DE60224508T2

DE60224508T2 - Wti-modifiziertes peptid

Info

Publication number: DE60224508T2
Application number: DE60224508T
Authority: DE
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2022-03-23
Also published as: JP2006034296A; KR100863853B1; KR20030084970A; EP1371664A4; WO2002079253A1; US20040097703A1; BRPI0208183B1; US8105604B2; ATE383375T1; JP3728439B2; JPWO2002079253A1; CA2440303C; BR0208183A; EP1371664B1; HK1070078A1; US20090325886A1; CN1281625C; ES2298353T3; CA2440303A1; CN1531553A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Krebs-Antigen, basierend auf dem Produkt des Wilms-Tumor Suppressorgens WT1. Dieses Krebsantigen ist als Antikrebsimpfstoff nützlich und zwar gegen Blutkrebs wie Leukämie, myelodysplastisches Syndrom, Morbus Kahler und malignes Lymphom, solide Krebsformen wie Magenkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Keimzellkrebs, Leberkrebs, Hautkrebs, Blasenkrebs, Prostatakrebs, Gebärmutterkrebs, Cervixkarzinom und Eierstockkrebs, wie auch jede andere Krebserkrankung, bei der WT1 exprimiert wird.
Beschreibung des Standes der Technik
Der Immunmechanismus zur Entfernung fremder Objekte aus dem Körper besteht üblicherweise aus humoraler Immunität, bei der Makrophagen involviert sind, die als das Antigen erkennende Antigen-präsentierende Zellen wirken, ferner Helfer-T-Zellen, die andere T-Zellen aktivieren, indem sie Antigene erkennen, die von den Makrophagen präsentiert werden und verschiedene Lymphokine produzieren, sowie B-Lymphozyten, die aufgrund der Wirkung der Lymphokine in Antikörper produzierende Zellen differenzieren; und der zellulären Immunität, bei der Killer-T-Zellen (zytotoxische T-Zellen (CTL)), die als Ergebnis einer Präsentation mit einem Antigen eine Differenzierung durchlaufen haben, Zielzellen angreifen und zerstören. Gegenwärtig glaubt man, dass Immunität gegen Krebs hauptsächlich das Ergebnis zellulärer Immunität ist, bei der Killer-T-Zellen mitwirken. Bei der durch Killer-T-Zellen beeinflussten Immunität gegen Krebs differenzieren und proliferieren Vorläufer-T-Zellen, die Krebsantigen erkannt haben, das in Form eines Komplexes von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I (MHC Klasse I-Antigen, auch als HLA-Antigen bei Menschen bezeichnet) und Krebsantigen präsentiert wird und die so erhaltenen Killer-T-Zellen greifen die Krebszellen an und zerstören sie. Zu dieser Zeit präsentieren die Krebszellen einen Komplex aus MHC Klasse I-Antigen und Krebsantigen auf ihrer Zelloberfläche und dieser wird von den Killer-T-Zellen gezielt erfasst (Cur. Opin. Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin. Immunol. 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev., 146, 167, 1995).
Man ist der Auffassung, dass das zuvor erwähnte, durch MHC Klasse I-Antigen auf den als Zielzellen dienenden Krebszellen präsentierte Krebsantigen ein Peptid ist, dass aus 8–12 Aminosäuren besteht und als Ergebnis einer Prozessierung eines innerhalb der Krebszellen gebildeten antigenen Proteins durch eine intrazelluläre Protease gebildet wird (Cur. Opin. Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin. Immunol. 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev., 146, 167, 1995).
Obwohl Recherchen zu Antigenproteinen für verschiedene Krebsarten durchgeführt worden sind, konnten bis heute wenige als Krebs-spezifische Antigene verifiziert werden.
Das Tumor Suppressorgen WT1 des Wilms-Tumor (WT1-Gen) ist aus Chromosom 11p13 als eines der Wilms-Tumor verursachenden Gene isoliert worden und zwar auf der Grundlage des WAGR-Syndroms, das als Komplikation des Wilms-Tumors, von Aniridie, urogenitalen Abnormalitäten, Geistesschwäche und so weiter gefunden wird (Gessler, M. et al., Nature 343, S. 774–778 (1990)). Seine genomische DNA umfasst etwa 50 Kb und besteht aus 10 Exons, wohingegen die cDNA etwa 3 Kb umfasst. Die aus der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt (Mol. Cell. Biol. 11, 1707, 1991).
Das WT1-Gen wird sehr häufig bei menschlicher Leukämie exprimiert. Wenn Leukämiezellen mit einem WT1-Antisense-Oligomer behandelt werden, wird das Wachstum der Zellen behindert (nicht geprüfte japanische Patentpublikation 9-104627 ). Somit geht man davon aus, dass das WT1-Gen das Wachstum von Leukämiezellen fördert. Darüber hinaus wird das WT1-Gen stark in soliden Krebsformen wie Magenkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Keimzellkrebs, Leberkrebs, Hautkrebs, Blasenkrebs, Prostatakrebs, Gebärmutterkrebs, Cervixkarzinom und Eierstockkrebs exprimiert ( japanische Patentanmeldung 9-191635 ) und das WT1-Gen wurde als neuer Tumormarker bei Leukämie und soliden Tumoren identifiziert.
Verschiedene Krebs-spezifische antigene Peptide, die aus einem Teil des WT1-Gen Expressionsproduktes bestehen, sind in der WO 00/06602 beschrieben, wobei ein besonders vielversprechendes Peptid als D^b bezeichnet wird und die folgende Aminosäuresequenz aufweist: Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID Nr.: 2; bezeichnet als „WT1-Wildtyp-Peptid" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung), auch beschrieben in der WO 00/26249 . WT-1-Peptide sind ferner beschrieben in der WO 00/18795 und der WO 00/26249 .
Beschreibung der Erfindung
Es ist somit ein Gegenstand der Erfindung, ein Peptid bereitzustellen, das vielversprechend als Krebsimpfstoff ist und eine höhere Aktivität als früher bekannte Krebs-spezifische Antigenpeptide aufweist.
Als ein Ergebnis von ernsthaft durchgeführten verschiedenen Studien zur Lösung der vorstehend beschriebenen Probleme haben die hier genannten Erfinder gefunden, dass ein Peptid (bezeichnet als „modifiziertes WT1-Peptid") mit einer Aminosäuresequenz, bei der die zweite Aminosäure Met der vorstehend genannten bekannten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) in Tyr geändert wurde, und zwar Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID Nr.: 3) eine höhere Aktivität besitzt, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Somit stellt die Erfindung ein Peptid (modifiziertes WT1-Peptid) bereit, das aus 9–30 Aminosäuren besteht und die nachfolgend angegebene Aminosäuresequenz umfasst: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID Nr.: 3). Dieses Peptid ist vorzugsweise ein Polypeptid, das aus 9–12 Aminosäuren besteht und die in SEQ ID Nr.: 3 angegebene Aminosäuresequenz umfasst und stärker bevorzugt ein Peptid, das aus der in SEQ ID Nr.: 3 angegebenen Aminosäuresequenz besteht.
Darüber hinaus stellt die Erfindung einen Krebsimpfstoff bereit, bei dem der aktive Inhaltsstoff das zuvor erwähnte modifizierte WT1-Peptid ist.
Ferner stellt die Erfindung einen DNA-Impfstoff gegen Krebs bereit, bei dem der aktive Inhaltsstoff eine das zuvor erwähnte Peptid kodierende DNA ist.
Zusätzlich stellt die Erfindung Antigen-präsentierende Zellen bereit, auf denen ein Komplex aus HLA-Antigen (MHC-Klasse I-Antigen) und dem vorgenannten Peptid präsentiert wird.
Weiterhin stellt die Erfindung zytotoxische T-Zellen bereit, die durch in vitro-Stimulierung peripherer Blutlymphozyten mit dem vorgenannten Peptid erhalten werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine graphische Darstellung, die die zellabtötenden Wirkungen (spezifische zytolytische Aktivität) auf C1R2402 Zielzellen (T), entweder mit Peptid gepulst oder nicht, durch Effektorzellen (E) darstellt, die mit Wildtyp-WT1-Peptid (SEQ ID Nr.: 2) oder dem erfindungsgemäßen modifizierten WT1-Peptid (SEQ ID Nr.: 3) stimuliert wurden. In der graphischen Darstellung zeigen die schwarzen Kreise den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zielzellen, gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen, die schwarzen Quadrate den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zielzellen, gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit Wildtyp-WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen, die weißen Kreise den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zielzellen, nicht gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen und die weißen Quadrate den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zielzellen, nicht gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit Wildtyp-WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen.
2 ist eine graphische Darstellung, die die zytolytische Wirkung von Effektorzellen auf akute myeloische Leukämiezellen zeigt, die das WT1-Antigen endogen exprimieren oder auf akute myeloische Leukämiezellen, die das WT1-Antigen nicht exprimieren, wobei die Effektorzellen mit dem WT1 Wildtyp-Peptid oder dem erfindungsgemäßen modifizierten WT1-Peptid stimuliert wurden.
3 ist eine graphische Darstellung, die die zellabtötende Wirkung (spezifische zytolytische Aktivität) auf C1R2402 Zielzellen, entweder mit Peptid gepulst oder nicht, durch Effektorzellen darstellt, die mit Wildtyp-WT1-Peptid oder dem erfindungsgemäßen modifizierten WT1-Peptid stimuliert wurden. In der graphischen Darstellung zeigen die schwarzen Kreise den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zellen, gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen, die schwarzen Quadrate den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zielzellen, gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit Wildtyp-WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen, die weißen Kreise den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zielzellen, nicht gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen und die weißen Quadrate den zytolytischen Effekt auf C1R2402 Zielzellen, nicht gepulst mit Wildtyp-Peptid, durch mit Wildtyp-WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen.
4 ist eine graphische Darstellung, die die zytolytische Wirkung von Effektorzellen auf Lungenkrebszelllinien zeigt, die das WT1-Antigen endogen exprimieren oder das WT1-Antigen nicht exprimieren, wobei die Effektorzellen mit dem WT1 Wildtyp-Peptid oder dem erfindungsgemäßen modifizierten WT1-Peptid stimuliert wurden.
5 ist eine graphische Darstellung, die die inhibitorischen Wirkungen von anti-HLA Klasse I-Antikörper, anti-HLA Klasse II-Antikörper und anti-CD8-Antikörper auf die zellabtötenden Wirkungen (spezifische zytolytische Aktivität) auf mit Wildtyp-Peptid gepulsten C1R2402 Zielzellen durch Effektorzellen, die mit dem WT1 Wildtyp-Peptid oder dem erfindungsgemäßen modifizierten WT1-Peptid stimuliert wurden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Das erfindungsgemäße Peptid ist ein aus 9–30 Aminosäuren bestehendes Peptid, das die aus neun Aminosäuren bestehende, in der SEQ ID Nr. 3 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst. Hinsichtlich der Präsentation durch Bindung an HLA-Antigen ist das Peptid vorzugsweise ein aus 9–12 Aminosäuren bestehendes Peptid, das die in der SEQ ID Nr. 3 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst. Stärker bevorzugt ist es ein Peptid, das Regeln (Motive) in der Sequenz des Antigenpeptids aufweist, das zu der Zeit durch Bindung an HLA-Antigen präsentiert wird (J. Immunol. 152, S. 3913, 1994; Immunogenetics 41, S. 178, 1995; J. Immunol. 155, S. 4307, 1994; J. Immunol. 155, S. 4749, 1995). Ferner ist das Peptid in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz der 9 in der SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuren besteht.
Darüber hinaus ist das vorgenannte „Peptid umfassend die in der SEQ ID Nr.: 3 dargestellte Aminosäuresequenz" insbesondere beispielsweise ein Peptid, das die in der SEQ ID Nr.: 3 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst und sich in N-terminaler und/oder C-terminaler Richtung von den anwendbaren Positionen von WT1 (SEQ ID Nr. 1) (Pos. Nr. 235–243) oder von den entsprechenden Positionen von menschlichem WT1 (NCBI-Datenbank Zugangsnummer XP012009) hin erstreckt und eine Aktivität als Krebsantigenpeptid aufweist.
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Messung der Aktivität des erfindungsgemäßen Krebsantigenpeptids ist das in J. Immunol. 154, S. 2257, 1995 beschriebene Verfahren. Nachfolgend wird eine Erklärung eines Überblicks über dieses Verfahrens zur Verfügung gestellt, wobei als Beispiel HLA-A24 als HLA-Typ eingesetzt wird. Zunächst werden periphere Blutlymphozyten aus einer für das HLA-A24 Antigen positiven Person isoliert. Anschließend werden CTL (zytotoxische T-Zellen) durch Stimulierung der peripheren Blutlymphozyten durch Zugabe des erfindungsgemäßen Peptids in vitro induziert, die spezifisch den Komplex aus erfindungsgemäßem Peptid und HLA-A24, präsentiert von den Antigen präsentierenden Zellen, erkennen.
Diese Induktion der CTL kann beispielsweise durch Messung der Mengen verschiedener durch die CTL aufgrund der Reaktion mit dem Komplex aus Antigenpeptid und HLA-A24 produzierten Zytokine (z. B. IFN-γ) ermittelt werden. Zusätzlich kann die Induktion der CTL durch ein Verfahren ermittelt werden, bei dem die Zytotoxizität der CTL hinsichtlich Antigenpeptid präsentierenden, mit ⁵¹Cr oder Europium markierten Zellen gemessen wird (⁵¹Cr-Freisetzungstest, Int. J. Cancer 58, S. 317, 1994; Europium-Freisetzungstest, J. Immunol. 154, S. 3991, 1995). Ferner kann die Induktion der CTL durch Referenz auf die nachfolgend beschriebenen Beispiele ermittelt werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Krebsimpfstoff, der das vorgenannte Antigen als seinen aktiven Inhaltsstoff aufweist. Dieser Impfstoff kann zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Blutkrebs wie Leukämie, myelodyspastisches Syndrom, Morbus Kahler und malignes Lymphom, wie auch solide Krebsformen wie Magenkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Keimzellkrebs, Leberkrebs, Hautkrebs, Blasenkrebs, Prostatakrebs, Gebärmutterkrebs, Cervixkarzinom und Eierstockkrebs eingesetzt werden. Insbesondere kann dieser Impfstoff Patienten verabreicht werden, die HLA-A24-postiv sind. Der Impfstoff kann oral oder parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch intraperitoneale, subkutane, intrakutane, intramuskuläre, intravenöse oder intranasale Verabreichung.
Darüber hinaus kann die Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes durch ein Verfahren bewerkstelligt werden, bei dem Monozyten aus dem peripheren Blut eines Patienten gesammelt werden, dendritische Zellen aus den Monozyten extrahiert werden, die dendritischen Zellen mit dem erfindungsgemäßen Peptid gepulst werden und dann dem Patienten durch subkutane Verabreichung wieder zurückgeführt werden usw.
Dieses Verfahren wird als Zytotherapie oder dendritische Zell(DC)-Therapie bezeichnet und es wird bezüglich weiterer Einzelheiten auf den nachfolgenden Abschnitt mit dem Titel „Antigen präsentierende Zellen" verwiesen.
Zusätzlich zu dem Peptid, das als der vorgenannte aktive Inhaltsstoff verabreicht wird, kann der Impfstoff ferner pharmazeutisch verträgliche Träger als ein geeignetes Adjuvans enthalten (Clin-Microbiol. Rev. 7, 277–289, 1994). Beispiele dafür schließen ein mineralisches Gel wie Aluminiumhydroxid, ein grenzflächenaktives Mittel wie Phosphorlecithin und ein pluronic-Polyol, ein Polyanion, eine Peptid und eine ölige Emulsion ein. In einer anderen Ausführungsform kann der Impfstoff andere Aggregate enthalten, die in Liposome gemischt sind oder mit Polysacchariden oder dem Impfstoff vermengt sind. Die Dosierung liegt üblicherweise bei 0,1 μg/kg bis 1 mg/kg pro Tag.
Erfindungsgemäß kann die den vorgenannten Polypeptidimpfstoff kodierende DNA ebenfalls als Impfstoff eingesetzt werden (DNA-Impfstoff). Nach dem Einfügen von Nukleinsäure und vorzugsweise von DNA enthaltend Nukleinsäuren, die das erfindungsgemäße modifizierte WT1-Peptid kodieren in einen geeigneten Vektor und vorzugsweise einen Expressionsvektor kann nämlich nach Verabreichung des Vektors an ein Tier Immunität gegen Krebs verliehen werden. Es wird auf WO 00/6602 oder J. Immunol. 160, S. 1717, 1998 usw. bezüglich der besonderen Technik verwiesen, die für diesen DNA-Impfstoff eingesetzt wird.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung Antigen präsentierende Zellen, auf denen ein Komplex aus HLA-Antigen und dem vorgenannten Peptid präsentiert wird. Obgleich in diesem Beispiel wegen der Stimulierung mit dem erfindungsgemäßen Peptid starke Zellabtötungsaktivität beobachtet wird, ist diese das Ergebnis des Vorhandenseins Antigen präsentierender Zellen, auf denen ein Komplex aus erfindungsgemäßem Peptid und HLA-Antigen (HLA-A24) präsentiert wird, innerhalb der peripheren Blutlymphozyten und der Induktion von CTL (zytotoxischen T-Zellen), die diese Antigen präsentierenden Zellen spezifisch erkennen. Diese Antigen präsentierenden Zellen, auf denen ein Komplex aus HLA-Antigen und dem erfindungsgemäßen Peptid präsentiert wird, werden wirksam in der Zytotherapie (DC Therapie) eingesetzt, wie nachfolgend beschrieben wird.
Die in der Zytotherapie eingesetzten Antigen präsentierenden Zellen werden hergestellt durch Isolierung von Zellen, die Antigen aus Tumorpatienten präsentieren können, Pulsen dieser Zellen mit dem erfindungsgemäßen Peptid außerhalb des Körpers und Bewirken, dass ein Komplex aus HLA-Antigen und dem erfindungsgemäßen Peptid auf der Oberfläche der Zellen präsentiert wird. Obwohl es hier keine bestimmten Einschränkungen hinsichtlich der „Zellen, die die Fähigkeit zur Antigenpräsentation aufweisen" gibt, sofern diese Zellen sind, die HLA-Antigen exprimieren, das das erfindungsgemäße Peptid auf der Zelloberfläche präsentieren kann, werden dendritische Zellen bevorzugt, da diesen eine gute Fähigkeit zur Antigenpräsentation zugeschrieben wird.
Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Peptid, welches zum Pulsen der vorgenannten Zellen mit der Fähigkeit zur Präsentation von Antigen eingesetzt wird nicht nur als Peptid vorliegen, sondern auch als DNA oder RNA, die das Peptid kodiert.
Bezüglich eines spezifischen Verfahrens zur Präparierung der erfindungsgemäßen Antigen-präsentierenden Zellen kann beispielsweise auf Cancer Immunol. Immunother. 46, 82, 1998, J. Immunol. 158, S. 1796, 1997 und Cancer Res. 59, S. 1184, 1999 verwiesen werden. Bei Verwendung dendritischer Zellen werden Lymphozyten aus dem peripheren Blut eines Tumorpatienten unter Verwendung des Ficoll-Verfahrens isoliert. Nach der anschließenden Entfernung der nicht adhärierenden Zellen werden die dendritischen Zellen aus den adhärenten Zellen durch Kultivierung in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 gewonnen. Danach können die erfindungsgemäßen Antigen-präsentierenden Zellen durch Pulsen der dendritischen Zellen durch Kultivierung mit dem erfindungsgemäßen Peptid präpariert werden.
Darüber hinaus kann im Falle der Herstellung der erfindungsgemäßen Antigen-präsentierenden Zellen durch Einführen von das erfindungsgemäße Peptid kodierender DNA oder RNA in die vorgenannten Zellen mit der Fähigkeit zur Antigenpräsentation dieses Einführen so durchgeführt werden, wie beispielsweise in Cancer Res. 56, S. 5672, 1996 oder J. Immunol. 161, S. 5607, 1998 für DNA oder in J. Exp. Med. 184, S. 465, 1996 für RNA beschrieben.
Die Antigen-präsentierenden Zellen können als aktiver Inhaltsstoff in einem tumortherapeutischen Wirkstoff eingesetzt werden. Um dann die Stabilität der Antigen-präsentierenden Zellen beizubehalten, enthält der Behandlungswirkstoff vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Medium usw. Beispiele für Verabreichungsverfahren schließen intravenöse Verabreichung, subkutane Verabreichung und intrakutane Verabreichung ein.
Ferner betrifft die Erfindung zytotoxische T-Zellen (CTL), die durch Stimulierung peripherer Blutlymphozyten in vitro unter Verwendung des vorgenannten Peptids erhalten werden. Die erfindungsgemäßen CTL können wirksam in der adoptiven, nachstehend beschriebenen Immuntherapie eingesetzt werden.
Bei Melanomen nämlich ist die adoptive Immuntherapie als therapeutisch wirksam erkannt worden, wobei eine große Anzahl an T-Zellen des Patienten, die in den Tumor eingedrungen sind, in vitro kultiviert werden und dem Patienten dann zurückgeführt werden (J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159, 1994). Bei Mausmelanomen ist ferner die Inhibierung von Metastasen beobachtet worden, wenn Milzzellen in vitro mit dem Tumorantigenpeptid TRP-2 stimuliert wurden, woraufhin man spezifische CTL in Gegenwart des Tumorsantigenpeptids proliferieren ließ und die CTL anschließend an mit Melanomen transplantierte Mäuse verabreicht hat (J. Exp. Med. 185, 453, 1997). Dies ist ein Ergebnis davon, dass man CTL in vitro hat proliferieren lassen, die einen Komplex aus dem HLA-Antigen der Antigen-präsentierenden Zellen und dem Tumorantigenpeptid spezifisch erkennen. Daher glaubt man, dass ein Behandlungsverfahren nützlich ist, bei dem periphere Blutlymphozyten von Patienten in vitro mit dem erfindungsgemäßen Peptid zur Vermehrung der tumorspezifischen CTL stimuliert werden und diese Zellen nachfolgend in der Patienten rückgeführt werden.
Auf diese Weise können die erfindungsgemäßen CTL als aktive Inhaltsstoffe eines tumortherapeutischen Wirkstoffs eingesetzt werden. Um dann die Stabilität der CTL beizubehalten, enthält der therapeutische Wirkstoff vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Medium usw. Beispiele für Verabreichungsverfahren schließen intravenöse Verabreichung, subkutane Verabreichung und intrakutane Verabreichung ein.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Klarstellung der Nützlichkeit des erfindungsgemäßen Peptids als Krebsantigen und Krebsimpfstoff.
Beispiel 1
Periphere einkernige Blutzellen wurden aus HLA-A*2402 positiven Spendern isoliert und auf die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung verteilt, worauf die Zugabe von Wildtyp-WT1-Peptid oder modifiziertem WT1-Peptid zu einer Konzentration von 20 μM und Kultivierung für eine Woche folgte. Das dafür verwendete Medium bestand aus 45% RPMI, 45% AIV, 10% FKS, 1 × nicht-essentiellen Aminosäuren und SM/PCG. Nach der genannten Kultivierung wurden die Zellen auf eine Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung eingestellt und als reagierende („Responder") Zellen eingesetzt.
Daneben wurden weitere periphere einkernige Blutzellen auf die gleiche Weise aus denselben HLA-A*2402 positiven Spendern isoliert und dann mit dem Peptid gepulst, indem 4 Tage lang in Gegenwart von einem der vorgenannten Peptide bei 20 μM kultiviert wurde. Nachdem die Zellen dann bei 30 Gy bestrahlt worden waren, wurden sie auf 4 × 10⁶ Zellen/Vertiefung eingestellt und als stimulierende Zellen eingesetzt.
Die wie vorstehend beschrieben hergestellten reagierenden und stimulierenden Zellen wurden dann gemischt und nach Zugabe von IL-2 zu einer Konzentration von 50 E/mL eine Woche kultiviert. Der Zustand der so erhaltenen Zellen ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 1

Peptid Anzahl Zellen CD4 CD8

Wildtyp-WT1 Peptid 2,4 × 10⁶/Vertiefung 5% 35%

Modifiziertes WT1-Peptid 3,0 × 10⁶/Vertiefung 18% 38%
Danach wurde ein Zellabtötungstest gemäß der ⁵¹Cr-Freisetzungsmethode (J. Immunol. 164, 1873, 2000) durchgeführt. C1R2402 Zellen und mit den vorgenannten Peptiden gepulste C1R2402 Zellen wurden als Zielzellen verwendet. Danach ließ man mit Wildtyp-WT1-Peptid oder modifiziertem WT1-Peptid wie vorher beschrieben stimulierte Zellen (Effektorzellen (E)) mit diesen Zielzellen (T) bei einem E:T Verhältnis von 1, 5 von 20 reagieren und nachfolgend wurde die Zelllyse gemessen. Diese Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Wie aus dieser Darstellung ersichtlich wird, zeigten die mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierten Zellen eine stärkere Zellabtötungsaktivität als die mit Wildtyp-WT1-Peptid stimulierten Zellen.
Beispiel 2
Die Zellabtötungsaktivität der mit Wildtyp-WT1-Peptid stimulierten oder mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierten Effektorzellen auf endogen WT1-Antigen exprimierende Leukämiezellen wurde mit der ⁵¹Cr-Freisetzungsmethode getestet. WT1+/A*2402+ Zellen (Leukämiezellen von AML-Patient #1), WT1–/A*2402+ Zellen (Leukämiezellen von AML-Patient #2), WT1+/A*2402– Zellen (Leukämiezellen von AML-Patient #3) und WT1–/A*2402– Zellen (Leukämiezellen von AML-Patient #4) wurden als Zielzellen eingesetzt.
Die in Beispiel 1 hergestellten Effektorzellen (E) und die vorgenannten Zielzellen (T) wurden bei einem E:T Verhältnis von 20:1 gemischt, 4 Stunden kultiviert und nachfolgend das Ausmaß der Zelllyse gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Wie aus dieser Darstellung ersichtlich wird, war das Aktivitätslevel höher beim modifizierten WT1-Peptid, obwohl die mit Wildtyp-WT1-Peptid wie auch die mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierten Zellen eine zytotoxische Aktivität auf die WT1+/A*2402 Zellen aufwiesen.
Beispiel 3
Dasselbe Experiment wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, wobei Effektorzellen eingesetzt wurden, die aus peripheren einkernigen Blutzellen verschiedener gesunder Spender präpariert wurden, die positiv für HLA-A*2402 waren. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Wie aus dieser Darstellung ersichtlich wird und ähnlich wie in Beispiel 1, zeigten mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierte Zellen eine stärkere zytotoxische Aktivität als mit dem Wildtyp-WT1-Peptid stimulierte Zellen.
Beispiel 4
Die Zellabtötungsaktivität der mit Wildtyp-WT1-Peptid stimulierten oder mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierten Effektorzellen auf eine endogen WT1-Antigen exprimierende und mit Lungenkrebs assoziierte Krebszelllinie (Zielzellen) wurde mit der ⁵¹Cr-Freisetzungsmethode getestet. RERF-LCAI (WT1+/A*2402+) LC1sq (WT1+/A*2402+), 11–18 (WT1–/A*2402+) und LK87 (WT1+/A*2402–) Zeilen wurden als Zielzellen eingesetzt.
Wie gemäß Beispiel 1 präparierte Effektorzellen (E) und die vorgenannten, mit ⁵¹Cr markierten Zielzellen (T) wurden 4 Stunden bei einem E:T Verhältnis 20:1 wie in Beispiel 2 kultiviert, worauf sich die Messung des Ausmaßes der Zelllyse anschloss. Diese Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Wie aus dieser graphischen Darstellung ersichtlich wird, war das Aktivitätslevel höher beim modifizierten WT1-Peptid, obwohl die mit Wildtyp-WT1-Peptid wie auch die mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierten Zellen eine zytotoxische Aktivität lediglich auf die WT1+/A*2402+ Zellen aufwiesen.
Beispiel 5
Es wurde unter Verwendung eines Blockierungstests mit einem Antikörper bestätigt, dass mit Wildtyp-WT1-Peptid oder mit modifiziertem WT1-Peptid stimulierte Effektorzellen CD8-positive Killerzellen sind, die an HLA Klasse I binden. Die verwendeten Antikörper bestanden aus anti-HLA Klasse I Antikörpern, anti-HLA Klasse II Antikörpern und anti-CD8 Antikörpern. Wie in Beispiel 1 präparierte Effektorzellen (E) und C1R2402 Zellen oder mit Wildtyp-WT1-Peptid gepulste C1R2402 Zellen als Zielzellen (T), beide mit ⁵¹Cr markiert, wurden mit Antikörpern in einem E:T Verhältnis von 20:1 vermischt und anschließend 4 Stunden kultiviert, worauf sich die Messung des Ausmaßes der Zelllyse mit der ⁵¹Cr-Freisetzungsmethode anschloss. Diese Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Wie aus dieser graphischen Darstellung ersichtlich wird, wurde die zytotoxische Aktivität durch die anti-HLA Klasse I Antikörper und anti-CD8 Antikörper blockiert und zwar sowohl bei den Zellen, die mit Wildtyp-WT1-Peptid als auch bei solchen, die mit modifiziertem WT1-Peptid stimuliert worden waren. Dies deutet darauf hin, dass die zytotoxische Aktivität zeigenden Zellen CD8 positive Killerzellen sind, die an HLA-Klasse I binden.
Beispiel 6
Die Bindungsaffinität des modifizierten WT1-Peptids und des Wildtyp-WT1-Peptids gegenüber HLA-A*2402 wurde ermittelt. Nach Behandlung von C1RA2402 Zellen für eine Minute mit einer Pufferlösung (131 mM Zitronensäure, 66 mM Natriumphosphat, 290 m Osmol, pH 3,3) wurden die Zellen durch Zugabe von DMEM Medium enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin neutralisiert. Nachdem die Zellen mit dem Medium gewaschen worden waren, wurden sie bei einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/mL in DMEM Medium suspendiert, das 200 nM β2-Mikroglobulin (Sigma) und 0,5% Rinderserumalbumin enthielt. 15 μl der Zellsuspension wurden mit 50 μL des Mediums gemischt, das verschiedene Konzentrationen an WT1-Peptid aufwies, worauf sich eine Inkubation für 4 Stunden bei Raumtemperatur anschloss. Nachdem die Zellen gewaschen worden waren, wurden sie mit einem mit FITC markiertem monoklonalen Antikörper gegen HLA-A24 (Name des Klons: 7A12) gefärbt und die Menge an exprimiertem HLA-A24 wurde mit einem Flußzytometer FACS System gemessen. Ein ähnliches Verfahren wurde mit dem Antigenpeptid des Melanomantigens pmeI 15 durchgeführt, über das berichtet wurde, dass es an HLA-A*2402 bindet (Ala Tyr Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Leu) (SEQ ID Nr.: 4) (J. Immunol. 154, 5994, 1995) und unter Verwendung von diesem als Standard wurden die Dissoziationskonstanten (Kd) der WT1-Peptide mit dem literaturbeschriebenen Verfahren (Immunogenetics 51, 816, 2000) berechnet. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

Peptid Dissoziationskonstante Kd (M)

Wildtyp-WT1-Peptid 1,82 × 10^–5

modifiziertes WT1-Peptid 6,40 × 10^–7
Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, zeigt das modifizierte WT1-Peptid eine höhere Bindungsaffinität für HLA-A*2402 als das Wildtyp-WT1-Peptid.
Auf der Grundlage der vorgenannten Ergebnisse wurde unzweideutig belegt, dass das erfindungsgemäße Peptid als Krebsantigen wirkt und die Induktion und Vermehrung von gegen Krebszellen gerichteten Killer-T-Zellen (für Krebszellen zytotoxische T-Zellen) bewirkt. Das erfindungsgemäße Krebsantigenpeptid ist somit als Krebsimpfstoff gegen Leukämie und feste Krebsformen, die mit einer erhöhten Expression des WT1-Gens einhergehen, geeignet. SEQUENZLISTE

Claims

Krebsantigenpeptid mit einem Peptid als aktivem Bestandteil, das aus 9 bis 30 Aminosäuren besteht und die folgende Aminosäuresequenz: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) umfasst.
Krebsantigenpeptid nach Anspruch 1, das aus 9 bis 12 Aminosäuren besteht und die in SEQ ID NO: 3 abgebildete Aminosäuresequenz umfasst.
Krebsantigenpeptid nach Anspruch 1, das aus der in SEQ ID NO: 3 abgebildeten Aminosäuresequenz besteht.
Krebsvakzin mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als aktivem Bestandteil.
DNA-Vakzin gegen Krebs mit DNA als aktivem Bestandteil, die für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Antigen-präsentierende Zellen, auf denen ein Komplex aus HLA-Antigen und einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 präsentiert wird.
Zytotoxische T-Zellen, die durch Stimulieren peripherer Blutlymphozyten in vitro unter Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhalten werden.
Verwendung zytotoxischer T-Zellen, die durch in vitro-Stimulation peripherer Blutlymphozyten mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhalten wurden, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.