KR20030084970A

KR20030084970A - 더블유티1 개변 펩티드

Info

Publication number: KR20030084970A
Application number: KR10-2003-7011790A
Authority: KR
Inventors: 하루오 스기야마
Original assignee: 스기야마 하루오
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2003-11-01
Also published as: JP2006034296A; KR100863853B1; EP1371664A4; WO2002079253A1; US20040097703A1; BRPI0208183B1; US8105604B2; ATE383375T1; JP3728439B2; JPWO2002079253A1; CA2440303C; BR0208183A; EP1371664B1; HK1070078A1; US20090325886A1; CN1281625C; ES2298353T3; CA2440303A1; CN1531553A; DE60224508D1

Abstract

본 발명은 다음과 같은 아미노산 서열: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(Sequence ID No.: 3)을 포함하는 암 항원 펩티드, 유효 성분으로서 이것을 갖는 암백신 및 이 펩티드를 코드하는 DNA를 유효 성분으로 갖는 DNA 백신.

Description

더블유티1 개변 펩티드{WT1 Modified Peptide}

이물(異物)을 배제하기 위한 면역 기구에는, 일반적으로 항원을 인식해서 항원제시세포로서 기능하는 마크로파지, 이 마크로파지의 항원제시를 인식해서 여러 가지의 림포킨을 생산해서 다른 T-세포 등을 활성화하는 헬퍼 T-세포, 상기 림포킨의 작용에 의해 항체생산 세포로 분화하는 B-림프구 등이 관여하는 액소성 면역 및, 항원의 제시를 받아서 분화한 킬러 T-세포(세포독성 T-세포(CTL))가 표적세포를 공격하여 파괴하는 세포성 면역 등이 있다.

현재로서는, 암 면역은 주로 킬러 T-세포가 관여하는 세포성 면역에 의한 것으로 생각되고 있다. 킬러 T-세포에 의한 암 면역에 있어서는, 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex; MHC) 클래스 I (MHC 클래스 I 항원, 인간의 경우는 HLA 항원으로 칭함)과 암 항원의 복합체의 형태로 제시되어 있는 암 항원을 인식한 전구체 T-세포가 분화하여 증식하여, 생성된 킬러 T-세포가 암세포를 공격하여 파괴한다. 이 때에, 암세포는 MHC 클래스 I 항원과 암 항원과의 복합체를 그 세포 표면에 제시되어 있고, 이것은 킬러 T-세포의 표적이 된다(Cur. Opin. Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin. Immunol., 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev, 146, 167, 1995).

표적세포로 제공되는 암세포 상에 MHC 클래스 I 항원에 의하여 제시되는 상기의 암 항원은 암세포 내에서 합성된 항원 단백질이 세포내 프로테아제에 의하여 처리되어 생성된 약 8-12개의 아미노산에서 생성된 펩티드인 것으로 생각되고 있다(Cur. Opin, Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin. Immunol., 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev., 146, 167, 1995).

현재, 여러 가지의 암에 대해서 항원 단백질에 대한 검색이 행해지고 있지만, 암-특이 항원으로서 증명되고 있는 것은 적다.

Wilms 종양의 암 억제 유전자 WT1(WT1 유전자)는 Wilms 종양, 무홍채, 비뇨생식기이상, 정신발달지체 등을 합병증으로서 발생하는 WAGR 증후군의 해석에서 Wilms 증상의 원인 유전자의 하나로서 염색체 11p13에서 단리된(Gessler, M., et al., Nature, Vol. 343, p. 774-778 (1990)) 것이고, 게놈 DNA는 약 50kb이고, 10개의 엑손으로 구성되지만, 그의 cDNA는 약 3kb이다. cDNA에서 추정되는 아미노산 서열은, Sequence ID No. 1에 나타낸 바와 같다(Mol. Cell. Biol., 11, 1707, 1991).

WT1 유전자는 인간 백혈병에서 고발현되고, 백혈병 세포를 WT1안티센스(antisense) 올리고머로 처리하면 그의 세포증식이 억제된다(특개평 9-104627호 공보). 그러므로, WT1 유전자는 백혈병 세포의 증식을 촉진하도록 작용하고 있는 것이 시사되고 있다. 또한, WT1 유전자는 또한 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암 등의 고형암에 있어서도 고발현되고(일본 특허출원번호(평) 9-191635), WT1 유전자는 백혈병 및 고형암에 있어서 새로운 종양 마커(marker)인 것이 판명되었다.

WO 00/06602에는 WT1 유전자 발현 생성물의 부분으로 이루어진 몇 개의 암특이 항원 펩티드가 기재되어 있고, 그 중에 유망한 펩티드는 D^b로 나타내고, 다음의 아미노산서열: Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (Sequence ID No. 2)(본 발명에서는 "WT1 와일드 펩티드"라 함)가 기재되어 있다.

본 발명은 Wilms 종양의 암억제 유전자 WT1의 생성물에 기초한 암 항원에 관한 것이다. 이 암항원은 백혈병, 골수이형성 증후군, 다발성골수종, 악성림프종 등과 같은 혈액암, 또는 고형암, 예를 들면 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암, 및 WT1을 발현하는 모든 암에 대한 항암 백신으로서 유용하다.

도 1은 WT1 와일드 펩티드(Sequence ID No. 2) 또는 본 발명의 WT1 개변 펩티드(Sequence ID No. 3)에 의하여 자극된 이펙터 세포(E)에 의한, 펩티드로 펄스되거나 또는 펄스되지 않는 C1R2402 표적세포(T)의 살세포 효과(비세포용해활성)를 나타낸 그래프이다. 도에서 검은 원형점은 와일드 펩티드에 의해 펄스된 C1R2402 표적세포에 대한 WT1 개변 펩티드로 자극된 이펙터 세포에 의한 세포용해 효과를 나타내고, 검은 사각점은 와일드 펩티드에 의하여 펄스된 C1R2402 표적세포에 대한, WT1 와일드 펩티드로 자극된 이펙터 세포에 의한 세포용해효과를 나타내고, 흰 원형점은 와일드 펩티드에 의하여 펄스되지 않은 C1R2402 표적세포에 대한, WT1 개변 펩티드로 자극되어진 이펙터 세포에 의한 세포용해효과를 나타내고, 그리고 흰 사각점은 와일드 펩티드에 의하여 펄스되지 않은 C1R2402 표적세포에 대한, WT1 와일드 펩티드로 자극된 이펙터 세포에 의한 세포용해효과를 나타낸다.

도 2는 WT1 와일드 펩티드 또는 본 발명의 WT1 개변 펩티드에 의하여 자극된 이펙터 세포에 의한, 내인성으로 WT1 항원을 발현하는 급성 골수성 백혈병 세포 또는 발현하지 않는 급성 골수성 백혈병 세포에 대한 세포용해활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 WT1 와일드 펩티드 또는 본 발명의 WT1 개변 펩티드에 의하여 자극된 이펙터 세포에 의한, 펩티드가 펄스되거나 또는 펄스되지 않은 C1R2402 표적세포의 살세포 효과(비세포용해활성)를 나타내는 그래프이다. 도에서, 검은 원형점은 와일드 펩티드에 의하여 펄스된 C1R2402 세포에 대한, WT1 개변 펩티드로 자극된 이펙터 세포에 의한 세포용해효과를 나타내고, 검은 사각점은 와일드 펩티드에 의하여펄스된 C1R2402 표적세포에 대한, WT1 와일드 펩티드로 자극된 이펙터 세포에 의한 세포용해효과를 나타내고, 흰 원형점은 와일드 펩티드에 의하여 펄스되지 않은 C1R2402 표적세포에 대한, WT1 개변 펩티드로 자극된 이펙터 세포에 의한 세포용해효과를 나타내고, 그리고 흰 사각점은 와일드 펩티드에 의하여 펄스되지 않은 C1R2402 표적세포에 대한, WT1 와일드 펩티드로 자극된 이펙터 세포에 의한 세포용해효과를 나타낸다.

도 4는, WT1 와일드 펩티드 또는 본 발명의 WT1 개변 펩티드에 의하여 자극된 이펙터 세포에 의한, 내인성으로 WT1를 발현하는 폐암세포주 또는 발현하지 않은 폐암세포주에 대한 세포용해활성을 나타내는 그래프이다.

도 5는, WT1 와일드 펩티드 또는 본 발명의 WT1 개변 펩티드에 의하여 자극된 이펙터 세포에 의한, 와일드 펩티드를 펄스되지 않은 C1R2402 표적세포의 살세포 효과(비세포용해활성)에 대한 항-HLA 클래스 Ⅰ 항체, 항-HLA 클래스 Ⅱ 항체, 항CD8 항체의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

발명의 개시

그러므로, 본 발명의 목적은 이미 알려진 암 특이 항원 펩티드에 비교하여 활성의 높고, 암 백신으로서 유망한 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 여러 가지 겸토를 한 결과, 이미 알려진 아미노산 서열(Sequence ID No. 2)의 2번째의 아미노산 Met를 Tyr로 변경한 아미노산 서열: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(Sequence ID No. 3)를 갖는 펩티드("WT1 개변 펩티드"라 칭함)가 더욱 높은 활성을 보이는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

그러므로, 본 발명은 9-30개의 아미노산으로 이루어지고, 하기 아미노산 서열: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (Sequence ID No. 3)을 포함하는 펩티드(WT1 개변 펩티드)를 제공한다. 9-12개의 아미노산으로 이루어지고, Sequence ID No. 3으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 바람직하고, Sequence ID No. 3으로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 WT1 개변 펩티드를 유효 성분으로 하는 암 백신을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩티드를 코드하는 DNA를 유효 성분으로 하는 암에 대한 DNA 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 HLA 항원(MHC 클래스 I 항원)과 상기 펩티드의 복합체의 제시된 항원제시세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 HLA 항원과 상기 펩티드의 복합체를 인식하는 세포 독성 T-세포를 제공한다.

본 발명의 펩티드는 Sequence ID No. 3에 나타난 9개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는, 9-30개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 또한, HLA 항원에 결합해서 제시된 것이라는 관점에서, Sequence ID No. 3에 나타난 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 9-12개로 이루어진 펩티드가 바람직하고, 그 때에 HLA 항원에 결합해서 제시되는 항원 펩티드의 서열에서의 규칙성(모티프)을 갖는 펩티드가 더욱 바람직하다(J. Immunol., 152, p. 3913, 1994; Immunogenetics, 41,p. 178, 1995; J. Immunol., 155, p. 4307, 1994; J. Immunol., 155, p. 4749, 1995). 또한, Sequence ID No. 3에 나타난 9개의 아미노산의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 가장 바람직하다.

또한, 상기 "Sequence ID No. 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 펩티드"는 구체적으로 예를 들어, Sequence ID No. 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, WT1(Sequence ID No. 1)상의 해당 위치(위치번호 235-243) 또는 인간 WT1(NCBI 데이터베이스 Accession No. XP012009)상의 대응 위치로부터 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향으로 신장한 펩티드이고, 또한, 암 항원 펩티드로서의 활성을 갖는 펩티드이다.

본 발명의 암 항원 펩티드의 활성 측정법으로서는, 예를 들어, J. Immunol., 154, p. 2257, 1995에 기재된 방법이 있다. 이하, 이 방법의 개략에 대해, HLA의 형이 HLA-A24의 경우를 예로 해서 설명한다. 첫 번째로, HLA-A24 항원 양성 인간으로부터 말초혈 림프구를 단리한다. 다음에는, 이 말초혈 림프구에 대해서 인 비트로에서 본 발명의 펩티드를 첨가하여 자극함으로써, 본 발명의 펩티드와 HLA-A24의 복합체가 제시된 항원제시세포를 특이적으로 인식하는 CTL(세포독성 T-세포)를 유도한다.

상기 CTL의 유도는 예를 들어, 항원 펩티드와 HLA-A24의 복합체에 반응해서 CTL이 생산하는 여러 가지의 사이토킨(예를 들어, IFN-γ)의 양을, 예를 들면 ELISA법으로 측정함으로써 조사할 수 있다. 또한,⁵¹Cr 및 Europium으로 표지한 항원펩티드제시 세포에 대한 CTL의 독성을 측정하는 방법에 의하여 조사할 수도 있다(⁵¹Cr Release Assay, Int. J. Cancer, 58, p. 317, 1994; Europium Release Assay, J. Immunol., 154, p. 3991, 1995). 또한, CTL의 유도는 하기 실시예를 참고로 하여 행할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 항원을 유효 성분으로 하는 암 백신에 관한 것이다. 이 백신은, WT1 유전자의 발현 레벨의 상승을 수반하는 암, 예를 들어, 백혈병, 골수이형성 증후군, 다발성 골수증, 악성 림프종 등의 혈액암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암 등의 고형암의 예방 또는 치료를 위해 사용할 수 있다. 특히 이 백신은 HLA-A24 양성 환자에 적용할 수 있다. 이 백신은 경구 투여, 또는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 피하 투여, 피부내 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 비강내 투여 등으로서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 백신의 투여방법으로는, 환자의 말초혈로부터의 단핵 세포를 모으고, 상기 단핵 세포에서 수상 세포를 적출하여, 본 발명의 펩티드를 펄스(pulse)한 다음, 피하 투여 등으로 환자에게 되돌리는 방법도 행하여진다.

본 방법은 세포요법 또는 수상 세포(DC)요법으로 불려지는 것이고, 하기의 "항원제시세포"섹션에서 상세한 언급된다.

백신은 또한, 상기 유효 성분으로서의 투여되는 펩티드 이 외에, 예를 들어, 적당한 보조제(Clin-Micobiol. Rev., 7, 277-289, 1994)과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있고, 예로는 수산화알루미늄과 같은 광물 겔, 포스포러스 레시틴 및 풀루로닉 폴리올과 같은 계면활성제, 폴리아니온(polyanion), 펩티드, 유성 에멀젼을 포함한다. 또한, 백신은 리포솜 중에 혼합하거나 또는 다당 및/또는 백신에 배합된 다른 집합체를 함유할 수 있다. 투여량은 일반적으로 1일당 0.1㎍/㎏ 내지 1㎎/㎏이다.

본 발명에서, 또한 상기 폴리펩티드 백신을 코드하는 DNA도 백신(DNA 백신)으로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 WT1 개변 펩티드를 코드하는 핵산을 함유하는 핵산, 바람직하기는 DNA를 적절한 벡터, 바람직하기는 발현 벡터에 삽입한 후, 동물에 투여함으로써, 암 면역을 생기게 할 수 있다. 이와 같은 DNA 백신의 구체적 기술은 WO00/06602 및 J. Immunol., 160, p. 1717, 1998등을 참조할 수 있다.

또한, 본 발명은 HLA 항원과 상기 펩티드의 복합체가 제시된 항원제시세포에 관한 것이다. 실시예에서는, 본 발명의 강한 펩티드 자극에 의해 강한 세포 킬링(killing) 활성이 인정되고 있지만, 이것은 말초혈 단핵구 중에 본 발명의 펩티드와 HLA 항원(HLA-A24항원)의 복합체가 제시된 항원제시세포가 존재하고, 그리고, 이 항원제시세포를 특이적으로 인식하는 CTL(세포 독성 T-세포)가 유도된 항원제시세포가 제시된 결과이다. 이와 같은, HLA 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체가 제시된 항원제시세포는, 하기의 세포요법(DC요법)에서 유용하게 사용된다.

세포요법에서 사용되는 항원제시세포는 종양환자로부터 항원제시능을 갖는 세포를 단리하고, 이 세포에 본 발명의 펩티드를 체외에서 펄스하고, HLA 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 세포 표면에 제시함으로써 제작된다. 여기서, "항원제시능을 갖는 세포"는 본 발명의 펩티드를 제시하는 것이 가능한 HLA 항원을 세포 표면에 발현하는 세포이면 특히 한정되지는 않지만, 항원제시능이 높은 수상 세포가 바람직하다.

또한, 항원제시능을 갖는 상기 세포를 펄스하도록 하는 본 발명의 펩티드는, 펩티드의 형태뿐만 아니라, 상기 펩티드를 코드하는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다.

본 발명의 항원제시세포의 구체적인 조제법으로서는, 예를 들어, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82, 1998, J. Immunol., 158, p. 1796, 1997, 및 Cancer Res., 59, p. 1184, 1999 등을 참고할 수 있다. 수상 세포를 이용하는 경우에는, 예를 들어, 종양환자의 말소혈로부터 Fycoll법에 의하여 임파구를 분리하고, 비부착 세포를 제거한 후, 수상 세포를 GM-CSF 및 IL-4 존재 하에서 배양해서 부착세포로부터 유도하고, 상기 수상 세포를 본 발명의 펩티드와 함께 배양하여 펄스함으로써, 본 발명의 항원제시세포를 제조할 수 있다.

또한, 상기 항원제시능을 갖는 세포에, 본 발명의 펩티드를 코드하는 DNA 및 RNA를 도입함으로써 본 발명의 항원제시세포를 조제하는 경우는, 예를 들어, DNA의 경우는 Cancer Res., 56, p. 5672, 1996이나 J. Immunol., 161, p. 5607, 1998 등을 참고하여 행할 수 있고, 또한 RNA의 경우는 J. Exp. Med., 184, p. 465, 1996 등을 참고하여 수행할 수 있다.

상기 항원제시세포는 종양의 치료제의 유효 성분으로서 사용될 수 있다. 이 때에는, 항원제시세포를 안정하게 유지하기 위하여 생리식염수, 인산완충생리식염수(PBS), 배지 등을 포함하는 치료제가 바람직하다. 투여방법으로서는, 정맥내 투여, 피하 투여, 피부내 투여를 포함한다.

또한, 본 발명은, 또한 HLA 항원과 상기 펩티드의 복합체를 인식하는 세포독성 T-세포(CTL)에 관한 것이다. 본 발명의 CTL은 하기 양자면역요법에 있어서 유효하게 이용된다.

즉, 색소세포종의 경우에서, 환자 본인의 종양 내 침윤 T 세포를 체외에서 대량으로 배양해서, 이 것을 환자에 되돌리는 양지면역요법에 치료효과가 인정되고 있다(J. Natl. Cancer. Inst., 86, 1159, 1994). 또한, 마우스의 색소세포종의 경우에는, 비장세포를 인비트로에서 종양항원펩티드 TRP-2로 자극하여, 종양 항원 펩티드에 특이적인 CTL을 증식시켜, 이 CTL을 색소세포종이식 마우스에 투여함으로써, 전이억제가 인정되고 있다(J. Exp. Med., 185, 453, 1997). 이것은 항원제시세포의 HLA 항원과 종양 항원 펩티드의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL을 인 비트로에서 증식한 결과에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 이용하여 인 비트로에서 환자 말초혈 임파구를 자극하여 종양 특이적인 CTL을 증가시킨 후, 이 CTL을 환자에 되돌리는 치료법이 유용하다고 생각되고 있다.

이와 같이 본 발명의 CTL은 종양의 치료제의 유효 성분으로 사용할 수 있다. 이 때에, CTL을 안정하게 유지하기 위해서, 생리식염수, 인산완충생리식염수 (PBS), 배지 등을 포함하는 것이 바람직하다. 투여방법으로서는 정맥내 투여, 피하 투여, 피부내 투여를 포함한다.

다음의 실시예에 의하여 본 발명의 펩티드는 암항원 및 암백신으로서 유용한 것을 명확히 한다.

실시예 1

HLA-A^*2402를 갖는 인간의 말초혈 단핵세포를 분리하고, 이것을 24-웰 플레이트에 2×10⁶세포/웰의 양으로 분배하고, 이것에 WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변펩티드를 20μM의 농도가 되도록 첨가하고, 1주일간 배양하였다. 이 때에 사용된 배지는 45% RPMI, 45% AIV, 10% FCS, 1×비필수 아미노산, SM/PCG를 사용했다. 상기의 배양 후, 세포를 2×10⁶세포/웰로 조정하고, 리스폰더(responder) 세포로 사용하였다.

한편, 상기 동일한 HLA-A^*2402의 인간으로부터 별도로 말초혈 단핵세포를 분리하고, 각각을 상기 펩티드 20μM과 함께 4시간 동안 배양하여 펩티드-펄스하고, 다음에 30㏉의 방사선 조사한 후, 세포를 4×10⁶세포/웰로 조정하고, 스티뮤레이트(stimulator) 세포로 사용하였다.

상기와 같이 제조한 리스폰더 세포 및 스티뮤레이터 세포를 혼합하고, 또한 IL-2를 50U/㎖의 농도로 첨가하여 1주일 동안 배양하였다. 그 결과, 얻어진 세포의 상태는 하기의 표에 나타난 바와 같다.

표 1

펩티드	세포수	CD4	CD8
WT1 와일드 펩티드	2.4×10⁶/웰	5%	35%
WT1 개변 펩티드	3.0×10⁶/웰	18%	38%

다음에는,⁵¹Cr 릴리이스법(release method)에 따라서 킬링 평가를 수행하였다(J. Immunol., 164, 1873, 2000). C1R2402 세포 및 상기 펩티드로 펄스된 C1R2402 세포는 표적세포로 사용하고, 이들 각각의 표적세포(T)에 상기와 같이 WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변 펩티드에 의하여 자극한 세포(이펙터 세포)(E)를, E:T 비 1.5 또는 20에서 작용시켜, 세포용해를 측정하였다. 결과는 도 1에 나타냈다. 이 도에서 명백한 바와 같이, WT1 개변 펩티드로 자극한 세포가 WT1 와일드 펩티드에 의하여 자극한 세포보다 강한 살세포 활성을 나타냈다.

실시예 2

내인성으로 WT1 항원을 발현하는 백혈병세포(표적세포)에 대한 WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변 펩티드로 자극한 이펙터 세포의 살세포 활성을⁵¹Cr 릴리이스법으로 시험하였다. 표적세포로서 WT1+/A^*2402+ 세포(#1 AML환자의 백혈병세포), WT1-/A^*2402+ 세포(#2 AML환자의 백혈병세포), WT1+/A^*2402- 세포(#3 AML환자의 백혈병세포), 및 WT1-/A^*2402- 세포(#4 AML환자의 백혈병세포)를 이용하였다.

실시예 1에서 제조된 이펙터 세포(E) 및 상기 표적세포(T)를 E/T 비 20:1로 혼합하고, 4시간 동안 배양된 다음, 세포용해의 정도를 측정하였다. 결과를 도 2에 나타냈다.

이 도에서 명백한 바와 같이, WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변 펩티드에 의하여 자극된 세포는 어느 것이라도 WT1+/A^*2402 세포에 대한 세포독성활성을 나타내지만, 이 활성 수준은 WT1 개변 펩티드의 쪽이 높았다.

실시예 3

실시예 1와 동일한 실험을 다른 HLA-A^*2402 양성의 건강한 인간의 말초혈 단핵세포로부터 제조한 이펙터 세포를 이용하여 실험하였다. 결과는 도 3에 나타냈다.

이 도에서 명백한 바와 같이, 실시예 1와 동일하게, WT1 개변 펩티드에 의하여 자극된 세포의 쪽이 WT1 와일드 펩티드로 자극된 세포보다 강한 세포독성활성을 나타내었다.

실시예 4

WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변 펩티드로 자극한 이펙터 세포의 내인성에 WT1 항원을 발현하는 폐암유래의 암세포주(표적세포)에 대한 세포독성활성을⁵¹Cr 릴리이스법을 사용하여 시험하였다. 표적세포로서 RERF-LCAI (WT1+/A^*2402+), LC1sq(WT1+/A^*2402+), 11-18(WT1-/A^*2402+), LK87(WT1+/A^*2042-)를 이용하였다.

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 이펙터 세포(E) 및⁵¹Cr로 표지한 상기의 표적세포(T)를 실시예 2와 동일한 방법으로 E/T 비 20:1로 혼합하고, 4시간 동안 배양하여, 세포용해의 정도를 측정하였다. 걸과를 도 4에 나타냈다.

이 도에서 명백한 바와 같이, WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변 펩티드에 의하여 자극된 세포의 어느 것이라도 WT1+/A^*2402+의 표적세포에 대해서만 세포독성활성을 나타내지만, 그의 활성은 WT1 개변 펩티드의 쪽이 높았다.

실시예 5

WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변 펩티드로 자극한 이펙터 세포가 항체를 사용한 블로킹 어세이에 의하여 HLA 클래스 I에 구속성 CD8-양성 킬러 세포인 것을확인하였다. 항체로서는, 항 HLA 클래스 I 항체, 항 HLA 클래스 Ⅱ 항체, 항 CD8 항체를 사용했다. 실시예 1과 동일한 방법에 의하여 제조된 이펙터 세포(E) 및⁵¹Cr로 표지한 C1R2402 세포 또는 WT1 와일드 펩티드를 펄스한 C1R2402 세포를 표적세포(T)로 하여, E/T 비 20:1로 항체와 함께 혼합된 다음, 4시간 동안 배양하고,⁵¹Cr 릴리이스법에 따라서 세포용해의 정도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타냈다.

이 도에서 명백한 바와 같이, WT1 와일드 펩티드 또는 WT1 개변 펩티드로 자극된 세포의 어느 것도 항-HLA 클래스 I 항체 및 항CD8 항체에 의해 세포독성활성이 저해되어 있고, 세포독성활성을 나타내는 세포는 HLA 클래스 I에 구속성의 CD8 양성 킬러 세포인 것이 나타났다.

실시예 6

HLA-A^*2402에 대한 WT1 개변 펩티드 및 WT1 와일드 펩티드의 결합친화성을 조사하였다. C1RA2402 세포를 완충액(131mM 시트르산, 66mM 인산나트륨, 290m osmol, pH 3.3)으로 1분간 처리한 후, 0.5% 소 혈청 알부민을 함유하는 DMEM 배양액을 첨가하여 중화하였다. 세포를 배지로 세정한 후, 200nM의 β2-마이크로글로블린 (Sigma사제) 및 0.5% 소 혈청 알부민을 함유하는 DMEM 배양액에서 2×10⁶세포/㎖의 농도로 현탁하였다. 세포현탁액 15㎕를 각종 농도의 WT1 펩티드를 함유하는 배양액 50㎕과 혼합하고, 실온에서 4시간 동안 배양하였다. 세포를 세정한 후, FITC로 표지한 HLA-A24에 대한 모노클로날 항체(클론명: 7A12)로 염색하고, 플로우 사이토미터(flow cytometer) FACS 시스템으로 HLA-A24 발현량을 해석하였다. 동일한 조작을 HLA-A^*2402에 결합하는 것이 보고되어 있는 색소세포종항원의 pmel 15의 항원 펩티드(Ala Tyr Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Leu)(Sequence ID No. 4)(J.Immunol., 154, 5994, 1995)에서도 수행하고, 이것을 표준품으로 사용하고, WT1 펩티드의 해리정수(Kd)를 문헌(Immunogenetics, 51:816, 2000)에 기재된 방법으로 산출하였다. 결과는 표 2에 나타냈다.

표 2

펩티드	해리정수 Kd(M)
WT1 와일드 펩티드	1.82×10^-8
WT1 개변 펩티드	6.40×10^-7

이 표에서 명백한 바와 같이, WT1 개변 펩티드는 WT1 와일드 펩티드보다도 HLA-A*2402으로의 결합친화성이 강했다.

상기 결과로부터, 본 발명의 펩티드는 확실히 암항원으로서 기능하고, 암세포에 대한 킬러 T-세포(암세포독성T세포)를 유도 증식하는 것이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 암항원펩티드는 WT1 유전자의 발현의 상승에 따른 백혈병 및 고형암에 대한 암 백신으로서 유용하다.

Claims

9-30개의 아미노산으로 이루어지고, 다음과 같은 아미노산 서열: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(Sequence ID No. 3)을 포함하는 펩티드를 유효 성분으로 하는 암 항원 펩티드.
제 1항에 있어서, 9-12개의 아미노산으로 이루어지고, 상기 Sequence ID No. 3에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 암 항원 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 Sequence ID No. 3에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 암 항원 펩티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 유효 성분으로 하는 암 백신.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 코드하는 DNA를 유효 성분으로 하는 암에 대한 DNA 백신.
HLA 항원과 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 복합체가 제시되어 있는 항원제시세포.
HLA 항원과 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 복합체를 인식하는 세포독성 T-세포.