DE3530870A1 - Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellung - Google Patents
Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellungInfo
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Description
Die biochemische sowie licht- und elektronenmikroskopische
Darstellung von spezifischen Rezeptoren gelingt bisher nur
durch Inkubation des biologischen Materials (Gewebe, Zellen,
Zellbestandteile, Zellinhaltsstoffe) mit radioaktiv mar
kierten (3H, 125 J) Liganden oder mit Liganden, die zuvor mit
einem fluoreszierenden Stoff (z. B. Fluoreszein-isothiocyanat)
oder einem Enzym (z. B. Peroxidase) markiert wurden. Diese
Verfahren erlauben jedoch lediglich den physiologischen bzw.
licht- und elektronenmikroskopischen Nachweis von spezifischen
Rezeptoren an biologischen Materialien, nicht jedoch die
Extraktion des spezifisch Rezeptor-Ligand-markierten Materials
aus einem Gemisch bestehend aus heterogenen biologischen
Materialien. Außerdem sind im Umgang mit radioaktiv-markier
ten Substanzen strenge Sicherheitsvorschriften zu befolgen,
die bei der hier vorgestellten Methode gänzlich entfallen.
Die hiermit geltend gemachten Patentansprüche ergeben sich
aus folgender Beschreibung:
- Gewebe, Zellen, Zellbestandteile und Zellinhaltsstoffe (biologisches Material), die entweder intakt oder vorbe handelt (z. B. homogenisiert) wurden, werden mit einem Ligandbindungspuffer inkubiert zu Bedingungen, die eine maximale Ablösung des gebundenen Liganden von seinem Re zeptor bewirkt. Das biologische Material weist danach ausschließlich nicht-Ligand-gebundene, freie Rezeptoren auf. Da das biologische Material auch den endogenen, nicht-Rezeptor-gebundenen "Liganden" enthalten kann, wird dieses mit einem Antikörper (AK I) - der mono- oder poly klonal sein kann - inkubiert, der spezifisch den endogenen, nicht-Rezeptor-gebundenen "Liganden" erkennt und bindet.
Danach wird das biologische Material mit einem Antikörper
(AK II) - der mono- oder polyklonal sein kann - inkubiert,
der spezifisch den AK I erkennt und bindet. Der endogene,
native "Ligand" ist somit blockiert und dadurch von allen
nachfolgenden Schritten ausgeschlossen. Sowohl die Inku
bation des biologischen Materials mit dem AK I als auch
mit dem AK II sind unter solchen Bedingungen (z. B. Puffer
wahl, Inkubationszeit- und temperatur) auszuführen, die
eine maximale Antigen-Antikörper-Bindung ermöglichen. Da
viele biologische Materialien keinen endogenen, nativen
"Liganden" enthalten und nur Rezeptoren für die Bindung
von Liganden aufweisen, kann die Inkubation des biologischen
Materials mit dem AK I und AK II entfallen.
Das biologische Material mit seinen freien Rezeptoren wird
nun inkubiert mit einem spezifischen Liganden zu Be
dingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des
Liganden an seinen Rezeptor ermöglicht. Danach wird das
biologische Material mit einem Antikörper (AK I) inkubiert
zu Bedingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des
AK I an den rezeptorgebundenen Liganden ermöglicht. Das
hieraus resultierende biologische Material wird als "Re
zeptor-Ligand-Ligandantikörper (RLL)-markiertes biologisches
Material" bezeichnet. Dieses biologische Material kann nun
aus einem Gemisch von heterogenen biologischen Materialien
(RLL-markiertes und unmarkiertes biologische Materialien
sind gemischt) spezifisch und rein dargstellt werden, in
dem ein Affinitätsmaterial, das mit einem spezifischen
Antikörper (AK III) - der mono- oder polyklonal sein kann -
verknüpft ist, und der spezifisch den Rezeptor-Ligand-ge
bundenen AK I erkennt und bindet, inkubiert wird zu Be
dingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des AK III
an AK I ermöglicht. Danach wird das nicht-RLL-markierte,
nicht-Affinitätsmaterial-gebundene, biologische Material
vom RLL-markierten, AK III-Affinitätsmaterial-gebundenen
biologischen Material getrennt, indem das Gemisch (freies
und gebundenes biologisches Material) mit einem Puffer ge
waschen wird, der die AK I-AK II-Bindung nicht löst.
Hieraus resultiert reines, RLL-markiertes biologisches
Material, das über dem AK III mit dem Affinitätsmaterial
verbunden ist. Dieses biologische Material - das die
Rezeptorkomponenten enthält - wird von seinem Liganden
wieder gelöst, indem das Affinitätsmaterial mit einem
Ligandbindungspuffer inkubiert wird, der eine maximale
Ablösung des Liganden von seinem spezifischen Rezeptor
bewirkt. Die Inkubationsbedingungen hierzu sind so zu
wählen, daß eine maximale Ablösung des Liganden von
seinem Rezeptor erfolgt. Im Eluat befindet sich jetzt
das rein dargestellte biologische Material, das, wenn
homogenisiertes Ausgangsmaterial verwendet wurde, rein
dargestellte spezifische Rezeptorkomponenten enthält.
Sowohl das rein dargestellte biologische Material als
auch die rein dargestellten Rezeptorkomponenten können
zur Herstellung von spezifischen mono- oder polyklonalen
Antikörpern, die spezifisch gegen diese biologischen
Materialien und Rezeptorkomponenten gerichtet sind und
diese spezifisch erkennen und binden, verwendet werden.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von spezifisch Rezeptor-
Ligand-Ligandantikörper (RLL)-markierten Geweben,
Zellen, Zellbestandteilen und Zellstoffen (biologisches
Material) und dessen Reindarstellung, gekennzeichnet
durch folgende Stufen:
- a) Inkubation des biologischen Materials mit einem Anti körper (AK I), der spezifisch den Liganden erkennt und bindet,
- b) Inkubation des biologischen Materials mit einem Anti körper (AK II), der spezifisch den AK I erkennt und bindet,
- c) Inkubation des biologischen Materials mit einem Liganden, der von dem AK I spezifich erkannt und gebunden wird,
- d) Wiederholung der Stufe (a),
- e) Inkubation des RLL-markierten biologischen Materials mit einem Affinitätsmaterial, das mit einem Antikörper (AK III) verknüpft ist, der spezifisch den Rezeptor-Ligand-ge bundenen Antikörper (AK II) erkennt und bindet,
- f) Trennung der Rezeptorkomponenten vom Affinitätsmaterial - AK III - AK II - gebundenen Liganden.
2. Abwandlung des Anspruchs aus (1) dahingehend, daß Stufe
(a) und (b) entfallen.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853530870 DE3530870A1 (de) | 1985-08-28 | 1985-08-28 | Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellung |
PCT/DE1986/000394 WO1987001459A1 (en) | 1985-08-28 | 1986-08-28 | Process for the production of pure receptors and/or ligands and/or antibodies, materials thus produced and their use |
EP19860905726 EP0267918A1 (de) | 1985-08-28 | 1986-08-28 | Verfahren zur herstellung von reinen rezeptoren und/oder liganden und/oder antikörpern, danach hergestellte materialien sowie deren verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853530870 DE3530870A1 (de) | 1985-08-28 | 1985-08-28 | Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DE3530870A1 true DE3530870A1 (de) | 1987-03-12 |
DE3530870C2 DE3530870C2 (de) | 1987-12-17 |
Family
ID=6279668
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19853530870 Granted DE3530870A1 (de) | 1985-08-28 | 1985-08-28 | Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellung |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0267918A1 (de) |
DE (1) | DE3530870A1 (de) |
WO (1) | WO1987001459A1 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5236830A (en) * | 1988-11-10 | 1993-08-17 | Eiji Ishikawa | Method of assay for antigen |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0169729A3 (de) * | 1984-07-23 | 1988-08-03 | Becton Dickinson and Company | Gewinnung von Zellenrezeptoren |
-
1985
- 1985-08-28 DE DE19853530870 patent/DE3530870A1/de active Granted
-
1986
- 1986-08-28 WO PCT/DE1986/000394 patent/WO1987001459A1/de unknown
- 1986-08-28 EP EP19860905726 patent/EP0267918A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (7)
Title |
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Adv.Biochem.Psychopharmacol., 1980, 21, S.151-158 * |
J.Biochem., 1984, 95, S.1055-1065 * |
Life Sciences, 1985, 36, S.1075-1085 * |
Nature, Nr.4920, 15.Febr.1964, S.679-682 * |
Proc.Natl.Acad.Sci., 1982, USA, Vol. 79, Seite 4810-4814 * |
Proc.Natl.Acad.Sci., 1985, USA, Vol. 82, Seite 594-598 * |
Recept.Biochem.Methodol., 1984, 4, S.151-162 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0267918A1 (de) | 1988-05-25 |
DE3530870C2 (de) | 1987-12-17 |
WO1987001459A1 (en) | 1987-03-12 |
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