DE68927118T2 - Ionenfang-Teste und -Vorrichtungen - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Immunoassayvorrichtungen und -methoden. Im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung neuere Methoden und Produkte, die bei der Durchführung von homogenen Immunoassays nützlich sind.
- Bei Assays zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Konzentration von Substanzen von Interesse oder klinischer Bedeutung, die in biologischen Flüssigkeiten oder anderen Materialien anwesend sein können, werden häufig verschiedene analytische Verfahren und Vorrichtungen eingesetzt. Solche Substanzen werden gemeinhin "Analyten" genannt und können Antikörper, Antigene, Drogen, Hormone usw. beinhalten.
- Immunoassaymethoden machen sich die Mechanismen der Immunsysteme von höheren Organismen zunutze, bei denen Antikörper produziert werden als Antwort auf die Anwesenheit von Antigenen, die für die Organismen pathogen oder fremd sind. Ein oder mehrere Antikörper werden als Antwort auf ein bestimmtes Antigen produziert und sind befähigt, mit diesem Antigen zu reagieren, wodurch ein hochspezifischer Reaktionsmechanismus geschaffen wird, denn vitro verwendet werden kann, um die Anwesenheit oder Konzentration dieses Antigens in einer biologischen Probe zu bestimmen.
- Der Festphasenimmunoassay ist eine häufig verwendete Immunoassaymethode. Es gibt eine Anzahl Festphasenimmunoassay- Vorrichtungen und -Verfahren, bei denen die Anwesenheit eines Analyten durch eine Reaktion auf einer "Festphase", wie z. B. einem Eintauchstab, einem Teststreifen, Papier, einer Fasermatrix, einer 1/4-Zoll (0,64 cmy -Perle oder einem anderen festen Material angezeigt wird.
- Eine herkömmliche Festphasenenzymimmunoassay- Konfiguration verwendet einen Antianalytenantikörper (Einfangantikörper), der an ein unlösliches Festphasenmaterial, wie z. B. Polystyrol-Perlen oder mit einer Fasermatrix assozuerte Latex-Mikropartikeln, gebunden ist. Ein zweiter Antianalytenantikörper wird mit einem Enzym markiert, um ein lösliches Indikatorreagenz zu bilden, und das Enzym wird mit einem Enzymsubstrat reagieren, so daß ein nachweisbares Produkt gebildet wird (der zweite Antikörper kann mit einem Radioisotop, Fluorophor, Chemolumiphor oder jeglichem leicht nachweisbaren Signalerzeuger markiert werden). Die zwei Antikörperkonjugate bilden einen unlöslichen ternären Immunokomplex ("Sandwich") mit dem Analyten, wenn dieser in der zu testenden Probe anwesend ist. Vor der Zugabe des Enzymsubstrats und dem Nachweisen oder der Messung des Produkts wird der Immunokomplex von überschüssigem Indikatorreagenz und anderen störenden Substanzen abgetrennt, indem der an die Festphase gebundene Immunokomplex physikalisch aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird Bei der Zugabe des Enzymsubstrats reagiert dieses mit dem Enzymanteil des Indikators, und die mit dem an die Festphase gebundenen Sandwich assozuerte Menge an markiertem Antikörper ist direkt proportional zu der in der zu testenden Probe enthaltenen Analytenmenge.
- Eine alternative Methodik ist der Konkurrenzassay. Der Einfangmechanismus verwendet wieder einen an die unlösliche Festphase konjugierten Antianalytenantikörper, es wird aber als Indikator enzymmarkierter Analyt (anstelle eines zweiten Antikörpers) verwendet, der gleichzeitig zusammen mit der zu testenden Probe und der Festphase inkubiert wird. Daher konkurriert im Konkurrenzassay der Indikator mit dem in der Probe anwesenden Analyten um die Bindung mit der Festphase, und es werden binäre Immunokomplexe gebildet, d. h. ein Festphasen/Analyt-Konjugat und ein Festphasen/Indikator- Konjugat. Im Konkurrenzassay ist die Menge an eingefangenem Indikatorreagenz umgekehrt proportional zu der in der Probe anwesenden Analytenmenge.
- Trotz ihrer großen Nützlichkeit sind mit solchen Assaymethoden einige Nachteile verbunden. Erstens kann das heterogene Reaktionsgemisch aus löslichen und unlöslichen Reagenzien und flüssiger zu testender Probe die Kinetik der Reaktion verlangsamen. Es können auch lange Inkubationszeiten erforderlich sein, bis im Reaktionsgemisch ein Gleichgewicht zwischen dem unlöslichen Festphasensystem, dem freien Analyten in der zu testender Probe, dem löslichen Indikatorreagenz und dem neugebildeten unlöslichen Komplex erreicht wird. Zweitens können herkömmliche Methoden, Einfangreagenzien an Festphasenmaterialien anzubinden, wie z. B. Adsorption, eine Festphase erzeugen, die leicht andere Substanzen als den Analyten bindet. Dies wird nichtspezifische Bindung genannt und kann das Nachweisen eines positiven Ergebnisses stiren. Drittens, während gewisse Methoden, wie der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA) und die enzymmultiplizierte Immunoassaymethode (EMIT) die Vorteile homogener Assays besitzen und einige der Probleme der Festphasensassays mit konkurrierender Bindung lösen, haben sie auch den Nachteil, daß sie das Signal in der Anwesenheit des Probenhintergrunds nachweisen.
- Von Relevanz als Hintergrund für die vorliegende Erfindung ist die zum Stand der Technik gehörende EP-A-0 230 768, in der Assays offenbart werden, die das Abtrennen einer Substanz aus einem flüssigen Medium mittels eines Magnetfeldgradienten enthalten. Der Assay stützt sich auf die Koagglutination von magnetischen Partikeln und nichtmagnetischen Partikeln, an die als Einfangreagenz ein Glied eines spezifisch bindenden Paares gebunden wird, z. B. durch kovalente Bindung. Koagglutination kann aufgrund ionischer Interaktion zwischen den entgegengesetzt geladenen magnetischen und nichtmagnetischen Partikeln stattfinden.
- Diese Erfindung stellt neuartige Assay- and Abtrennverfahren vor, die es ermöglichen, daß sowohl das Einfangreagenz als auch das Indikatorreagenz gelöst sind, um Probleme bezüglich einer verzögerten Reaktionskinetik zu vermeiden.
- Das Abtrennverfahren verwendet eine lösliche spezifisch bindende Substanz, d. h. ein Einfangreagenz, das an eine geladene Substanz konjugiert ist, und ein unlösliches Festphasenmaterial, das entgegengesetzt geladen ist. Eine flüssige Probe, in der der Analyt vermutet wird, wird mit dem gelösten Einfangreagenz gemischt, wobei ein geladener Komplex gebildet wird. Wenn die Bindung vollständig ist, wird die Lösung mit dem entgegengesetzt geladenen Festphasenmaterial in Kontakt gebracht, so daß der neugebildete Komplex angezogen, angebunden und aus der flüssigen Probe abgetrennt wird.
- Die Erfindung kann weiterhin zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe verwendet werden, indem ein Indikatorreagenz, d. h. eine zweite analytenspezifische Bindesubstanz, die an eine Markierung konjugiert ist, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist, zugegeben wird. Das Indikatorreagenz kann in einem Konkurrenzassay oder einem Sandwichassay verwendet werden, wobei es mit dem Analyten und dem Einfangreagenz in Kontakt gebracht wird, so daß ein Einfangreagenz/Analyt/Indikatorreagenz-Komplex gebildet wird, der sowohl markiert als auch geladen ist. Der Komplex kann dann durch Kontakt mit dem entgegengesetzt geladenen Festphasenmaterial aus der Lösung abgetrennt werden, und die Anwesenheit oder Menge an Analyt wird durch Nachweisen der Markierung des Indikatorreagenzes überwacht.
- Gebraucht werden kann außerdem eine Anzahl geladener Festphasenmaterialien sowie spezifisch geladene Spezies, insbesondere polymere ionische Substanzen die zur Anziehung und Anbindung des entgegengesetzt geladenen Einfangreagenz-und- Assay-Komplexes an das Festphasenmaterial gekoppelt werden können. Die Verwendung der geladenen Substanzen führt zu Assayverfahren mit einer hochspezifischen Abtrennmethode, minimaler nichtspezifischer Bindung und einer hohen Empfindlichkeit.
- Bei einer bekannten Assaymethode wird das Einfangreagenz, als typisches Beispiel ein Antikörper, an eine Festphase konjugiert, und die flüssige zu testende Probe durch oder über die Festphase geführt, damit der Antikörper den Analyten anziehen und aus der Lösung abtrennen kann. Somit begrenzt die Affinität des Antikörpers für den Analyten die Wirksamkeit des Einfangvorganges des Analyten aus der zu testender Probe, und sie kann zusammen mit der Heterogenität des Reaktionsgemisches (d. h. löslicher Analyt und immobilisierter Einfangantikörper auf einer Festphase) zu schlechter Reaktionskinetik und schlechter Abtrennung während der kurzen "Durchströmung" der Probe durch die Festphase führen.
- In der vorliegenden Erfindung sind sowohl das Einfangals auch das Indikatorreagenz löslich, und beide sind in einer flüssigen zu testenden Probe dispergiert, so daß ein homogenes Reaktionsgemisch gebildet wird. Man glaubt, das homogene Reaktionsgemisch biete eine verbesserte Gelegenheit zur Komplexierung des geladenen Einfangantikörpers sowie des markierten Antikörpers an einen Antigenanalyten. Man glaubt, die Dispersion des Analyten und des geladenen Einfangantikörpers in der Lösung beschleunige die Reaktionskinetik und erhöhe die Wahrscheinlichkeit der Analyt/Antikörper-Bindung im Vergleich zur Bindung bei der "Durchströmungs"-Methode.
- Wenn der Komplex aus geladenem Einfangreagenz und Analyt (und/oder Indikatorreagenz) durch die entgegengesetzt geladene Festphase geführt wird, bestimmt die ionische Anziehung der entgegengesetzt geladenen Spezies die Wirksamkeit der Abtrennung des Komplexes aus der Lösung. Die ionische Anziehung kann so gewählt werden, daß sie eine stärkere Anziehung bietet als die Anziehung Antikörper gegenüber Antigen bei anderen Abtrennungsmethoden, insbesondere wenn multiple polykationische and polyanionische Spezies verwendet werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die "Ioneneinfang"-Methode die nichtspezifische Adsorption von störenden Substanzen auf das Festphasenmaterial minimiert, wodurch eine verbesserte Analysegenauigkeit geboten wird.
- Die Assaymethoden und Reagenzien der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Immunoassayformaten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ist aber nicht auf immunoreaktive Assays begrenzt. Jeder Assay, der spezifisch bindende Glieder verwendet, kann durchgeführt werden. Ein "spezifisch bindendes Glied", wie es hier verwendet wird, ist ein Glied eines spezifisch bindenden Paares, d. h. zweier unterschiedlicher Moleküle, wobei eines der Moleküle auf chemische oder physikalische Weise spezifisch an das zweite Molekül bindet. Deshalb können zusätzlich zu spezifisch bindende Paaren aus Antigen und Antikörper andere spezifisch bindende Paare Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lektine, komplementäre Nukleotidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzymcofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme und dergleichen beinhalten. Weiterhin können spezifisch bindende Paare Glieder beinhalten, die Analoga des ursprünglichen spezifisch bindenden Glieds sind, wie z. B. ein Analyt-Analogon. Immunoreaktive spezifisch bindende Glieder beinhalten Antigene, Haptene, Antikörper und Komplexe davon, einschließlich derer, die durch auf rekombinanter DNA beruhenden Methoden gebildet wurden.
- In einem Sandwichassay wird ein lösliches Einfangreagenz verwendet, das ein spezifisch bindendes Glied beinhaltet, das an eine geladene Substanz, wie z. B. ein: Anion oder Kation, gebunden worden ist. Die ionische Spezies kann ein Monomer oder Polymer sein. Falls das spezifisch bindende Glied ein Immunoreaktant ist, kann es ein Antikörper, Antigen oder Komplex davon sein, jeweils spezifisch für den Analyten von Interesse, und bei Verwendung eines Antikörpers kann es ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein rekombinanter Antikörper sowie eine Mischung davon, oder eine Mischung eines Antikörpers und anderer spezifisch bindender Glieder sein. Das Einfangreagenz wird mit einer Probe, in der Analyt vermutet wird, und einem Indikatorreagenz, das ein zweites, mit einer signalerzeugenden Verbindung (z. B. einem Enzym, oder einer fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Verbindung) markiertes, spezifisch bindendes Glied enthält, in Kontakt gebracht. Die Reagenzien können gleichzeitig gemischt öder nacheinander zugegeben werden, entweder einzeln oder kombiniert. Eine Verbindungsreaktion führt zur Bildung eines Einfangreagenz/Analyt/Indikatorreagenz-Komplexes. Der Assay umfaßt auch den Schritt der Abtrennung des resultierenden löslichen Komplexes von den überschüssigen Reagenzien und zu testender Probe durch Verwendung eines Festphasenmaterials, das entweder in bezug auf das Einfangreagenz entgegengesetzt geladen ist oder eine entgegengesetzt geladene Substanz, wie z. B. ein anionisches oder kationisches Polymer, zurückhält. Durch die Wechselwirkung der entgegengesetzten Ladungen zieht das entgegengesetzt geladene Festphasenmaterial den Einfangreagenz/Analyt/Indikatorreagenz-Komplex an und bindet an ihn. Das Festphasenmaterial kann jedes geeignete Material sein, vörzugsweise ein poröses Material, wie z. B. Papier, ein Glasmikrofasermaterial und dergleichen.
- Der auf dem Festphasenmaterial zurückgehaltene Komplex wird durch Untersuchung der Festphase auf das Indikatorreagenz hin nachgewiesen. Bei Anwesenheit von Analyt in der Probe wird auch auf dem Festphasenmaterial Markierung anwesend sein. Die Menge an Markierung auf der Festphase ist proportional zur Menge an Analyt in der Probe. Eine Enzymmarkierung kann durch Augenschein nachgewiesen oder nach Zugabe eines Enzymsubstrats spektralphotometrisch gemessen werden. Oder die Markierung kann in Abhängigkeit von der verwendeten Markierung durch die Messung von Fluoreszenz, Chemilumineszenz, radioaktiver Energieabstrahlung usw. nachgewiesen werden.
- "Analyt", wie er hier verwendet wird, ist die mittels der vorliegenden Erfindung nachzuweisende oder aus der Probe abzutrennende, Substanz. Der Analyt kann jede Substanz sein, für die es ein in der Natur vorkommendes spezifisch bindendes Glied gibt (z. B. einen Antikörper) oder für die ein spezifisch bindendes Glied hergestellt werden kann. Somit ist ein "Analyt" eine Substanz, die sich in einem Assay an einen oder mehrere spezifisch bindende Glieder binden kann. "Analyt" beinhaltet auch antigene Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon. Als Glied eines spezifisch bindenden Paares kann der Analyt mittels in der Natur vorkommender spezifisch bindender Partner nachgewiesen werden, wie z. B. die Verwendung von Innerer-Faktor-Protein in den Einfang- und/oder Indikatorreagenzien zur Bestimmung von Vitamin B&sub1;&sub2; oder die Verwendung eines Lektins in Einfang- und/oder Indikatorreagenzien zur Bestimmung eines Kohlenhydrats. Der Analyt kann ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Hormon, ein Steroid, ein Vitamin, eine Droge einschließlich derer, die zu therapeutischen Zwecken verabreicht werden, sowie derer, die zu unerlaubten Zwecken verabreicht werden, ein Bakterium, einen Virus, und Metaboliten von einer beliebigen oder Antikörper gegen eine beliebige der obigen Substanzen beinhalten.
- Mit der vorliegenden Erfindung kann auch ein Konkurrenzassay durchgeführt werden. Bei einer konkurrierenden Konfiguration beinhaltet das lösliche Einfangreagenz wieder ein spezifisch bindendes Glied, das an eine geladene Substanz gebunden worden ist, wie z. B. ein anionisches oder kationisches Polymer. Das Einfangreagenz wird sowohl mit der zu testenden Probe als auch mit einem Indikator in Kontakt gebracht, das einen Analyten, der mit einer signalerzeugenden Verbindung markiert worden ist, oder ein Analyt-Analogon, das mit einer signalerzeugenden Verbindung markiert worden ist, beinhaltet. Eine Reaktion findet statt und führt zur Bildung löslicher Komplexe aus (1) Einfangreagenz/Probenanalyt und (2) Einfangreagenz/Indikatorreagenz.
- Die löslichen Komplexe werden durch In-Kontakt-Bringen des Reaktionsgemisches mit dem entgegengesetzt geladenen Festphasenmaterial von den überschüssigen Reagenzien und der zu testenden Probe entfernt. Die Komplexe werden auf der Festphase durch deren. Anziehung des entgegengesetzt geladenen Einfangreagenzes zurückgehalten. Die auf der Festphase zürückgehaltenen Komplexe werden durch die Markierung auf dem Indikatorreagenz nachgewiesen. Beim Konkurrenzassay ist die Menge an Markierung auf der Festphase umgekehrt proportional zur Menge an Analyt in der Probe. Somit wird eine positive Testsubstanz ein negatives Signal erzeugen.
- Bei einem Assay zum Nachweis von Theophyllin z. B. kann ein Anti-Theophyllin-Antikörper (entweder monoklonal oder polyklonal) mit einer anionischen Substanz konjugiert werden, so daß ein lösliches Einfangreagenz gebildet wird, und eine Konkurrenz um die Bindung an diesen Antikörper kann zwischen dem löslichen, markierten Theophyllin (d. h. Indikatorreagenz) und dem unmarkierten Theophyllin der zu testenden Probe hergestellt werden. Nach der Inkubation kann das homogene Gemisch durch ein mit Kationen beschichtetes poröses Festphasenmaterial geführt werden. Die Anziehung zwischen den entgegengesetzt geladenen Ionenspezies des Einfangreagenzes und der Festphase trennt den Immunokomplex aus dem Reaktionsgemisch ab. Das vom Indikatorreagenz stammende Signal kann dann nachgewiesen werden. In diesem Fall werden erhöhte Theophyllinspiegel in der Probe zu einer verminderten mit der Festphase verbundenen Signalerzeugung führen.
- Gleichermaßen kann die vorliegende Erfindung bei einem Sandwichassay verwendet werden, um einen Immunokomplex aus Einfangreagenz/Analyt/Indikatorreagenz und Variationen davon zu bilden, wie z. B. ein indirekter Immunoassay mit der Bildung eines Komplexes aus Einfangreagenz/Analyt/Antianalytenantikörper/Indikatorreagenz. Somit kann ein Indikatorreagenz entweder für den Analyten in einem Sandwichassay, für das Einfangreagenz in einem Konkurrenzassay oder für ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das selbst spezifisch für den Analyten ist, in einem indirektem Assay, einen spezifisch bindenden Partner umfassen. Gleichermaßen kann ein Einfangreagenz entweder für den Analyten in einem Sandwichassay, für den Analyten und das Indikatorreagenz in einem Konkurrenzassay oder für ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das selbst spezifisch für den Analyten ist, in einem indirektem Assay, einen spezifisch bindenden Partner umfassen.
- Die vorliegende Erfindung kann auch ausschließlich zur Abtrennung einer Substanz aus einer Lösung verwendet werden. Z. B. können das Einfangreagenz und das Festphasenmaterial ohne den Indikator zum Zwecke der Abtrennung eines Analyten aus einer zu testenden Probe verwendet werden. Weiterhin kann das Einfangreagenz mit einer löslichen zweiten geladenen Substanz, die in bezug auf die geladene Substanz des Einfangreagenzes entgegengesetzt geladen ist, in Kontakt gebracht werden. Die zweite geladene Substanz wird vor dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Festphasenmaterial nicht auf dem Festphasenmaterial zurückgehalten, aber sie zieht das Einfangreagenz an und bindet sich an es, in der Weise, daß die resultierenden Assaykomplexe auf der Festphase zurückgehalten werden.
- Das Indikatorreagenz umfaßt eine an ein spezifisch bindendes Glied konjugierte Markierung. Das Indikatorreagenz erzeugt ein nachweisbares Signal mit einem Pegel, der in bezug zur Menge eines Analyten in der zu testenden Probe steht. Im allgemeinen wird das Indikatorreagenz nachgewiesen oder gemessen, nachdem es auf dem Festphasenmaterial eingefangen worden ist, aber das ungebundene Indikatorreagenz kann auch zur Bestimmung des Ergebnises eines Assays gemessen werden.
- Das spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes muß nicht nur entweder ein Antigen- oder ein Antikörperglied eines spezifisch bindenden Paares sein, sondern es kann auch ein Glied jedes spezifisch bindenden Paares sein, einschließlich entweder Biotin oder Avidin, eines Kohlenhydrats oder eines Lektins, einer komplementären Nukleotidsequenz, eines Effektor- oder Rezeptormoleküls, eines Enzymcofaktors oder eines Enzyms, eines Enzyminhibitors oder eines Enzyms. Ein immunoreaktives spezifisch bindendes Glied kann ein Antikörper, Antigen oder Antikörper/Antigen-Komplex sein, jeweils befähigt, sich entweder wie in einem Sandwichassay an einen Analyten oder wie in einem Konkurrenzassay an ein Einfangreagenz oder wie in einem indirekten Assay an ein spezifisch bindendes Hilfsglied zu binden. Bei Verwendung eines Antikörpers kann es ein monoklonaler Antikörper, polyklonaler Antikörper, Antikörperfragment, rekombinierter Antikörper, eine Mischung davon oder eine Mischung eines Antikörpers und anderer spezifisch bindender Glieder sein. Die Einzelheiten der Herstellung solcher Antikörper und ihre Eignung zur Verwendung als spezifisch bindende Glieder sind gut bekannt und werden hier nicht wiederholt.
- Die Markierung des Indikatorreagenzes ist befähigt, ein meßbares, durch externe Mittel nachweisbares Signal zu erzeugen. Die verschiedenen Markierungen können Chromogene, Katalysatoren, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, radioaktive Markierungen und direkt sichtbare Markierungen beinhalten. Die Auswahl einer bestimmten Markierung ist nicht entscheidend, aber sie wird befähigt sein, entweder selbst oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen ein Signal zu erzeugen.
- Durch Variierung entweder der Markierung oder des spezifisch bindenden Glieds kann eine Vielfalt verschiedener Indikatorreagenzien gebildet werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Indikatorreagenz einen monoklonalen Antikörper, der an eine Enzymmarkierung gebunden ist, z. B. an ein Fragment eines anti-karzinoembryonalen Antigenantikörpers- gebundene alkalische Phosphatase.
- Das Einfangreagenz der vorliegenden Erfindung hat zwei grundlegende Komponenten. Die erste Komponente ist ein spezifisch bindendes Glied, spezifisch entweder für den Analyten wie in einem Sandwichassay, für das Indikatorreagenz und den Änalyten wie in einem Konkurrenzassay oder für ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das selbst spezifisch für den Analyten ist, wie in einem indirekten Assay. Die zweite Komponente ist eine an die erste Komponente konjugierte geladene Substanz. Die Konjugation der Komponenten ist im Prinzip irreversibel und kann kovalente Mechanismen beinhalten.
- Die geladenen Substanzen können anionische und kationische Monomere oder Polymere beinhalten. Z. B. beinhalten anionische Polymere Polyglutaminsäure (PGS), anionisches Protein oder derivatisiertes Protein, wie z. B. Albumin, anionische Saccharide, wie z. B. Heparin oder Alginsäure, Polyasparaginsäure, Polyacrylsäure und Polyaminosäuren mit negativer Nettoladung bei einem geeigneten pH-Wert (wie z. B. ein pH-Wert zwischen 4 und 10). Weiterhin kann das spezifisch bindende Glied zur Erhöhung der mit dem Einfangreagenz assoziierten Nettoladung mit mehr als einem geladenen Monomer oder Polymer zusammengebracht werden.
- Das spezifisch bindende Glied des Einfangreagenzes kann jedes Molekül sein, das befähigt ist, sich spezifisch an ein anderes Molekül zu binden, genau wie bei spezifisch bindenden Gliedern des Indikatorreagenzes. Das spezifisch bindende Glied des Einfangreagenzes kann eine immunoreaktive Komponente, wie z. B. ein Antikörper, Antigen oder Antikörper/Antigen-Komplex, sein. Bei Verwendung eines Antikörpers, kann es ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Antikörperfragment, ein rekombinierter Antikörper, eine Mischung davon oder eine Mischung von Antikörper und anderen spezifisch bindenden Gliedern sein.
- Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch ein Festphasenmaterial. Das Festphasenmaterial kann nach seiner Eigenladung und seiner Fähigkeit, das Einfangreagenz anzuziehen, gewählt werden, z. B. methylierte Wolle, Nylonarten und Spezialglassorten mit positiver Ladung. Alternativ kann das Festphasenmaterial eine zusätzliche geladene Substanz zurückhalten, die in bezug auf die geladene Substanz des Einfangreagenzes entgegengesetzt geladen ist. Z. B. kann eine anionische Substanz an das Einfangreagenz gebunden und eine kationische Substanz auf dem Festphasenmaterial zurückgehalten werden, oder umgekehrt.
- Sobald Komplexbildung stattfindet, wird die Festphase als Abtrennungsmechanismus verwendet. Das homogene Reaktionsgemisch wird mit dem Festphasenmaterial in Kontakt gebracht, und der(die) neugebildete(n) Komplex(e) werden durch die Anziehung der entgegengesetzten Ladungen des Festphasenmaterials und des Einfangreagenzes auf dem Festphasenmaterial zurückgehalten.
- Eine Assayvorrichtung für die vorliegende Erfindung kann viele Konfigurationen haben, von denen mehrere von dem als Festphasenmaterial gewählten Material abhängig sind. Das Festphasenmaterial kann jedes geeignete poröse Material beinhalten. Mit "porös" ist gemeint, daß das Material von Flüssigkeiten durchflossen und leicht durchströmt werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung kann das Festphasenmaterial folgende Materialien beinhalten: Glasfaser, Cellulose oder ein Nylonkissen für die Verwendung in einer Gieß- und Durchfluß- Assayvorrichtung mit einer oder mehreren Schichten, die ein oder mehrere der Assayreagenzien enthalten; einen Eintauchstab für einen Eintauch- und Ablese-Assay; einen Teststreifen für chromatographische (z. B. Papier) oder dünnschicht chromatographische (z. B. Nitrocellulose) Methoden, bei denen ein oder alle Reagenzien in getrennten Zonen eines einzigen Streifens des Festphasenmaterials enthalten sind; oder anderes poröses Material, das einem Fachmann gut bekannt ist. Das Festphasenmaterial ist jedoch nicht auf poröse Materialien beschränkt. Das Festphasenmaterial kann auch 1/4-Zoll (0,64 cm) -Perlen, magnetische Perlen, Latexpartikeln, ein gläsernes Reagenzglas oder jedes andere Material umfassen, das eine Eigenladung hat oder eine geladene Substanz zurückhalten kann.
- Natürliche, synthetische oder in der Natur vorkommende Materialien, die synthetisch modifizierte sind, können als Festphasenmaterial verwendet werden, einschließlich Polysaccharide, z. B. Cellulosematerialien, wie z. B. Papier und Cellulosederivate, wie z. B. Celluloseacetat und Nitrocellulose; Siliciumdioxid; anorganische Materialien, wie z. B. deaktivierte Tonerde, Diatomeenerde, MgSO&sub4;, oder anderes feinverteiltes anorganisches Material, das in einer porösen Polymermatrix gleichmäßig dispergiert ist, wobei Polymere wie z. B. Vinylchlorid, Vinylchloridpropylen-Copolymerisat und Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymerisat in Frage kommen; Gewebe, sowohl in der Natur vorkommendes (z. B. Baumwolle) als auch synthetisches (z. B. Nylon); poröse Gele wie z. B. Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine; polymere Filme, wie z. B. Polyacrylamid; und dergleichen. Das Festphasenmaterial sollte eine ausreichende Festigkeit haben, oder die Festigkeit kann mittels einer Unterstützung gegeben werden, und es sollte bei der Erzeugung eines nachweisbaren Signals nicht stören.
- Bevorzugte Festphasenmaterialien beinhalten ein poroses Glasfasermaterial, wie z. B. ein "Whatman 934-AH "-Filterpapier mit einer nominalen Stärke von 0,33 mm oder die Vorrichtungen von Abbott Laboratories (Abbott Park, IL, 60064) zum einmaligen Gebrauch IMx -Keil und TestPack (Fasermatrix). Die Stärke solchen Materials ist nicht entscheidend und wird eine Sache der Wahl sein, die größtenteils auf den Eigenschaften der Probe, an der der Assay durchgeführt wird, oder des Analyten, an dem der Assay durchgeführt wird, basiert, wie z. B. auf der Fließfähigkeit der Probe.
- Zur Änderung oder Erhöhung der Eigenladung des Festphasenmaterials kann das Material direkt oder Mikropartikeln, die dann von einem Festphasen-Basismaterial zurückgehalten werden, mit einer geladenen Substanz beschichtet werden. Alternativ können auch Mikropartikeln allein als geladenes Festphasenmaterial verwendet werden. Eine mögliche geladene Substanz ist ein polymeres Kation, das vom Festphasenmaterial zurückgehalten wird, und das die entgegengesetzt geladene Spezies, die über das Einfangreagenz ein Teil des Assaykomplexes wird, anzieht und zurückhält.
- Es steht eine breite Vielfalt von Marken-Polykationen zur Verfügung, einschließlich GafQuat (GAF Corporation, Wayne, NJ, 07470), Diäthylaminoäthyl-Dextran (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) und wasserlösliche Cellulosederivate, wie z. B. Celquat L-200 und Celquat H-100 (National Starch & Chemical Corporation, Bridgewater, NJ, 08807).
- Obwohl es für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend ist, können Partikeln, z. B. "Perlen" oder "Mikropartikeln", auch mit der geladenen Substanz beschichtet werden. Diese Partikeln können als Festphase dienen, indem sie in einer Säule zurückgehalten oder in dem Gemisch aus löslichen Reagenzien und Probe schwebend zurückgehalten werden, oder die Partikeln selbst können von einem Festphasen-Basismaterial zurückgehalten und immobilisiert werden. Mit "zurückgehalten und immobilisiert" ist gemeint, daß die Partikeln, sobald sie sich auf dem Festphasenmaterial befinden, nicht mehr zu wesentlichen Bewegungen auf andere Positionen innerhalb des Materials befähigt sind. Die Partikeln können von einem Fachmann aus allen geeigneten Typen von Partikelmaterial geählt werden, das aus Polystyrol, Polymethylacrylat, Polypropylen, Latex, Polytetrafluoräthylen, Polyacrylnitril, Polycarbonat oder ähnlichen Materialien besteht. Die Größe der Partikeln ist nicht entscheidend, obwohl der durchschnittliche Partikeldurchmesser vorzugsweise kleiner sein sollte als die durchschnittliche Porengröße des verwendeten Festphasenbasismaterials.
- Der Begriff "spezifisch bindendes Hilfsglied" bezieht sich auf ein beliebiges Glied eines spezifisch bindenden Paares, das in, einem Assay oder Trennungsverfahren zusätzlich zu den spezifisch bindenden Gliedern des Einfangreagenzes und des Indikatorreagenzes verwendet wird. Wie in den Beispielen gezeigt wird, können in einem Assay ein oder mehrere spezifisch bindende Hilfsglieder verwendet werden.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen bevorzugte Wege zur Herstellung der neuartigen Materialien der vorliegenden Erfindung und zur Durchführung des Assayverfahrens mit diesen Materialien. Die Beispiele sind jedoch nur zur Veranschaulichung gedacht, und sollten nicht als Einschränkungen des Schutzumfangs der Erfindung ausgelegt werden, der ausschließlich durch die angefügten Ansprüche festgelegt wird.
- Die folgenden Schritte beschreiben die bei der Herstellung eines Antikörper/Polyglutaminsäure (PGS) -Konjugats, d. h. eines Einfangreagenzes aus Antikörper/anionischem Polymer, eingesetzte Chemie .
- Das Natriumsalz von PGS (ein Gramm; 7,14 x 10&supmin;&sup5; Mol; durchschnittliches Molekulargewicht 14.000; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) wurde durch die Methode von Tsukada, et al. (JNCI; 73; 721-729; 1984) in 3-(2-Pyridyldithio)-propionyl- PGS (PDP-PGS) umgewandelt, wobei das Verfahren wie folgt modifiziert wurde. Die PDP-PGS wurde vor der Thiopropyl- Sepharose-68-Isolierung nicht zum freien Sulfhydril reduziert.
- Stattdessen wurde die PDP-PGS in 0,1 M Na-Phosphat und 1 mM EDTA (pH 6,5) gelöst und mit Thiopropyl-Sepharose 68 (60 ml; 30 Gramm; Pharmacia Chemicals, Uppsala, Schweden) gerührt. Nach Dialyse und Lyophilisierung wurde eine 24%-Ausbeute des PDP-PGS- Konjugats gewonnen (0,244 g; 1,72 x 10&supmin;&sup5; Mol).
- Um sicherzustellen, daß das Disulfid während der anschließenden chemischen Verfahren erhalten blieb, wurde die Thiopyridyl-Gruppe gegen eine 5-Thio-2-Nitrobenzoat (TNB) -Schutzgruppe ausgetauscht. Einer in 0,1 M Natriumphosphat (4ml; pH 7) gelösten Lösung der PDP-PGS (20 mg; 1:42 x 106 Mol) wurde ein 100-Mol-Überschuß an 1,4-Dithiothreit (Molekulargewicht 154,2) zugegeben, und man ließ die Reaktion eine Stunde lang bei 40ºC laufen. Das Gemisch wurde mit 5 mM Natriumacetat, 0,14 M NaCl und 1 mM EDTA (pH 5,5) auf 10 ml verdünnt und in 2000-MWCO (Molekulargewicht-Cut-off)-Rohren gegen den Verdünnungspuffer dialysiert. Die Dialyse wurde gegen destilliertes Wasser fortgesetzt, mit anschließender Lyophilisierung. Die Ausbeute an Thiopropyl-PSA (HS-PGS) lag bei 13,5 mg. Die HS-PGS (13,5 mg) wurde in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7; 9,6 x 10&supmin;&sup7; Mol) gelöst und eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem 10-Mol-Überschuß an 5,5, Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) zur Reaktion gebracht. Dieses Gemisch wurde mit 0,1 M Natriumphosphat (pH 7) auf 10 Milliliter verdünnt und in 2000-MWCO-Rohren gegen den Verdünnungspuffer dialysiert. Die Dialyse wurde gegen destilliertes Wasser fortgesetzt, mit anschließender Lyophilisierung, wodurch 5-(2-Nitrobenzoe-Dithio)-Propionyl-PGS (TNB-PGS; 8,5 mg; 6,07 x 10&supmin;&sup7; Mol) produziert wurde.
- Um die Zahl der an jeden Einfangreagenz-Antikörper angebundenen anionischen Polymermoleküle nachzuweisen, wurde die TNB-geschützte PGS dann mit einem Äthylendiaminderivat von Fluorescein markiert. Die TNB-PGS wurde durch Lösung von TNB-PGS (8,5 mg) in trockenem N-N Dimethylformamid (2 ml), Behandlung mit einem 90-Mol-Überschuß an N-Methylmorpholin (Molekulargewicht 101,15), Absenkung der Temperatur auf 0ºC und Zugabe eines 90-Mol-Überschusses an Isobutylcloroformiat (Molekulargewicht 136,58) mit Äthylendiamin-derivatisiertem Fluorescein (EDA-Fl; Molekulargewicht 532) beladen. Diese Reaktion ließ man eine Stunde lang bei 0ºC laufen. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt, ein 30-Mol-Überschuß an EDA-Fl wurde zugegeben, und die Reaktion ließ man unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur laufen. Das Gemisch wurde mit 0,1 M Natriumphosphat (pH 7) auf: 10 Milliliter verdünnt und in 2000- MWCO-Rohren gegen den Verdünnungspuffer dialysiert. Die Dialyse wurde gegen destilliertes Wasser fortgesetzt, mit anschließender Lyophilisierung, wodurch TNB-PGS/EDA-Fl-Konjugat (7,8 mg; 5,6 x 10&supmin;&sup7; Mol) erhalten wurde.
- Die TNB-Gruppe wurde durch Lösung des TNB-PGS/EDA-Fl (7,8 ml) in 0,1 M Natriumphosphat (3 ml; pH 7) und einstündige Behandlung mit einem 10-Mol-Überschuß an 1,4-Dithiothreit bei 4000 entfernt. Die Reaktion wurde auf eine Verschiebung von einem 334 nm- zu einem 412 nm-Spitzenwert hin auf einem UV/VIS- Spektralphotometer überwacht. Das Material wurde mit destilliertem Wasser auf 10 Milliliter verdünnt und in 2000- MWCO-Rohren gegen destilliertes Wasser dialysiert. Bei Lyophilisierung wurde Thioprcpyl-PGS/EDA-Fl (HS-PGS/EDA-Fl; 8,4 mg) erhalten. An diesem Punkt wurde zur Bestimmung der Zahl der Fluoresceine pro PGS-Molekül (d. h. der Beladung) eine UV/VIS- Untersuchung vorgenommen. Für dieses Präparat wurde ein Wert von 0,81 Fluoresceine pro PGS errechnet.
- Der monoklonale Antikörper, ein Anti-GEA-Antikörper, wurde nach der Methode von Tuskada, et al. (JNCI: 73; 721-729, 1984), mit den folgenden Abweichungen, Maleinimid-aktiviert. Die Antikörperkonzentration lag bei 1 mg/ml, und es wurde ein 150- Mol-Überschuß an N-Succinimidyl-m-(N-maleinimido)benzoat (SMBE, Molekulargewicht 314,3; Sigma) verwendet. Es wurde experimentell bestimmt, daß zur Einbringung. von drei bis fünf Maleinimid- Gruppen an den Anti-CEA-Antikörper ein 150-Mol-Überschuß notwendig war. Die Reinigung wurde unter Verwendung der Zentifugenmethode von Maeres, et al. (Analytical Biochemistry: 1142; 68-78, 1984) mit Sephadex G-50/80 (Sigma) in 3- Milliliter-Spritzensäulen durchgeführt. Die Zahl von Maleinimiden pro Antikörper wurde unter Verwendung der Titrationsmethode von Liu, et al. (Biochemistry: 18; 690-696, 1979) bestimmt. Es wurde festgestellt, daß während dieser Antikörperaktivierung 4,6 Maleinimide pro Antikörper eingebracht worden waren.
- Die Thiopropyl-geschützte, mit Fluorescein markierte PGS aus Beispiel A.1.a. wurde dann mit dem Maleinimid-abgeleiteten Antikörper zur Reaktion gebracht, um das für einen Karzinoembryonal-Antigen-Ioneneinfang-Immunoassay geeignete Antikörper/PGS-Konjugat zu ergeben. Der Maleinimid-aktivierte Antikörper (1,0 mg; 6,25 x 10&supmin;&sup9; Mol) in 0,1 M Natriumphosphat (1 bis 2 ml; pH 7) wurde mit 1 N HCL auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Dann wurde dem aktivierten Antikörperpräparat ein 10-Mol-Überschuß an HS-PGS/EDA-Fl (ca. 1 mg) in 0,1 M Natriumphosphat (100 µl) zugegeben. Die Konjugation ließ man über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren laufen. Das Gemisch wurde auf 10 Milliliter in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7) verdünnt und in 50.000-MWCO-Rohren gegen 0,001 M Na-Phosphat (pH 7) dialysiert, mit anschließender Lyophilisierung. Das trockene Material wurde wieder in destilliertem Wasser (0,25 ml) gelöst, und durch Hochleistungsflüssigchromatographie fraktioniert, um den größten Peak bei A280 zu erhalten. Die Chromatographie wurde unter Verwendung einer 300 mm x 7,5 mm Bio-Sil TSK250 Säule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) durchgeführt, mit Eluierung bei 1 Milliliter/Minute mit 50 mM Natriumsulfat, 20 mM Natriumphosphat und 0,3 M NaCl (pH 6,8).
- Der größte Peak wurde einem Assay zur Bestimmung des Proteingehalts unterzogen, wobei ein Bio-Rad Bradford-Assay mit einem Rinder-IgG-Standard verwendet wurde. Der Peak enthielt 95,5 µg/ml Protein, was 5,97 x 10&supmin;&sup7; molarem Protein (IgG- Molekulargewicht 160.000) entspricht. Durch Untersuchung des UV/VIS und Messung der Extinktion bei 494 nm wurde wurde festgestellt, daß diese Fraktion auch 2,12 x 10&supmin;&sup6; molares Fluorescein enthielt. Die Gleichung des molaren Fluoresceins ergab 3,6 Fluoresceine pro Antikörpermolekül. Da bekannt war, daß 0,81 Fluoresceine pro PGS-Molekül vorlagen, entsprach dies 4,4 PGS-Molekülen, die an jeden Antikörper konjugiert waren. Die Peakfraktion wurde eingefroren und nachfolgend in dem Assay verwendet.
- Ein wichtiger Gesichtspunkt der oben beschriebenen chemischen Verfahren ist, daß es zwischen jedem polymeren Anion und dem Antikörper nur eine einzige Stelle der Anbindung gibt. Die einzelne kovalente Bindung zwischen den beiden umgeht die potentielle intermolekulare und intramolekulare Kreuzvernetzung, die bei Einsatz eines mehrere aktivierte Gruppen tragenden polymeren Anions vorkommen könnte.
- Als eine Alternative zu obigem Einfangreagenz-Beispiel könnte auch ein kationischer abgeleiteter Antikörper zur Verwendung in Verbindung mit einem anionischen Festphasenmaterial gebildet werden.
- Die Festphasen-Fasermatrix eines IMx -Keils zum Einmalgebrauch wurde mit einer polymeren Quaternärverbindung beschichtet, um dem Festphasenmaterial eine positive Ladung zu verleihen. Es wurde Celquat L-200, ein wasserlösliches Cellulosederivat, verwendet. Eine 1%ige wässrige Lösung von celquattm L-200 (50 µl) wurde auf das Festphasenmaterial aufgetragen, mit einer anschließenden Waschung mit einem Verdünnungsmittel, das 300 mM NaCl, 50 mM Tris und 0,1% NaN&sub3; (75 µl; pH 7,5) enthielt.
- Das Indikatorreagenz bestand aus einem Konjugat von alkalischer Phosphatase und Anti-CEA-Antikörper-Fragment, das sich an ein anderes Epitop bindet als den im Einfangreagenz in Beispiel 1.b. (siehe oben) spezifizierten Antikörper. Das mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-CEA-Antikörper-Fragment befand sich in einem Puffer, der 50 mM Tris, 50 ZnM NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 5 mM Natriumtartrat, 0,5% Kalbshautgelatine und 3% Mausserum enthielt.
- Das Ioneneinfang-Immunoassayprotokoll beinhatete die Verwendung von wie in Beispiel A.2 beschrieben hergestelltem Festphasenmaterial. Das Indikatorreagenz aus Beispiel A.3 (70 µl) wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben. Dann wurde wie in Beispiel A.1 hergestelltes gepuffertes Einfangreagenz (20 µl Anti-CEA/PGS- Konjugats in einem Puffer aus 50 mM Na&sub2;SO&sub4;, 20 mM Natriumphosphat und 300 mM NaCl mit einem pH-Wert von 6,8) dem Gefäß zugegeben. Eine 35-µl-Probe, die CEA enthielt, wurde dem Gefäß zugegeben, und das homogene Immunoreaktions-Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 34,500 inkubiert. Der Assay wurde mit vier verschiedenen Spezimen ausgeführt, von denen jedes ein CEA-Kalibrator aus dem OEA-Enzymimmunoassaykit von Abbott Laboratories war. Dann wurde ein aliquoter Anteil jedes Reaktionsgemisches (100 µl) auf das quat-behandelte Festphäsenmaterial aufgetragen, mit anschließend drei 75 µl-Waschungen mit Verdünnungsmittel Schließlich wurde ein Enzymsubstrat (70 µl, 1,2 mM 4-Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100 mM AMP, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 4 mM Tetramisol mit einem von pH-Wert 10,3) bei 34,5ºC zum Reagieren mit dem Indikatorreagenz zugegeben, und die resultierende Fluoreszenzrate wurde gemessen. Tabelle 1 zeigt die Dosis- Wirkungs-Ergebnisse des Assays. TABELLE 1 CEA-Ioneneinfang-Sandwichassay Einfangreagenz: PGS/Anti-CEA-Antikörper-Konjugat Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markiertes Anti- CEA-Antikörper-Fragment
- Teil B veranschaulicht einen Komplex und eine erfindungsgemäße Methode seiner Bildung.
- Ein Protein-A-Affinität-gereinigtes monoklonales Maus- Immunglobulin G wurde unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimid-Reagenzes (1-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid; EDCI) gemäß den folgenden Verfahren an eine negativ geladene PGS gekoppelt.
- Mit Fluorescein markierte PGS (10 mg; Fl-PGS) wurde einer eiskalten Lösung des Antikörpers (4,8 mg/ml) in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (75 mM KH&sub2;PO&sub4; und 300 mM NaCl mit pH 7,2) zugegeben. Dieser Lösung wurde eine frisch hergestellte eiskalte Lösung von EDCI (100 µl, 10 mg/ml) zugegeben, und das resultierende Reaktionsgemisch ließ man sich bei ständigem Rühren 2,5 Stunden lang auf Raumtemperatur erwärmen. Eine weitere frisch hergestellte eiskalte Lösung von EDCI (50 µl, 100 mg/ml) wurde dann unter schnellem Rühren dem Reaktionsgemisch zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 1,5 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Gemisch durch Gelchromatographie in einer mit einer Spherogel TSK-G Schutzsäule (2,15 cm x 7,5 cm; Beckmann Instruments, Inc., Fullerton, CA, 92634) versehenen Spherogel TSK-3000SWG Säule (2,15 cm x 30 cm) fraktioniert. Die Säule wurde mit mit Phosphat gepufferter Salzlösung bei einer Durchflußmenge von fünf Millilitern/Minute eluiert. Das PGS/Antikörper-Verhältnis dieses Pools wurde durch Quantifizierung der Fluoreszenz in den Fl-PGS-Konjugaten des Antikörpers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2 PGS/Anti-CEA-Antikörper-Konjugate, hergestellt unter Verwendung von EDCI
- Das Festphasenmaterial wurde mit einer polymeren quaternären Ammonium-Verbindung (Gafquat 755N; GAF Corporation) beschichtet. Eine wässerige Lösung von 0,5% Gafquat (50 µl) wurde auf die Oberfläche des Materials aufgetragen, mit einer anschließenden Wasserwaschung (75 µl).
- Das Indikatorreagenz, ein Alkaliphosphatase-Konjugat mit Schafs-Anti-Maus-Immunglobulin (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.; West Grove, PA, 19390) wurde in mit Tris gepufferter Salzlösung, die 1% Fischgelatine [25 mM Tris (Hydroxymethyl)-aminomethan und 100 mM NaCl, pH 7,5] enthielt, verdünnt. Das Einfangreagenz, PGS/Maus-Monoklonalantikörper- Konjugat (Pool 1 aus Beispiel B.1), wurde auf ähnliche Weise behandelt. Zweihundert Mikroliter jedes Reagenzes wurde in eine Reihe von Reagenzgläsern gegeben, die dann 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert wurden. Ein aliquoter Anteil des Reaktionsgemisches (75 µl) wurde auf die quat-behandelten Materialien aufgetragen (aus Beispiel B.2), unmittelbar gefolgt von drei 150-µl-Waschungen mit Tris-gepufferter Salzlösung. Schließlich wurde den Materialien bei 32,7ºC ein Enzymsubstrat (70 ul von 1,2 mM 4-Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100 mM AMP, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 4 mm Tetramisol; pH 10,3) zugegeben und die resultierende Fluoreszenzrate gemessen.
- Die Ergebnisse des Experiments sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefaßt. TABELLE 3 Dosis-Abhängigkeit der Einfangreagenz/Indikatorreagenz-Bindung
- * Die Anfangskonzentrationen des mit PGS gekoppelten Antikörpers vor der Mischung mit einem 1.000fach verdünnten mit alkalischer Phosphatase markierten Schafs-Anti-Maus- Immunglobulin. TABELLE 4 Dosis-Abhängigkeit der Indikatorreagenz/Einfangreagenz*-Bindung
- *Die Anfangskonzentration von mit PGS gekoppeltem Antikörper vor der Mischung mit mit alkalischer Phosphatase markiertem Schafs-Anti-Maus-Immunglobulin lag bei 5 µg/ml.
- **Der Indikatorreagenztiter ist der Kehrwert der Verdünnung des Reagenzvorrats.
- Das Einfangreagenz und das Indikatorreagenz wurden wie in Beispiel B.3 beschrieben hergestellt. Alle Reagenzien wurden in mit Tris gepufferter, 1% Fischgelatine enthaltender Salzlösung verdünnt. Das Indikatorreagenz wurde aus der Vorratslösung heraus 1.000fach verdünnt, und das Einfangreagenz wurde auf zehn µg/ml verdünnt. In einer Reihe von Reagenzgläsern wurden jeweils 150 µl des geeignet verdünnten Indikatorreagenzes, Einfangreagenzes und Maus-Monoklonalantikörpers gemischt. Die Gemische wurden 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Aliquote Anteile der Gemische (75 µl) wurden auf die quat-behandelten Materialien (aus Beispiel B.2) aufgetragen, unmittelbar gefolgt von drei 150-µl-Waschungen mit mit Tris gepufferter Salzlösung. Ein Enzymsubstrat (70 µl von 1,2 mM 4-Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100 mM AMP, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 4 mM Tetramisol; pH 10,3) wurde dann dem Festphasenmaterial bei 32,7ºC zugegeben und die resultierende Fluoreszenzrate gemessen. Die Ergebnisse dieses Beispiels, die einen konkurrierenden Inhibitionsassay für Maus-IgG veranschaulichen, sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5 Inhibition von Indikatorreagenzbindung aufgrund von Maus Monoklonalantikörper Einfangreagenz: PGS/Maus-Monoklonal-IgG-Konjugat Indikatorreagenz: Alkalische-Phosphatase-Schafs-Anti-Maus- Immnunglobulin-Konjugat
- Ein Albuminderivat mit hoher negativer Ladung wurde hergestellt und an Anti-HCG-Antikörper gekoppelt, um gemäß den folgenden Verfahren das Einfangreagenz zu bilden.
- Hasenserumalbumin (RSA, "rabbit serum albumin") wurde in hohem Maße succinyliert und mittels des Verfahrens von Jou, et al., (Methods in Enzymology: Vol 92, Part E; 257-276, Academic Press, 1983) mit Para-Azobenzolsulfonat gekoppelt. Zwei Prozent RSA in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (14 ml, pH 8) wurde mit 5% Succinyloxid in Paradioxan (2,28 ml) gemischt. Der pH wurde durch Zugabe von 1 N NaOH auf einem Wert von 8 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Hydroxylaminhydrochlorid wurde zugegeben (0,6 g) und der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe einer entsprechenden Menge an 5 N NaOH auf 9,5 eingestellt. Dann wurde das Gemisch gegen Wasser dialysiert. Die resultierende SUC&sub6;&sub5;-RSA wurde gemäß den folgenden Reaktionen an Para-Azobenzolsulfonat gekoppelt.
- Eine Suspension von Para-Azobenzolsulfonsäure (0,15 mmol, 26 mg) in 1 N HCL (0,8 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt und mit 1 N NaNO&sub2; (0,2 ml) 30 Minuten lang unter schnellem Rühren behandelt. Die resultierende Diazoniumsalzlösung wurde unter schnellem Rühren tropfenweise der eisgekühlten SUC&sub6;&sub5;-RSA-Lösung zugegeben. Der pH des Reaktionsgemisches wurde durch Zugabe von 1 N NaOH auf einem Wert von 11 gehalten. Das dunkelrote Reaktionsgemisch wurde gerührt, und man ließ es sich eine Stunde lang auf Raumtemperatur erwärmen, bevor es in hohem Maße gegen Wasser dialysiert wurde. Das resultierende Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA anionisch-abgeleitete Protein wurde bis zum späteren Gebrauch gekühlt aufbewahrt.
- Anti-HCG-F(ab')&sub2;-Fragmente wurden gemäß der Methode von Nisonoff, et al. (Arch. Biochem. Biophy.: 89; 230-2444, 1960) aus affinitätsgereinigten Ziegen-Anti-HCG-Antikörpern hergestellt. Ein Anteil der affinitätsgereinigten Antikörper- Lösung in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,2) wurde durch Zugabe von Essigsäure auf einen pH-Wert von 4 angesäuert. Die bevorzugte Antikörperkonzentration an diesem Punkt lag bei 1 mg/ml. Zur Erreichung einer endgültigen Konzentration von 20 µg/ml wurde Pepsin zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 6 N NaOH abgebrochen, wodurch das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 7,5, gebracht wurde. Die Lösung der digerierten Antikörperfragmenten wurde auf 20mg/ml konzentriert. Die F(ab')&sub2; -Fragmente wurden durch Hochleistungs- Gelfiltrationsflüssigchromatographie unter Verwendung einer mit einer Spherogel TSK-G Schutzsäule (2,15 cm x 7,5 cm) versehenen Spherogel TSK-3000SWG Säule (2,15 cm x 30 cm) gereinigt.
- Anti-HCG-Fab'-Fragmente wurden hergestellt und gemäß einer Modifikation der Methoden von Parham, et al., (J. Immunol. Method.:53:133-173, 1982). und Brennan, et al., (Science: 229: 81-83, 1985) in eine Thiol-reaktive Form derivatisiert. Unter Rühren wurde eine Lösung (158 µl) von 0,1 M NaAsO&sub2;, die 20 mM EDTA enthielt, 1,28 ml Ziegen-F(ab')&sub2; (Ziegen-Antihuman-Chorion- Gonadotropin-Antikörper-Fragment, 16 mg/ml), das Spuren von ¹²&sup5;I- F(ab')&sub2; in PBS enthielt, zugegeben. Die reduktive Spaltreaktion wurde durch Zugabe von 0,1 M Cystein-HCL (158 µl) gestartet. Das Reaktionsgemisch wurde in Stickstoffatmosphäre gebracht und unter Rühren eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 19 mg 5,5-Dithiobis-(2- Nitrobenzoesäure) gelöscht. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Gemisch in einer mit PBS vorequilibrierten PD-10 Säule (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) chromatographiert, und dann in einer Hochleistungs- Ausschlußflüssigchromatographie-Säule [Spherogel TSK-2000SWG Säule (2,15 cm x 30 cm), versehen mit ein er Spherogel TSK-G Schutzsäule (2,15 cm x 7,5 cm)], chromatographiert. Das gereinigte Thionitrobenzoat-Derivat von Fab' (TNB-Fab') wurde unter Verwendung einer CX-10-Ultrafiltrationseinheit (Millipore Corp., Bedford, MA) auf 7,9 mg/ml konzentriert.
- Eine Lösung von 1 M Dithiothreitol (DTT; 86 µl) wurde einer Lösung (4;2 ml) zugegeben, die Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA (2,2 mg/ml) in 37,5 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl und 2 mM EDTA (pH 6,8) enthielt. Das Gemisch wurde drei Stunden lang bei 37º0 und dann über. Nacht beb Raumtemperatur inkubiert. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde in einer mit Sephadextm G-25 (Pharmacia Inc.) gefüllten und mit 75 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl und 2 mM EDTA (pH 6,8) vorequilibrierten Säule von 2,5 cm x 20 cm chromatographiert. Ein 2-Milliliter-Anteil der gepoolten Fraktionen der reduzierten Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA (0,48 mg/ml) wurde mit Anti-HCG-TNB-Fab' (0,15 ml; 7,9 mg/ml) gemischt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 100 mM Iodessigsäure (107 µl) behandelt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Fab'-Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA-Konjugat wurde mittels Hochleistungs Ausschlußflüssigchromatographie unter Verwendung einer mit einer Sperogel TSK-G Schutzsäule (2,15 cm x 7,5 cm) versehenen Sperogel TSK-3000SWG Säule (2,15 cm x 30 cm) gereinigt.
- Eine Lösung (27 µl) von 30 mM succinimidyl 4-(Nmaleinimid-methyl)-cyclohexan-1-carboxylat in N,N- Diamethylformamid wurde 2,25 ml von affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-HCG-Antikörper (3 mg/ml) in PBS zugegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und dann in einer mit 75 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl und 2 mM EDTA (pH 6,8) vorequilibrierten PD-10T Säule chromatographiert. Ein 1,8-ml- Anteil der vereinigten Fraktionen von modifizierten Antikörpern (1,6 mg/ml) wurde mit 3 Millilitern der DTT-reduzierten Sp- SUC&sub6;&sub5;-RSA (0,48 mg/ml) aus Beispiel C.1.d. gemischt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 mM Iodessigsäure (0,25 ml) und einstündiges Rühren bei Raumtemperatur gel:scht. Das Antikörper-Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA-Konjugat wurde durch Hochleistungs-Ausschlußflüssigchromatographie auf die gleiche Weise wie in Beispiel C.1.d beschrieben gereinigt.
- Das Indikatorreagenz bestand aus einem Alkalische- Phosphatase-Ziegen-Anti-HCG-Antikörper-Konjugat in einem Assaypuffer mit 25 mM Tris (Hydroxymethyl) -Aminomethan, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 0,07% NaN&sub3; und 1% Fischgelatine mit einem pH-Wert von 7,5.
- Das Ioneneinfang-Immunoassayprotokoll beinhaltete die Verwendung eines wie in Beispiel B.2 hergestellten Festphasenmaterials, eines wie in Beispiel C.2 beschriebenen Indikatorreagenzes (Alkalische-Phosphatase-Ziegen-Anti-HCG- Antikörper-Konjugat), eines von zwei unterschiedlichen, wie in Beispiel C.1.d. bzw. e. beschriebenen Einfangreagenzien (Ziegen- Anti-HCG-Fab'-Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA und Ziegen-Anti-HCG-IgG-Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA) und einer gereinigten HCG-Standardlösung. Alle Reagenzien wurden im Assaypuffer geeignet verdünnt. Gleiche Volumina (750 µl) des Indikatorreagenzes und der HCG-Probenlösung wurden in eine Reihe von Reagenzgläsern gegeben. Nach einer 30minütigen Inkubation bei 37ºC wurde ein aliquoter Anteil (125 µl) jedes inkubierten Gemisches in einem eigenen Reagenzglas mit einem gleichen Volumen eines Einfangreagenzes gemischt. Die resultierenden Gemische wurden 30 Minuten lang inkubiert. Das Assaygemisch (75 µl) wurde dann jedem Festphasenmaterial zugegeben. Die Festphasenmaterialien wurden dann dreimal mit 150-µl-Mengen von Wäschpuffer [25 mM Tris (Hydroxymethyl)-aminomethan, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl&sub2; , 0,1 mM ZnCl&sub2; und 0,07% NaN&sub3; bei einem pH-Wert von 7,5] gewaschen. Ein Enzymsubstrat (70 µl von 1,2 mM 4- Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100 mM AMP, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 4 mM Tetramisol bei einem pH-Wert von 10,3) wurde dann den Festphasenmaterialien zugegeben. Die resultierende Fluoreszenzrate wurde bei 32,7ºC gemessen. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. TABELLE 6 HCG-Ioneneinfang-Sandwichassay zum Vergleichen verschiedener Einfangreagenzien Indikatorreagenz: HCG-spezifische Ziegen-IgG-Alkalische- Phosphatase
- Der indirekte Ioneneinfang-Immunoassay beinhaltete die Verwendung eines wie in Beispiel B.2 hergestellten Festphasenmaterials, eines Indikatorreagenzes von Alkalische- Phosphatase-Schafs-Anti-Maus-IgG-Konjugat (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.), eines wie in Beispiel C.1.e. hergestellten Einfangreagenzes von Ziegen-Anti-HCG-F (ab')&sub2;-Sp- SUC&sub6;&sub5;-RSA, eines spezifisch bindendes Hilfsglieds von Maus- Monoklonal-Anti-HCG-Antikörpern (Immunosearch; Thomas River, NJ, 08753) und einer gereinigten HCG-Standardlösung. Das spezifisch bindende Hilfsglied wurde zur Bindung mit dem Analyten und dem Indikatorreagenz verwendet. Alle Reagenzien wurden im Assaypuffer geeignet verdünnt. Gleiche Volumina (150 µl) des Indikatorreagenzes, der HCG-Probenlösung und des spezifisch bindenden Hilfsglieds wurden in eine Reihe von Reagenzgläsern gegeben. Nach fünfminütiger Inkubation bei 37ºC wurde jedem Reagenzglas ein 150 µl-Anteil des Einfangreagenzes zugegeben. Die resultierenden Gemische wurden fünf Minuten lang inkubiert. Dann wurde jedem hergestellten Festphasenmaterial das Assaygemisch (200 µl) zugegeben. Dann wurden die Festphasenmaterialien mit Waschpuffer gewaschen und auf die gleiche Weise wie in Beispiel C.3 (siehe oben) beschrieben mit Enzymsubstratlösung behandelt. Die resultierende Fluoreszenzrate wurde bei 32,7ºC gemessen. Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. TABELLE 7 Ioneneinfang-Indirekt-Sandwichassay zum Nachweis von HCG Einfangreagenz: Ziegen-Anti-HCG-F(ab')&sub2;-Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA Indikatorreagenz: Schafs-Anti-Maus-IgG-Alkalische-Phosphatase Spezifisch bindendes Hilfsglied: Maus-Monoklonal-Anti-HCG- Antikörper
- Das Ioneneinfang-Immunoassayprotokoll beinhaltete die Verwendung eines wie in Beispiel B.2 hergestellten Festphasenmaterials, eines Indikatorreagenzes von Alkalische- Phosphatase-Schafs-Anti-Maus-IgG-Konjugat, (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.), eines spezifisch bindenden Hilfsglieds von Maus-Monoklonal-Anti-HCG-Antikörpern (Immunosearch; Thomas River, NJ, 08753) und einer gereinigten HCG-Standardlosung. Zusätzlich verwendete das Protokoll ein zweites spezifisch bindendes Hilfsglied von Affinitätgereinigten Ziegen-Anti-HCG-Antikörpern und ein Einfangreagenz von Hasen-Anti-Ziegen-IgG-Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA. Das Einfangreagenz wurde durch Koppeln von Affinität-gereingten Hasen-Anti-Ziegen-IgG (Cappel; Cochranville, PA, 19330) gemäß dem in Beispiel C.1.e. (siehe oben) beschriebenen:Verfahren an Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA hergestellt. Alle Reagenzien wurden im Assaypuffer geeignet verdünnt. Gleiche Volumen (100 µl) des Indikatorreagenzes, der HCG-Probenlösung und des ersten spezifisch bindenden Hilfsglieds wurden in eine Reihe von Reagenzgläsern gegeben. Nach der Inkubation (zehn Minuten bei 37ºC) wurde das zweite spezifisch bindende Hilfsglied (100 µl) zugegeben und die Inkubation fortgesetzt (zusätzliche fünf Minuten bei 37ºC). Schließlich wurde jedem Reagenzglas Einfangreagenz zugegeben. Die resultierenden Gemische wurden fünf Minuten lang inkubiert. Das Assaygemisch (200 µl) wurde dann jedem hergestellten Festphasenmaterial zugegeben. Dann wurden die Festphasenmaterialien mit Waschpuffer gewaschen, mit Enzymsubstratlösung behandelt und die Fluoreszenzrate auf die gleiche Weise wie in Beispiel C.4 (siehe oben) beschrieben gemessen. Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. TABELLE 8 Ioneneinfang-Doppelt-Indirekt-Sandwichassay zum Nachweise von HCG Einfangreagenz: Hasen-Anti-Ziegen-IgG-Sp-SUC&sub6;&sub5;-RSA Indikatorreagenz: Schafs-Anti-Maus-IgG-Alkalische-Phosphatase Spezifisch bindendes Hilfsglied: Maus-Monoklonal-Anti-HCG- Antikörper Spezifisch bindendes Hilfsglied: Ziegen-Anti-HCG-Antikörper
- Die folgenden Schritte beschreiben die bei der Herstellung eines Antikörper/Polyglutaminsäure-Konjugats eingesetzte Chemie.
- Das Natriumsalz von PGS (200 mg; 1,47 x 10&supmin;&sup5; Mol; durchschnittliches Molekulargewicht 13.600; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) wurde mit einem Kationenaustausch-Harz (AG50W-X8; 13 Gramm; Bio-Rad, Richmond, CA) in 60 Millilitern Wasser drei Stunden lang gerührt. Die obenschwimmende Flüssigkeit wurde dekantiert, gefiltert und verdampft, wobei eine 80%-Ausbeute der Freie-Säure-Form von PGS als ein weißes Pulver (137 mg; durchschnittliches Molekulargewicht 11.620) erzielt wurde.
- Einer Lösung der Freie-Säure-Form von PGS (65 mg; 5,6 x 10&supmin;&sup6; Mol) in Dimethylformamid (DMF; 2 ml) wurde Triethylamin (100 µl; 7,2 x 10&supmin;&sup4; Mol) und 1,3-Phenyldiisothiocyanat (110 mg; 5,7 x 10-4 Mol; Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur, wurde Essigsäure (100 ul; 1,7 x 10&supmin;³ Mol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch dann verdampft. Methylenchlorid (25 ml) wurde dem Rückstand zugegeben und das Gemisch nach zweistündigem Rühren gefiltert, um die ITC- PGS als weißes Pulver (101 mg) zu ergeben.
- Die ITC-PGS (295 µg; 2,5 x 10&supmin;&sup8; Mol; in 40 µl von 20% DMF/0,1 M Natriumphosphat bei pH 7,0) wurde einer gepufferten Lösung von Ziegen-Anti-Maus-IgG (200 µg; 1,25 x 10&supmin;&sup9; Mol; Sigma Chemical Company; in 40 µl von 0,1 M Natriumphosphat bei pH 7) zugegeben, wobei das mit PGS markierte Ziegen-Anti-Maus- Einfangreagenz gebildet wurde. Nach zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde 0,1 M Tris (20µl; pH 7,4) zugegeben und das resultierende Gemisch bei 2 bis 8ºC bis zum späteren Gebrauch aufbewahrt.
- Der Anti-Progesteron-Antikörper-Ioneneinfang-Immunoassay beinhaltete die Verwendung von mit einer polymeren quaternären Verbindung (Beschreibung siehe Beispiel A.2.) beschichteten Festphasenmaterialien. Eine 60-µl-Probe wurde einem Reaktionsgefäß zugegeben. Die Proben bestanden aus einem m6noklonalen Anti-Progesteron-Antikörper in Konzentrationen von 0, 5, 50, 100, 250 und 500 ng/ml in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (50 mM Natriumphosphat, 99 mM NaCl, 0,1% NaN&sub3;, bei pH 7,4). Als nächstes wurden dem Reaktionsgefäß 20 µl mit Phosphat gepufferter Salzlösung zugegeben, gefolgt von 20 µl des gepufferten Indikatorreagenzes, mit alkalischer Phosphatase markierten Progesterons (3 µg/ml in einem Trispuffer von 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NaN&sub3;, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; und 1% BSA). Nach zehnminütiger Inkubation des Gemisches bei 34,5ºC wurde das Einfangreagenz zugegeben (20 µl; mit PGS markierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper in einer 1/100-Verdünnung in mit Phosphat gepufferter Salzlösung aus der in Beispiel D.1. beschriebenen Vorratslösung). Das Gemisch wurde dann zusätzliche zehn Minuten bei 34,5ºC inkubiert. Ein 100 µl aliquoter Anteil des Gemisches wurde dann auf das Festphasenmaterial aufgetragen, gefolgt von drei 75 µl-Waschungen mit Verdünnungsmittel Letztlich wurde der Festphase die Enzymsubstratlösung (70 µl; 1,2 mM 4-Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100 mM AMP, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 4 mM Tetramisol mit pH 10,3) zugegeben und die resultierende Fluoreszenzrate gemessen. Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 9 dargestellt. TABELLE 9 Ioneneinfangassay zum Nachweis von Maus-Monoklonal- Antiprogesteron-Antikörper Einfangreagenz: mit PGS markierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markiertes Progesteron
- Das Festphasenmaterial wurde wie in Beispiel A.2 beschrieben hergestellt. Eine 60-µl-Probe mit verschiedenen Konzentrationen von Progesteron in mit Phosphat gepufferter Salzlösung wurde mit 20 µl von mit Progesteron markiertem Alkalische-Phosphatase-Indikatorreagenz (0,4 µg/ml in dem Trispuffer aus Beispiel D.2) und 20 µl von Maus-Anti- Progesteron-Antikörper als ein spezifisch bindendes Hilfsglied (0,3 µg/ml in mit Phosphat gepufferter Salzlösung) gemischt. Nach zehnminütiger Inkubation des Gemisches bei 34,5ºC wurden 20 µl des mit PGS markierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörper- Einfangreagenzes wie in Beispiel D.2 (siehe oben) beschrieben zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde zusätzliche zehn Minuten bei 34,5ºC inkubiert. Ein 100 µl aliquoter Anteil des Gemisches wurde dann auf das Festphasenmaterial aufgetragen, gefolgt von drei Waschung mit Verdünnungsmittel Letztlich wurden der Festphase 70 µl der Enzymsubstratlösung (wie in Beispiel D.2) zugegeben und die resultierende Fluoreszenzrate gemessen. Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 10 dargestellt. TABELLE 10 Ioneneinfang-Indirekter-Konkurrierender-Assay zum Nachweis von Progesteron Einfangreagenz: mit PGS markierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markiertes Progesteron Spezifisch bindendes Hilfsglied: Maus-Anti-Progesteron- Antikörper Progesteron (ng/ml) Fluoreszenzrate (Zählimpulse/sek./sek.)
- Die Konzepte der vorliegenden Erfindung sind auf verschiedene Typen von Bindungsassays anwendbar. Es wird jedoch anzuerkennen sein, daß ein Fachmann viele andere Typen von Assays erdenken kann, darunter Assays für andere Analyten als Antigene oder Antikörper, auf die die vorliegenden erfinderischen Konzepte angewendet werden können. Die beschriebenen Ausführungsformen und die dargestellten alternativen Ausführungsformen stellen eher Beispiele als Einschränkungen dar. Somit ist die Beschreibung der Erfindung nicht als Einschränkung der Erfindung auf die besonderen offenbarten Ausführungsformen gedacht, sondern soll alle Äquivalente und Gegenstände wie oben beschrieben und in den folgenden Ansprüchen definiert umfassen.
Claims (16)
1. Verfahren zum Abtrennen eines Analyten aus einer
flüssigen Probe, das folgendes umfaßt:
a) das Bereitstellen
(1) eines löslichen Einfangreagenzes, das ein spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine erste geladene Substanz
konjugiert ist, wobei das spezifisch bindende Glied den Analyten
direkt oder den Analyten indirekt mittels eines spezifisch
bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten spezifisch
ist, und
(2) eines unlöslichen Festphasenmaterials, das eine zweite
geladene Substanz umfaßt, die in Bezug auf die erste geladene
Substanz entgegengesetzt geladen ist;
b) das In-Kontakt-Bringen der flüssigen Probe mit dem
Einfangreagenz, wobei das Einfangreagenz an den Analyten in der
Probe gebunden wird, wodurch sich ein Einfangreagenz/Analyt-
Komplex ausbildet, und
c) das Abtrennen des Einfangreagenz/Analyt-Komplexes aus der
Probe, indem die Probe mit dem Festphasenmaterial in Kontakt
gebracht wird, wodurch das Festphasenmaterial die erste geladene
Substanz anzieht und sich an diese anbindet, wodurch der
Einfängreagenz/Analyt-Komplex aus der Probe abgetrennt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Einfangreagenz den
Analyten indirekt mittels eines spezifisch bindenden
Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten spezifisch ist.
3. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen
Probe, das folgendes umfaßt:
a) das Bereitstellen
(1) eines löslichen Einfangreagenzes, das ein erstes spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine erste geladene Substanz
konjugiert ist, wobei das erste spezifisch bindende Glied den
Analyten direkt oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten
spezifisch ist,
(2) eines löslichen Indikatorreagenzes, das ein zweites
spezifisch bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung
konjugiert ist, die zur Erzeugnung eines nachweisbaren Signals
in der Lage ist, wobei das zweite spezifisch bindende Glied den
Analyten direkt oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten
spezifisch ist, und
(3) eines unlöslichen Festphasenmaterials, das eine zweite
geladene Substanz umfaßt, die in Bezug auf die erste geladene
Substanz entgegengesetzt geladen ist;
b) das In-Kontakt-Bringen der flüssigen Probe mit dem
Einfangreagenz, wodurch das Einfahgreagenz an den Analyten in
der Probe gebunden wird, wobei sich ein Einfangreagenz/Analyt-
Komplex ausbildet;
c) das In-Kontakt-Bringen des Einfangreagenz/Analyt-Komplexes
mit dem Indikatorreagenz, wobei das Indikatorreagenz an den
Analyten gebunden wird, wobei sich ein
Einfangreagenz/Analyt/Indikatorreagenz-Sandwichkomplex ausbildet;
d) das Abtrennen des Sandwichkomplexes aus der Probe, indem die
Probe mit dem Festphasenmaterial in Kontakt gebracht wird, wobei
die feste Phase die erste geladene Substanz des
Sandwichkomplexes anzieht und sich an diese anbindet, wobei der
Sandwichkomplex aus der Probe abgetrennt wird; und
e) das Nachweisen der Markierung, die mit der festen Phase
verbunden ist, oder aber ungebundenen Indikatorreagenzes als
Anzeige für die Anwesenheit oder Menge des Analyten in der
Probe.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Einfangreagenz und
das Indikatorreagenz gleichzeitig mit der flüssigen Probe in
Kontakt gebracht werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei wenigstens das
Einfangreagenz oder das Indikatorreagenz indirekt an den
Analyten mittels eines spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet,
das für den Analyten spezifisch ist.
6. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen
Probe, das folgendes umfaßt:
a) das Bereitstellen
1) eines löslichen Einfangreagenzes, das ein erstes spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine erste geladene Substanz
konjugiert ist, wobei das erste spezifisch bindende Glied den
Analyten direkt oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten
spezifisch ist;
2) eines löslichen Indikatorreagenzes, das ein zweites
spezifisch bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung
konjugiert ist, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals
befähigt ist, wobei das zweite spezifisch bindende Glied das
erste spezifisch bindende Glied direkt oder das erste spezifisch
bindende Glied indirekt mittels eines spezifisch bindenden
Hilfsgliedes bindet, das für das erste spezifisch bindende Glied
spezifisch ist, und
3) eines unlöslichen Festphasenmaterials, das eine zweite
geladene Substanz umfaßt, die in Bezug auf die erste geladene
Substanz entgegengesetzt geladen ist;
b) das In-Kontakt-Bringen der flüssigen Probe mit dem
Einfangreagenz und dem Indikatorreagenz, wobei der Analyt in der
Probe mit dem Indikatorreagenz um die Bindung an das
Einfangreagenz konkurriert, wobei sich ein
Einfangreagenz/Analyt-Komplek und ein Einfangreagenz/Indikatorreagenz-Komplex
ausbilden;
c) das Abtrennen der Komplexe aus der Probe durch In-Kontakt-
Bringen der Probe mit dem Festphasenmaterial, wobei das
Festphasenmaterial die erste geladene Substanz anzieht und sich
an diese anbindet, wobei die Komplexe aus der Probe abgetrennt
werden; und
d) das Nachweisen der Markierung, die mit der festen Phase
verbunden ist oder des ungebundenen Indikatorreagenzes als
Anzeige für die Änwesenheit oder Menge an Analyt in der Probe.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wqbei das Einfangreagenz und
das Indikatorreagenz nacheinander mit der flüssigen Probe in
Kontakt gebracht werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Einfangreagenz das
Indikatorreagenz oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3 und 6, wobei die
erste geladene Substanz eine anionische Substanz ist, und wobei
die zweite geladene Substanz eine kationische Substanz ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3 und 6, wobei das
unlösliche Festphasenmaterial eine Vielzahl von geladenen
Mikropartikeln umfaßt, wobei die Mikropartikel von einem
Festphasengrundmaterial zurückgehalten werden, wobei die
Mikropartikel in Bezug auf die erste geladene Substanz
entgegengesetzt geladen sind.
11. Ein Sandwichimmunoassaykit zur Bestimmung der Anwesenheit
öder Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe, das
folgendes umfaßt:
a) ein lösliches Einfangreagenz, das ein erstes spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine erste geladene Substanz
konjugiert ist, wobei das erste spezifisch bindende Glied den
Analyten direkt oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten
spezifisch ist;
b) ein lösliches Indikatorreagenz, das ein zweites spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an einer Markierung konjugiert ist,
die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist,
wobei das zweite spezifisch bindende Glied den Analyten direkt
öder den Analyten indirekt mittels eines spezifisch bindenden
Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten spezifisch ist; und
c) ein unlösliches Festphasenmaterial, das eine zweite geladene
Substanz umfaßt, die im Bezug auf die erste geladene Substanz
entgegengesetzt geladen ist.
12. Konkurrenzimmunoassaykit zur Bestimmung der Anwesenheit
oder Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe, das
folgendes umfaßt:
a) ein lösliches Einfangreagenz, das ein erstes spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine erste geladene Substanz
konjugiert ist, wobei das erste spezifisch bindende Glied den
Analyten direkt bindet oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten
spezifisch ist;
b) ein unlösliches Indikatorreagenz, das ein zweites spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung konjugiert ist,
die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals fähig ist, wobei
das zweite spezifisch bindende Hilfsglied das erste spezifisch
bindende Glied direkt bindet, so daß es mit dem Analyten um die
Bindungszentren auf dem ersten spezifisch bindenden Glied
konkurriert oder wobei es das erste spezifisch bindende Glied
indirekt mittels des spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet,
das für die Bindungszentren auf dem ersten spezifisch bindenden
Glied spezifisch ist, wobei das zweite spezifisch bindende Glied
mit dem Analyten um die Bindungszentren auf dem spezifisch
bindenden Hilfsglied konkurriert; und
c) ein unlösliches Festphasenmaterial, das eine zweite geladene
Substanz umfaßt, die in Bezug auf die erste geladene Substanz
entgegengesetzt geladen ist.
13. Sandwichimmunoassaykit zur Bestimmung der Anwesenheit
oder Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe, das
folgendes umfaßt:
a) ein lösliches Einfangreagenz, das ein erstes spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine erste geladene Substanz
konjugiert ist, wobei das erste spezifisch bindende Glied den
Analyten direkt bindet oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten
spezifisch ist;
b) ein lösliches Indikatorreagenz, das ein zweites spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung konjugiert ist,
die zur Erzeuguhg eines nachweisbaren Signals fähig ist, wobei
das zweite spezifisch bindende Glied den Analyten direkt bindet
oder den Analyten indirekt mittels eines spezifisch bindenden
Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten spezifisch ist; und
c) ein unlöslichen Festphasenmater, das eine zweite umfaßt,
die mit einer zweiten geladenen Substanz beschichtet sind, die
in Bezug auf die erste geladene Substanz entgegengesetzt geladen
ist, wobei die Mikropartikel auf einem Festphasengrundmaterial
zurückgehalten werden.
14. Konkurrenzimmunoassaykit zur Bestimmung der Anwesenheit
oder Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe, das
folgendes umfaßt:
a) ein lösliches Einfangreagenz, das ein erstes spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine erste geladene Substanz
konjugiert ist, wobei das erste spezifisch bindende Glied den
Analyten direkt oder den Analyten indirekt mittels eines
spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet, das für den Analyten
spezifisch ist;
b) ein lösliches Indikatorreagenz, das ein zweites spezifisch
bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung konjugiert ist,
die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals fähig ist, wobei
das zweite spezifisch bindende Glied das erste spezifisch
bindende Glied direkt bindet, so daß es mit dem Analyten um die
Bindungszentren auf dem ersten spezifisch bindenden Glied
konkurriert oder wobei es das erste spezifisch bindende Glied
indirekt mittels des spezifisch bindenden Hilfsgliedes bindet,
das für die Bindungszentren auf dem ersten spezifischen
Bindungsglied spezifisch ist, wobei das zweite spezifisch
bindende Glied mit dem Analyten um die Bindungszentren auf dem
spezifisch bindenden Hilfsglied konkurriert; und
c) ein unlosliches Festphasenmaterial, das Mikropartikel umfaßt,
die mit einer zweiten geladenen Substanz beschichtet sind, die
in Bezug auf die erste geladene Substanz entgegengesetzt geladen
ist, wobei die Mikropartikel auf einem Festphasengrundmaterial
zurückgehalten werden.
15. Komplex, der ein lösliches Einfangreagenz umfaßt, welches
ein spezifisöh bindendes Glied umfaßt, das an eine geladene
Substanz konjugiert ist, und eine feste Phase, die eine zweite
geladene Substanz enthält, die in Bezug auf die erste geladene
Substanz entgegengesetzt geladen ist, wobei der Komplex durch
die Anziehung und die Anbindung der ersten und der zweiten
Substanz ausgebildet wird.
16. Verfahren zur Ausbildung eines Komplexes, das den Schritt
des In-Kontakt-Bringens einer festen Phase mit einer flüssigen
Probe umfaßt, die ein lösliches Einfangreagenz enthält, das ein
spezifisch bindendes Glied umfaßt, das an eine geladene Substanz
konjugiert ist, wobei die feste Phase eine zweite geladene
Substanz enthält, die in Bezug auf die erste geladene Substanz
entgegengesetzt geladen ist, wobei der Komplex durch die
Änziehung und die Anbindung der ersten und der zweiten Substanz
ausgebildet wird.
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