JPS61239886A - ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents
ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法Info
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- JPS61239886A JPS61239886A JP60080885A JP8088585A JPS61239886A JP S61239886 A JPS61239886 A JP S61239886A JP 60080885 A JP60080885 A JP 60080885A JP 8088585 A JP8088585 A JP 8088585A JP S61239886 A JPS61239886 A JP S61239886A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はピラノース・オキシダーゼお゛よびその製造法
に関する。さらに詳しくはβ−Ｄ−グルコースのみなら
ずα−Ｄ−グルコースにモ作用するピラノース・オキシ
ダーゼおよびポリポラス属に属する担子菌によるその製
造法に関するＯ 本発明のピラノース・オキシダーゼは、酸素の存在下、
α−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコースに作用し
た場合、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を生成する。それ
故、過酸化水素の住成量あるいは酸素の減少量を公知の
方法で測定することによって、生体試料中または食品中
のグルコース量を迅速に測定することが可能である〇 〔従来技術〕 従来、Ｄ−グルコースを酸化して、Ｄ−グルコゾンと過
酸化水素を生成するピラノース・オキシダーゼが担子菌
ポリポラス・オプッサスに見出されている（パイオキミ
カ・工・バイオフイジカ・アクタ） （Ｂｉｏｏｈｉｍ
ｉｏａ ＠ｔ ＢｉｏｐｈｙｇｉｏａＡｏｔａ） Ｍｏ
ｌ １６７、ｐ４９３、ｐ ５０１ （１９６８））。
に関する。さらに詳しくはβ−Ｄ−グルコースのみなら
ずα−Ｄ−グルコースにモ作用するピラノース・オキシ
ダーゼおよびポリポラス属に属する担子菌によるその製
造法に関するＯ 本発明のピラノース・オキシダーゼは、酸素の存在下、
α−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコースに作用し
た場合、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を生成する。それ
故、過酸化水素の住成量あるいは酸素の減少量を公知の
方法で測定することによって、生体試料中または食品中
のグルコース量を迅速に測定することが可能である〇 〔従来技術〕 従来、Ｄ−グルコースを酸化して、Ｄ−グルコゾンと過
酸化水素を生成するピラノース・オキシダーゼが担子菌
ポリポラス・オプッサスに見出されている（パイオキミ
カ・工・バイオフイジカ・アクタ） （Ｂｉｏｏｈｉｍ
ｉｏａ ＠ｔ ＢｉｏｐｈｙｇｉｏａＡｏｔａ） Ｍｏ
ｌ １６７、ｐ４９３、ｐ ５０１ （１９６８））。
しかし、この酵素はβ−Ｄ−グルコースに作用スル力、
α−Ｄ−グルコースは基質となり得ない。また最近、特
開昭５８−４３７８５号公報にコリオラス属、ダエダレ
オプシス属、プロイロタス属またはグロエオフイルム属
にａする微生物がＤ−グルコースに特異性が高いピラノ
ース・オキシダーゼを生産するという報告もある・〔発
明が解決しようとする問題点〕 生体試料中あるいは食品中のＤ−グルコースを特異的に
定量する方法としては従来よりグルコース・オキシダー
ゼが繁用されている。しかし、グルコース會オキシダー
ゼはβ−Ｄ−グルコースにしか作用しない。生体試料中
あるいは食品中のＤ−グルコースの存在形態はα−Ｄ−
グルコースとして３６．５％、β−Ｄ−グルコースとし
て６３．５％である。このため、グルコース・オキシダ
ーゼを用いてＤ−グルコースを定量する場合、ムタロタ
ーゼを添加しなければ迅速な定量ができない。
α−Ｄ−グルコースは基質となり得ない。また最近、特
開昭５８−４３７８５号公報にコリオラス属、ダエダレ
オプシス属、プロイロタス属またはグロエオフイルム属
にａする微生物がＤ−グルコースに特異性が高いピラノ
ース・オキシダーゼを生産するという報告もある・〔発
明が解決しようとする問題点〕 生体試料中あるいは食品中のＤ−グルコースを特異的に
定量する方法としては従来よりグルコース・オキシダー
ゼが繁用されている。しかし、グルコース會オキシダー
ゼはβ−Ｄ−グルコースにしか作用しない。生体試料中
あるいは食品中のＤ−グルコースの存在形態はα−Ｄ−
グルコースとして３６．５％、β−Ｄ−グルコースとし
て６３．５％である。このため、グルコース・オキシダ
ーゼを用いてＤ−グルコースを定量する場合、ムタロタ
ーゼを添加しなければ迅速な定量ができない。
本発明者らは、上記現状に鑑み、担子菌の生斎ｔスピラ
ノースＩＩす卓９１−ゼ１ｒついア絽音検討を重ねた結
果、ピラノース書オキシダーゼ生産菌として公知である
ポリポラスＯオブッサスが培養物中にα−Ｄ−グルコー
スにも作用する従来知られていなかったピラノースのオ
キシダーゼを著量生産することを見出し、本発明を完成
した。従って本発明の目的はＤ−グルコースを迅速に定
量できるピラノース・オキシダーゼ射よびポリポラス・
オプッサスを培養して上記酵素を工業的に安価に製造す
る方法を提供することにある。
ノースＩＩす卓９１−ゼ１ｒついア絽音検討を重ねた結
果、ピラノース書オキシダーゼ生産菌として公知である
ポリポラスＯオブッサスが培養物中にα−Ｄ−グルコー
スにも作用する従来知られていなかったピラノースのオ
キシダーゼを著量生産することを見出し、本発明を完成
した。従って本発明の目的はＤ−グルコースを迅速に定
量できるピラノース・オキシダーゼ射よびポリポラス・
オプッサスを培養して上記酵素を工業的に安価に製造す
る方法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明はピラノース・オキシダー
ゼ詔よびその製造法に関するものであり、本発明の第１
の発明は下記の理化学的性質を有することを特徴とする
ピラノース・オキシダーゼに関する。
ゼ詔よびその製造法に関するものであり、本発明の第１
の発明は下記の理化学的性質を有することを特徴とする
ピラノース・オキシダーゼに関する。
（１）作用：酸素の存在下、Ｄ−グルコースの第２炭素
を酸化し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を生成する。
を酸化し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を生成する。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する作用が最も
高いが、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マルト
ース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコー
ス、グルコン酸δ−ラクトンなどにも作用する０また、
Ｄ−グルコースに作用する場合、β−Ｄ−グルコースの
みららず、α−Ｄ−グルコースをも酸化する０ （３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：至適ｐＨが５．０付
近であり、３７℃、６０分処理ではｐＨ５，０〜９．０
の間で安定である。
高いが、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マルト
ース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコー
ス、グルコン酸δ−ラクトンなどにも作用する０また、
Ｄ−グルコースに作用する場合、β−Ｄ−グルコースの
みららず、α−Ｄ−グルコースをも酸化する０ （３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：至適ｐＨが５．０付
近であり、３７℃、６０分処理ではｐＨ５，０〜９．０
の間で安定である。
（４）至適温度および熱安定性：至適温度が５５℃付近
であり、ｐＨ６，０，１０分間処理では６０℃まで安定
である。
であり、ｐＨ６，０，１０分間処理では６０℃まで安定
である。
（５）電子受容体二分子状酸素を衰退の電子受容体とす
るが、フエナジンメトサルフエイトおよび２，６−シク
ロロフエノールインドフエノ□ −ルをも電子受
容体とする。
るが、フエナジンメトサルフエイトおよび２，６−シク
ロロフエノールインドフエノ□ −ルをも電子受
容体とする。
（６）分子量ニゲル濾過法で測定した分子量が約１９５
０００で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法で測定すると約４０００
０のサブユニット３個１約５ｏｏｏｏのサブユニット１
個および約２８０００のサブユニット１個から構成され
ている。
０００で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法で測定すると約４０００
０のサブユニット３個１約５ｏｏｏｏのサブユニット１
個および約２８０００のサブユニット１個から構成され
ている。
（７）補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジヌク
レオチド（Ｆ’ＡＤ ）が約４００００のサブユニット
１個当り１分子、酵素１分子当り３分子共有結合してい
る。
レオチド（Ｆ’ＡＤ ）が約４００００のサブユニット
１個当り１分子、酵素１分子当り３分子共有結合してい
る。
（８）等電点：６．９５
（９）阻害剤：ＨｇＩ＋、Ｆ・１＋、Ａ ｇ＋、フェニ
ルメチルスルホニルフルオリド、硫化ナトリウム、Ｐ−
クロロメルクリ安息香酸、ｏ−フエナントロリンなどに
よって阻害される。
ルメチルスルホニルフルオリド、硫化ナトリウム、Ｐ−
クロロメルクリ安息香酸、ｏ−フエナントロリンなどに
よって阻害される。
（１０）Ｋ ｍ値： １．２３Ｘ１０−３Ｍ（Ｄ −ク
ルコース）また、本発明の第２の発明はポリポラス属に
属するピラノースのオキシダーゼ生産能を有する菌株を
培地に培養し、該培養物から本発明の第１の発明のピラ
ノース・オキシダーゼを採取することを特徴とする。
ルコース）また、本発明の第２の発明はポリポラス属に
属するピラノースのオキシダーゼ生産能を有する菌株を
培地に培養し、該培養物から本発明の第１の発明のピラ
ノース・オキシダーゼを採取することを特徴とする。
本発明に使用される担子菌には、ポリポラス（Ｐｏ１ｙ
ｐｏｒｕｓ ）属に属する菌株、例えばポリポラス・オ
ブツサ２ （Ｐｏ１ｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ ）
ＡＴＣＧ２６７３３がある。
ｐｏｒｕｓ ）属に属する菌株、例えばポリポラス・オ
ブツサ２ （Ｐｏ１ｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ ）
ＡＴＣＧ２６７３３がある。
本発明方法を更に詳しく説明すれば、培地に加える栄養
源は使用する菌株が利用し、ピラノース・オキシダーゼ
を生産するものであればよく、炭素源としては例えばグ
ルコース、デンプン、シュクロース、マルトース、ラク
トース、グリセロール、デキストリン、油脂類などが利
用でき、奮素源としては酵母エキス、ペプトン、脱脂大
豆、コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当である
。その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩など
の無機質および金属塩類を加えてもよく、更にはビタミ
ン類、生長促進因子を加えてもよい。
源は使用する菌株が利用し、ピラノース・オキシダーゼ
を生産するものであればよく、炭素源としては例えばグ
ルコース、デンプン、シュクロース、マルトース、ラク
トース、グリセロール、デキストリン、油脂類などが利
用でき、奮素源としては酵母エキス、ペプトン、脱脂大
豆、コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当である
。その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩など
の無機質および金属塩類を加えてもよく、更にはビタミ
ン類、生長促進因子を加えてもよい。
担子菌を培養するにあたり、ピラノース・オキシダーゼ
の生産量は培養条件により大きく変動するが、一般に培
養温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く、２〜
ＩＯ日間の通気攪拌培養でピラノース・オキシダーゼの
生産は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組
成などに応じ、ピラノース・オキシダーゼの生産量が最
大になるように設定するのは当然である０本発明の菌株
によって生成されたピラノース・オキシダーゼは主に菌
体内にある。菌体からのピラノース・オキシダーゼの精
製は次のように行なう。
の生産量は培養条件により大きく変動するが、一般に培
養温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く、２〜
ＩＯ日間の通気攪拌培養でピラノース・オキシダーゼの
生産は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組
成などに応じ、ピラノース・オキシダーゼの生産量が最
大になるように設定するのは当然である０本発明の菌株
によって生成されたピラノース・オキシダーゼは主に菌
体内にある。菌体からのピラノース・オキシダーゼの精
製は次のように行なう。
培養液を濾過して得た菌体をｐＨ４〜１０の緩衝液に懸
濁して、１０〜４０℃で２〜４８時間攪拌するとピラノ
ース・オキシダーゼが菌体内より抽出される。
濁して、１０〜４０℃で２〜４８時間攪拌するとピラノ
ース・オキシダーゼが菌体内より抽出される。
例えば、菌体１０Ｆを０．１ Ｍ、 ０．ｓ Ｍ、 Ｉ
Ｍ右よび２Ｍの各リン酸緩衝液（ｐＨ７，０） １０
０−に懸濁し、２０℃あるいは３０℃で２０時間攪拌し
て抽出した後、遠心分離して得た上澄中のピラノース・
オキシダーゼ活性を第１表に示す。なお、コントロール
として菌体１０ｆと０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
） １００ｒｎｌ！をエマレーション〔テラ才力（株）
製〕を用いてホモゲナイズして得た上澄中の活性をも示
す。
Ｍ右よび２Ｍの各リン酸緩衝液（ｐＨ７，０） １０
０−に懸濁し、２０℃あるいは３０℃で２０時間攪拌し
て抽出した後、遠心分離して得た上澄中のピラノース・
オキシダーゼ活性を第１表に示す。なお、コントロール
として菌体１０ｆと０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
） １００ｒｎｌ！をエマレーション〔テラ才力（株）
製〕を用いてホモゲナイズして得た上澄中の活性をも示
す。
第 １ 表
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２９７
３１５０．５Ｍ ／／ ＃ ３２０３４４ＩＭ ｙ
ｉｔ ３５０３７２ ２Ｍ Ｉ ＪＦ ３６３３６８ コントロール ２３０得られた
抽出液に沈殿剤、例えば硫安を２０〜８０ ｗ／ｖ％加
えることにより、あるいは有機溶媒、例えばアルコール
、アセトンなどを５０〜８０ｖ／マ％加えることにより
沈殿として分離される。得られた沈殿物を限外濾過、透
析あるいはセファデックス処理などによって脱塩し、粗
酵素液を得る。得られた粗酵素液を精製するには、あら
かじめ０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ’ ９．
０）で緩衝化したＤＥＡＢ−セファロース（ＣＬ−５Ｂ
）のカラムに粗酵素液を吸着させ、吸着物を０．０３Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で洗浄後、０．１Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ９，０）で溶出して活性区分を集める。次
にこの活性区分を限外濾過で濃縮、脱塩後、０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で緩衝化しりＣＭ−セファ
ロース（ＣＬ −６Ｂ ）のカラムに吸着させ、吸着物
を０．０３Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で洗浄後、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出して活性区
分を集める。この活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥
し、精製酵素粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリル
アミドゲルディスク電気泳動的に単一である。
３１５０．５Ｍ ／／ ＃ ３２０３４４ＩＭ ｙ
ｉｔ ３５０３７２ ２Ｍ Ｉ ＪＦ ３６３３６８ コントロール ２３０得られた
抽出液に沈殿剤、例えば硫安を２０〜８０ ｗ／ｖ％加
えることにより、あるいは有機溶媒、例えばアルコール
、アセトンなどを５０〜８０ｖ／マ％加えることにより
沈殿として分離される。得られた沈殿物を限外濾過、透
析あるいはセファデックス処理などによって脱塩し、粗
酵素液を得る。得られた粗酵素液を精製するには、あら
かじめ０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ’ ９．
０）で緩衝化したＤＥＡＢ−セファロース（ＣＬ−５Ｂ
）のカラムに粗酵素液を吸着させ、吸着物を０．０３Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で洗浄後、０．１Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ９，０）で溶出して活性区分を集める。次
にこの活性区分を限外濾過で濃縮、脱塩後、０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で緩衝化しりＣＭ−セファ
ロース（ＣＬ −６Ｂ ）のカラムに吸着させ、吸着物
を０．０３Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で洗浄後、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出して活性区
分を集める。この活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥
し、精製酵素粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリル
アミドゲルディスク電気泳動的に単一である。
本発明のピラノース・オキシダーゼの酵素化学的および
理化学的性質は次のとおりである。
理化学的性質は次のとおりである。
（１）作 用：
本酵素は酸素の存在下、Ｄ−グルコースに作用した場合
、Ｄ−グルコースの第２炭素を酸化し、Ｄ−グルコゾン
と過酸化水素を生成する。
、Ｄ−グルコースの第２炭素を酸化し、Ｄ−グルコゾン
と過酸化水素を生成する。
その反応式は下記のごとくである。
Ｄ−グルコース＋０．→ Ｄ−グルコゾン＋Ｈ８０゜碩
）基質特異性： 本酵素の基質として各種の糖溶液（反応液中濃度１．６
７ｍＭ ’）を用いて検討したところ、本酵素はＤ−グ
ルコースに対する特異性が高く、他にＬ−ソルボース、
Ｄ−キシロースなどにも作用した（第２表）０ 第 ２ 表 Ｄ−グルコース １００Ｌ−
ソルボース ５．８Ｄ−キ
シロース ４．８０−マル
トース ２．８Ｄ−ガラ
クトース ２．８２−デオ
キシ−Ｄ−グルコース ２．６Ｄ−グル
クロン酸 ０．８グルコン
酸δ−ラクトン ０．５また、本酵
素がα−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−グルコースに作用し
た場合の反応速度を比較した。反応系は１１００ｎα−
Ｄ−グルコースあるいはβ−Ｄ−グルコース溶液０，１
ｒｎＩ！、マツキルベイン緩衝液（ｐＨ６，０） １．
５ｍｌ！、２４．６ｍＭ ４−アミノアンチピリン溶液
０．１ｄ、０．４２Ｍフエ／ −／Ｌ’溶液０．１ ｄ
、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ溶液（２４０単位
／ｄ）０．１ｒｒｆ！、水１．０−および本酵素液（３
０単位／ｄ）０．１ｒｎｌ・反応液量３． ＯＷＩｌで
３７℃、キュベツト中で反応を行ない生成したキツネイ
ミン色素による５００Ｌｍの吸収変化を経時的に測定し
た０その結果を第１図に示す。
）基質特異性： 本酵素の基質として各種の糖溶液（反応液中濃度１．６
７ｍＭ ’）を用いて検討したところ、本酵素はＤ−グ
ルコースに対する特異性が高く、他にＬ−ソルボース、
Ｄ−キシロースなどにも作用した（第２表）０ 第 ２ 表 Ｄ−グルコース １００Ｌ−
ソルボース ５．８Ｄ−キ
シロース ４．８０−マル
トース ２．８Ｄ−ガラ
クトース ２．８２−デオ
キシ−Ｄ−グルコース ２．６Ｄ−グル
クロン酸 ０．８グルコン
酸δ−ラクトン ０．５また、本酵
素がα−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−グルコースに作用し
た場合の反応速度を比較した。反応系は１１００ｎα−
Ｄ−グルコースあるいはβ−Ｄ−グルコース溶液０，１
ｒｎＩ！、マツキルベイン緩衝液（ｐＨ６，０） １．
５ｍｌ！、２４．６ｍＭ ４−アミノアンチピリン溶液
０．１ｄ、０．４２Ｍフエ／ −／Ｌ’溶液０．１ ｄ
、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ溶液（２４０単位
／ｄ）０．１ｒｒｆ！、水１．０−および本酵素液（３
０単位／ｄ）０．１ｒｎｌ・反応液量３． ＯＷＩｌで
３７℃、キュベツト中で反応を行ない生成したキツネイ
ミン色素による５００Ｌｍの吸収変化を経時的に測定し
た０その結果を第１図に示す。
第１図中、実線はβ−Ｄ−グルコース、点線はα−Ｄ−
グルコースの場合であり、横軸は反応時間（秒）、縦軸
は吸光度をそれぞれ示す。
グルコースの場合であり、横軸は反応時間（秒）、縦軸
は吸光度をそれぞれ示す。
第１図より明らかなように本酵素はβ−Ｄ−グルコース
に対する活性よりも若干低いが、α−Ｄ−グルコースに
も充分作用することが認められた。
に対する活性よりも若干低いが、α−Ｄ−グルコースに
も充分作用することが認められた。
ところで、α−Ｄ−グルコースには作用しないことが公
知であるグルコース・オキシダーゼを用いて同様な実験
を行なった。その結果を第２図に示す。第２図中実線は
β−Ｄ−グルコース、点線はα−Ｄ−グルコースの場合
であり、横軸は反応時間（秒）、縦軸は吸光度をそれぞ
れ示ス。グルコース・オキシダーゼ溶液（東洋紡製３０
０単位／ｄ）０，１ｒｎｌを用いて、５０ Ｑｎｍの吸
収変化を追跡したところ、見かけ上α−Ｄ−グルコース
にも若干作用しているが、これはα−Ｄ−グルコースか
らβ−Ｄ−グルコースヘノ非酵嵩的変換に起因するもの
である〇 （３〕至適ｐＨおよびｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは第３図の曲線で表わされるとと＜、
ｐＨ５，０付近に高い活性を有している。
知であるグルコース・オキシダーゼを用いて同様な実験
を行なった。その結果を第２図に示す。第２図中実線は
β−Ｄ−グルコース、点線はα−Ｄ−グルコースの場合
であり、横軸は反応時間（秒）、縦軸は吸光度をそれぞ
れ示ス。グルコース・オキシダーゼ溶液（東洋紡製３０
０単位／ｄ）０，１ｒｎｌを用いて、５０ Ｑｎｍの吸
収変化を追跡したところ、見かけ上α−Ｄ−グルコース
にも若干作用しているが、これはα−Ｄ−グルコースか
らβ−Ｄ−グルコースヘノ非酵嵩的変換に起因するもの
である〇 （３〕至適ｐＨおよびｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは第３図の曲線で表わされるとと＜、
ｐＨ５，０付近に高い活性を有している。
本酵素を３７℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理
したときのｐＨ安定性を第４図に示した。
したときのｐＨ安定性を第４図に示した。
第４図より明らかなように本酵素はｐＨ５，０〜９．０
の間で安定である。
の間で安定である。
（４）至適温度および熱安定性：
（本酵素の至適温度は第５図の曲線で表わされるごとく
、５５℃付近に至適温度を有している。
、５５℃付近に至適温度を有している。
本酵素をｐＨ６，０においてそれぞれの温度で１０分間
処理したときの熱安定性を第６図に示した。
処理したときの熱安定性を第６図に示した。
本酵素は６０℃まで安定であった。
（５）電子受容体：
本酵素の電子受容体の検討を行なったところ本酵素は分
子状の酸素を最適の電子受容体とするが、他にフエナジ
ンメトサルフエイト諸よび２．６−ジクロロフェノール
インドフェノールをも電子受容体とした（第３表）。
子状の酸素を最適の電子受容体とするが、他にフエナジ
ンメトサルフエイト諸よび２．６−ジクロロフェノール
インドフェノールをも電子受容体とした（第３表）。
酸 素 溶存酸素 １００
フエナジンメトサルフエイト ０．３ ２
９．８２．６−シクロロフエノールインド ０．
０４ ９．６フエノール メチレンブルー ０．０１
０チトクロームＧ Ｏ，１０フエリ
シアン化カリウム ０．５ＯＮＡＤ
Ｏ，１０ＮＡＤＰ
Ｏ，１０（６）分子量： 本酵素の分子量は、セファクリルＳ−３００（ファルマ
シア製）によるゲル沖過法では約１９５０００であった
。また、（ＳＤＳ ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で測定すると、約４００００のサブユニット３個、
約ａｏｏｏ。
フエナジンメトサルフエイト ０．３ ２
９．８２．６−シクロロフエノールインド ０．
０４ ９．６フエノール メチレンブルー ０．０１
０チトクロームＧ Ｏ，１０フエリ
シアン化カリウム ０．５ＯＮＡＤ
Ｏ，１０ＮＡＤＰ
Ｏ，１０（６）分子量： 本酵素の分子量は、セファクリルＳ−３００（ファルマ
シア製）によるゲル沖過法では約１９５０００であった
。また、（ＳＤＳ ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で測定すると、約４００００のサブユニット３個、
約ａｏｏｏ。
のサブユニット１個および約２８０００のサブユニット
１個から構成されていた。
１個から構成されていた。
（７）補酵素：
精製酵素液０．１％濃度（０，１Ｍリン酸緩衝液ｐａ７
．０）の吸収スペクトルを測定したところ、第７図に示
すフラビン酵素の吸収スペクトルを示した。
．０）の吸収スペクトルを測定したところ、第７図に示
すフラビン酵素の吸収スペクトルを示した。
本酵素を熱処理あるいはトリクロロ酢酸処理し、遠心分
離して得られた上澄の薄層クロマトグラフィーを行なっ
たが（展開溶媒ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：５
）、フラビン系色素は原点から移動せず酵素蛋白と共有
結合していることが示唆された。そこで本酵素にプロナ
ーゼを作用させた後、ホスホジェステラーゼ処理をした
ところアデノシン−５′−１リン酸（ＡＭＰ）の生成が
認められたので、ＦＡＤが本酵素の補酵素であることが
判明した。ＦＡＤの４５Ｏｎｌｌにおける分子吸光係数
から判断すると、本酵素１分子当り３分子のＰＡＤが含
まれていた。なお、本酵素の（ＳＤＳ）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なって得られたゲルを５％酢酸
溶液中で 、 ′３６５ｎｆｆｉの紫外線照射するこ
とにより、３種のサブユニットのうち４００００のサブ
ユニットのみにＦ’ＡＤが存在することが確認された。
離して得られた上澄の薄層クロマトグラフィーを行なっ
たが（展開溶媒ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：５
）、フラビン系色素は原点から移動せず酵素蛋白と共有
結合していることが示唆された。そこで本酵素にプロナ
ーゼを作用させた後、ホスホジェステラーゼ処理をした
ところアデノシン−５′−１リン酸（ＡＭＰ）の生成が
認められたので、ＦＡＤが本酵素の補酵素であることが
判明した。ＦＡＤの４５Ｏｎｌｌにおける分子吸光係数
から判断すると、本酵素１分子当り３分子のＰＡＤが含
まれていた。なお、本酵素の（ＳＤＳ）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なって得られたゲルを５％酢酸
溶液中で 、 ′３６５ｎｆｆｉの紫外線照射するこ
とにより、３種のサブユニットのうち４００００のサブ
ユニットのみにＦ’ＡＤが存在することが確認された。
（８）等電点：
ファルマライト（ｐＨ３〜１０．ファルマシア製）を用
いた焦点電気泳動法により求めた本酵素の等電点は６．
９５であった。
いた焦点電気泳動法により求めた本酵素の等電点は６．
９５であった。
（９）阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影ＩＰ＝
本酵素はｕｇｍ＋、Ｆ＠１＋、Ａｇｓ＋、ＰＭＳＦ（フ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）、硫化ナトリウム
、ＰＣＭＢ （ｐ−クロロメルクリ安息香酸）、０−フ
ェナントロリンなどによって阻害される（第第 ４
表 無添加 １００ ＨｇＣ１ｔ
ＯＰＭＳＦ ｌｌ Ｆ＠ＳＯａ ３硫化ナトリウ
ム ｌ ８ＡｇＮＯ１１０ＰＣＭＢ
２１ ３ｎＣ１婁９２Ｑ−７１ナン
ドロリン２７ Ｃｏａｌｓ ９２アスコ
ルビン酸ナトリウム ５Ｑ Ｃｕ５Ｏａ
９４（Ｉｆ、（！’−シヒリジｋ
３Ｑ Ｚｎ８０４ ９４シアン化カリウ
ム ｆ３２ＭｎＣ１１９４アジ化ナトリウＡ
９（３８ａＣ１１９５（ｌＯ）Ｋ ｍ値： ラインライ−バー−パークプロットにより本酵素のグル
コースに対するＫｍ値を検討したとこ１ ろ１．
２３Ｘ１０−１Ｍであった。
本酵素はｕｇｍ＋、Ｆ＠１＋、Ａｇｓ＋、ＰＭＳＦ（フ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）、硫化ナトリウム
、ＰＣＭＢ （ｐ−クロロメルクリ安息香酸）、０−フ
ェナントロリンなどによって阻害される（第第 ４
表 無添加 １００ ＨｇＣ１ｔ
ＯＰＭＳＦ ｌｌ Ｆ＠ＳＯａ ３硫化ナトリウ
ム ｌ ８ＡｇＮＯ１１０ＰＣＭＢ
２１ ３ｎＣ１婁９２Ｑ−７１ナン
ドロリン２７ Ｃｏａｌｓ ９２アスコ
ルビン酸ナトリウム ５Ｑ Ｃｕ５Ｏａ
９４（Ｉｆ、（！’−シヒリジｋ
３Ｑ Ｚｎ８０４ ９４シアン化カリウ
ム ｆ３２ＭｎＣ１１９４アジ化ナトリウＡ
９（３８ａＣ１１９５（ｌＯ）Ｋ ｍ値： ラインライ−バー−パークプロットにより本酵素のグル
コースに対するＫｍ値を検討したとこ１ ろ１．
２３Ｘ１０−１Ｍであった。
（Ｕ）酵素活性測定法：
ピラノース・オキシダーゼ活性の測定は、反応生成物の
一つである過酸化水素の生成量から求めた。即ち、ＩＭ
Ｄ−グルコース溶液０．１ ｄ。
一つである過酸化水素の生成量から求めた。即ち、ＩＭ
Ｄ−グルコース溶液０．１ ｄ。
マツキルベイン緩衝液ＣＰＨ６，０） １．５ ｄ、２
４．６ｍＭ ４−アミノアンチピリン溶液０．１ｄ、
０．４２Ｖフェノール溶液ｏ、ｉｙ、西洋ワサビ由来の
ペルオキシダーゼ溶液（２４０単位／１ｎり０．１ｍ、
水１．Ｏｄおよび適当に希釈した酵素液０．１−１反応
液量３．０−で３７℃、１０分間反応させた後５００ｎ
ａ１の吸光度（ＯＤサンプル）を測定する。
４．６ｍＭ ４−アミノアンチピリン溶液０．１ｄ、
０．４２Ｖフェノール溶液ｏ、ｉｙ、西洋ワサビ由来の
ペルオキシダーゼ溶液（２４０単位／１ｎり０．１ｍ、
水１．Ｏｄおよび適当に希釈した酵素液０．１−１反応
液量３．０−で３７℃、１０分間反応させた後５００ｎ
ａ１の吸光度（ＯＤサンプル）を測定する。
別に対照としてＤ−グルコース溶液の代わりに水を０．
１−加え、同様の操作によって吸光度（ＯＤブランク）
を測定し、Δ０Ｄｓｃ＋ｏ （ＯＤサンプル−ＯＤブラ
ンク）を求めた。ピラノース・オキシダーゼ活性は下記
の計算式によって求められる。
１−加え、同様の操作によって吸光度（ＯＤブランク）
を測定し、Δ０Ｄｓｃ＋ｏ （ＯＤサンプル−ＯＤブラ
ンク）を求めた。ピラノース・オキシダーゼ活性は下記
の計算式によって求められる。
５．７８ＸｔＸＶｓ
＝ Δ０ＤＸ０．５１９Ｘａｒ
ｖｔ：反応液量（３，０１ｒ１１）
ｖ−二酵素液（Ｑ、１ｍｔ’）
５．７８ ：上記条件下、５００ｎ１１１に詔けるキツ
ネイミン色素のミリモル分子吸光係数（ａｉ／マイクロ
モル）ｔ：反応時間（１０分間） ｄｆ：希釈率 〔実施例〕 以下に本発明によるピラノース・オキシダーゼの製造方
法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例に限
定されるものではないＯな詔、襲は他に特記せぬ限りＷ
／マ％である。
ネイミン色素のミリモル分子吸光係数（ａｉ／マイクロ
モル）ｔ：反応時間（１０分間） ｄｆ：希釈率 〔実施例〕 以下に本発明によるピラノース・オキシダーゼの製造方
法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例に限
定されるものではないＯな詔、襲は他に特記せぬ限りＷ
／マ％である。
実施例 １
グルコース２％、エビオス０．５％および寒天１．５％
（エビオス培地）の組成の斜面培地にポリポラス・オプ
ツサスＡ″１’ＣＣ２６７３３を接種し、２５℃にて１
週間静置培養して種菌とした。グルコース２％、酵母エ
キス０．３％、ペプトン１％、ＫＨｓＰＯ＊ ０．３％
およびＭｇ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏ００１％の組成の培地１０
０ｍｔ’を５００℃容の三角フラスコに分注し、１２０
℃で２０分間殺菌後、冷却し、これに上記の種菌をかき
とり接種して、２５℃で８日間、毎分１００回転で振盪
培養した。
（エビオス培地）の組成の斜面培地にポリポラス・オプ
ツサスＡ″１’ＣＣ２６７３３を接種し、２５℃にて１
週間静置培養して種菌とした。グルコース２％、酵母エ
キス０．３％、ペプトン１％、ＫＨｓＰＯ＊ ０．３％
およびＭｇ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏ００１％の組成の培地１０
０ｍｔ’を５００℃容の三角フラスコに分注し、１２０
℃で２０分間殺菌後、冷却し、これに上記の種菌をかき
とり接種して、２５℃で８日間、毎分１００回転で振盪
培養した。
培養終了後、培養液を沖過して菌体を得た。この菌体を
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）５０−と共に三角フラス
コに入れ、２５℃、２０時間攪拌しながらピラノース・
オキシダーゼの抽出を行なった。この抽出液から遠心分
離によって上澄液を得た。この上澄液の総活性は２２０
単位であった。
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）５０−と共に三角フラス
コに入れ、２５℃、２０時間攪拌しながらピラノース・
オキシダーゼの抽出を行なった。この抽出液から遠心分
離によって上澄液を得た。この上澄液の総活性は２２０
単位であった。
実施例 ２
実施例１のエビオス培地で培養したポリポラス・オブツ
サスＡＴＣＣ２６７３３をグルコース２％、酵母エキス
０．３％、ペプトン１％、ＫＨ＊ＰＯａ０、３ ％ 右
よびＭｇ５Ｏａ ・７ＨｓＯ０，１％の培地１０〇−を
分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５００−の三
角フラスコに接種し、２５℃で６日間培養して、種培養
液とした。グルコース２％、酵母エキス０．１％、ペプ
トン２％、ＫＨ，Ｐｏ。
サスＡＴＣＣ２６７３３をグルコース２％、酵母エキス
０．３％、ペプトン１％、ＫＨ＊ＰＯａ０、３ ％ 右
よびＭｇ５Ｏａ ・７ＨｓＯ０，１％の培地１０〇−を
分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５００−の三
角フラスコに接種し、２５℃で６日間培養して、種培養
液とした。グルコース２％、酵母エキス０．１％、ペプ
トン２％、ＫＨ，Ｐｏ。
０．３％、ＭｇＳＯ４＠ ７１１１０ ０．１ ％およ
び消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４４２） ０．０２ ’
ｆ−（ｖ／ｖ ） ０）組成の培地２０ｔを３０１容の
ジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間殺菌
した。冷却後、上記の種培養液１００−を接種し、２７
℃で７日間、毎分２０１の通気量と毎分３００回転の攪
拌速度の条件で培養した。培養終了後、沖過して菌体を
得た。この菌体１．５０）Ｃｐと１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） １０ ｔを攪拌槽に入れ１３０℃で２４時
間、撹拌しながらピラノース・オキシダーゼの抽出を行
なった。抽出液から沖過により菌体残渣を除き、上澄液
を得た。この上澄液１１ｔのピラノース・オキシダーゼ
活性は５．４０単位／ｄであった。この上澄液１１ｔに
硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加えて、−
昼夜放置後、得た硫安沈殿物を約５００１ｎＩ！の０．
ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解した。この粗
酵素液を限外沖過で濃縮し、脱塩後、あらかじめ０．Ｏ
ＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で緩衝化したＤＩＡＩ
−セファロース（ＣＬ−５Ｂ）のカラム（直径５．０
ｃｍ Ｘ長さ１０ ｏｚ ）に吸着させ、吸着物を０．
０３ Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で洗浄後、０．１
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で溶出して活性区分を集
めた。次にこの活性区分を限外を過で濃縮し、脱塩後、
０． ＯＩ Ｍ ！ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で緩衝
化したＣトセファロース（ＣＬ −６Ｂ ）のカラム（
直径５．０ ｃｓ Ｘ長さ４１）に吸着させ、吸着物を
０．０３ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出して活性
区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透析後１凍結乾
燥し、精製酵素粉末２．２５ｆを得た。この粉末の比活
性は１３．７単位／ｗｉであった。この酵素粉末はポリ
アクリルアミドゲルディスク電気泳動的に単一であった
。以上の精製工程を第５表に示す。
び消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４４２） ０．０２ ’
ｆ−（ｖ／ｖ ） ０）組成の培地２０ｔを３０１容の
ジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間殺菌
した。冷却後、上記の種培養液１００−を接種し、２７
℃で７日間、毎分２０１の通気量と毎分３００回転の攪
拌速度の条件で培養した。培養終了後、沖過して菌体を
得た。この菌体１．５０）Ｃｐと１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） １０ ｔを攪拌槽に入れ１３０℃で２４時
間、撹拌しながらピラノース・オキシダーゼの抽出を行
なった。抽出液から沖過により菌体残渣を除き、上澄液
を得た。この上澄液１１ｔのピラノース・オキシダーゼ
活性は５．４０単位／ｄであった。この上澄液１１ｔに
硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加えて、−
昼夜放置後、得た硫安沈殿物を約５００１ｎＩ！の０．
ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解した。この粗
酵素液を限外沖過で濃縮し、脱塩後、あらかじめ０．Ｏ
ＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で緩衝化したＤＩＡＩ
−セファロース（ＣＬ−５Ｂ）のカラム（直径５．０
ｃｍ Ｘ長さ１０ ｏｚ ）に吸着させ、吸着物を０．
０３ Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で洗浄後、０．１
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で溶出して活性区分を集
めた。次にこの活性区分を限外を過で濃縮し、脱塩後、
０． ＯＩ Ｍ ！ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で緩衝
化したＣトセファロース（ＣＬ −６Ｂ ）のカラム（
直径５．０ ｃｓ Ｘ長さ４１）に吸着させ、吸着物を
０．０３ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出して活性
区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透析後１凍結乾
燥し、精製酵素粉末２．２５ｆを得た。この粉末の比活
性は１３．７単位／ｗｉであった。この酵素粉末はポリ
アクリルアミドゲルディスク電気泳動的に単一であった
。以上の精製工程を第５表に示す。
上澄液 １１８１００ ５９４００ ０．５０３
１００硫安塩析 ２６４００ ５５５００
２．１０ ９３．４限外を過 １６９００
４８９００ ２．８９ ８２．３〔発明の効果
〕 本発明により臨床診断試薬として極めて有用なピラノー
スのオキシダーゼ壜よびその工業的生産に適した製造法
が提供された。
１００硫安塩析 ２６４００ ５５５００
２．１０ ９３．４限外を過 １６９００
４８９００ ２．８９ ８２．３〔発明の効果
〕 本発明により臨床診断試薬として極めて有用なピラノー
スのオキシダーゼ壜よびその工業的生産に適した製造法
が提供された。
第１図は本発明により得られるピラノースのオキシダー
ゼのα−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコースに対
する反応の特異性を表わすグラフであり１第２図は公知
のグルコース・オキシダーゼのα−Ｄ−グルコースオヨ
ヒβ−Ｄ−グルコースに対する反応の特異性を表わすグ
ラフであり、第３図は本発明により得られるピラノース
・オキシダーゼのｐＨと活性の関係を表わすグラフであ
り、第４図は本発明による酵素を３７℃においてそれぞ
れのｐＨで６０分間処理した後のｐＨと活性の関係を表
わすグラフであり、第５図は本発明による酵素の温度と
活性の関係を表わすグラフであり、第６図はｐＨ６，０
においてそれぞれの温度で１０分間処理した後の温度と
活性の関係を表わすグラフであり、第７図は本発明によ
る酵素の吸収スペクトル（酵素濃度０．１％、ｐＨ７，
０）を表わすグラフである。 第１図 第２図 第３図 第５図 第４図 第６図 ｐＨ１度（０Ｃ） 第７図 波長（ｎｍ）
ゼのα−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコースに対
する反応の特異性を表わすグラフであり１第２図は公知
のグルコース・オキシダーゼのα−Ｄ−グルコースオヨ
ヒβ−Ｄ−グルコースに対する反応の特異性を表わすグ
ラフであり、第３図は本発明により得られるピラノース
・オキシダーゼのｐＨと活性の関係を表わすグラフであ
り、第４図は本発明による酵素を３７℃においてそれぞ
れのｐＨで６０分間処理した後のｐＨと活性の関係を表
わすグラフであり、第５図は本発明による酵素の温度と
活性の関係を表わすグラフであり、第６図はｐＨ６，０
においてそれぞれの温度で１０分間処理した後の温度と
活性の関係を表わすグラフであり、第７図は本発明によ
る酵素の吸収スペクトル（酵素濃度０．１％、ｐＨ７，
０）を表わすグラフである。 第１図 第２図 第３図 第５図 第４図 第６図 ｐＨ１度（０Ｃ） 第７図 波長（ｎｍ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有するピラノース・オキシダー
ゼ （１）作用：酸素の存在下、Ｄ−グルコースの第２炭素
を酸化し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を生成する。 （２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する作用が最も
高いが、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マルト
ース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコー
ス、グルコン酸δ−ラクトンなどにも作用する。またＤ
−グルコースに作用する場合、β−Ｄ−グルコースのみ
ならずα−Ｄ−グルコースをも酸化する。 （３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：至適ｐＨが５．０付
近であり、３７℃、６０分処理ではｐＨ５．０〜９．０
の間で安定である。 （４）至適温度および熱安定性：至適温度が５５℃付近
であり、ｐＨ６．０、１０分間処理では６０℃まで安定
である。 （５）電子受容体：分子状酸素を最適の電子受容体とす
るが、フエナジンメトサルフエイトおよび２、６−ジク
ロロフェノールインドフェノールをも電子受容体とする
。 （６）分子量：ゲルろ過法で測定した分子量が約１９５
０００で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で測定すると約４００００
のサブユニット３個、約３００００のサブユニット１個
および約２８０００のサブユニット１個から構成されて
いる。 （７）補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジヌク
レオチド（ＦＡＤ）が約４００００のサブユニット１個
当り１分子、酵素１分子当り３分子共有結合している。 （８）等電点：６．９５ （９）阻害剤：Ｈｇ＾２＾＋、Ｆｅ＾２＾＋、Ａｇ＾＋
、フェニルメチルスルホニルフルオリド、硫化ナトリウ
ム、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、ｏ−フエナントロリ
ンなどによつて阻害される。 （１０）Ｋｍ値：１．２３×１０＾−＾３Ｍ（Ｄ−グル
コース）２、ポリポラス属に属するピラノース・オキシ
ダーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、該培養物か
ら特許請求の範囲第１項記載のピラノース、オキシダー
ゼを採取することを特徴とするピラノース・オキシダー
ゼの製造法。 ３、培養物からピラノース・オキシダーゼを採取するに
際し、培養物から得られる培養菌体をｐＨ４〜１０の緩
衝液に懸濁してピラノース・オキシダーゼを抽出する工
程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の
方法。 ４、ポリポラス属に属する担子菌がポリポラス・オブツ
サスであることを特徴とする特許請求の範囲第２項また
は第３項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60080885A JPS61239886A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60080885A JPS61239886A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61239886A true JPS61239886A (ja) | 1986-10-25 |
| JPH0314426B2 JPH0314426B2 (ja) | 1991-02-26 |
Family
ID=13730796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60080885A Granted JPS61239886A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61239886A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
| US5486458A (en) * | 1992-06-30 | 1996-01-23 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
-
1985
- 1985-04-16 JP JP60080885A patent/JPS61239886A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
| US5486458A (en) * | 1992-06-30 | 1996-01-23 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0314426B2 (ja) | 1991-02-26 |
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