DE19603668A1

DE19603668A1 - Expression von TAP und LMP in Tumorzellen

Info

Publication number: DE19603668A1
Application number: DE19603668A
Authority: DE
Inventors: Barbara Seliger; Christoph Huber
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1996-02-02
Publication date: 1997-08-07

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Steigerung der Immunantwort auf einen Tumor durch Transfektion von Tumorzellen mit Nukleinsäuren, die für TAP und/oder LMP kodie ren, Verfahren zum Auffinden von Tumorantigenen, transfizierte Tumorzellen, die Verwen dung TAP- und/oder LMP-spezifischer Nukleinsäuren für diese Verfahren sowie zur Her stellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.

Im Stand der Technik sind die Gene für TAP-1 (= RING 4) und TAP-2 (= RING 11) sowie LMP-2 (= RING 10) und LMP-7 (= RING 12) bekannt (WO 92/1 Restifo et al., J. Exp. Med. 177: 265-272 (1993); Glynne et al., Nature 353: 357 (1991); Bahram et al., Proc. Natl. Acad Sci. 88: 10094-10098 (1991); Powis et al., Nature 354: 528 (1991); Brown et al., Nature 353: 355 (1991); Ortiz-Navarrete et al., Nature 353 : 662 (1991); Townsend et al., Cell 62: 285-295 (1990); Trowsdale et al., Nature 348 : 741-744 (1990)). Sie spielen eine Rolle bei der MHC-Klasse-I-vermittelten Antigenpräsentation. LMP-2 und -7 sind Bestandteile des Proteasoms, eines ATP-abhängigen zytosolischen proteolytischen Proteinkomplexes. TAP-1 und -2 gehören der Familie der ABC-Transporter an. Sie bilden einen heterodimeren Komplex in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) und transportieren Peptide, die vom Proteasom durch den Verdauung von Proteinen erzeugt wer den, vom Zytosol in das Innere des ER-Lumens (Fig. 1). Die WO 92/11289, auf die hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschreibt die Klonierung und Charakterisierung der genannten Gene aus humanen Zellen. Ferner wird dort über die Transfektion von TAP-2- cDNA in eine TAP-2-defiziente Zellinie (BM36.1) berichtet, wodurch eine Verbesserung der Antigenpräsentation dieser Zellen erreicht worden sei. Restifo et al., loc. cit., auf die ebenfalls vollinhaltlich Bezug genommen wird, identifizierten menschliche Tumorzellinien des kleinzelligen Lungenkarzinoms mit niedriger oder nicht nachweisbarer Expression von TAP-1, -2, LMP-2 und -7, die eine gestörte Antigenpräsentation aufweisen. Durch Be handlung der Zellen mit Interferon-γ konnte die Expression dieser Gene gesteigert und die Antigenpräsentation verbessert werden. Die Autoren spekulieren, daß eine reduzierte Antigenprozessierung eine der Strategien sein könnte, mit der Tumorzellen dem Immun system entkommen. Die Verstärkung der Antigenprozessierung durch Erhöhung der Transkription MHC-kodierter Proteasom- und Transportergene könnte daher therapeuti sche Anwendung finden.

Verschiedene Strategien wurden gewählt, um die Natur von Antigenen zu bestimmen, die von tumorreaktiven CTLs erkannt werden. Bis heute ist die Identität dieser Antigene größtenteils unbekannt geblieben. Lediglich Melanom-assoziierte Antigene wurden defi niert. Sowohl der genetische als auch der biochemische Ansatz resultierten in der Identifi zierung von Antigenen, die von CTL erkannt wurden. Diese gehören zur MAGE-Familie, Tyrnsinase, gp100, und Mart-1/Melan-A. Die von MAGE-1 und MAGE-3 kodierten Anti genpeptide werden von dem MHC-Klasse-I-Molekül HLA-A1 präsentiert, wohingegen das Tyrosinaseantigen von HLA-A2 präsentiert wird. Unter Verwendung des T2-Assays wur den neue Peptide von MAGE-2, die an HLA-A2 binden, identifiziert. Sehr wichtig ist, daß eine primäre CTL Antwort mit antigenen Peptiden von MAGE-2 und MAGE-3 induziert werden kann, wie es schon früher für Peptide gezeigt wurden, die von p53 und humanem Papillomavirus abgeleitet waren. T. Boon und Mitarbeiter entwickelten ein Verfahren zum Auffinden von Tumorantigenen, bei dem tumorspezifische CTL durch Mischkultur von pe ripheren Blutlymphozyten mit Tumorzellen erzeugt wurden (Coulie et al., J. Immunother. 14(2): 104-9 (1993)). Genomische DNA aus diesen Tumorzellen wurde dann in eine CTL- resistente Variante dieser Tumorzellen transfiziert und Transfektanten identifiziert, die in der Lage waren, die tumorspezifischen CTL zu stimulieren. Dann wurde aus den selektier ten Transfektanten das Gen kloniert, das diese Eigenschaft vermittelte, also ein Tumoranti gen kodierte.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zu finden, mit dem die Immunantwort auf einen Tumor gesteigert werden kann, sowie Mittel für solche Verfahren bereitzustellen. Ferner sollte ein Verfahren gefunden werden, mit dem effizienter neue Tu morantigene identifiziert werden können.

Diese Aufgaben konnten mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der Immunantwort auf eine Tumorzelle durch Steigerung der intrazellulären TAP- und/oder LMP-Konzentration, das dadurch ge kennzeichnet ist, daß eine oder mehrere Nukleinsäuren in die Tumorzelle eingebracht wer den, die für TAP-Protein und/oder LMP-Protein kodieren, und die Expression dieser Nu kleinsäuren in der Tumorzelle bewirkt wird. Bevorzugt sind dabei die Gene, die für TAP-1, TAP-2, LMP-2 und/oder LMP-7 kodieren. Die einzubringende Nukleinsäure ist vorteilhaft in Form eines oder mehrerer Expressionsvektoren, gegebenenfalls Doppel- oder Mehrfach expressionsvektoren. Die Nukleinsäure oder die Nukleinsäuren können beispielsweise durch Elektroporation oder Liposomenfusion in die Tumorzelle eingebracht werden. Vorteilhaft sind auch Transfektionsverfahren, bei denen die Nukleinsäure oder die Nukleinsäuren mit einem Konjugat komplexiert sind, das ein endosomolytisches Agens und ein DNA-binden des Agens enthält. Insbesondere kann das endosomolytische Agens ein inaktivierter Ade novirus und das DNA-bindende Agens Polylysin sein (Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154 (1992)).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur gentherapeuti schen Behandlung von Tumorerkrankungen. Dabei handelt es sich insbesondere um Verfah ren, bei denen einem Patienten Tumorgewebe entnommen wird, und in die Tumorzellen eine Nukleinsäure oder Nukleinsäuren eingebracht werden, die für TAP-Protein und/oder LMP- Protein kodieren, die Expression dieser Nukleinsäuren in der Tumorzelle bewirkt wird, und diese Tumorzellen wieder in den Körper des Patienten eingebracht werden. Bevorzugt sind dabei die Gene, die für TAP-1, TAP-2, LMP-2 und/oder LMP-7 kodieren. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn die Teilungsfähigkeit der Tumorzellen vor der Einbringung in den Kör per des Patienten zerstört wird. So hergestellte Transfektanten können als Tumorvakzine verwendet werden. Zusätzlich können weitere Gene in die Tumorzellen eingebracht werden, die die Immunantwort auf diese Tumorzellen erhöhen, beispielsweise Interleukin-2 (IL-2) oder GM-CSF.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden von Tumorantigenen, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) die Antigenpräsentation von Tumorzellen durch die Einführung und Expression von einer oder mehrerer Nukleinsäuren, die für TAP-1 und/oder TAP-2 und/oder LMP-2 und/oder LMP-7 kodieren, gesteigert wird,
(b) tumor-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) durch Mischkultur von Lymphozyten mit den aus (a) erhaltenen Tumorzellen erzeugt werden,
(c) in CTL-resistente Zellen Cosmid-Klone, genomische DNA oder Komplementär- DNA (cDNA) eingebracht und zur Expression gebracht wird, die aus den erwähnten Tu morzellen erhalten oder abgeleitet ist,
(d) Transfektanten selektiert werden, die die Eigenschaft haben, die aus (b) erhalte nen tumorspezifischen CTL zu stimulieren, und
(e) das transfizierte Gen kloniert wird, das diese Eigenschaft vermittelt.

Der entscheidende Schritt gegenüber dem Stand der Technik ist dabei, daß die Anti genpräsentation der Tumorzellen, die zur Erzeugung der tumorspezifischen CTL verwendet werden, durch Transfektion und Expression von Nukleinsäuren, die für TAP- und/oder LMP-Proteine kodieren, gesteigert wird. Die Stimulierung der tumorspezifischen CTL kann beispielsweise dadurch gemessen werden, daß die TNF-α-Produktion der entsprechenden CTL-Klone nach Inkubation mit den Transfektanten gemessen wird.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Tumorzellen, in die eine oder mehrere Nukleinsäuren eingebracht wurden, die für ein oder mehrere TAP-Proteine und/oder LMP-Proteine kodieren, sowie die Verwendung solcher Tumorzellen als Tumor vakzine oder zur Herstellung tumorspezifischer CTL.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Nuklein säure, die für ein oder mehrere TAP-Proteine und/oder LMP-Proteine kodiert, zur Steige rung der Immunantwort auf eine Tumorzelle.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Nuklein säure, die für ein oder mehrere TAP-Proteine und/oder LMP-Proteine kodiert, zum Auffin den von Tumorantigenen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Nuklein säure, die für ein oder mehrere TAP-Proteine und/oder LMP-Proteine kodiert, zur Herstel lung eines Mittels zur Behandlung von Krebserkrankungen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) gegen autologe Tumorzellen, dadurch gekennzeich net, daß

(a) in Tumorzellen aus Biopsiematerial oder davon abgeleitete Tumorzellen eine oder mehrere Nukleinsäuren eingebracht werden, die für TAP-Protein und/oder LMP-Protein kodieren, und die Expression dieser Nukleinsäure oder dieser Nukleinsäuren in den Tumor zellen bewirkt wird,
(b) die so behandelten Tumorzellen mit Lymphozyten in Kontakt gebracht werden, vorzugsweise in Mischkulturen mit Lymphozyten gehalten werden.

Zur weiteren Verbesserung der Antigenprozessierung/Antigenpräsentation können die genannten antigenpräsentierenden Zellen mit einem Zytokin, insbesondere Interferon-γ, sti muliert werden.

Die Gewinnung von Tumorzellen, zum Beispiel aus Biopsiematerial von Patienten, kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen. Ebenso können Verfahren zur Isolierung von TAP- und LMP-Genen (s. die oben genannten Literaturstellen, insbesondere WO 92/11289), zur Konstruktion eukaryontischer Expressionsvektoren (Sambrook et al., Mo lecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour 1989, 16.3- 16.73) sowie zur Einbringung der Konstrukte in Tumorzellen dem Stand der Technik ent nommen werden (Curiel et al., loc. cit., Sambrook et al., loc. cit). Es können auch Mehr fachexpressionsvektoren, z. B. Doppelexpressionsvektoren verwendet werden, die die Ex pression von mehr als einem Gen steuern können. Verfahren zur Elektroporation, zur Lipo somenfusion oder zum Einbringen von Komplexen aus DNA, Polykationen und gegebenen falls adenoviralen Partikeln sind ebenfalls aus der Literatur bekannt (Curiel et al., loc. cit.; Sambrook et al., loc. cit.). Das Hygromycin-Gen oder das Neomycinresistenz-Gen können beispielsweise als Selektionsmarker verwendet werden. Nach stabilem Transfer der TAP- und/oder LMP-Gene (z. B. Selektion der Transfektanten mit Hygromycin bzw. G-418) kann ihre Integration und Expression in den Zellinien durch Southern, Northern Blot und FACScan Analysen nachgewiesen werden. Der Erfolg der Transfektion kann ferner mit den in den Beispielen beschriebenen Versuchen überprüft werden, die Effizienz des TAP-ab hängigen Peptidtransports beispielsweise mit dem Peptidtranslokationsversuch (s. Bei spiele). Der Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch über die CTL-vermittelte allogene Lyse von Tumorzellen überprüft werden, wie sie in den Beispielen unten beschrie ben wird. Für die Zerstörung der Teilungsfähigkeit der Tumorzellen vor dem erneuten Ein bringen in den Körper des Patienten sind Standardmethoden bekannt. Gentherapeutische Strategien und Applikationsprotokolle, in denen die erfindungsgemäßen Verfahren ange wendet werden können, sind in der Literatur bekannt (Morgan et Anderson, Ann. Rev. Bio chem. 62: 191-217 (1993), und Referenzen darin; Mulligan, Science 260 : 926-932 (1993)). Für die Herstellung tumorspezifischer CTL sind ebenfalls Protokolle in der Literatur be kannt. Insbesondere können für die Mischkultur Lymphozyten aus peripherem Blut verwen det werden.

Zytokine, die immunmodulatorisch wirken, sowie deren Herstellung sind aus der Lite ratur bekannt. So ist insbesondere die Herstellung von Interferon-γ bekannt (Arakawa et al., J. Biol. Chem. 260: 14435-9 (1985)).

Fig. 2 stellt eine Möglichkeit dar, erfindungsgemäß neue Tumorantigene aufzufinden. Tumorzellen werden mit Expressionsvektoren transfiziert, die TAP- und/oder LMP-Gene enthalten. Die Transfektanten zeigen eine verbesserte Antigenpräsentation und eignen sich daher besser zur Generierung spezifischer CTL. Diese werden beispielsweise durch Misch kultur mit mononuklearen Zellen oder Lymphozyten aus peripherem Blut erzeugt. Dann wird genomische DNA aus den Tumorzellen oder cDNA, die von mRNA aus den Tumor zellen abgeleitet ist, in CTL-resistente Zellen, z. B. eine CTL-resistente Variante der Tumor zellen oder COS-7-Zellen transfiziert und zur Expression gebracht. Transfektanten, die tu morspezifische CTL stimulieren können, exprimieren ein Tumorantigen. Solche Transfek tanten werden selektiert und das Gen für das Tumorantigen isoliert bzw. kloniert. Dabei kann nach dem von T. Boon et al. (Boon, Genetic analysis of tumor rejection antigens, Adv. Cancer Res. S8: 177-210 (1992); Coulie et al., loc. cit.) entwickelten Verfahren vorgegan gen werden.

Durch das Einbringen von TAP- und/oder LMP-Genen wird die Immunogenität von Tumorzellen wirksam gesteigert. Dies kann zur Therapie von Krebserkrankungen, nament lich in der Gentherapie, insbesondere in Form von Tumorvakzinen ausgenutzt werden. Ein weitere Anwendungsschwerpunkt liegt in Verfahren zum Auffinden von Tumorantigenen. Hier können entsprechende Transfektanten zur effizienteren Herstellung tumorspezifischer CTL verwendet werden.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 gibt eine schematische Übersicht über die MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation.

Fig. 2 erläutert die Strategie zur Identifizierung von Tumorantigenen, die von T-Zel len erkannt werden können.

Fig. 3 stellt die alternative Nomenklatur der TAP- und LMP-Gene dar.

Fig. 4a und b zeigen die Lyse der RCC-Zellinien MZ1851RC und MZ1851LN durch HLA-B7-restringierte CTL. Man erkennt, daß die Zugabe von IFN die spezifische Lyse steigert. Es ist ferner zu sehen, daß Zellen, die aus einer Lymphknotenmetastase (LN) eta bliert wurden, eine schlechtere Lyse zeigen als solche, die aus dem entsprechenden Primär tumor (RC) gewonnen wurden.

Fig. 5 zeigt die Karte des verwendeten Expressionsvektors für TAP-1.

Fig. 6 zeigt die Karte des verwendeten Expressionsvektors für TAP-2.

Fig. 7 zeigt die ATP-Abhängigkeit der Peptidtranslokation und unterschiedliche Pep tidtransportraten zwischen MZ1851RC und MZ1851LN. Die verschiedenen Peptide wurden in der Anwesenheit oder Abwesenheit von ATP in Streptolysin-O-permeablisierten MZ1851NN, MZ1851RC und MZ1851LN-Zellen transloziert. Translozierte Peptide wur den mit ConA-Sepharose isoliert, quantifiziert und als Prozent des zugegebenen Peptids ausgedrückt. Die benutzten Peptide waren 10mere: #63 (RYWANATRSI), #56 (RYWANATRSR, #67 (RYWANATRSF), #600 (TNKTRIDGQY).

Fig. 8 zeigt die verschiedenen Effizienzen der Peptidtransportrate in normalen Nie renzellen (NN), primären (RC) und metastatischen (LN) Läsionen. Peptid #67 wurde für einen Vergleich der Raten der Peptidtranslokation in normalen epithelialen Nierenzellen (MZ1851NN), primären RCC-Zellen (MZ1851RC) und metastatischen Läsionen (MZ1851LN) benutzt. Vgl. auch Fig. 7.

Fig. 9 zeigt die Suppression aller H-2 Loci in RMA-Zellen durch ras-Transformation. Immunfluoreszenzanalysen wurden wie beschrieben ausgeführt. NIH LTRpEJrasC13 -Zellen und parentale NIH3T3-Zellen wurden mit den H-2-locusspezifischen und ras-mAb gefärbt. Die Ergebnisse sind als mittlere spezifische Fluoreszenzintensität ausgedrückt.

Fig. 10 zeigt die erniedrigte Lyse von RMAras-Zellen durch CTL 10BK. 1. Die Zyto toxizität wurde in einem Standard-Chrom-Freisetzungs-Assay wie beschrieben gemessen. Die Lyse wurde in % berechnet.

Beispiele Methoden Zellinien und Zellkultur

Verschiedene Nierenkarzinomzellinien, wie z. B. Zellinie MZ1851RC (primäre Tu morzellinie) und die Zellinie MZ1851LN (Lymphknotenmetastase des gleichen Patienten), ferner die Zellinien MZ1879RC und MZ1940RC wurden etabliert. HLA-Typisierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBM) der Patienten wurde durchgeführt.

Um die Tumorzellinien zu etablieren, wurde frisches Tumormaterial enzymatisch verdaut und Einzelzellsuspensionen in CMRL-Medium (Seromed) inkubiert, das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM Glutamin, Penicillin und Streptomycin supplementiert war. Beide Zellinien konnten für mehr als 25 Passagen kultiviert werden, ohne daß sich ihr Phänotyp veränderte. Die Isolierung von Kurzzeitkulturen von normalem korrespondieren dem Nierengewebe der gleichen Patienten wurde analog zur Etablierung der Langzeitkult zuren durchgeführt (MZ1851NN, MZ1879NN, MZ1940NN). Kurzzeitkulturen konnten jedoch nur für maximal 10 Passagen aufrechterhalten werden. Die murine T-Lymphom- Zellinien RMA, die daraus abgeleitete Mutante RMA-S die eine Punktmutation im TAP-2- Gen hat (Ljunggren et Kärre, J. Exp. Med. 162: 1745 (1985)), die humane lymphoblastoide Zellinie T2 (Hosken et Bevan J. Exp. Med. 175: 719 (1992)) und murine NIH3T3-Zellen, dienten als Kontrollen in Temperatur-Shift-Experimenten. Melanomzellen wurden analog etabliert und kultiviert.

Vektoren

Die Gene für TAP-1, TAP-2, LMP-2 bzw. LMP-7 wurden in den kommerziell erhält lichen Expressionsvektor pcDNA3 (TAP-1neo, phuTAP1, TAP2neo) kloniert (vgl. Fig. 5 und 6), der das Neomycin-Resistenzgen trägt.

Elektroporation

Für die Elektroporation wurden 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ Zellen in 1 ml PBS vorsichtig mit 20 µg Plasmid-DNA gemischt und 15 Minuten auf Eis gekühlt. An die Suspension wurde in einem BIO-RAD Genpulser Apparatus ein Puls (Richmond (CA)) bei einer Kapazität von 960 µF und einer Spannung von 250 Volt angelegt. Nach der Elektroporation wurden die Zellen für 10 Minuten auf Eis zurück und anschließend in Nährmedium gegeben. In einem anderen Protokoll wurden 2.5 × 10⁶ Zellen mit 10 µg linearisiertem TAP1-Expressions plasmid (TAP-1neo, phuTAP1, TAP-2neo) in einem Elektroporationsgerät (Fischer, Hei delberg, Deutschland) bei 330 V, 1200 mF und 2 msec transfiziert.

Selektion von neo®-Klonen

Die Häufigkeit der stabilen Tranformation wurde durch Transfektion von 20 µg des Plasmides pAG60 kontrolliert, das das Neomycinresistenzgen (neo®) unter der Kontrolle des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinasepromotors (Colbère-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981)) enthält. Stabile Transformanten wurden 48 h nach der Transfektion durch Selektion in einem Medium isoliert, daß mit 100-500 µg/ml G-418 (GIBCO, Heidel berg, Deutschland), abhängig von der Zellinie, vorzugsweise 200 µg/ml, supplementiert wurde. 2 Wochen danach wurden die Zahl der neo®-Klone bestimmt.

JFN-Behandlung

Es wurde menschliches rekombinantes IFN-α mit einer spezifischen Aktivtät von 1.8 × 10⁸ U/mg Protein (Essex-Pharma, München, Deutschland) und IFN-γ mit einer spezifi schen Aktivtät von 3 × 10⁶ U/mg Protein (Thomae, Biberach, Deutschland) verwendet. Ad härente Tumorzellen wurden über die angegebene Zeit mit 50 ng/ml IFN-α oder IFN-γ be handelt. Eine Dosis-Wirkungsanalyse ergab, daß die IFN-α/γ Konzentration in keiner der beiden Zellinien zytotoxische Effekte verursachte, aber in der Lage war, MHC-Klasse-I- Oberflächenexpression zu induzieren.

Norhern blot Analyse

Zelluläre Gesamt-RNA von 5 × 10⁷ Zellen wurde mit einer Guanidinium-Iso thiocyanat-Extraktion und einer Cäsiumchloridzentifugation nach Chirgwin et al. isoliert (J. Biochem. 18: 5294 (1979)). 20 µg Gesamt-RNA wurde der Gelelektrophorese in einem 1%igen Agarose-Formaldehydgel unterworfen, größenfraktioniert und auf Nylonmembra nen (Hybond, Amersham Buchler, Braunschweig, Deutschland) transferiert. Die Blots wur den nacheinander mit spezifischen cDNA-Sequenzen hybridisiert, die die gesamten kodie renden Regionen von TAP-1, TAP-2 (Spies et al. Nature 348: 744 (1990)), β₂-m, HLA, LMP-2 und LMP-7 (Ortiz-Navarette et al. Nature 353: 663 (1991)) enthielten und mit ³²P nach der random-priming-Prozedur markiert waren (Feinberg et Vogelstein, Anal. Biochem. 132: 6 (1984)). Die Hybridisierungen wurden bei 42°C über Nacht in einer 50%igen For mamidlösung ausgeführt, die 4 mg tRNA, 0.5% SDS und 5 × Denhardts Lösung enthielt. Die Membranen wurden dann 3 × bei 42°C für 10 Minuten mit abnehmenden Salzkonzen trationen gewaschen. Mit den Blots wurden über Nacht Kodak X-OMAT AR Filme (Kodak Rochester, NY) belichtet. Die Genexpression wurde durch densitometrische Analyse und Autoradiogramme quantifiziert. Um geringfügige Abweichungen der RNA-Beschickung zu korrigieren, wurde jede Spur auf das 28S/18S-Signal normalisiert.

Immunfluoreszenzanalyse

Immunfluoreszenzanalyse wurde ausgeführt mit einem monkionalen Antikörper (mAb) MsIgG (Negativkontrolle; Coulter Clone), den Hybridomaüberständen W6/32, der HLA-A,-B,-C-Locus-Produkte, die mit β₂-Microglobulin komplexiert sind (β₂-m; Brodsky et al. Immunol. Rev. 47: 342 (1979)), erkennt, BB7.2, der HLA-A2. 1 erkennt, 148.3, der TAP-1 erkennt (Meyer et al., FEBS Lett 351: 443-447 (1994)), BBM1, (Institut für Hu mangenetik, München, Deutschland), der freies und komplexiertes β₂-m erkennt, 20-8-4 S, der H-2K^bD^b (American Typ Tissue Culture Collection) und 34-1-2S, der H-2K^dD^d er kennt. Der Zweitantikörper war FITC-markierter Ziegen-anti-Maus-Antikörper (Becton Dickinson). Vor der Färbung mit dem mAb 148.3, der gegen TAP-1 gerichtet ist, wurden die Zellen für 30 Minuten auf Eis mit 70%igem Ethanol permeabilisiert. Für die Zytofluo metrie wurden 5 × 10⁵ bis 1 × 10⁶ Zellen mit einem Überschuß des jeweiligen Antikörpers für 30 Minuten bei 4°C inkubiert und gelegentlich geschüttelt, 2 × mit eiskaltem PBS ge waschen und dann im Dunkeln mit FITC-GAM für weitere 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden 2 × mit PBS gewaschen und mit einem FACScan Analyzer analysiert (Becton Dickinson). Zytofluometrie wurde wenigstens dreimal durchgeführt. In FACScan- Histogrammen repräsentiert die vertikale Achse die relative Zellzahl und die horizontale Achse den log der Fluoreszenzintensität. Die Daten sind als Fluoreszenzintensität dargestellt und stellen den Mittelwert von wenigstens zwei unabhängigen Experimenten dar.

Peptidsynthese und Peptidbindungsanalyse

Peptide wurden auf der Festphase mit F-moc für vorübergehenden NH₂-terminalen Schutz mit einem AMS multiple synthesizer (Abimed, Langenfeld, Deutschland) syntheti siert, durch HPLC gereinigt und durch Aminosäureanalyse charakterisiert.

Die für die Peptidbindungsanalyse verwendeten Peptide waren HLA-A2 bindendes HIV-Peptid IV9 (HIVpol 510-518; ILKEPVHGV) und das H2L^d bindende CMV-Peptid (CMV 168-176, YPHFMPTNL). 5 × 10⁵ Zellen wurden für 15-18 Stunden in serumfreien Medium inkubiert, das menschliches β₂-Microglobulin (Sigma, St. Louis USA) bei einer Konzentration bei 2.5 kg/ml und 0.5% DMSO enthielt, oder in dem gleichen Medium, das zusätzlich zu dem β₂-Microglobulin die jeweiligen Peptide in einer Konzentration von 100 µ M enthielt. Peptide wurden vorher in DMSO aufgelöst. Die Endkonzentration an DMSO betrug 0.5%. Peptidmarkierte Zellen wurden durch indirekte Immunfluoreszenzanalyse wie beschrieben angefärbt.

Peptidfranslokationsassay

Die Effizienz des TAP-abhängigen Peptidtransportes vom Zytosol in das ER kann anhand von verschiedenen Modellpeptiden durch den sogenannten Peptidtranslokationsver such bestimmt werden. Die Peptidtranslokationsversuche können eingesetzt werden, um den Peptidtransport von primären Tumorzellinien, ihren Metastasen und Kulturen aus nor malem Gewebe zu vergleichen. Dies gibt dann eine direkte Aussage über die Aktivität des TAP-Heterodimers in den entsprechenden Zellen und zeigt funktionelle TAP-Defizienzen auf.

Peptide wurden auf der Festphase mit F-moc für vorübergehenden NH₂-terminalen Schutz mit einem AMS multiple synthesizer (Abimed, Langenfeld, Deutschland) syntheti siert, durch HPLC gereinigt und durch Aminosäureanalyse charakterisiert. 10 µg des jewei ligen Peptides wurden mit der Chloramin-T-Methode iodiniert (Neefjes et al., Science 261: 769 (1993)) und hatten eine spezifische Aktivität von 20-50 µCi/µg. Weiter wurde nach bekannten Protokollen verfahren (Neefjes et al., loc. cit.; Momburg et al., J. Exp. Med. 179: 1613 (1994)). 2.5 × 10⁶ Zellen/Inkubation wurden geerntet und einmal mit Inkuba tionspuffer (130 mM KCI, 10 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.3) gewaschen. Dann wurden die Nierenkarzinomzellen durch die Behandlung mit 2 IU Streptolysin O/ml (Wellcome Reagent Ltd., Beckenham, UK) in 50 µl Inku bationspuffer für 15 min bei 37°C permeabilisiert und die so behandelten Zellen mit 10 µl ¹²⁵I-iodierten, mit einer Glykosylierungstelle ausgestatteten Peptiden in der An- oder Ab wesenheit von 10 µl 10 mM ATP (Boehringer Mannheim, Deutschland) in einem Endvo lumen von 100 µl für weitere 15 min bei 37°C inkubiert. Die Peptidtranslokation wurde durch Lyse der permeabilisierten Zellen mit 1 ml NP-40 Lysismix inhibiert. Kerne wurden entfernt, glykosylierte Peptide wurden mit ConA-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schwe den) wie beschrieben erhalten (Neefjes et al., loc. cit) und in einem γ-Zähler quantifiziert. Die Daten wurden als Prozentsatz gebundenen Peptids in Bezug auf das zugegebene Peptid ausgedrückt.

Bestimmung der CTL-mediierten Zytotoxizität

Um die Rolle von TAP und LMP für die Erkennung durch das Immunsystem zu über prüfen, kann zum einen mit allogenen, zum anderen mit autologen MHC Klasse I-restrin gierten CTLs gearbeitet werden.

Für die CTL-vermittelte allogene Lyse der Tumorzellinien wurden zwei unterschied liche Strategien gewählt: Zum einen wurde ein rekombinantes Vacciniasystem verwendet, zum anderen über peptidspezifische MHC-restringierte CTLs Lyse nachgewiesen. Zunächst wurde durch Infektion mit rekombinantem Vaccinia-Virus, welches das K^d-Gen enthält (Vac-K^d), die Effizienz der Antigenprozessierung mittels eines Zytotoxizitätsversuchs in den ausgewählten Tumorzellinien determiniert. Das rekombinante Vac-K^d-Virus sowie die entsprechenden K^d-restringierten, Vac-spezifischen CD8-positiven LAK-Zellen sind aus der Literatur bekannt (Restifo et al., loc. cit.). Für dieses Experiment wurden die Tumorzellen mit 10 PFU/Zelle K^d-exprimierendem Vaccinia-Virus für 2 Stunden infiziert, dann für eine Stunde mit Na⁵¹CrO₄ markiert, bevor sie für 4 Stunden mit CD8 positiven Zellen inkubiert wurden. Danach wurde das freigesetzte ⁵¹Cr im γ-Szintillationszähler gemessen und die spezifische Zellyse errechnet. Die Lyse der Tumorzellen stellt ein direktes Maß der Kapazi tät der verschiedenen Tumorzellinien dar, den K^d-restringierten, Vac-spezifischen CD8-po sitiven T-Zellen Vac-Antigene zu präsentieren, und damit der Effizienz ihrer Antigenpro zessierung.

Mit dem gleichen experimentellen Ansatz wurde geprüft, ob die Effizienz der Anti genprozessierung bei Verwendung des oben beschriebenen rekombinanten Vac-K^d-Systems in den TAP- bzw. LMP-Transfektanten im Vergleich zu den parentalen Tumorzellen verbessert ist, was durch eine gesteigerte Lyse der Tumorzellen nachgewiesen wird.

Ferner konnte in den HLA-A2 exprimierenden Tumorzellinien mit einem HLA-A2-re stringierten Influenza-Matrix-Peptid und dem Einsatz von Peptid-spezifischen CTLs gezeigt werden, daß die parentalen Tumorzellinien effizient lysiert werden können, und daß die Ly se von TAP- und/ oder LMP-Transfektanten verbessert ist.

CTL-Klone, die gegen autologe RCC-Zellinien gerichtet waren, wurden durch ge mischte Lymphozyten-Tumorzellkultur unter Verwendung von peripheren Blutlymphozyten erzeugt. Der CD8⁺, CD4⁻ CTL Klon MZ1257-CTL5/30 mit hoher zytolytischer Aktivität für die autologe RCC-Zellinie MZ1257RC wurde etabliert und für die Bestimmung seiner zytolytischen Aktivtät auf allogene RCC-Zellinien und K562-Zellen verwendet. Die Mes sung der Zytotoxizität wurde mit einem Standard-⁵¹Cr-Freisetzungsassay gemessen.

Beispiel 1 MHC-Klasse I- und TAP-1-Expression ist in RCC-Zellinien reduziert

Zellinien von Patienten mit metastatischen Nierenzellkarzinomen (RCC) wurden aus Primärtumoren und in einem Fall aus einer Lymphknotenmetastase etabliert. Die Proteinex pression von schwerer und leichter Kette des MHC Klasse I sowie von TAP-1 in diesen RCC-Linien wurde mit derjenigen von Kurzzeitkulturen entsprechenden normalen Nieren zellgewebes der gleichen Patienten verglichen. Es wurden indirekte Immunofluoreszenzana lysen durchgeführt, wobei die monoklonalen Antikörper W6/32, der HLA-A, -B, -C-Ketten, die mit β₂-m assoziiert sind, erkennt, BBM1, der mit freiem und gebundenem β₂-m reagiert, und mAb 148.3, der TAP-1-Protein erkennt, verwendet wurden (Tabelle 1). In den normalen Epithel-Kulturen MZ1851NN, MZ1879NN und MZ1940NN wurde eine starke positive Färbung für TAP-1 und MHC Klasse I gefunden, wohingegen in allen RCC-Zellen ein er niedrigtes TAP-1- und MHC Klasse I-Expressionsmuster beobachtet wurde (Tabelle I). In mutanten T2-Zellen war die TAP-1-Färbung negativ, und mit dem mAb W6/32 wurde nur eine schwache Färbung dieser Zellen erhalten. Im Vergleich zu normalen Nierenzellen war die Proteinexpression sowohl von TAP-1 als auch MHC Klasse I in primären RCC-Linien herunterreguliert. In der Zellinie, die aus einer Lymphknotenmetastase abgeleitet wurde, war das Expressionsniveau noch weiter erniedrigt (Tabelle 1). Um das Muster der MHC Klasse I-Erniedrigung weiter zu analysieren, wurde die Expression von HLA-A2 im MZ1851- und MZ1879-System bestimmt. Wieder hatten die normalen Nierenzellen MZl851NN und MZ1879NN die größte Oberflächenexpression im Vergleich zu den malig nen Gegenstücken. Zusätzlich war in den MZ1851LN-Zellen die HLA-A2-Expression noch weiter supprimiert (Tabelle 1). Das Ausmaß der Herunterregulierung von HLA-A-Allelen war vergleichbar mit dem, das mit dem mAb W6/32, der gegen monomorphe Komponenten des HLA-Moleküls gerichtet ist, detektiert werden konnte.

Tabelle 1

Expression von TAP, B₂-m, MHC I und HLA-A2 in normalen Nierenzellen und Nierenkarzinomzellen

Beispiel 2 Reduzierte oder fehlende Expression von LMP, TAP, β₂-m und HLA nicht nur in Nierenkarzinomzellinien, sondern auch in Melanomzellen

Verschiedene Melanomzellinien wurden mit den oben beschriebenen Methoden auf die Expression von LMP, TAP, β₂-Mikroglobulin und HLA untersucht. Northern Blot so wie Durchflußzytometrie ergaben eine heterogene Expression von TAP, LMP, MHC (schwere und leichte Kette) in den getesteten Melanomzellinien. Eine Melanomzellinie war vollständig negativ für TAP, LMP und MHC Klasse I Expression.

Tabelle 2

Heterogene MHC Klasse I-Membranexpression von Melanomzellinien

Beispiel 3 Effekte erniedrigter Temperatur auf die MHC Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche von Melanomzellen, RCC- und normalen Nierenepithelzellen

Da nur der trimere MHC/β₂-Mikroglobulin/Peptidkomplex stabil auf der Zelloberflä che exprimiert wird, führt eine TAP- bzw. LMP-Defizienz unter normalen Kulturbedingun gen zu einer verminderten oder fehlenden MHC Klasse I-Membranexpression, während In kubation dieser Zellen bei niedrigen, unphysiologischen Temperaturen den dimeren β₂-Mi kroglobulin/MHC-Komplex stabilisiert und damit eine Erhöhung der MHC-Membranex pression bewirkt. Ebenfalls kann eine Stabilisierung der Membranexpression von MHC Klasse I-Genen durch die exogene Zugabe von MHC Klasse I-spezifischen Peptiden hervor gerufen werden. Solche Temperaturshift- und exogene Peptidbeladungsexperimente geben einen Hinweis, ob die verminderte MHC Klasse I-Membranexpression auf Defizienz der Gene der Antigenprozessierungsmaschinerie beruhen. Aus diesem Gründe wurden diese beiden Versuchansätze mit den ausgewählten Tumorzellinien im Vergleich zu den korre spondierenden normalen nicht malignen Gewebekulturen durchgeführt, wobei für die Pep tidbeladungsexperimente die HLA-Phänotypisierung der Zellen Voraussetzung ist.

MHC Klasse I Membranexpression wurde in Melanomzellen nach paralleler Inkuba tion der Zellen bei 37°C und 26°C für 36 Stunden bestimmt.

Tabelle 3

Stabilisierung von MHC Klasse I durch Temperaturshift

MHC Klasse I/β₂-m-Komplexe, die kein Peptid tragen, werden bei 26°C stabil auf der Zelloberfläche exprimiert, zerfallen jedoch bei 37°C (Ortiz-Navarette et Hämmerling, Proc. Natl. Acad. Sci. US. A. 88: 3594-7 (1991)). Um die Möglichkeit zu überprüfen, daß eine niedrige MHC Klasse I-Expression auf RCC-Zellen auf den Mangel einer angemessenen Peptidmenge zurückzuführen ist, wurden die beiden RCC-Linien des Patienten MZ1851 und die Kurzzeitkultur MZ1851NN für 36 Stunden bei 26°C oder 37°C kultiviert und dann durch FACScan-Analyse untersucht. Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, war die MHC Klasse I- Expression in normalen Nierenzellen bei Inkubation bei niedriger Temperatur nicht ver stärkt, während MZ1851RC und MZ1851LN-Zellen eine Zunahme der MHC Klasse I- Oberflächenexpression unter diesen Bedingungen zeigten. Interessanterweise wurde eine 1.6fache Induktion der MHC Klasse I-Oberflächenexpression in MZ1851LN-Zellen bei 26°C beobachtet, die mit der TAP-defizienter T2-Zellen vergleichbar war.

Tabelle 4

Stabilitätsindex von MHC Klasse I-Molekülen bei 37°C in normalen Nierenzel len und Nierenkarzinomzellen

MHC Klasse I-Oberflächenexpression der Zellinien des MZ1851-Systems, MZ1851NN, MZ1851RC und MZ1851LN, und von T2-Zellen wurde nach paralleler Kultur der Zellen bei 37°C und 26°C für 36 Stunden analysiert. Die Ergebnisse wurden dargestellt als Stabilitätsindex von MHC Klasse I Oberfläche bei 37°C und wurden erhalten, indem die mittlere spezifische Fluoreszenzintensität bei 37°C durch diejenige bei 26°C dividiert wurde. Der benutzte Antikörper war W6/32, der mit einer monomorphen Determinante auf den MHC Klasse I-Molekülen reagiert.

Beispiel 4 Der Effekt von Proteasomeninhibitoren auf die stabile MHC Klasse I Mem branexpression von Tumorzellinien

Um die Bedeutung der Proteasomen für eine effektive Antigenpräsentation in ver schiedenen Tumorzellinien aufzuklären, wurden von uns Proteasomeninhibitoren eingesetzt. Diese Substanzen inhibieren die wesentlichen Peptidaseaktivitäten der 20S und 26S Pro teasomen und reduzieren den Abbau von Proteinen und ubiquitinierten Proteinsubstraten.

Der Effekt von Proteasomeninhibitoren auf die MHC Klasse I Expression kann in den Nierenkarzinomzellinien mittels FACScan Analysen nachgewiesen werden. Außerdem kann der Effekt dieser Substanzen auf die Präsentation eines Influenza Matrix Proteins, welches via Elektroporation in die Nierenkarzinomzellen transferiert werden kann, überprüft wer den. Dieses in das Zytosol eingeschleuste Protein wird proteolytisch gespalten und von den MHC Klasse I Molekülen präsentiert. Die MHC Klasse I Moleküle, die das vom Influenza- Matrix Protein abstammende Peptid enthalten, können mit Antigen-spezifischen CTLs nachgewiesen werden.

Im weiteren können die Proteasomeninhibitoren verwendet werden, um nachzuwei sen, ob die von den MHC Klasse I Molekülen präsentierten Peptide durch die Proteasomen generiert werden. Für die Untersuchung dieser Hypothese können MHC Klasse I-Moleküle mit einem Antikörper, der die konformationellen Determinanten, die nur auf dem intakten Heterodimer vorhanden sind, in An- bzw. Abwesenheit des Proteasomeninhibitors immuno präzipitiert werden. Wenn die Behandlung der Nierenkarzinomzellen mit dem Proteasomen inhibitor die Bildung von Peptiden verhindert, kann die exogene Zugabe von Peptid zeigen, ob das MHC Klasse I Assembly von Proteasomeninhibitor-behandelten Zellen rekonstituiert werden kann.

So konnte zum Beispiel gezeigt werden, daß die Proteasomeninhibitoren nach Trans fer eines Modellproteins (Ovalbumin) die Präsentation von Ovalbumin-spezifischen Peptiden durch den MHC Klasse I-Komplex verhindern, was auf einer Hemmung der proteolytischen Aktivität des Proteasomenkomplexes beruht.

Wir untersuchten in Melanom- und in Nierenkarzinomzellinien den Effekt von Protea someninhibitoren auf die MHC Klasse I-Präsentation:

Dosis-Wirkungs-Analysen zeigten eine konzentrationsabhängige Inhibition der stabi len MHC Klasse I Membranexpression.

Tabelle 5

Dois-Wirkungs-Analyse von Proetasomeninhibitor auf die MHC I Expression am Beispiel der Melanomzellinie Mel4

Der Einsatz von 50 µM Inhibitor führte, abhängig von den Zellinien, zu einer ca. 30 bis 70 fachen Reduktion der MHC Klasse I Membranexpression.

Tabelle 6

Effekt des Proteasomeninhibitors auf die MHC Klasse I Membranexpression unterschiedlicher Tumorzellinien

Von einigen Patienten können relativ einfach CTL gegen den autologen Tumor ge neriert werden, während bei anderen dies unmöglich erscheint. Grund für diese Diskrepanz kann ein Verlust, eine reduzierte oder veränderte Peptidpräsentation von Tumorzellen sein, die dann eine verminderte Erkennung durch CTL zur Folge hat. Es wurden in den verschie denen Tumorzellinien und TAP- und LMP-Transfektanten in An- und Abwesenheit von Zytokinen bestimmt, (1) ob der Transfer von TAP oder LMP Genen in entsprechend defizi ente Zellen und (2) ob Zytokin-Behandlung und damit die Induktion der TAP/LMP-Ex pression und MHC Gene nicht nur die Antigenprozessierung (Vac-K^d-System), sondern auch die Generierung von MHC-restringierten CTLs sowie die CTL-vermittelte Lyse im autologen Tumorzell/CTL-System verbessert werden.

Zuerst wurde anhand des oben detailliert beschriebenen Vac-K^d-Systems nachgewie sen, daß neben dem Gentransfer auch eine Induktion der LMP und/oder TAP Expression durch Zytokinbehandlung die Lyse der K^d-spezifischen CTLs erhöht. In Systemen, in denen bereits Pärchen von Tumorzellen und CTLs etabliert sind, kann gezeigt werden, daß eine verbesserte TAP- und/ oder LMP-Expression nach Zytokinbehandlung zu einer effizienteren CTL-vermittelten Elimination der Tumorzellen führt. Für diese Untersuchungen kann die Zytotoxizität der CTL entweder über einen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay oder über einen Bioas say (Freisetzung von TNF-α) bestimmt werden. Im weiteren können dann gegen Nieren karzinomzellen, die eine reduzierte Kapazität der Antigenprozessierung besitzen, durch Behandlung mit Zytokinen MHC-restringierte autologe CTLs gegen die entsprechenden Tumorzellinien mittels gemischter Lymphozyten-Tumorzellkulturen etabliert werden.

Exogene Zugabe von Peptid bzw. IFN-γ konnte die MHC Klasse I Expression in den Proteasomeninhibitor-behandelten Zellen zumindest teilweise rekonstituieren.

Tabelle 7

Effekt von Peptid und IFN auf MHC I von Proteasomeninhibitor-behandelten Zellen am Beispiel der Zellinie MZ1851RC

Beipiel 5 Verminderte MHC Klasse I Membranexpression korreliert mit reduzierter CTL-Lyse

Es wurde mit den Zellinien MZ1851RC (Primärtumor) und MZ1851LN (Metastase) funktionell getestet, ob die stark verminderte MHC Klasse I Expression der MZ1851LN Zellen eine reduzierte CTL-vermittelte Lyse zur Folge hat. Für diesen Versuchsansatz wur den allogene HLA-B7-restringierte CTL verwendet. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Fig. 4a und b dargestellt.

Beispiel 6 Rekonstitution der MHC Klasse I-Expression in TAP-Transfektanten

Ein TAP-1-Expressionsvektor wurde durch Elektroporation in MZ1851RC-Zellen eingeführt. Neo®-Klone wurden selektiert und die TAP-1-Genexpression mit dem TAP-1- spezifischen Antikörper mAb 148.3 gemessen. Die Färbung der drei neo®-K1one zeigte eine Zunahme der TAP-1-Expression im Vergleich zu den parentalen MZ1851RC-Zellen. Ferner besaßen RCC-Klone, die das rekombinante TAP-1-Gen exprimierten, höhere Dichten des MHC Klasse I-Antigens auf der Oberfläche. Die schlechte MHC Klasse I-Expression der parentalen RCC-Linien konnte durch TAP-1-Gentransfer rekonstituiert werden (Messung mit mAb W6/32; Tabelle 8). Die Transfektanten hatten eine ca. 1.5-fache Erhöhung der MHC Klasse I Membranexpression. Peptidtranslokationsassays ergaben ebenfalls einen um das ca. 1.6-fache effizienteren Peptidtransport vom Zytoplasma in das ER.

Tabelle 8

MHC- und TAP-1-Expression in TAP-1-transfizierten Zellen, bezogen auf un fransfizierte Kontrollzellen

Die Ergebnisse sind als x-fache Induktion von MHC Klasse I und TAP-1, bezogen auf untransfizierte Kontrollzellen, ausgedrückt (MZ1851RC, MZ1851LN).

Beispiel 7 Interferone (IFNs) induzieren koordinierte Expression von TAP und MHC- Klasse-I-Genen in RCC-Zellinien

Die TAP- und MHC-Klasse-I-Protein-Niveaus in unbehandelten und IFN-behandelten RCC-Zellen wurden durch FACScan-Analyse bestimmt. Die Behandlung von diesen Zellen entweder mit JFNα als auch mit IFNγ ergab eine signifikante Zunahme sowohl von MHC- Klasse-I-Molekülen der schweren und leichten Kette als auch von TAP-1-Protein. Optimale IFNγ-Dosen ergaben eine etwa zweifach erhöhte Expression, während optimale IFNα-Do sen nur eine 1.3-1.6-fache Erhöhung verursachten. Einige Zellinien wie MZ1846RC zeigten fast keine Erhöhung. Zwischen Zellinien mit konstitutiv temperaturstabilem oder tempera turlabilem MHC-Klasse-I-Membranphänotyp wurden keine Unterschiede beobachtet.

Die Kinetik der IFN-mediierten Induktion von TAP-1 und MHC-Klasse-I mRNA und Protein wurden genauer an der Zellinie MZ1257RC untersucht. Sowohl Northern blot als auch FACScan-Analysen zeigten eine koordinierte Regulation von mRNA und Protein- Level der Gene des Antigen-prozessierenden Apparates. Die IFNγ-mediierte Erhöhung von TAP-1-Protein war schneller und ging derjenigen von MHC-Klasse-I schwere Kette Ober flächenprotein um etwa 8 Stunden voran.

Tabelle 9

JFN-mediierte Modulation von MHC-Klasse-I und TAP-1-Proteinexpression in RCC-Zellen

Die Zellen waren vor der FACScan-Analyse für 24 h unbehandelt oder wurden für 24h mit IFN behandelt.

¹Die Ergebnissse sind als Verhältnisse durch Division der mittleren spezifischen Fluo reszenzintensität der IFN-behandelten RCC-Linien durch die unbehandelten ausgedrückt.

Beispiel 8 Reduzierte Peptidtransportrate in RCC-Linien

Für eine effektive Peptidbeladung von MHC Klasse I-Molekülen und stabiler Oberflä chenexpression ist Transporteraktivität notwendig. Die Effizienz des Peptidtransports im MZ1851-Zellsystem wurde untersucht. ¹²⁵I-markierte Peptide, die die Konsensussequenz für N-verknüpfte Glykosilierung enthielten, wurden in das ER (endoplasmatische Retiku lum) Streptolysin-O-permeabilisierter MZ1851-Zellen transportiert und die glykosilierte Fraktion mit ConA-Sepharose isoliert. Die Menge translozierter Peptide wurde in einem γ- Zähler bestimmt und mit der eingegebenen Peptidmenge verglichen. Als Kontrolle wurden permeabilisierte Zellen mit Peptiden in der Abwesenheit von ATP inkubiert. Abb. 8 zeigt, daß das Peptid RYWANATRSF (Peptid #67) mit unterschiedlicher Effizienz in MZ1851-Zellen transportiert wurde. Im Vergleich mit der Transportrate korrespondieren der normaler Nierenzellen war die Peptid-Translokation in MZ1851RC auf etwa 57%, in MZ1851LN-Zellen auf 25% reduziert. Die unterschiedlichen Transportraten von RCC aus primärer und metastatischer Läsion war konsistent, wenn drei andere Peptide benutzt wur den (#56: RYWANATRSR, #63: RYWANATRSI, #600: TNKTRIDGQY) (Abb. 7).

Die erniedrigte Zelloberflächenexpression beider RCC-Zellen war also mindestens teilweise durch den Mangel von Peptiden im ER verursacht. Dies führte zu einer inadäqua ten Peptidbeladung und Stabilisierung des β₂-m/MHC Klasse I-Komplexes.

Beispiel 9 Zellinien und Zellkultur

Es wurden die parentale murine Fibroblastenzellinie NIH3T3 und die konstitutiv c- Ha-ras exprimierende Zellinie NIH EJras c13, die nach Transfektion von NIH3T3-Zellen mit dem mutierten humanen c-Ha-ras etabliert worden war, benutzt. Diese sind in der Literatur beschrieben (Seliger et al, J. Virol. 65: 6307 (1991)). Beide Zellinien wurden in modifi ziertem Eagle′s Medium (MEM) kultiviert, das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 U/ml), und Streptomycin (100 µg/ml) supplementiert war. Die mit dem Rauscher-Virus transformierte Maus-T-Lymphom-Zellinie RMA (Ljunggren et al., J. Exp. Med. 162: 1745 (1985)) wurde in CRPMI-Medium gehalten, das mit 10% FCS, Glutamin und den entsprechenden Antibiotika supplementiert war. Die H-2K^b-beschränkte CTL 10BK. 1 mit Spezifität für Ovalbumin (OVA) (Dick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2316 (1989)) wurde in Iscove′s modifiziertem Dulbecco′s Medium (IDMEM) kultiviert, das mit 5% FCS und 3 U/ml rekombinantem IL-2 (Boehringer Mannheim, Deutschland) supplementiert war. Von diesem Klon wurde kürzlich gezeigt, daß er das Peptid OVA 257- 264 erkennt, das ein häufiges Nebenprodukt in OVA-Präparationen ist (Staege et al., Im munol. 81: 333 (1994)).

Immunfluoreszenz-Analyse

Die folgenden Antikörper wurden für die Durchflußzytometrie verwendet: mAb 9C5 mit Spezifität für H-2D^b (Jankovic et al., J. Exp. Med. 163: 1459 (1986)), mAb B8-24-3 (American Type Tissue Culture Collection, ATCC, USA) mit Spezifität für H-2K^b,^p,^pa,^r (Köhler et al., In: Steinberg CM, Lefkovits I (Hrsg.) The immune System. Vol.2, S. 202, Karger, Basel (1981)), mAb 34-1-2S mit Spezifität für H-2K (ATCC, USA), 31-3-4S mit Spezifität für H-2K^d, 34-5-8S mit Spezifität für H-2D^d, 30-5-7S mit Spezifität für H-2L^d (Cedarlane, Hornby, Ontario, Kanada), und mAb-1, der Ha-, Ki- und N-ras erkennt (Dianova, Hamburg; Deutschland). Die Immunfluoreszenzanalyse wurde durchgeführt wie in den anderen Beispielen beschrieben. Für die intrazelluläre Färbung mit dem mAb anti-ras wurden die Zellen mit 70% Ethanol für 30 Min. auf Eis permeabilisiert. Dann wurden 5 × 10⁵ Zellen mit einer geeigneten Konzentration des Erstantikörpers für 25 Min. bei 4°C in kubiert, gewaschen (PBS, 1% [w/v] FCS) und dann für weitere 30 Min. bei 4°C im Dunkeln mit fluoreszinierten anti-Maus-Ig-Antikörpern (Coulter, USA) inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, bevor die Fluoreszenzintensität mit einem FACScan Durch flußzytometer (Coulter, USA) analysiert wurde. Zytofluometrieanalysen wurden wenigstens dreimal ausgeführt.

Elektroporation

Elektroporation wurde ausgeführt wie an anderer Stelle beschrieben (Oellig et al., J. Neurosci. Res. 26: 390 (1990)). 1 × 10⁶ - 5 × 10⁶ RMA-Zellen wurden in 1 ml PBS sus pendiert, das 10 µg/ml linearisierte c-Ha-ras-Plasmid-DNA enthielt (Seliger et al., J. Virol. 61: 2567 (1988)), und für 15 Min. auf Eis gekühlt. Die Suspension wurde einmal pulsiert, wobei 960 µF und 250 V eingehalten wurden und ein BIORAD Gene Pulser Apparatus (BIORAD, Richmond, USA) benutzt wurde. Die Zellen wurden sofort zurück auf Eis gege ben, weitere 10 Min. gekühlt, und im jeweiligen Kulturmedium ausgesät. 36 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in 24-Loch-Platten aliquotiert und in einem CRPMI-Me dium selektiert, das mit 1.1 mg/ml G4 18 (Gibco, Gaithersburg) supplementiert war.

Zellmediierte Zytotoxizität in vifro

Die Zytotoxizität wurde mit einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay wie beschrieben bestimmt (Dick et al., J. Immunol. 150: 2575 (1993)). Zielzellen wurden mit 1.5 mg/ml OVA für 2 Stunden bei 37°C pulsiert, mit 3.75 MBq Na₂⁵¹CrO₄ (Amersham Buchler, Braunschweig, Deutschland) für 1 Stuade bei 37°C markiert, zweimal gewaschen, in IMDM mit 10% FCS resuspendiert, und auf 96-Loch-Mikrotiterplatten mit V-förmigem Boden bei einer Zellzahl von 5000 Zellen pro Loch ausgesät. 10BK. 1-Zellen in variierenden Konzentrationen wurden bis zu einem Endvolumen von 150 µl/Loch zugegeben. Nach 4 Stunden wurde der Über stand der Proben (100 µl) geerntet und in einem γ-Zähler gezählt. Der Prozentsatz spezifi scher Lyse wurde wie folgt kalkuliert: % Lyse = (experimentelle cpm - spontane cpm)/ (maximale cpm - spontane cpm) × 100.

Onkogen-mediierte Erniedrigung der MHC Klasse I-Oberflächenexpression betrifft alle Loci

FACScan-Analysen von EJ ras-transformierten NIH3T3-Zellen, NIH3T3pEJras- Clone3, der konstitutiv große Mengen des ras-Proteins p21 exprimiert, sowie von parenta len untransformierten NIH3T3-Zellen wurden mit einem Satz H-2-locusspezifischer mAbs durchgeführt. NIH3T3pEJrasC13-Zellen zeigten ein erniedrigtes Niveau von MHC Klasse I- Oberflächenexpression im Vergleich zur parentalen Kontrolle. Die ras-mediierte Suppres sion von MHC Klasse I-Expression betraf alle H-2-Loci, aber das Ausmaß der Erniedrigung von H-2K^d, -D^d und -L^d variierte etwa zwischen 10 bis 50% der Kontrollzellen (Abb. 1). Die stärkste Suppression wurde für die H-2L^d-Loci beobachtet.

Heterogene, aber reduzierte Niveaus der MHC Klasse I-Expression in RMA-ras-Transfor manten

Die T-Lymphom-Zellinie RMA, die große Mengen von H-2K^b exprimiert, wurde stabil mit einem Ha-ras enthaltenden Plasmid transfiziert. Neo® Massenkulturen von ras- Transformanten enthalten eine gemischte Population von Tumorklonen mit einem breiten Bereich von ras- und H-2K^b-Expression. Deshalb wurden die Massenkulturen kloniert, um RMA ras-Klone zu erhalten. Die Klone wurden dann auf Expression von p21ras, H-2K^b und H-2D^b mit Durchflußzytometrie gescreened. Intrazelluläre ras- und H-2-Oberflächenexpressionen einer Anzahl von Klonen ist in Tabelle 10 dargestellt. Obwohl eine breite Verteilung im Muster der ras- und H-2K^b/H-2D^b-Expression beobachtet wird, war die H-2- Oberflächenexpression in allen RMAras-Klonen erniedrigt. Ferner bestand eine inverse Korrelation zwischen den Niveaus der ras und MHC Klasse I Expression in der Mehrzahl der RMAras-Klone.

Tabelle 10

Expression von MHC Klasse 1 und ras in ras-Transformanten

Immunfluoreszenzanalyse von RMAras-Klonen wurden mit den entsprechenden Anti körpern ausführt. Parentale RMA-Zellen dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse sind als % der mittleren spezifischen Fluoreszenzintensität der RMA-Zellen ausgedrückt.

Die Rolle der MHC Klasse I- und ras-Expression für die lytische Suszeptibilität

Es stellt sich die Frage, ob das Ausmaß der MHC Klasse I-Antigenexpression die Tumorerkennung durch CTL beeinflussen kann und in vivo Tumorzellen, die weniger MHC-Antigene exprimieren, einen selektiven Vorteil bietet. Ausgewählte RMAras-Klone wurden auf Lyse durch CTL 10BK. 1 getestet. Dies ist ein H-2K^b-beschränkter CTL-Klon mit Spezifität für OVA, von dem gezeigt wurde, daß er ein spezifisches OVA-Peptid er kennt. Die Lyse zweier unabhängiger repräsentativer RMAras-Klone, die mit OVA-Peptid gepulst und durch CTL 10BK. 1 bei einem Effektor-Zielzell-Verhältnis (E : T) von 0,063 : 1 bis 8 : 1 lysiert wurden, ist in Abb. 10 dargestellt. Im Vergleich w parentalen RMA-Zellen war die CTL-mediierte Lyse von RMAras5SK1 und RMAras5SK2 signifikant erniedrigt. Interessanterweise haben die beiden Klone eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber der Lyse durch CTL 10BK. 1, die invers verknüpft ist mit erniedrigten Niveaus von H-2K^b An tigenen, die wiederum auf hohe Niveaus der p21ras-Expression zurückzuführen sind.

Claims

1. Verfahren zur Steigerung der Immunantwort auf eine Tumorzelle durch Steigerung der intrazellulären TAP- und/oder LMP-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Nukleinsäuren in die Tumorzelle eingebracht werden, die für TAP-Protein und/oder LMP-Protein kodieren, und die Expression dieser Nukleinsäuren in der Tumor zelle bewirkt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um TAP-1 und/oder TAP-2 handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um LMP-2 und/oder LMP-7 handelt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die be treffende Nukleinsäure oder die betreffenden Nukleinsäuren ein oder mehrere Expressions vektoren, gegebenenfalls Doppel- oder Mehrfachexpressionsvektoren, sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure oder die Nukleinsäuren durch Elektroporation oder Liposomenfusion in die Tumorzelle eingebracht werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure oder die Nukleinsäuren mit einem Konjugat komplexiert sind, das ein endo somolytisches Agens und ein DNA-bindendes Agens enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das endosomolytische Agens ein inaktivierter Adenovirus ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß DNA-bindende Agens Polylysin ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß einem Patienten Tumorgewebe entnommen wird, die Nukleinsäure oder die Nukleinsäuren in Tu morzellen dieses Tumorgewebes eingebracht werden, und diese Tumorzellen wieder in den Körper des Patienten eingebracht werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilungsfähigkeit der Tumorzellen vor der Einbringung in den Körper des Patienten zerstört wird.

11. Verfahren zum Auffinden von Tumorantigenen, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) die Antigenpräsentation von Tumorzellen durch die Einführung und Expression von einer oder mehrerer Nukleinsäuren, die für TAP-1 und/oder TAP-2 und/oder LMP-2 und/oder LMP-7 kodieren, gesteigert wird,
(b) tumor-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) durch Mischkultur von Lymphozyten mit den aus (a) erhaltenen Tumorzellen erzeugt werden
(c) in CTL-resistente Zellen Cosmid-Klone, genomische DNA oder Komplementär- DNA (cDNA) eingebracht und zur Expression gebracht wird, die aus den erwähnten Tu morzellen erhalten oder abgeleitet ist,
(d) Transfektanten selektiert werden, die die Eigenschaft haben, die aus (b) erhalte nen tumorspezifischen CTL zu stimulieren, und
(e) das transfizierte Gen kloniert wird, das diese Eigenschaft vermittelt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulation der tumorspezifischen CTL dadurch gemessen wird, daß die TNF-α-Produktion der CTL nach Inkubation mit den Tumorzellen gemessen wird.

13. Tumorzellen; in die eine oder mehrere Nukleinsäuren eingebracht wurden, die für TAP-Protein und/oder LMP-Protein kodieren.

14. Verwendung von Tumorzellen nach Anspruch 13 als Tumorvakzin.

15. Verwendung einer Nukleinsäure, die für TAP-Protein und/oder LMP-Protein kodiert, zur Steigerung der Immunantwort auf eine Tumorzelle.

16. Verwendung einer Nukleinsäure, die für TAP-Protein und/oder LMP-Protein kodiert, zum Auffinden von Tumorantigenen.

17. Verwendung einer Nukleinsäure, die für TAP-Protein und/oder LMP-Protein kodiert, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Krebserkrankungen.

18. Verfahren zur Herstellung zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) gegen autologe Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die TAP- und/oder LMP-transfizierten Zellen mit einem Zytokin stimuliert werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Inter feron-γ ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 18 bis 20, dadurch gekenn zeichnet, daß die Tumorzellen zusätzlich mit einer Nukleinsäure transfiziert sind, die für B7 kodiert.