließend der Marker nach dem Waschen gemessen wird, und das Verfahren, bei dem der Marker, der in die in der Beschreibung des Verfahrens (A) erwähnten aktive Komponente eingeführt ist, gemessen wird.
Das letztere Verfahren ist bevorzugt, weil sein Ablauf einfach ist. Insbesondere wird das letztere Verfahren eingesetzt, wenn der Gegenstand des Assays ein Antigen ist.
Wie vorstehend beschrieben, erlaubt die vorliegende Erfindung verglichen mit den herkömmlichen Verfahren einen höherempfindlichen Assay auf Antikörper order antigene Substanzen, die durch ein herkömmliches Immunoassayverfahren prüfbar sind.
Repräsentative Verfahren des Antikörperassays sind wie folgt:
1. Ein Antigen als aktive Komponente, das zuvor an zwei Arten funktioneller Gruppen gebunden wurde, wird durch eine der beiden funktionellen Gruppen in Verfahren (A) an einen festen Träger gebunden, wodurch der Grad des nicht-spezifischen Bindens von nicht-spezifischem Immunglobulin an den festen Träger verglichen mit den herkömmlichen Verfahren erniedrigt wird, und der antikörper in dem Komplex auf dem festen Träger wird mittels eines markierten Anti-Antikörpers in Verfahren (D) geprüft. Wenn der Anti-Antikörper zur Immunoglobulinklassenerkennung befähigt ist, ist ein Assay mit Unterscheidung der Antikörper-Immunoglobulinklasse möglich.
2. Ein Antigen als aktive Komponente, das zuvor an eine funktionelle Gruppe und einen Marker gebunden wurde, wird durch die funktionelle Gruppe in Verfahren (A) an einen festen Träger gebunden, ein Anti-Antikörper-gebundener fester Träger wird in Verfahren (C) verwendet, wodurch der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten Antigens an den festen Träger erniedrigt wird, und der Marker in dem Komplex auf dem festen Träger wird in Verfahren (D) geprüft. Wenn der Anti-Antikörper zur Immunoglobulinklassenerkennung befähigt ist, ist ein Assay mit Unterscheidung der Antikörper-Immunoglobulinklasse möglich.
3. Wenn einige der Antikörper in Form eines Antigen-Antikörper-Komplexes in der Testlösung vorliegen, werden sowohl ein Antigen als auch ein Antikörper als aktive Komponenten verwendet. Ein Antigen wird zum Freisetzen des Antikörpers unter Bilden eines Antigen-Antikörper-Komplexes zugesetzt, anschließend wird ein markierter Antikörper, an den eine funktionelle Gruppe gebunden ist, unter Bilden eines Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplexes zugesetzt, der sich daraus ergebende Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplexes wird durch die funktionelle Gruppe in Verfahren (A) an einen festen Träger gebunden, ein mit einem Antikörper gegen den zu prüfenden Antikörper gebundener fester Träger wird in Verfahren (C) verwendet, wodurch der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten Antikörpers an den festen Träger verringert wird und der Marker in dem Komplex auf dem festen Träger wird in Verfahren (D) geprüft. Wenn der Anti- Antikörper zur Immunglobulinklassenerkennung befähigt ist, ist ein Assay mit Unterscheidung der Antikörper-Immunglobulinklasse möglich.
Wenn es außerdem erwünscht ist, den Antigen-Antikörper-Komplex in der Testlösung allein zu prüfen, wird der Zweck erreicht, indem dem vorstehenden Verfahren ohne Zusatz eines Antigens gefolgt wird.
4. Ein Antigen als aktive Komponente, das im voraus an eine funktionelle Gruppe gebunden ist, wird durch die funktionelle Gruppe in Verfahren (A) an einen festen Träger gebunden, ein an einen Anti-Antikörper gebundener fester Träger wird in Verfahren (C) verwendet, wodurch der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten Antigens an den festen Träger verringert wird und der Antikörper in dem Komplex auf dem festen Träger mittels eines markierten Anti-Antikörpers in Verfahren (D) geprüft wird. Wenn der Anti-Antikörper zur Immunglobulinklassenerkennung befähigt ist, ist ein Assay mit Unterscheidung der Antikörper- Immunglobulinklasse möglich.
Repräsentative Verfahren eines Antigenassays sind wie folgt
1. Für einen Assay auf Grundlage der Sandwichtechnik werden verschiedene, von zwei Tierarten stammende Antikörper als aktive Komponenten verwendet. Einer der beiden Antikörper ist im voraus an eine funktionelle Gruppe gebunden und der andere ist im voraus an einen Marker gebunden. Diese Antikörper werden aneinander unter Bilden eines Komplexes gebunden, der auf diese Weise erhaltene Komplex wird durch die funktionelle Gruppe in Verfahren (A) an einen festen Träger gebunden, ein an einen Anti- Antikörper gegen den an eine funktionelle Gruppe gebundenen Antikörper gebundener fester Träger wird in Verfahren (C) verwendet, wodurch der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten Antikörpers an den festen Träger verringert wird und der Marker in dem Komplex auf dem festen Träger wird in Verfahren (D) geprüft.
2. Wenn zwei von denselben Tierarten stammende Arten Antikörper als aktive Komponenten verwendet werden, wird einer der Antikörper im voraus an zwei Arten funktioneller Gruppen gebunden und der andere wird im voraus an einen Marker gebunden. Diese Antikörper werden unter Bilden eines Komplexes zusammengebunden, der Komplex wird durch eine der funktionellen Gruppen in Verfahren (A) an einen festen Träger gebunden, ein fester Träger, der zum Binden an die andere funktionelle Gruppe befähigt ist, wird in Verfahren (C) verwendet, wodurch der Grad des nicht-spezifischen Bindens des markierten Antikörpers an den festen Träger verringert wird, und der Marker in dem Komplex auf dem festen Träger wird in Verfahren (D) geprüft.
3. Für einen Assay auf Grundlage einer kompetitiven Proteinbindungsanalyse werden sowohl ein Antigen als auch ein Antikörper als aktive Komponenten verwendet. Ein im voraus an einen Marker gebundenes Antigen und ein im voraus an eine funktionelle Gruppe gebundener Antikörper werden unter Bilden eines Komplexes zusammen gebunden, wonach der Komplex durch die funktionelle Gruppe in Verfahren (A) an einen festen Träger gebunden wird, ein fester Träger, der an einen Anti-Antikörper gegen den Antikörper gebunden ist, wird in Verfahren (C) verwendet, wodurch der Grad der nicht-spezifischen Bindung des markierten Antigens an den festen Träger verringert wird und der Marker im Komplex auf dem festen Träger wird in Verfahren (D) geprüft.
Wie vorstehend beschrieben, gestattet das Verfahren der vorliegenden Erfindung den Assay auf alle Antikörper gegen jedes Hapten oder Antigen mit ultrahoher Empfindlichkeit und mit Unterscheidung der Immunglobulinklasse; deshalb ist das vorliegende Verfahren für die Diagnose verschiedener Erkrankungen durch einen Assay auf Antikörper bei Infektionskrankheiten, wie etwa Hepatitis B, ATL und AIDS, Auto-Antikörper bei Autoimmunkrankheiten, allergische Erkrankungen verursachende Antikörper und andere Antikörper, förderlich.
Weiterhin gestattet das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Assay auf Antigene mit ultrahoher Empfindlichkeit; deshalb ist das vorliegende Verfahren auch der Diagnose verschiedener Hormonausscheidungsstörungen, wie etwa Schilddrüsenerkrankungen und Hypopituitarismus, verschiedene Infektionskrankheiten und so weiter, förderlich.
Die vorliegende Erfindung wird nun im einzelnen mittels der folgenden Beispiele beschrieben, die Erfindung wird aber durch diese Beispiele niemals begrenzt.

Beispiel 1

A. Herstellung eines nicht-spezifischen Dinitrophenyl-Biotinyl- Kaninchen-IgG-Insulin-Konlugats

(1) Herstellung von nicht-spezifischem Maleimid-Kaninchen-IgG

Maleimidgruppen wurden in nicht-spezifisches Kaninchen-IgG mittels N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat gemäß einem bekannten Verfahren [Hashida et al., Journal of Applied Biochemistry, 6, 56 (1984)] eingeführt. Die durchschnittliche Zahl der je nicht- spezifischem Kaninchen-IgG-Molekül eingeführten Maleimidgruppen betrug 16.

(2) Herstellung von N-Biotinyl-2-mercaptoethylamin

Eine aliquote Menge (0,1 ml) 44 mM Biotin-N-hydroxysuccinimid (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, Kalifornien) in N,N- Dimethylformamid wurde mit 1,0 ml 4,4 mM 2-Mercaptoethylamin in 5 mM EDTA enthaltendem 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert und 0,1 ml 1M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, wurden zugesetzt.

(3) Herstellung von nicht-spezifischem Biotinyl-Kaninchen-IgG

Eine aliquote Menge in (2) hergestellte (0,22 ml) N-Biotinyl-2- mercaptoethylaminlösung wurde mit 10 mg in (1) hergestelltem nicht-spezifischem Maleimid-Kaninchen-IgG in 2,0 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden dem Reaktionsgemisch 0,05 ml 0,1M 2-Mercaptoethylaminlösung zugesetzt und das Gemisch wurde der Gelfiltration an einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia) unterzogen.
Die durchschnittliche Zahl je IgG-Molekül eingeführter Biotinreste betrug 9,7, wie aus der Abnahme der Zahl der Maleimidgruppen berechnet wurde.

(4) Herstellung von nicht-spezifischem Mercaptosuccinyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG

Thiolgruppen wurden mittels S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (Nakarai Chemicals, Kyoto, Japan) gemäß einem bekannten Verfahren [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay, 4, 209 (1983)] in in (3) hergestelltes nicht-spezifisches Biotinyl-Kaninchen- IgG eingeführt. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Biotinyl-Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Thiolgruppen betrug 17.

(5) Herstellung von Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin

Eine aliquote Menge (1,0 ml) 5,5 mM Dinitrophenyl-L-lysin-hydrochlorid (Tokyo Kasei, Tokio, Japan) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, wurde 30 Minuten mit 0,1 ml einer Lösung von 5,5 mM N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat in N,N-Dimethylformamid bei 30ºC inkubiert.

(6) Herstellung von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl- Kaninchen-IgG

Eine aliquote Menge (0,59 ml) in (5) hergestelltes Maleimiddinitrophenyl-L-lysin wurde mit 4,4 mg in (4) hergestelltem nicht-spezifischemmercaptosuccinyliertem Biotinyl-Kaninchen-IgG in 3,1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert und das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration mittels Sephadex G-25 unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 7,3.

(7) Herstellung von Maleimid-Insulin

Maleimid-Insulin wurde auf dieselbe Weise wie in (1) hergestellt.

(8) Herstellung von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl- Kaninchen-IgG-Insulin-Konjugat

In (7) hergestelltes Maleimid-Insulin (1,2 mg) wurde in 0,3 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, mit in (6) hergestelltem nicht-spezifischem, mercaptosuccinyliertem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kahinchen-IgG (0,73 mg) in 0,2 ml 0,1 H Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 20 Stunden bei 4ºC inkubiert und das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration auf einer Ultragel AcA 34-Säule (LKB, Schweden) unterzogen.

B. Assay von Anti-Insulin-Antikörper durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung

Eine mit Kaninchen- (Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin) IgG überzogene Polystyrolkugel (3,2 mm Durchmesser, Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois) wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren [Ishikawa et al., Scandinavian Journal of Immunology, 8 (Erg. 7), 43 (1978)] hergestellt und mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 2 mg/ml nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, 1 g/l Rinderserumalbumin, 0,1 M NaCl und 1 g/l NaN&sub3; enthielt (Puffer A), 3 Stunden bei 20ºC behandelt. Diese Polystyrolkugel wurde mit 0,01 ml Humanserum (Probe), 0,09 ml vorgenanntem Puffer A, der 30 fMol nicht-spezifisches Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG-Insulin-Konjugat und 0,3 mg nicht- spezifisches Kaninchen-IgG enthielt, und 0,05 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 1 M NaCl und 1 g/l Rinderserumalbumin enthielt, 4 Stunden bei 20ºC inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde anschließend zwei Mal mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt (Puffer B), gewaschen und mit 0,15 ml Puffer A, der 1 mM Dinitrophenyl-L-lysin und 0,3 mg nicht- spezifisches Kaninchen-IgG enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Polystyrolkugel wurde das Eluat mit einer mit Avidin überzogenen Polystyrolkugel, die auf dieselbe Weise wie vorstehend behandelt war, 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde anschließend zwei Mal mit Puffer B gewaschen. An diese feste Phase gebundenes Anti-Insulin-IgG wurde mittels Meerrettichperoxidase-markiertem Anti- Human-IgG-Fab' geprüft. Das heißt, die Polystyrolkugel wurde mit 50 ng markiertem Fab' in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 1 g/l Rinderserumalbumin enthielt, 30 Minuten bei 20ºC inkubiert, wonach er zwei Mal mit Puffer B gewaschen wurde, worauf die Aktivität der an die feste Phase gebundenen Peroxidase durch das herkömmliche Verfahren [Imagawa et al., Analytical Letters, 16, 1509 (1983)] geprüft wurde. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 dargestellt.

C. Assay auf Anti-Insulin-Antikörper durch das herkömmliche Verfahren

Ein bereits mitgeteiltes Verfahren [Kohno et al., Journal of Biochemistry, 98, 379 (1985)] wurde für den Assay verwendet. Das heißt, eine mit Insulin-Rinderserumalbumin überzogene Polystyrolkugel (3,2 mm Durchmesser; Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois) wurde mit einer Serumprobe 3 Stunden bei 37ºC inkubiert und gewaschen, wonach sie für den Assay mit Meerrettichperoxidase-markiertem (Anti-Human-IgG)-Fab' geprüft wurde. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 dargestellt, d.h. Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse des Assays durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung und durch das herkömmliche Verfahren von Serumproben in Verdünnung mit normalem Humanserum darstellen, welche aus Patienten gesammelt wurden, die eine Insulinbehandlung erhalten hatten, ausgedrückt durch die Beziehung zwischen der Verdünnungsrate für das Serum von Insulin-behandelten Patienten mit normalem Humanserum (Abszisse) und die Fluoreszenzintensität für die Aktivität der an die feste Phase gebundenen Peroxidase (Ordinate).
Wie in Fig. 1 dargestellt, gestattet das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Anti-Insulin-Antikörperassay mit einer etwa 1000fach höheren Empfindlichkeit, verglichen mit dem herkömmlichen, auf der vorgenannten Technik 1 beruhenden Verfahren.

Beispiel 2

Herstellung von IgG, F(ab')&sub2; und Fab'

IgG, F(ab')&sub2; und Fab' wurden durch Fraktionierung mit Natriumsulfat, gefolgt vom Durchgang durch eine DEAE-Cellulosesäule, durch Verdauung von IgG mit Pepsin beziehungsweise durch Reduktion von F(ab')&sub2; durch ein bekanntes Verfahren [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)] hergestellt.

Assay der Peroxidaseaktivität

Die Peroxidaseaktivität wurde fluorometrisch durch ein bekanntes Verfahren mittels 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure als Substrat [Imagawa et al., Analytical Letters (vorstehend angeführt)] geprüft. Die Fluoreszenzaktivität wurde bezogen auf 1 mg/l Chinin in 50 mM Schwefelsäure gemessen.

Herstellung von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG-Insulin-konjugat

1. Herstellung von nicht-spezifischem Maleimid-Kaninchen-IgG

Nicht-spezifisches Kaninchen IgG (12 mg) in 2,0 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, wurde mit 0,2 ml 27,5 mM N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (vorstehend beschrieben) in N,N-Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration an einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia) (1,0 x 30 cm) unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Maleimidgruppen betrug 16.

2. Herstellung von N-Biotinyl-2-mercaptoethylamin

Eine aliquote Menge (0,1 ml) 44 mM Biotin-N-hydroxysuccinimid (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, Kalifornien) in N,N- Dimethylformamid wurde mit 1,0 ml 4,4 mM 2-Mercaptoethylamin in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,1 ml 1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, zugesetzt.

3. Herstellung von nicht-spezifischem Biotinyl-Kaninchen IgG

Eine aliquote Menge (0,22 ml) der in 2 hergestellten N-Biotinyl- 2-mercaptoethylaminlösung wurde mit in 1 hergestelltem, nicht- spezifischem Maleimid-Kaninchen-IgG in 2,0 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,05 ml 0,1 M 2- Mercaptoethylamin in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, dem Reaktionsgemisch zugesetzt und das Gemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 (Pharinacia) unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht- spezifischem Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Biotinreste betrug 9,7, wie aus der Abnahme der Zahl der Maleimidgruppen berechnet wurde.

4. Herstellung von nicht-spezifischem, mercaptosuccinyliertem Biotinyl-Kaninchen-IgG

Thiolgruppen wurden mittels S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (Nakarai Chemicals, Kyoto, Japan) gemäß einem bekannten Verfahren [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)] in das in 3 hergestellte nicht-spezifische Biotinyl- Kaninchen-IgG eingeführt. Die durchschnittliche Zahl je nicht- spezifischem Biotinyl-Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Thiolgruppen betrug 17.

5. Herstellung von Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin

Eine aliquote Menge (1,0 ml) 5,5 mM Dinitrophenyl-L-lysin-hydrochlorid (Tokio Kasei, Tokio, Japan) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, wurde mit 0,1 ml 5,5 mM N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat in N,N-Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC inkubiert.

6. Herstellung von nicht-spezifischem, mercaptosuccinyliertem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG

Eine aliquote Menge (0,59 ml) in 5 hergestellter Maleimid-dinitrophenyl-L-lysinlösung wurde mit 4,4 mg in 4 hergestelltem nicht-spezifischem, mercaptosuccinyliertem Biotinyl-Kaninchen- IgG in 3,1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 (Pharmacia) unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem, mercaptosuccinyliertem Biotinyl-Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 7,3, wie aus der Absorption bei 360 nm unter der Annahme des molaren Extinktionskoeffizienten zu 17400 Mol&supmin;¹ 1 cm&supmin;¹ berechnet wurde.

7. Herstellung von Maleimid-Insulin

Schweineinsulin (40 IE in 1,0 ml, Actrapid MC, Novo) wurde mit 0,1 ml 4,4 mM N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat in N,N-Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC inkubiert und der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 (Pharmacia) unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Schweineinsulin-Molekül eingeführter Maleimidgruppen betrug 0,23. Die Insulininenge wurde aus der Absorption bei 280 nm unter der Annahme des molaren Extinktionskoeffizienten zu 0,9 g-1 1 cm&supmin;¹ und des Molekulargewichts zu 5778 berechnet.

8. Herstellung von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl- Kaninchen-IgG-Insulin-Konjugat

In 7 hergestelltes Maleimid-Insulin (1,2 mg) in 0,3 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde bei 4ºC 20 Stunden mit in 6 hergestelltem (7 Thiolgruppen je Molekül), nicht-spezifischem, mercaptosuccinyliertem Dinitrophenylbiotinyl-Kaninchen-IgG (0,73 mg) in 0,2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 45 cm) aus Ultrogel AcA34 (LKB, Stockholm, Schweden) mittels 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG-Molekül konjugierter Insulinmoleküle betrug 5,8. Die Menge nicht-spezifischer Dinitrophenyl- Biotinyl-Kaninchen-IgG-Moleküle wurde aus der Absorption bei 360 nm und die Zahl der eingeführten Insulinmoleküle wurde aus der Absorption bei 280 nm berechnet.

Herstellung von mit Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG oder Avidin überzogener fester Phase

Polystyrolkugeln (3,2 mm Durchmesser; Precision Plastic Ball Co., Chicago) wurden durch physikalische Adsorption mit Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG-Lösung (0,1 g/l) oder Avidinlösung (0,1 g/l) durch ein bekanntes Verfahren [Ishikawa et al., Scandinavian Journal of Immunology (vorstehend angeführt)] überzogen.

Vorbehandlung von überzogener fester Phase

Die überzogene feste Phase wurde durch ein bekanntes Verfahren [Kohno et al., Journal of Biochemistry (vorstehend angeführt)] vor Gebrauch mit nicht-spezifischem Kaninchen-IgG vorbehandelt.

Herstellung von Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette-Fab'-Peroxidase

Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-Fab' wurde durch ein bekanntes Verfahren [Hashida et al., Journal of Applied Biochemistry (vorstehend angeführt)] mittels N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat als Vernetzungsmittel mit Meerettichoxidase konjugiert.

Herstellung von Dextran-Aktivkohle

Dextran-Aktivkohle wurde durch das Verfahren von Dickson [Dickson, Clinical Chemistry, 20, 1275 (1974)] mit den folgenden Ersetzungen hergestellt. Humanserumalbumin und Norit NK wurden durch Rinderserumalbumin beziehungsweise Norit A (Nakarai Chemicals, Kyoto, Japan) ersetzt. Die Dextran-Aktivkohlesuspension enthielt 60 mg Dextran-Aktivkohle im Trockengewicht je ml.

Dextran-Aktivkohle-Behandlung von Serumproben

Eine aliquote Menge von 0,075 ml Serumproben, die durch Verdünnen von Diabetikerserum hergestellt wurden, welche eine Insulinbehandlung mit normalem Humanserum bei verschiedenen Verdünnungsraten erhalten hatten, wurde durch Zusatz von 0,015 ml 0,2 M HCl auf pH 6,0 eingestellt. Diesem Gemisch wurden 0,0375 ml der Dextran-Aktivkohle-Suspension zugesetzt und dies wurde von 5 Minuten Rühren gefolgt. Anschließend wurden 0,015 ml 50 mM NaOH zum Neutralisieren des Gemischs zugesetzt. Das neutralisierte Gemisch wurde 15 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde unter Anwenden derselben Bedingungen wie vorstehend zentrifugiert.

Assay des Anti-Insulin-Antikörpers

Eine aliquote Menge (0,095 ml) der Dextran-Aktivkohle-behandelten Serumprobe wurde mit 0,015 ml 0,03 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,3% NaN&sub3;, 3,1 M NaCl und 0,3% Rinderserumalbumin enthielt, und 0,02 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 1,5% nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, 0,1% NaN&sub3;, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, gemischt und mit 30 fMol nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl-Xaninchen-IgG-Insulin- Konjugat in 0,02 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 0,1% NaN&sub3;, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 8 Stunden bei 37ºC und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde weiter mit einer mit Kaninchen-(Anti- Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogenen Polystyrolkugel 4 Stunden bei 20ºC inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 150 nMol Dinitrophenyl-L-lysin in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3;, 0,1 M NaCl, 0,2% nicht-spezifisches Kaninchen-IgG und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Polystyrolkugel wurde das Eluat 3 Stunden bei 20ºC mit einer mit Avidin überzogenen Polystyrolkugel inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde anschließend zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, wie vorstehend beschrieben gewaschen und mit 50 ng Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase-Konjugat in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach Waschen der Polystyrolkugel wie vorstehend beschrieben wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 2 dargestellt, war ein Assay bis zu 10³-facher Verdünnung möglich.

Vergleichsbeispiel 2

Der Assay der Peroxidaseaktivität, die Herstellung von Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase und die Dextran- Aktivkohlebehandlung von Serumproben wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 2 ausgeführt.

Herstellung von mit Insulin-Rinderserumalbumin überzogener fester Phase

Die überzogene feste Phase wurde durch Überziehen einer Polystyrolkugel mit Rinderserumalbumin (1,0 g/l) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2, Aktivieren der Polystyrolkugel durch ein bekanntes Verfahren mittels Glutaraldehyd [Kohno et al., Journal of Biochemistry (vorstehend angeführt)] und nachfolgendes Umsetzen mit Insulin hergestellt.

Assay des Anti-Insulin-Antikörpers

Die mit Dextran-Aktivkohle in Beispiel 2 behandelte Probe wurde 5,3 x 10&sup4;-fach mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3; und 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, verdünnt. Die verdünnte Serumprobe (0,15 ml) wurde 3 Stunden bei 37ºC mit der mit Insulin-Rinderserumalbumin überzogenen Polystyrolkugel inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde anschließend zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 50 ng Kaninchen-(Anti-Human- IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase-Konjugat in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach Waschen der Polystyrolkugel auf dieselbe Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 2 dargestellt, war ein Assay bis zu 1-facher Verdünnung möglich.
Das Verfahren von Beispiel 2 gemäß der vorliegenden Erfindung gestattet den Assay von Serum-Anti-Insulin-Antikörper mit höherer Empfindlichkeit verglichen mit dem herkömmlichen Verfahren des Vergleichsbeispiels 2.

Beispiel 3

Der Test der Peroxidaseaktivität, die Herstellung von mit IgG- überzogener fester Phase, die Vorbehandlung überzogener fester Phase und die Herstellung von Dextran-Aktivkohle wurde gemäß den Verfahren des Beispiels 2 ausgeführt.

Herstellung von Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin-Insulin-Peroxidase-Konjugat

1. Herstellung von mercaptosuccinyliertem Rinderserumalbumin Thiolgruppen wurden durch ein bekanntes Verfahren mittels S-Acetylmercaptosuccinanhydrid [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)] in Rinderserumalbumin (Fraktion V, Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, Illinois) eingeführt. Die durchschnittliche Zahl je Rinderserumalbuminmolekül eingeführter Thiolgruppen betrug 8,2.

2. Herstellung von Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin

Eine aliquote Menge (1,5 ml) 5,5 mM Dinitrophenyl-L-lysin-hydrochlorid in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 0,15 ml 5,5 mM N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat in N,N-Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC inkubiert.

3. Herstellung von Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin

Das mercaptosuccinylierte Rinderserumalbumin (5 mg) in 1,0 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 1,5 ml Maleimid-dinitrophenyl-L-lysinlösung 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 45 cm) aus Sephadex G-25 mittels 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Rinderserumalbuminmolekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 5,5.
4. Herstellung von mercaptosuccinyliertem Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin
Thiolgruppen wurden durch ein bekanntes Verfahren mittels S- Acetylmercaptosuccinanhydrid [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)] in Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin eingeführt. Die durchschnittliche Anzahl je Dinitrophenyl- Rinderserumalbumin-Molekül eingeführter Thiolgruppen betrug 7,0.

5. Herstellung von Maleimid-Insulin und Maleimid-Peroxidase

Maleimidgruppen wurden durch ein bekanntes Verfahren mittels N- Succinimidyl-6-maleimidohexanoat [Hashida et al., Journal of Applied Biochemistry (vorstehend angeführt)] in Schweineinsulin (Actrapid MC., Novo Industri A/S, Kopenhagen, Dänemark) und Meerrettichperoxidase (Qualität I, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Westdeutschland) eingeführt. Die durchschnittliche Zahl je Insulinmolekül und Peroxidasemolekül eingeführter Maleimidgruppen betrug 0,9 beziehungsweise 1,1.

6. Herstellung von Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin-Insulin- Peroxidase-Konjugat

Das mercaptosuccinylierte Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin (1,9 mg) in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 1,7 mg Maleimid-Insulin in 0,3 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, und 1,7 mg Maleimid-Peroxidase in 0,2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 2 Stunden bei 30ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 45 cm) Ultrogel AcA 44 mittels 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Rinderserumalbuminmolekül konjugierter Insulin-Moleküle und Peroxidase-Moleküle betrug 3,8 beziehungsweise 2,0.

Herstellung von Protein-Sepharose 4B

Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin (10 mg) und Human-IgG (10 mg) wurden jeweils mit CNBr-aktivierter Sepharose 4B (1 g) gemäß den Vorschriften von Pharmacia gekuppelt.

Affinitätsreinigung von IgG

Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG (Miles Co., Elkhart, Indiana) und Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)- IgG (Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan) wurden durch Elution bei pH 2,5 an Säulen aus Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin-gekuppelter Sepharose 4B beziehungsweise Human-IgG- gekuppelter Sepharose 4B durch ein bekanntes Verfahren [Kohno et al., Journal of Biochemistry (vorstehend angeführt)] affinitätsgereinigt.

Dextran-Aktivkohle-Behandlung von Serumproben

Eine durch Verdünnen von Serum von Diabetikern, die eine Insulinbehandlung mit normalem Humanserum bei verschiedenen Verdünnungsraten erhalten hatten, hergestellte aliquote Menge (1,0 ml) Serumprobe wurde durch Zusatz von 0,2 ml 0,2 M HCl auf pH 6,0 eingestellt. Nach Zusatz von 0,5 ml Dextran-Aktivkohle- Suspension, gefolgt von 5 Minuten Rühren, wurden 0,2 ml 50 mM NaOH zum Neutralisieren des Gemischs zugesetzt. Das neutralisierte Gemisch wurde 15 Minuten bei 1500 g zentrifugiert und der sich daraus ergebende Überstand wurde unter Anwenden derselben Bedingungen wie vorstehend zentrifugiert.

Assay des Anti-Insulin-Antikörpers

Die beiden mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln wurden mit 0,019 ml mit Dextran-Aktivkohle behandeltem Serum, 0,081 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 15 fMol Dinitrophenyl- Rinderserumalbumin-Insulin-Peroxidase-Konjugat, 0,37% nicht- spezifisches Kaninchen-IgG, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und 0,05 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Die Polystyrolkugeln wurden anschließend zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 150 nMol Dinitrophenyl-L-lysin in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach Waschen der mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln in derselben Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an das Polystyrol gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 3 dargestellt, war ein Assay bis zur 10³-fachen Verdünnung möglich.

Vergleichsbeispiel 3

Der Assay der Peroxidaseaktivität und die Herstellung der mit IgG überzogenen festen Phase wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 ausgeführt. Die Affinitätsreinigung von Kaninchen-(Anti- Human-IgGy-Kette)-IgG und die Dextran-Aktivkohlebehandlung der Serumprobe wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 3 ausgeführt.

Herstellung von Insulin-Peroxidase

1. Herstellung von mercaptosuccinyliertem Insulin

Thiolgruppen wurden mittels S-Acetylmercaptosuccinanhydrid auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 in Insulin eingeführt. Die Zahl der je Insulinmolekül eingeführten Thiolgruppen betrug 0,46.

2. Herstellung von Insulin-Peroxidase

Das mercaptosuccinylierte Insulin (4 mg) in 5,7 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 2,4 mg in Beispiel 3 hergestellter Maleimid-Peroxidase in 0,6 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 20 Stunden bei 4ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (2,0 x 40 cm) aus Ultrogel AcA 44 mittels 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Peroxidase-Molekül konjugierter Insulin-Moleküle betrug 1,6.

Assay von Anti-Insulin-Antikörper

Die in Beispiel 3 mit Dextran-Aktivkohle behandelte Probe wurde mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3;, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 2,6 x 104-fach verdünnt. Eine mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Human-IgG- γ-Kette)-IgG überzogene Polystyrolkugel wurde mit einer aliquoten Menge von 0,15 ml dieses verdünnten Serums 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 50 ng Insulin-Peroxidase-Konjugat in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach Waschen der Polystyrolkugel in derselben Weise wie vorstehend, wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 3 dargestellt, war ein Assay bis zu 3 x 10facher Verdünnung möglich.
Das Verfahren des Beispiels 3 gemäß der vorliegenden Erfindung gestattet den Assay des Serim-Anti-Insulin-Antikörpers mit höherer Empfindlichkeit verglichen mit den herkömmlichen Verfahren der Vergleichsbeispiele 2 und 3.

Beispiel 4

Der Assay der Peroxidaseaktivität, die Herstellung mit IgG überzogener fester Phase, Vorbehandlung der überzogenen festen Phase, Herstellung von IgG, F(ab')&sub2; und Fab' und die Herstellung von Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase wurden gemäß den Verfahren des Beispiels 2 ausgeführt. Die Herstellung von Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin, die Herstellung von Protein-Sepharose 4B und die Affinitätsreinigung von IgG wurden gemäß den Verfahren des Beispiels 3 ausgeführt.

Reinigung von Thyroglobulin

Rohes Thyroglobulin, das aus Schilddrüsen durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat hergestellt worden war [Roitt et al., Lancet, 15, 1027 (1958)], wurde weiter durch Chromatographie an einer Säule aus DEAE-Cellulose gereinigt [Ohtaki et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolite, 52, 239 (1981)].
Das vorstehend gereinigte Thyroglobulin (3,0 mg) in 1,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3; enthielt, ließ man durch eine Säule (0,9 x 5,5 cm) aus Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ- Kette)-IgG-Sepharose 4B unter Verwenden desselben Puffers gehen und unterzog der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 45 cm) aus Ultrogel AcA 22 unter Verwenden desselben Puffers. Die Homogenität des gereinigten Thyroglobulins wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Anwesenheit von Harnstoff bestätigt. Die Thyroglobulinmenge wurde aus der Absorption bei 280 nm durch Annahme des Extinktionskoeffizienten zu 1,0 g-1 1 cm&supmin;¹ berechnet.

Herstellung von Dinitrophenyl-Thyroglobulin

1. Herstellung von mercaptosuccinyliertem Thyroglobulin

Thiolgruppen wurden durch ein bekanntes Verfahren unter Verwenden von S-Acetylmercaptosuccinanhydrid [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)] in gereinigtes Thyroglobulin eingeführt. Die Zahl je Thyroglobulin eingeführter Thiolgruppen betrug 20.

2. Herstellung von Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin

Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 hergestellt.

3. Herstellung von Dinitrophenyl-thyroglobulin

Das mercaptosuccinylierte Thyroglobulin (0,5 mg) in 1,0 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 0,03 ml Maleimid-dinitrophenyl-L-lysinlösung 30 Minuten bei 30ºC und nachfolgend 15 Minuten bei 30ºC mit 5 ul 0,1 M N-Ethylmaleimid in demselben Puffer inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3; enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Thyroglobulinmolekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 16.

Assay des Anti-Thyroalobulin-Antikörpers

Eine aliquote Menge (0,02 ml) einer durch Verdünnen von Anti- Thyroglobulin-Antikörper enthaltendem Humanserum mit normalem Humanserum bei verschiedenen Verdünnungsraten hergestellten Probe wurde mit 0,08 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 50 fMol Dinitrophenyl-thyroglobulin, 0,375% nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, 0,1% NaN&sub3;, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 0,05 ml, 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3;, 1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und einer mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti- Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogenen Polystyrolkugel 20 Stunden bei 20ºC inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde anschließend zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 150 nMol Dinitrophenyl-L-lysin in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,2% nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, 0,1% NaN&sub3;, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach Entfernen der Polystyrolkugel wurde mit einer mit Kaninchen-(Anti-Thyroglobulin)-IgG überzogene Polystyrolkugel 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde anschließend auf dieselbe Weise wie vorstehend gewaschen und mit 50 ng Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase-Konjugat in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 20º inkubiert. Nach Waschen der Polystyrolkugel auf dieselbe Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 4 dargestellt war ein Assay bis zur 10&sup5;-fachen Verdünnung möglich.

Vergleichsbeispiel 4

Der Assay der Peroxidaseaktivität, die Herstellung mit IgG überzogener fester Phase und die Herstellung von Kaninchen- (Anti-Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 2 ausgeführt. Die Reinigung von Thyroglobulin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 durchgeführt.

Herstellung von mit Thyroglobulin überzogener fester Phase

Thyroglobulin (0,1 g/l) wurde durch physikalische Adsorption auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 auf eine Polystyrolkugel aufgetragen.

Assay des Anti-Thyroglobulin-Antikörpers

Eine durch Verdünnen von Humanserum, das Anti-Thyroglobulin- Antikörper enthielt, mit normalem Humanserum bei verschiedenen Verdünnungsraten hergestellte Probe wurde mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN3, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 1 x 10&sup5;-fach verdünnt. Eine aliquote Menge (0,15 ml) dieses verdünnten Serums wurde 3 Stunden bei 37ºC mit einer mit Thyroglobulin überzogenen Polystyrolkugel inkubiert. Die Polystyrolkugel wurde anschließend zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 50 ng Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase-Konjugat in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach Waschen der Polystyrolkugel in derselben Weise wie vorstehend, wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 4 dargestellt, war ein Assay bis zur 10 x 5-fachen Verdünnung möglich.

Beispiel 5

Der Assay der Peroxidaseaktivität, die Herstellung mit IgG überzogener fester Phase, die Herstellung von nicht-spezifischem Biotinyl-Kaninchen-IgG und die Herstellung von Kaninchen-(Anti- Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase wurde gemäß den Verfahren des Beispiels 2 ausgeführt. Die Herstellung von Protein-Sepharose 4B und die Affinitätsreinigung von IgG wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 3 ausgeführt. Die Reinigung von Thyroglobulin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 ausgeführt.

Herstellung von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG-affinitätsgereinigtem Anti-Thyroalobulin-Fab'

1. Herstellung von mercaptosuccinyliertem nicht-spezifischem Kaninchen IgG

Nicht-spezifisches Kaninchen-IgG (4,0 mg) in 1,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde mit 0,15 ml 0,11 M S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (Nakarai Chemicals, Kyoto, Japan) in N,N- Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Gemisch mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0 (0,15 ml), 0,1 M EDTA, pH 7,0 (0,1 ml) und 1 M Hydroxylamin, pH 7,0 (0,25 ml) 15 Minuten bei 30ºC inkubiert. Das Gemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Thiolgruppen betrug 16.

2. Herstellung von Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin

Eine aliquote Menge (1,5 ml) 8,8 mM Dinitrophenyl-L-lysin (Tokio Kasei, Tokio, Japan) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 0,15 ml 8,8 mM N-Succinimidyl-6- maleimidohexanoat (Dojin Kagaku, Kumamoto, Japan) in N,N-Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC inkubiert.

3. Herstellung von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Kaninchen- IgG

Das mercaptosuccinylierte, nicht-spezifische Kaninchen-IgG (3,0 mg) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0 (1,8 ml), der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 1,5 ml Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht- spezifischem Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 11,9. Die Bestimmung der Dinitrophenylgruppen wurde spektrophotometrisch ausgeführt.

4. Herstellung von nicht-spezifischem Maleimid-Dinitrophenyl- Kaninchen-IgG

Das nicht-spezifische Dinitrophenyl-Kaninchen-IgG (2,4 mg) in Lösung in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (3,0 ml), wurde mit 88 mM N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat in N,N-Dimethylformamid (0,3 ml) 30 Minuten bei 30ºC inkubiert und das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Kaninchen-IgG- Molekül eingeführter Maleimidgruppen betrug 18.

5. Herstellung von N-Biotinyl-2-mercaptoethylainin

Eine aliquote Menge (0,2 ml) 44 mM Biotin-N-hydroxysuccinimid (Zymed Laboratories, San Francisco, Kalifornien) in N,N-Dimethylformamid wurde mit 2,0 inl 4,4 mM Mercaptoethylamin in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert.

6. Herstellung von nicht-spezifischem Maleimid-Dinitrophenyl- Biotinyl-Kaninchen-IgG

Das nicht-spezifische Maleimid-Dinitrophenyl-Kaninchen-IgG (2,0 mg) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0 (3,2 ml), der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 0,11 ml N-Biotinyl-2-mercaptoethylamin 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Maleimid-Dinitrophenyl- Kaninchen-IgG eingeführter Biotinyl-Gruppen betrug 14,4, wie aus der Abnahme der Zahl der Maleimidgruppen in dem nicht-spezifischem Maleimid-dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG berechnet wurde.

7. Herstellung von nicht-spezifischem Maleimid-Dinitrophenyl- Biotinyl-Kaninchen-IgG-Anti-Thyroglobulin-Fab'-Konjugat

Das nicht-spezifische Maleimid-Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen- IgG (1,3 mg) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0 (0,1 ml), der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 0,1 ml Kaninchen-Anti-Thyroglobulin-Fab' (0,4 mg) in demselben Puffer 20 Stunden bei 4ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 45 cm) aus Ultrogel AcA 22 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3; enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG-Molekül eingeführter Kaninchen-Anti-Thyroglobulin-Fab'-Fragmente betrug 0,8.

8. Herstellung von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl- Kaninchen-IgG-affinitätsgereinigtem Kaninchen-Anti-Thyroglobulin-Fab'-Konjugat

Nicht-spezifisches Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG-Kaninchen-Anti-Thyroglobulin-Fab' (0,5 mg) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (0,5 ml), der 0,1% NaN&sub3; enthielt, wurde durch eine Säule (3,5 x 2,6 mm) aus mit Thyroglobulin überzogener Sepharose 4B, die mit demselben Puffer äquilibriert war, geführt, wonach sie mit 3,2 mM Salzsäure, pH 2,5, unter Ergeben von nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG-affinitätsgereinigtem Kaninchen-Anti-Thyroglobulin-Fab' (0,06 mg) eluiert wurde.

Herstellung einer mit nicht-spezifischem Avidin-Biotinyl-Kaninchen-IaG überzogenen Polystyrolkugel

Nicht-spezifisches Biotinyl-Kaninchen-IgG (0,1 g/l) wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 an einer Polystyrolkugel physikalisch adsorbiert, wonach die mit nicht-spezifischem Biotinyl- IgG überzogene Polystyrolkugel mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% Avidin und 0,1% NaN&sub3; enthielt, 4 Stunden bei 37ºC inkubiert wurde.

Assay des Anti-Thyroglobulin-Antikörpers

Eine aliquote Menge (0,02 ml) der durch Verdünnen von Humanserum, das Anti-Thyroglobulin-Antikörper enthielt, mit normalem Humanserum bei verschiedenen Verdünnungsraten hergestellten Probe wurde mit 0,06 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 30 fMol Thyroglobulin, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und 0,05 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde weiter mit 100 fMol nicht-spezifischem Dinitrophenyl-Biotinyl-Kaninchen-IgG- affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Thyroglobulin)-Fab'-Konjugat in 0,01 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 4 Stunden bei 37ºC und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Dem Gemisch wurden 0,01 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 3% nicht-spezifisches Kaninchen-IgG enthielt, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin zugesetzt und das Gemisch wurde mit einer mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogenen Polystyrolkugel 4 Stunden bei 24ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Polystyrolkugel zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 150 nMol Dinitrophenyl-L-lysin in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,2% nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Polystyrolkugel wurde das Eluat mit einer mit nicht-spezifischem Avidin-Biotinyl-Kaninchen-IgG überzogenen Polystyrolkugel 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Polystyrolkugel zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit Kaninchen-(Anti- Human-IgG-γ-Kette)-Fab'-Peroxidase (50 ng) in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach Waschen der Polystyrolkugel in derselben Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 5 dargestellt, war ein Assay bis zu 10³-facher Verdünnung möglich.

Beispiel 6

Der Assay der Peroxidaseaktivität, die Herstellung mit IgG überzogener fester Phase und die Vorbehandlung von mit IgG überzogener fester Phase wurde gemäß den Verfahren von Beispiel 2 ausgeführt. Die Herstellung von Protein-Sepharose 4B und Affinitätsreinigung von IgG wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 3 ausgeführt. Die Reinigung von Thyroglobulin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 ausgeführt.

Herstellung von Dinitrophenyl-Thyroclobulin-Peroxidase-Konjugat

1. Herstellung von mercaptosuccinyliertem Thyroglobulin

Das Thyroglobulin (1,4 mg) in 2,8 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde mit 0,25 ml 55 mM S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (Nakarai Chemicals, Kyoto, Japan) in N,N-Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration an einer Sephadex G-25-Säule (1,0 x 30 cm) unter Verwenden von 0,1 Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 5 mM EDTA enthielt, fraktioniert. Die 1,2 mg S-Acetylmercaptosuccinyl-thyroglobulin enthaltende Fraktion (4,0 ml) wurde mit 0,4 ml 1,0 M Hydroxylamin, pH 7,0, 15 Minuten bei 30ºC inkubiert und der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Thyroglobulin-Molekül eingeführter Thiolgruppen betrug 22.

2. Herstellung von Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin

Dem Verfahren von Beispiel 5 wurde gefolgt.

3. Herstellung von mercaptosuccinyliertem Dinitrophenyl-Thyroglobulin

Eine aliquote Menge (0,5 ml) der Maleimid-dinitrophenyl-L-lysinlösung wurde mit mercaptosuccinyliertem Thyroglobulin (1,05 mg) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0 (0,5 ml), der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Gemisch der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden desselben Puffers unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je mercaptosuccinyliertem Thyroglobulinmolekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 11.

4. Herstellung von Dinitrophenyl-Thyroglobulin-Peroxidase

Das mercaptosuccinylierte Dinitrophenyl-Thyroglobulin (0,6 mg) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0 (0,3 ml), der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit der in Beispiel 3 hergestellten Maleimid- Peroxidase (1,0 mg) in demselben Puffer (0,03 ml) 20 Stunden bei 4ºC inkubiert und das Reaktionsgemisch wurde mit 5 ul 0,1 M N- Ethylmaleimid in demselben Puffer 15 Minuten bei 30 ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 45 cm) aus Ultrogel AcA 22 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Dinitrophenyl-Thyroglobulinmolekül eingeführter Peroxidasemoleküle betrug 1,4.

Assay des Anti-Thyroglobulin-Antikörper

Eine aliquote Menge (0,01 ml) einer durch Verdünnen von Anti- Thyroglobulin-Antikörper enthaltendem Humanserum mit normalem Humanserum bei verschiedenen Verdünnungsraten hergestellten Probe wurde mit 0,09 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 15 fMol Dinitrophenyl-Thyroglobulin-Peroxidase-Konjugat, 0,333% nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, 0,1% Rinderserumalbumin und 0,1 M NaCl enthielt, 0,05 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 1,0 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl- Rinderserumalbumin)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Polystyrolkugeln zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 150 nMol Dinitrophenyl-L- lysin in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach Waschen der mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Human-IgG- γ-Kette)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln in derselben Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugeln gebundenen Peroxidase 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Wie in Fig. 5 dargestellt, war ein Assay bis zu 5 x 10&sup4;-facher Verdünnung möglich.
Der Assay des Anti-Thyroglobulin-Antikörpers wurde in den Beispielen 4, 5 und 6 gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit höherer Empfindlichkeit verglichen mit Vergleichsbeispiel 4 gemäß dem herkömmlichen Verfahren erreicht.

Beispiel 7

Die Herstellung von IgG und die Herstellungen von mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogener fester Phase und von mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-IgG überzogener fester Phase wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 2 ausgeführt. Der Assay der Peroxidaseaktivität wurde gemäß den Verfahren von Beispiel 2 unter Verwenden von 0,2 mg/l Chinin in 50 mM Schwefelsäure als Standard ausgeführt. Die Affinitätsreinigung von IgG und die Herstellung von Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)- IgG-Sepharose 4B wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 3 ausgeführt. Die Reinigung von Thyroglobulin und die Herstellung von Dinitrophenyl-Thyroglobulin wurden gemäß den Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt.

Herstellung von Thyroglobulin-Peroxidase

1. Herstellung von mercaptosuccinyliertem Thyroglobulin

Thiolgruppen wurde in gereinigtes Thyroglobulin durch ein bekanntes Verfahren unter Verwenden von S-Acetylmercaptosuccinanhydrid [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)] eingeführt. Die durchschnittliche Zahl je Thyroglobulinmolekül eingeführter Thiolgruppen betrug 3,8.

2. Herstellung von Maleimid-Peroxidase

Maleimidgruppen wurden in Meerrettich-Peroxidase durch ein bekanntes Verfahren unter Verwenden von N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat [Hashida et al., Journal of Applied Biochemistry (vorstehend angeführt)] eingeführt. Die durchschnittliche Zahl je Peroxidasemolekül eingeführter Maleimidgruppen betrug 1,3.

3. Herstellung von Thyroglobulin-Peroxidase

Mercaptosuccinyliertes Thyroglobulin (0,31 mg) in 0,07 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, wurde mit 93 ug Maleimid-Peroxidase in 0,005 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 20 Stunden bei 4ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,5 x 45 cm) Ultrogel AcA 22 (LKB, Stockholm, Schweden) mittels 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je Thyroglobulinmolekül eingeführter Peroxidasegruppen betrug 1,7.

Reinigung von Human-Anti-Thyroglobulin-IgG

Die Serumprobe wurde an Patienten mit Basedow-Erkrankung gesammelt und das IgG im Serum der Patienten wurde durch Fraktionierung mit Natriumsulfat gefolgt vom Führen durch eine Säule aus DEAE-Cellulose gereinigt. Auf diese Weise erhaltenes IgG (4 mg) wurde in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% NaN&sub3; enthielt, gelöst.
Die Affinitätsreinigung wurde durch ein bekanntes Verfahren des Eluierens bei pH 2,5 unter Verwenden einer Thyroglobulin-Sepharose 4B-Säule (1 x 3 mm) [Kohno et al., Journal of Biochemistry 100, 1247 (1986)] gemäß den Verfahren des Beispiels 3 unter Ergeben von Human-Anti-Thyroglobulin-IgG (5,1 ug) ausgeführt.

Assay des Anti-Thyroglobulin-Antikörpers

Eine aliquote Menge (0,02 ml) einer durch Verdünnen von Human- Anti-Thyroglobulin-IgG mit normalem Human-Serum bei verschiedenen Konzentrationswerten hergestellten Probe wurde mit 100 fMol Dinitrophenyl-Thyroglobulin, 100 fMol Thyroglobulin-Peroxidase- Konjugat in 0,13 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,46 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch mit zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 3 Stunden bei 20ºC und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Polystyrolkugeln zwei Mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 150 nMol Dinitrophenyl-L-lysin in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, und zwei mit affinitätsgereinigten Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ-Kette)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 1 Stunde bei 20ºC inkubiert. Nach Entfernen der beiden mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin) IgG überzogenen Polystyrolkugeln wurde das Eluat und die mit affinitätsgereinigten Kaninchen- (Anti-Human-IgG-γ-Kette)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 2 Stunden bei 20ºC weiterinkubiert, anschließend in derselben Weise wie vorstehend gewaschen und die Aktivität der an die Polystyrolkugeln gebundenen Peroxidase wurde 150 Minuten bei 30ºC geprüft. Die Ergebnisse werden in Fig. 6 dargestellt.

Vergleichsbeispiel 5

Human-Anti-Thyroglobulin-IgG wurde in derselben Weise wie in Vergleichsbeispiel 4 unter Verwenden einer durch Verdünnen einer bekannten Menge Human-Anti-Thyroglobulin-IgG mit normalem Human- Serum bei verschiedenen Konzentrationswerten hergestellten Probe geprüft. Die Ergebnisse werden in Fig. 6 dargestellt.

Beispiel 8

Puffer

Der regelmäßig verwandte Puffer war 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1% Rinderserumalbumin und 0,1% NaN&sub3; enthielt (Puffer A).

hTSH-Standardprobe

Eine in dem hTSH-Kit "Daiichi" (Daiichi Radioisotope Labs., Tokio, Japan) enthaltene Zubereitung wurde als hTSH-Standardprobe verwendet.

Herstellung von IgG, F(ab')&sub2; und Fab'

IgG, F(ab')&sub2; und Fab' wurden durch Fraktionierung mit Natriumsulfat, gefolgt vom Durchgang durch eine Säule aus DEAE-Cellulose, durch Verdauung von IgG mit Pepsin beziehungsweise durch Reduktion von F(ab')&sub2; durch ein bekanntes Verfahren hergestellt [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)].

Herstellung von monoklonalem Dinitrophenyl-Maus-(Anti-hTSH-β- Untereinheit-IaG&sub1;

1. Herstellung von mercaptosuccinyliertem, monoklonalem Maus- (Anti-hTSH-β-Untereinheit)-IgG&sub1;

Thiolgruppen wurden in monoklonales Maus-(Anti-hTSH-β-Untereinheit)-IgG&sub1; (Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri) durch ein bekanntes Verfahren unter Verwenden von S-Acetylmercaptosuccinanhydrid [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (vorstehend angeführt)] eingeführt. Die durchschnittliche Zahl je monoklonalem Maus-(anti-hTSH-β-Untereinheit)-IgG&sub1;-Molekül eingeführter Thiolgruppen betrug 10,5.

2. Herstellung von Maleimid-dinitrophenyl-L-lysin

Eine aliquote Menge (0,9 ml) 5,5 mM Dinitrophenyl-L-lysin in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 5 mM EDTA enthielt, und 0,10 ml 5 mM N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (vorstehend angeführt) 30 Minuten bei 30ºC in N,N-Dimethylformamid.

3. Herstellung von monoklonalem Dinitrophenyl-Maus-(Anti-hTSH- β-Untereinheit)-IgG&sub1;

Eine aliquote Menge (0,5 ml) Maleimid-dinitrophenyl-L-lysinlösung wurde mit 0,1 mg mercaptosuccinyliertem, monoklonalem Maus- (anti-hTSH-β-Untereinheit)-IgG1 in 4,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 5 mM EDTA enthielt, 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration an einer Säule (1,0 x 30 cm) aus Sephadex G-25 unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, unterzogen. Die durchschnittliche Zahl je monoklonalem Maus-(anti-hTSH-β-Untereinheit)-IgG&sub1;- Molekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 7,2.

Herstellung von Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin

Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin wurde in derselben Weise wie vorstehend unter Verwenden von Rinderserumalbumin (Fraktion V, Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, Illinois) hergestellt.
Die durchschnittliche Zahl je Rinderserumalbuminmolekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 7,0.

Herstellung von Protein-Sepharose 4B

Gemäß den Vorschriften von Pharmacia wurde hCG (2,5 mg), Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin (10 mg) und nicht-spezifisches Maus-IgG (20 mg) an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (1 g) gebunden.

Affinitätsreinigung von IgG

Aus Kaninchen-(Anti-hCG)-IgG (Dakopatts a/s, Glostrup, Dänemark) Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG (Miles Co., Elkhart, Indiana) und Kaninchen-(Anti-Maus-IgG)-IgG (Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan) hergestelltes Kaninchen-(Anti-hCG)-F(ab')&sub2;, wurden durch Elution bei pH 2,5 an Säulen aus hCG, Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin beziehungsweise mit nicht-spezifischem Maus-IgG gekuppelter Sepharose 4B durch ein bekanntes Verfahren [Kohno et al., Journal of Biochemistry, 100, 1247 (1986)] affinitätsgereinigt.

Assay der β-D-Galactosidaseaktivität

Die β-D-Galactosidaseaktivität wurde durch ein bekanntes Verfahren [Imagawa et al., Annals Clinical Biochemistry, 21, 310 (1984)] unter Verwenden von 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosidase als Substrat nach 16 Stunden Reaktion bei 30ºC fluorometrisch geprüft. Die Fluoreszenzintensität wurde bezüglich 10&supmin;&sup8; M 4-Methylumbelliferon in 0,1 M Glycin-NaOH-Puffer, pH 10,3, gemessen.

Herstellung affinitätsgereinigter Kaninchen-Anti-(hCG-Fab'-β-D- galactosidase

Affinitätsgereinigtes Kaninchen-Anti(hCG)-Fab' wurde mit β-D- Galactosidase durch ein bekanntes Verfahren [Ishikawa et al., Scandinavian Journal of Immunology, 8 (Erg. 7) 43 (1978)] unter Verwenden von N,N'-o-Phenylendimaleimid als Vernetzungsmittel konjugiert. Die durchschnittliche Zahl je β-D-Galactosidasemolekül konjugierter Fab'-Moleküle betrug 2,1.
Fab'-β-D-Galactosidasekonjugate (0,8 mg) in 0,5 ml Puffer A wurden durch eine Säule (0,55 x 1,0 cm) aus nicht-spezifischem Mausserumprotein-Sepharos 4B mittels Puffer A geführt. Die Konjugatmenge wurde aus der Enzymaktivität berechnet.

Herstellung von affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG und mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Maus-IaG)-IgG überzogener fester Phase

Polystyrolkugeln (3,2 mm Durchmesser; Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois) wurden durch physikalische Adsorption mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG-Lösung (0,1 g/l) oder affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Maus-IgG)-IgG-Lösung (0,1 g/l) durch ein bekanntes Verfahren [Ishikawa et al., Scandinavian Journal of Immunology (vorstehend angeführt)] überzogen.

hTSH-Assay

Affinitätsgereinigte Kaninchen-Anti-(hCG)-Fab'-β-D-Galactosidase (200 fMol) in 0,01 ml Puffer A wurde mit 200 fMol 0,1 ug nicht- spezifischem Maus-IgG in 0,01 ml Puffer A 2 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Monoklonales Dinitrophenyl-Maus-(Anti-hTSH-f3-Untereinheit)-IgG&sub1; (150 fMol) in 0,02 ml Puffer A wurde mit 0,1 mg nicht-spezifischem Kaninchen-F(ab')&sub2; in 0,02 ml Puffer A 2 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Diese beiden Inkubationsgemische wurden anschließend zusammengemischt und mit verschiedenen Konzentrationen hTSH-Standardproben in Lösung in 0,09 ml Puffer A über Nacht bei 20ºC inkubiert. Dem Reaktionsgemisch wurden zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogene Polystyrolkugeln zugesetzt und die Inkubation wurde 4 Stunden bei 20ºC fortgesetzt.
Nach Entfernen des Inkubationsgemischs wurden die Polystyrolkugeln zwei Mal mit 2 ml Puffer A gewaschen und mit 0,15 ml Puffer A, der 1 mM Dinitrophenyl-L-lysin und 0,1 mg nicht-spezifisches Kaninchen-F(ab')&sub2; enthielt, und zwei mit affinitätsgereinigtem-Kaninchen-(Anti-Maus-IgG)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 4 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Nach dem Waschen der mit affinitätsgereinigten Kaninchen-(Anti- Maus-IgG)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln in derselben Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugeln gebundenen β-D-Galactosidase 16 Stunden bei 30ºC geprüft. Die Ergebnisse werden in Fig. 7 zusammen mit den Ergebnissen im Vergleichsbeispiel 6 nachstehend dargestellt. Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse des Assays durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung und durch das herkömmliche Verfahren, ausgedrückt durch die Beziehung zwischen der hTSH-Konzentration (nE/Röhrchen, Abszisse) und Fluoreszenzintensität, welche der spezifisch gebundenen β-D-Galactosidase (Ordinate) entspricht, darstellt.

Vergleichsbeispiel 6

Der Puffer und die hTSH-Standardprobe waren die gleichen wie diejenigen in Beispiel 8. Der Assay der β-D-Galactosidaseaktivität, die Herstellung der affinitätsgereinigten Kaninchen-(Anti- hCG)-Fab'-β-D-Galactosidase und die Herstellung der mit monoklonalem Maus-(Anti-hTSH-β-Untereinheit)-IgG&sub1; überzogenen Polystyrolkugeln wurden in derselben Weise wie in Beispiel 8 durchgeführt.

hTSH-Assay

Eine mit monoklonalem Maus-Anti-(hTSH-β-Untereinheit)-IgG&sub1; überzogene Polystyrolkugel wurde mit einer hTSH-Standardprobe in 0,15 ml Puffer A über Nacht bei 200 inkubiert.
Nach Entfernen des Inkubationsgemisches wurde die Polystyrolkugel zwei Mal mit 2 ml Puffer A gewaschen und mit 200 fMol affinitätsgereinigter Kaninchen-(Anti-hCG)-Fab'-β-D-Galactosidase und 0,1 mg nicht-spezifischem Kaninchen-F(ab')&sub2; 4 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Nach Waschen der Polystyrolkugel in derselben Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen β-Galactosidase 1 Stunde bei 30ºC geprüft. Die Ergebnisse werden in Fig. 7 dargestellt.

Beispiel 9

Der Puffer war derselbe wie der in Beispiel 8 verwendete. Die Herstellung von IgG, F(ab')&sub2; und Fab', die Herstellung von Protein-Sepharos 4B, die Affinitätsreinigung von IgG und die Herstellung von mit affinitätsgereinigtem (Anti-Dinitrophenyl- Rinderserumalbumin)-IgG überzogener fester Phase und mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Maus-lgG)-IgG überzogener fester Phase wurde gemäß den Verfahren von Beispiel 8 ausgeführt.

hGH-Standardprobe

Eine in einem hGH-RIA-Kit (Dainabot Co., Ltd., Tokio, Japan) enthaltene Zubereitung wurde als hGH-Standardprobe verwendet.

Herstellung von monoklonalem Dinitrophenyl-Maus-(Anti-hGH)-IgG&sub1;

Dem Verfahren des Beispiels 8 wurde gefolgt. Die Zahl der je monoklonalem Maus-(Anti-hGH)-IgG&sub1;-Molekül eingeführter Dinitrophenylgruppen betrug 5,7.

Herstellung von Kaninchen-(Anti-hGH)-Fab'-β-D-Galactosidase- Konjugat

Dem Verfahren von Beispiel 8 wurde gefolgt. Die durchschnittliche Zahl je β-D-Galactosidasemolekül konjugierter Fab'-Moleküle betrug 4,1.

hGH-Assay

Affinitätsgereinigtes Kaninchen-Anti-(hGH)-Fab'-β-D-Galactosidase-Konjugat (200 fMol) in 0,01 ml Puffer A wurde mit 0,1 ug nicht-spezifischem Maus-IgG in 0,01 ml Puffer A 2 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Monoklonales Dinitrophenyl-Maus-(Anti-hGH)-IgG&sub1; (150 fMol) in 0,02 ml Puffer A wurde mit 0,1 mg nicht-spezifischem Kaninchen- F(ab')&sub2; in 0,02 ml Puffer A 2 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Diese beiden Inkubationsgemische wurden anschließend zusammengemischt und mit verschiedenen Konzentrationen hGH-Standardprobe in 0,09 ml Puffer A über Nacht bei 20ºC inkubiert. Dem Reaktionsgemisch wurden zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen- (Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogene Polystyrolkugeln zugesetzt und die Tnkubation wurde 4 Stunden bei 20ºC fortgesetzt.
Nach Entfernen des Inkubationsgemisches wurden die Polystyrolkugeln zwei Mal mit 2 ml Puffer A gewaschen und mit 0,15 ml Puffer A, der 1 mM Dinitrophenyl-L-lysin und 0,1 mg nicht-spezifisches Kaninchen-F(ab')&sub2; enthielt, und zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Maus-IgG)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 4 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Nach dem Waschen der mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti- Maus-IgG)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln in derselben Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen β-D-Galactosidase 16 Stunden bei 30ºC geprüft. Die Ergebnisse werden in Fig. 8 zusammen mit den Ergebnissen in Vergleichsbeispiel 7 nachstehend dargestellt. Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse des Assays durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung und durch das herkömmliche Verfahren, ausgedrückt durch die Beziehung zwischen der hGH-Konzentration (pg/Röhrchen, Abszisse) und Fluoreszenzintensität, welche der spezifisch gebundenen β-D-Galactosidase (Ordinate) entspricht, darstellt.

Vergleichsbeispiel 7

Der Puffer war derselbe wie der in Beispiel 8. Der Assay der β- D-Galactosidaseaktivität und die Herstellung der mit monoklonalem Maus-(Anti-hGH)-IgG überzogenen festen Phase wurden in derselben Weise wie in Beispiel 9 durchgeführt.

hGH-Assay

Eine mit monoklonalem Maus-(Anti-hGH)-IgG&sub1; überzogene Polystyrolkugel wurde mit einer hGH-Standardprobe in 0,15 ml Puffer A über Nacht bei 20ºC inkubiert.
Nach Entfernen des Inkubationsgemisches wurde die Polystyrolkugel zwei Mal mit 2 ml Puffer A gewaschen und mit 200 fMol Kaninchen-(anti-hGH)-Fab'-β-D-Galactosidase und 0,1 mg nicht- spezifischem-Kaninchen-F(ab')&sub2; in 0,15 ml Puffer A 4 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Nach Waschen der Polystyrolkugel in derselben Weise wie vorstehend wurde die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen β-D-Galactosidase 1 Stunde bei 30ºC geprüft.
Die Ergebnisse werden in Fig. 8 dargestellt.

Beispiel 10

Der Assay der Peroxidaseaktivität, die Herstellung der mit IgG überzogenen festen Phase und die Herstellung von Kaninchen- (Anti-Thyroglobulin)-Fab'-Peroxidase wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 2 ausgeführt. Die Affinitätsreinigung von IgG wurde mit den Verfahren von Beispiel 3 ausgeführt. Die Reinigung von Thyroglobulin und die Herstellung von Dinitrophenyl-Thyroglobulin wurden mit den Verfahren von Beispiel 4 durchgeführt.

Assay des Anti-Thyroglobulin-Antikörpers

Eine aliquote Menge (0,02 ml) einer Probe, die durch Verdünnen von Anti-Thyroglobulin-Antikörper enthaltendem Humanserum mit normalem Humanserum bei verschiedenen Verdünnungsraten hergestellt wurde, wurde mit 0,08 ml 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,0, das 15 fMol Dinitrophenyl-Thyroglobulin, 3,75 g/l nicht-spezifisches Kaninchen-IgG, 1 g/l NaN&sub3;, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 0,05 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl, 0,1% Rinderserumalbumin und 0,1% NaN&sub3; enthielt, und zwei mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin)-IgG überzogenen Polystyrolkugeln 4 Stunden bei 20ºC und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Polystyrolkugeln waren wie in Beispiel 2 beschrieben mit nicht- spezifischem Kaninchen-IgG behandelt worden. Nach der Inkubation wurden die Polystyrolkugeln zwei mal mit 2 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und mit 150 nMol Dinitrophenyl-L-lysin in 0,15 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, der 0,1% NaN&sub3;, 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, unter Eluieren des Komplexes aus Anti-Thyroglobulin-IgG und Dinitrophenyl-Thyroglobulin 1 Stunde bei 20ºC inkubiert. Nach Entfernen der Polystyrolkugeln wurde das Eluat mit einer mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-(Anti-Human-IgG-γ- Kette)-IgG überzogenen Polystyrolkugel 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die mit Kaninchen-(Anti-Human- IgG-γ-Kette)-IgG überzogene Polystyrolkugel wie vorstehend beschrieben gewaschen und mit Kaninchen-Anti-Thyroglobulin-Fab'- Peroxidase-Konjugat (50 ng) in 0,15 m1 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 3 Stunden bei 20ºC inkubiert.
Schließlich wurde die Polystyrolkugel wie vorstehend beschrieben gewaschen und die Aktivität der an die Polystyrolkugel gebundenen Peroxidase wurde 10 Minuten bei 30ºC geprüft. Ein Assay war bis zu 10&sup5;-facher Verdünnung möglich.
Das Verfahren des Beispiels 10 gemäß der vorliegenden Erfindung gestattet einen Assay des Anti-Thyroglobulin-Antikörpers mit höherer Empfindlichkeit verglichen mit den herkömmlichen Verfahren des Vergleichsbeispiels 4.

Claims

1. Hochempfindliches Immunoassayverfahren zum Prüfen auf eine Zielsubstanz, bei der es sich um eine zu prüfende antigene Substanz oder einen zu prüfenden spezifischen Antikörper handelt, in einer Testlösung, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte (A), (B), (C) und (D) umfaßt:

(A) Hinzufügen zu der Testlösung

(1) einer oder mehrerer aktiver Komponenten, die mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen konjugiert sind, wobei die aktiven Komponenten in der Lage sind, an die Zielsubstanz zu binden, und die funktionellen Gruppen in der Lage sind, an die reaktiven Gruppen an einem festen Träger in Verfahrensschritt (A) und gegebenenfalls an einem festen Träger in Schritt (C) zu binden, unter Bildung eines Immunokomplexes, der aus der Zielsubstanz und einer aktiven Komponente zusammengesetzt ist; sowie Hinzufügen

(2) des ersten festen Trägers mit wenigstens einer reaktiven Gruppe, die in der Lage ist, an die funktionellen Gruppen zu binden, unter Bindung des Immunokomplexes an den ersten festen Träger;

(B) Dissoziieren des Immunokomplexes von dem ersten festen Träger;

(C) Hinzufügen eines zweiten festen Trägers mit einer reaktiven Gruppe, die in der Lage ist, an den Immunokomplex zu binden, zu dem in Schritt (B) abdissoziierten Immunokomplex unter Bildung eines Immunokomplexes, der an den zweiten festen Träger gebunden ist; sowie

(D) Prüfen auf den Komplex, der an den zweiten festen Träger gebunden ist.

2. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielsubstanz ein spezifischer Antikörper ist.

3. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielsubstanz eine antigene Substanz ist.

4. Immunoassayverfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der aktiven Komponenten mit einem Marker markiert ist.

5. Immunoassayverfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Dissoziieren in Schritt (B) das Hinzufügen einer ausreichenden Menge einer Substanz mit derselben funktionellen Gruppe wie die aktive Komponente zu dem an den ersten Träger gebundenen Komplex umfaßt, um das Abdissoziieren des Komplexes von dem Träger zu bewirken.

6. Immunoassayverfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe, die den Komplex in Verfahrensschritt (C) an den festen Träger bindet, von der reaktiven Gruppe in Verfahrensschritt (A) verschieden ist.

7. Immunoassayverfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei die mit wenigstens einer funktionellen Gruppe konjugierte aktive Komponente in Form eines Antigens, Antikörpers, Haptens oder Biotins über eine S-S-Bindung daran gebunden ist.

8. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 7, wobei Schritt (B) das Hinzufügen einer ausreichenden Menge eines Reagenses, das in der Lage ist, die S-S-Bindung aufzubrechen, zu dem an den ersten Träger gebundenen Komplex umfaßt.

9. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antigen als aktive Komponente, das im voraus an zwei Arten funktioneller Gruppen gebunden ist, in Verfahrensschritt (A) über eine der beiden funktionellen Gruppen an den ersten festen Träger gebunden wird, die aktive Komponente in Verfahrensschritt (C) über die andere funktionelle Gruppe an den zweiten festen Träger gebunden wird und in Verfahrensschritt (D) mit einem markierten Anti-Antikörper auf den Antikörper in dem Komplex an dem zweiten Träger geprüft wird.

10. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antigen als aktive Komponente, das im voraus an eine funktionelle Gruppe und einen Marker gebunden ist, in Verfahrensschritt (A) über die funktionelle Gruppe an den ersten festen Träger gebunden wird, in Verfahrensschritt (C) der mit einem Anti-Antikörper konjugierte zweite Träger verwendet wird und in Verfahrensschritt (D) auf den Marker in dem Komplex an dem zweiten Träger geprüft wird.

11. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 2, wobei einige der Antikörper in der Testlösung in Form eines Antigen-Antikörper-Komplexes vorliegen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antigen und ein Antikörper als aktive Komponenten verwendet werden, freie Antikörper unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes an ein hinzugefügtes Antigen gebunden werden, ein an eine funktionelle Gruppe gebundener und markierter Antikörper unter Bildung eines Antikörper-Antigen- Antikörper-Komplexes hinzugefügt wird, der so erhaltene Komplex in Verfahrensschritt (A) über die funktionelle Gruppe an den ersten festen Träger gebunden wird, in Verfahrensschritt (C) der zweite feste Träger, der an einen Anti-Antikörper gegen den zu prüfenden Antikörper gebunden ist, verwendet wird und in Verfahrensschritt (D) auf den Marker in dem Komplex an dem zweiten festen Träger geprüft wird.

12. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-Antikörper zur Erkennung von Immunoglobulinklassen in der Lage ist.

13. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwei verschiedene, von zwei Tierarten stammende Antikörper als aktive Komponenten, wobei der eine an eine funktionelle Gruppe gebunden ist und der andere an einen Marker gebunden ist, unter Bildung eines Komplexes zusammen mit der zu prüfenden antigenen Substanz gekoppelt werden, der so erhaltene Komplex in Verfahrensschritt (A) über die funktionelle Gruppe an den ersten festen Träger gebunden wird, in Verfahrensschritt (C) der zweite feste Träger, der an einen Anti-Antikörper gegen den an die funktionelle Gruppe gebundenen Antikörper gebunden ist, verwendet wird und in Verfahrensschritt (D) auf den Marker in dem Komplex an dem zweiten festen Träger geprüft wird.

14. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Arten von Antikörpern, die von derselben Tierart stammen, als aktive Komponenten, wobei der eine an zwei Arten funktioneller Gruppen gebunden ist und der andere an einen Marker gebunden ist, unter Bildung eines Komplexes zusammen mit der zu prüfenden antigenen Substanz gebunden werden, der so erhaltene Komplex in Verfahrensschritt (A) über eine der beiden funktionellen Gruppen an den ersten festen Träger gebunden wird, in Verfahrensschritt (C) der zweite feste Träger, der an die andere funktionelle Gruppe binden kann, verwendet wird und in Verfahrensschritt (D) auf den Marker in dem Komplex an dem zweiten festen Träger geprüft wird.

15. Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 3, das auf kompetitiver Proteinbindungsanalyse beruht, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antigen und ein Antikörper als aktive Komponenten, wobei das Antigen an einen Marker gebunden ist und der Antikörper an eine funktionelle Gruppe gebunden ist, unter Bildung eines Komplexes zusammen gebunden werden, woraufhin der Komplex an einen festen Träger gebunden wird, in Verfahrensschritt (C) ein fester Träger, der mit einem Anti-Antikörper gegen den Antikörper konjugiert ist, verwendet wird und in Verfahrensschritt (D) auf den Marker in dem Komplex an dem festen Träger geprüft wird.

16. Hochempfindliches Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei die aktive Komponente (I) ein spezifisches Antigen oder ein idiotypischer Antikörper, der mit dem zu prüfenden spezifischen Antikörper eine Antigen-Antikörper-Reaktion verursacht, (II) ein Antikörper, der mit der zu prüfenden antigenen Substanz eine Antigen-Antikörper-Reaktion verursacht, ist.

17. Hochempfindliches Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe (I) ein Hapten oder ein über eine -S-S-Bindung gebundenes Hapten, (II) Biotin oder über eine -S-S-Bindung gebundenes Biotin oder (III) ein über eine -S-S-Bindung gebundener Antikörper oder Antigen, die sich von dem zu prüfenden spezifischen Antikörper oder der antigenen Substanz unterscheiden, ist.

18. Hochempfindliches Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 1, wobei

(I) wenn die funktionelle Gruppe ein Hapten ist, die reaktive Gruppe ein Antikörper dagegen ist,

(II) wenn die funktionelle Gruppe ein Biotin ist, die reaktive Gruppe ein Avidin oder Streptavidin ist oder

(III) wenn die funktionelle Gruppe ein durch -S-S-Bindung vermitteltes Antigen oder Antikörper ist, die reaktive Gruppe der entsprechende Antikörper bzw. Antigen ist.

19. Hochempfindliches Immunoassayverfahren gemäß Anspruch 2, wobei die aktive Komponente an zwei Arten funktioneller Gruppen gebunden ist.