DE3889845T2

DE3889845T2 - Verfahren zur Massanalyse von Wasserstoff-Peroxyd und Reagens dafür.

Info

Publication number: DE3889845T2
Application number: DE3889845T
Authority: DE
Inventors: Toshikatsu Abe; Atsushi Izumi; Akemichi Maki; Mitsuhisa Manabe; Fumio Masumi; Masayuki Nozawa
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1988-10-24
Publication date: 1995-01-26
Anticipated expiration: 2008-10-25
Also published as: EP0314046A3; EP0314046B1; JPH01112155A; JP2516381B2; US4933277A; DE3889845D1; EP0314046A2; ATE106453T1; ES2056870T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid und ein Reagenz zur Verwendung bei einer derartigen quantitativen Analyse.

Beschreibung des Hintergrundes:

In Körperflüssigkeiten wie Blut und Urin enthaltene meßbare Bestandteile erlangten in den letzten Jahren starke Bedeutung für die Diagnose von Krankheiten und zur Bestimmung von Heilwirkungen und Krankheitsursachen.
Unter zahlreichen Verfahren zur Messung von Bestandteilen in Körperflüssigkeit, die bislang entwickelt und übernommen wurden, sind quantitative Analysen von Wasserstoffperoxid in breitem Maße verwendet worden und erlangten starke Bedeutung. Ein übliches anerkanntes quantitatives Analysenverfahren für Wasserstoffperoxid umfaßt die Umsetzung einer geeigneten Oxidase mit einem zu analysierenden Bestandteil, Erzeugen von Wasserstoffperoxid entsprechend der enthaltenen Bestandteilsmenge in der Probe, die ein Reagenz enthält, das sich bei der Analyse von Wasserstoffperoxid verfärbt, und anschließend Ausführen der colorimetrischen Analyse zur Bestimmung der Bestandteilsmenge. Dieses Verfahren wird zur quantitativen Analyse von Cholesterin, Neutralfett, Glucose, Phospholipid, freier Fettsäure, Harnsäure, anorganischen Phosphorverbindungen, Brenztraubensäure, L-Milchsäuren, Aminosäuren und dergleichen, die beispielsweise im Blut oder Urin enthalten sind, verwendet. Das Verfahren wird ebenfalls zur quantitativen Analyse enzymatischer Aktivitäten, einschließlich Aktivitäten von Cholinesterase, α-Amylase, Monoaminoxidase, Transaminase oder dergleichen, angewendet.
Ein zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid verwendetes Farbreagenz ist im allgemeinen eine Kombination von 4-Aminoantipyrin und Phenol, Anilin, Toluidin, Anisidin oder Derivaten dieser Verbindungen [beispielsweise Biochemistry, 6, 24-27 (1969) und FR-A-2 413 660]. Oxidationskondensate, die durch eine solche Kombination von Verbindungen erzeugt werden, haben jedoch eine ziemlich kurzwellige maximale Absorptionswellenlänge (λmax), beispielsweise in der Nähe von 500 nm, und aus diesem Grunde können sie durch gefärbte Substanzen, die üblicherweise in Körperflüssigkeiten vorliegen, wie Hämoglobin, Bilirubin oder dergleichen, beeinflußt werden. Sie werden auch größtenteils durch Trübung beeinflußt. Zusätzlich ist ihre Empfindlichkeit gering, so daß das Verfahren nicht zur Analyse eines Bestandteils, der in einer Probe in einer sehr kleinen Menge enthalten ist, wirksam ist.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben Untersuchungen zur Entwicklung der quantitativen Analyse ausgeführt, um diese Problematik zu überwinden und im Ergebnis fanden sie, daß die kombinierte Verwendung einer zweiwertigen Kobaltverbindung und eines Indikators für dreiwertiges Kobalt eine hochempfindliche quantitative Analyse für Wasserstoffperoxid bei einer Wellenlänge von mehr als 600 nm bereitstellt. Auf dieser Grundlage wurde die Erfindung ausgeführt.

Zusammenfassung der Erfindung

Folglich ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid, wie in Anspruch 1 definiert, bereitzustellen, umfassend die Umsetzung einer zweiwertigen Kobaltverbindung mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase oder einer Substanz ähnlich zu Peroxidase (Peroxidase und Substanzen ähnlich zu Peroxidase werden forthin gemeinsam als "POD" bezeichnet) unter Herstellung einer dreiwertigen Kobaltverbindung, Umsetzen der so erhaltenen dreiwertigen Kobaltverbindung mit einem Indikator für dreiwertiges Kobalt unter Herstellen eines farbigen Komplexes und colorimetrische quantitative Analyse des farbigen Komplexes.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das vorstehend genannte Verfahren zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid bereitzustellen, wobei der Indikator für dreiwertiges Kobalt eine Verbindung der nachstehenden Formel (I) wiedergibt oder ein Salz davon verwendet wird als Indikator für dreiwertiges Kobalt:
worin R&sub1;
darstellt (wobei X und Y gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Halogenatome oder halogenierte Alkylgruppen bedeuten), R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Niederalkylgruppen, Sulfoalkylgruppen oder ω-Sulfohydroxyalkylgruppen bedeuten und R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe darstellt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Reagenz es zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid, definiert gemäß Anspruch 2, umfassend eine zweiwertige Kobaltverbindung, einen Indikator für dreiwertiges Kobalt und POD.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden leicht aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen und bevorzugte Ausführungsformen

Die quantitative Bestimmung gemäß vorliegender Erfindung verwendet die nachstehende Reaktion: Wasserstoffperoxid Co(II) farbiger Komplex POD Wasser Co(III) Indikator für dreiwegiges Co
Gemäß vorstehendem Reaktionsschema wird die zu analysierende Verbindung Wasserstoffperoxid mit einer zweiwertigen Kobaltverbindung in Gegenwart von POD umgesetzt, das bei dieser Umsetzung erzeugte dreiwertige Kobalt wird mit einem Indikator für dreiwertiges Kobalt umgesetzt und dann der erzeugte Farbkomplex quantitativ unter Bestimmung der Wasserstoffperoxidmenge analysiert.
Es gibt keine speziellen Einschränkungen hinsichtlich der bei der Analyse verwendeten zweiwertigen Kobaltverbindungen. Insbesondere schließen sie Kobalt(II)chlorid, Kobalt- (II)sulfat, Kobalt(II)nitrat, Kobalt(II)ammoniumsulfat, Kobalt(II)acetat, Bis(acetylacetonato)kobalt(II), Kobalt(II)natriumethylendiamin und andere Kobalt(II)verbindungen mit ähnlicher Reaktivität wie diese Verbindungen ein.
Es gibt auch keine speziellen Beschränkungen hinsichtlich der Indikatoren, die bei der erfindungsgemäßen Analyse für dreiwertiges Kobalt verwendet werden, solange ein Indikator in der rage ist, einen gefärbten Komplex durch Umsetzung mit dreiwertigem Kobalt zu erzeugen und ein heterocyclisches Azoaminobenzoesäurederivat der nachstehenden Formel (I) oder ein Salz einer solchen Verbindung ist:
worin R&sub1;
darstellt (wobei X und Y gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Halogenatome oder halogenierte Alkylgruppen bedeuten), R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Niederalkylgruppen, Sulfoalkylgruppen oder ω-Sulfohydroxyalkylgruppen bedeuten und R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe darstellt.
Insbesondere schließen die Verbindungen, beispielsweise die nachstehenden Verbindungen, ein:
2-(2-Thiazolylazo)-4-methyl-5-sulfomethylaminobenzoesäure (TAMSMB)
2-(2-Thiazolylazo)-5-dimethylaminobenzoesäure (TAMB)
2-(2-Benzothiazolylazo)-5-dimethylaminobenzoesäure (BTAMB)
2-[(3,5)-Dibrom -2-pyridylazo]-5-dimethylaminobenzoesäure (PAMB)
2-(2-Thiazolylazo)-5-sulfomethylaminobenzoesäure (TASMB)
2-(3,5-Dibrom-2-pyridylazo)-5-(N-ethyl-N-sulfopropylamino)benzoesäure (DSAB)
2-(3,5-Dibrom-2-pyridylazo)-5-(N-sulfopropylamino)benzoesäure
2-(3,5-Dibrom-2-pyridylazo)-5-(N-2-hydroxy-3-sulfopropylamino)benzoesäure
2-(3,5-Dibrom-2-pyridylazo)-5-(N-ethyl-N-2-hydroxy-3- sulfopropylamino)benzoesäure
2-(3,5-Dibrom-2-pyridylazo)-5-(N-sulfopropylamino)benzoesäure
2-(3,5-Dibrom-2-pyridylazo)-5-[N,N-di(2-hydroxy-3- sulfopropyl)amino]benzoesäure
2-(2-Thiazolylazo)-4-methyl-5-sulfopropylaminobenzoesäure (TAMSPB)
2-(2-Thiazolylazo)-4-methyl-5-sulfoethylaminobenzoesäure (TAMSEB)
Trinatrium 2-(2-thiazolylazo)-5-disulfobutylaminobenzoeat (TASBB)
Von den vorstehenden Verbindungen sind (1) bis (4) handelsüblich. Verbindung (5) kann gemäß dem Verfahren, beispielsweise beschrieben in Analytical Chemistry, 28, 535-540 (1979), hergestellt werden. Verbindungen (6) bis (11) können gemäß dem Verfahren, beschrieben in Analytical Science, I, 461-465 (1985), hergestellt werden. Verbindungen (12) und (13) können gemäß dem in Mikrochimica Acta [Wien], 1983 III, 235-244, beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren zur Synthese der Verbindung (14) wird als ein Beispiel der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Als ein Peroxidase-ähnlicher Stoff können beliebige Verbindungen, die ein Reaktionsverhalten ähnlich Peroxidase aufweisen, ohne spezielle Begrenzung verwendet werden. Beispiele einer solchen Verbindung, die verwendet werden kann, sind Cytochrom C, Hämoglobin, Mikroperoxidase und dergleichen.
Die quantitative Analyse gemäß dieser Erfindung wird durch Umsetzung der zu analysierenden Probe, eines Indikators für dreiwertiges Kobalt, einer zweiwertigen Kobaltverbindung und POD in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bis 10 und bei Einhalten der vorgeschriebenen Temperatur (beispielsweise bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 40ºC), gefolgt von Messen des in dem Reaktionsgemisch erzeugten farbigen Komplexes mit einer optischen Vorrichtung, ausgeführt.
Die zweiwertige Kobaltverbindung wird in einer Konzentration in dem Reaktionsgemisch von 0,01 bis 10 mMol/l, vorzugsweise 0,05 bis 1 mMol/l, verwendet. Der Indikator für dreiwertiges Kobalt wird bei einer Konzentration in dem Reaktionsgemisch von 0,01 bis 200 mMol/l, vorzugsweise 0,05 bis 1 mMol/l, verwendet. POD wird bei einer Konzentration in dem Reaktionsgemisch von 1 bis 10 000 U/l, vorzugsweise 500 bis 5 000 U/l, verwendet.
Eine beliebige Pufferlösung, die den vorstehend genannten pH-Wert beibehalten kann, kann ohne spezielle Beschränkung verwendet werden. Beispiele einer solchen Pufferlösung sind Essigsäurepuffer, Phosphorsäurepuffer, Borsäurepuffer, Trispuffer, Glycinpuffer, Good's Puffer und dergleichen.
Um die Menge an Wasserstoffperoxid zu bestimmen, wird zunächst die Änderung der Extinktion bei einer für die erzeugte Farbe geeigneten Wellenlänge gemessen. Alternativ dazu wird die Extinktion bei derselben Wellenlänge nach einem vorgeschriebenen Zeitraum nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von Säure, einem alkalischen Mittel oder einem Tensid gemessen. Anschließend wird der durch Subtraktion der Extinktion der Blindprobe von der gemessenen Extinktion oder die Extinktionsänderung mit der Extinktion oder der Extinktionsänderung der Standardlösung zur Bestimmung der in der Probe enthaltenen Wasserstoffperoxidmenge verglichen.
Die quantitative Analyse der vorliegenden Erfindung kann auf eine Reaktion angewendet werden, bei der Wasserstoffperoxid in dem Reaktionsgemisch erzeugt wird, beispielsweise zur Bestimmung der Wasserstoffperoxidmenge verschiedener Reaktionen, in die Oxidoreduktasen einbezogen sind. Dies ermöglicht eine quantitative Analyse von Enzymen und deren Substraten. Nachstehend einige dieser Beispiele:
(1) Analyse eines Bestandteils in der Körperflüssigkeit (Harnsäure) unter Verwendung von Oxidase. Harnsäure Wasser Co(III) Co(III) Indikator Uricase POD Allantoin Wasserstoffperoxid Co(II) farbiger Komplex
(2) Analyse eines Bestandteils in der Körperflüssigkeit (Gallensäure) unter Verwendung von Reduktase. Gallensäure Wasser Indikator Elektronenträger 3-Keto-gallensäure Wasserstoffperoxid farbiger Komplex
3-α-HSD: 3-α-Hydroxysteroiddehydrogenase
NAD: Nicotinamidadenindinucleotid
NADH: reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid
SOD: Superoxiddismutase
(3) Analyse eines Bestandteils in der Körperflüssigkeit (Cholesterin) unter Verwendung von Dehydrogenase. Cholesterin Wasserstoffperoxid farbiger Komplex Elektronenträger Cholestenon Indikator
CHD: Cholesterindehydrogenase
Es ist ebenfalls möglich, POD durch die Verwendung eines Reagenzes, das eine zweiwertige Kobaltverbindung enthält, einen Indikator für dreiwertiges Kobalt und Wasserstoffperoxid, quantitativ zu analysieren.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann Wasserstoffperoxid quantitativ mit sehr hoher Genauigkeit bestimmt werden. Zusätzlich ermöglicht das Verfahren die Bestimmung verschiedener enzymatischer Wasserstoffperoxid erzeugender Aktivitäten durch Umsetzung mit Substraten sowie die Bestimmung der Menge oder der Aktivität von Substanzen (Substraten), die bekannte enzymatischen Reaktionen gekoppelt mit solchen enzymatischen Reaktionen einbeziehen und von quantitativ zu ermittelnden Enzymen und Coenzymen, sehr leicht bei hoher Empfindlichkeit bei einer Wellenlänge oberhalb 600 nm ohne Störung durch Hämoglobin, Bilirubin oder Trübung.
Andere Merkmale der Erfindung werden natürlich aus der nachstehenden Beschreibung der beispielhaften Ausführungsformen ersichtlich, die zur Erläuterung der Erfindung angeführt werden.

Beispiele

Bezugsbeispiel 1

Synthese von TASBB (Verbindung 14)

In 12 ml Wasser wurden 0,756 g m-Aminobenzoesäure suspendiert. Zu der Suspension wurden 0,795 g Natriumcarbonat gegeben und das Gemisch bei 95ºC erhitzt. Dann wurden 1,83 g Butansulton tropfenweise unter Rühren zugegeben. Zu diesem Gemisch wurden zusätzlich 1,06 g Natriumcarbonat, 2,44 g Butansulton und anschließend 0,4 g Natriumhydroxid zugegeben. Nach Erhitzen des Reaktionsgemisches für 30 Minuten unter Rühren wurde Salzsäure zur Einstellung des pH-Wertes des Gemisches auf 4 zugegeben. Das Gemisch wird hier als "Reaktionsgemisch A" bezeichnet.
Getrennt dazu wurde eine Lösung durch Auflösen von 0,746 g 2-Aminothiazolsulfat in 3 ml 3N Salzsäurelösung hergestellt und dann zu dieser Lösung Natriumnitritplätzchen unter Eiskühlen zugegeben, gefolgt von weiterer Zugabe einer Spatelspitze Sulfaminsäure. Diese Lösung wurde tropfenweise zum Reaktionsgemisch A unter Eiskühlung gegeben. Das Gemisch schlug nach tiefviolett um. Dieses wurde zur Trockne eingedampft und die Zielverbindung aus dem Rückstand mit Hilfe einer Umkehr-ODS-Säule getrennt. Die rohen Kristalle wurden in Methanol gelöst und zu der Lösung wurde Aceton gegeben zur Umkristallisation der reinen Verbindung 14, die als rote Kristalle anfiel.
Elementaranalyse: als C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;N&sub4;O&sub8;S&sub3;Na&sub3;·H&sub2;O
Berechnet: C: 35,76% H: 3,83% N: 9,26% Gefunden: C: 36,04% H: 3,89% N: 9,21%

Beispiel 1

Quantitative Analyse von Wasserstoffperoxid

In 1 ml 50 mMol/l Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 0,025 mMol/l Kobalt(II)ammoniumsulfat, 0,04 mMol/l TASBB und 2 000 U/l Peroxidase wurden 10 ul Wasserstoffperoxid enthaltende Probe gegeben. Nach Erhitzen des Gemisches auf 37ºC für 5 Minuten wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 678 nm gemessen mit einer Blindprobe als Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Wasserstoffperoxidkonzentration (uMol/l) Extinktion

50 0,127
100 0,254
150 0,382
200 0,508
Die Kalibrierkurve war eine Gerade, die durch den Ursprung verlief.

Beispiel 2

Quantitative Analyse von Wasserstoffperoxid

In 3 ml 20 mMol/l Phosphatpuffer (pH 5,0) mit 0,1 mMol/l Bis(acetylacetonato)kobalt(II), 0,07 mMol/l TAMSMB und 1 000 U/l Peroxidase wurden 20 ul Wasserstoffperoxid enthaltende Probe gegeben. Nach Erhitzen des Gemisches auf 37ºC für 5 Minuten wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 655 nm gemessen mit einer Blindprobe als Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Wasserstoffperoxidkonzentration (uMol/l) Extinktion

10 0,124
25 0,309
50 0,618
75 0,928
100 1,236
Die Kalibrierkurve war eine Gerade, die durch den Ursprung verlief.

Beispiel 3

Quantitative Analyse von Glucose

In 1 ml 50 mMol/l Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 0,05 mMol/l Kobalt(II)ammoniumsulfat, 0,04 mMol/l TASBB und 2 000 U/l Peroxidase wurden 10 ul Glucose enthaltende Probe gegeben. Nach Erhitzen des Gemisches auf 37ºC für 5 Minuten wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 678 nm gemessen mit einer Blindprobe als Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3

Glucosekonzentration (uMol/l) Extinktion

50 0,074
100 0,149
200 0,297
300 0,445
400 0,593
500 0,742
Die Kalibrierkurve war eine Gerade, die durch den Ursprung verlief und zeigte somit eine gute quantitative Messung.

Beispiel 4

Quantitative Analyse von Harnsäure

In 10 ul einer Harnsäure enthaltenden Probe wurden 0,5 ml 50 mMol/ml Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 0,08 mMol/l TASBB und 200 U/l Uricase zugegeben. Nach Erhitzen des Gemisches auf 37ºC für 5 Minuten wurden 0,5 ml 50 mMol/l Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 0,1 mMol/l Kobalt(II)nitrat und 4 000 U/l Peroxidase zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37ºC für weitere 5 Minuten erhitzt und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 678 nm gemessen mit einer Blindprobe als Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4

Harnsäurekonzentration (mg/dl) Extinktion

2,5 0,319
5,0 0,639
7,5 0,958
10,0 1,277

Beispiel 5

Vergleich der Empfindlichkeiten und der Wellenlänge des Absorptionsmaximums

In 1,0 ml 50 mMol/l Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 0,03 Gew.-% 4-Aminoantipyrin, 0,02 Gew.-% Phenol und 2 000 U/l Peroxidase wurden 10 ul einer Probe mit Wasserstoffperoxid gegeben. Nach Erhitzen des Gemisches auf 37ºC für 5 Minuten wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 505 nm gemessen mit einer Blindprobe als Kontrolle.
Die quantitative Analyse wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 ausgeführt unter Verwendung verschiedener Arten von Indikatoren für dreiwertiges Kobalt. Relative Empfindlichkeiten bei der Verwendung dieser Indikatorarten wurden durch Heranziehen der Empfindlichkeit der vorstehend genannten Messung als 1 bestimmt. Die Wellenlängen der Absorptionsmaxima wurden hinsichtlich dieser Indikatoren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Indikator relative Empfindlichkeit Absorptionsmaximum (nm) 4-Aminoantipyrin und Phenol

Beispiel 6

Quantitative Analyse von Peroxidase

In 100 ul einer Peroxidase enthaltenden Probe wurden 1,0 ml 30 mMol/l Phosphatpuffer (pH 4,0) mit 0,06 mMol/l TAMSMB, 0,06 mMol/l Kobalt(II)nitrat und 0,625 mMol/l Wasserstoffperoxid gegeben. Nach Erhitzen des Gemisches auf 37ºC für 5 Minuten wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 654 nm gemessen mit einer Blindprobe als Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6

Peroxidasekonzentration (U/l) Extinktion

0,10 0,195
0,25 0,488
0,50 0,975
0,75 1,463
1,00 1,951

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid, umfassend:

Umsetzen einer zweiwertigen Kobaltverbindung bei einer Konzentration im Reaktionsgemisch von 0,01 bis 10 mMol/l mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase oder einem Peroxidase-ähnlichen Stoff bei einer Konzentration in dem Reaktionsgemisch von 1 bis 10 000 U/l unter Herstellung einer dreiwertigen Kobaltverbindung, Umsetzen der so hergestellten dreiwertigen Kobaltverbindung mit einem Indikator für dreiwertiges Kobalt bei einer Konzentration in dem Reaktionsgemisch von 0,01 bis 200 mMol/l unter Herstellung eines farbigen Komplexes und quantitative kolorimetrische Analyse des farbigen Komplexes, wobei der Indikator für dreiwertiges Kobalt eine Verbindung nachstehender Formel (I) oder eines Salzes davon ist:

worin R&sub1;

darstellt (wobei X und Y gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Halogenatome oder halogenierte Alkylgruppen bedeuten), R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Niederalkylgruppen, Sulfoalkylgruppen oder ω-Sulfohydroxyalkylgruppen bedeuten und R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe darstellt.

2. Reagenz zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid, umfassend eine zweiwertige Kobaltverbindung einer Konzentration von 0,01 bis 10 mMol/l in dem Reaktionsgemisch, einen Indikator für dreiwertiges Kobalt mit einer Konzentration von 0,01 bis 200 mMol/l in dem Reaktionsgemisch und Peroxidase oder einen Peroxidase-ähnlichen Stoff mit einer Konzentration im Reaktionsgemisch von 1 bis 10 000 U/l, wobei der Indikator für dreiwertiges Kobalt eine Verbindung, dargestellt durch nachstehende Formel (I), oder einem Salz davon ist:

worin R&sub1;

bedeutet (wobei X und Y gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Halogenatome oder halogenierte Alkylgruppen bedeuten), R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Niederalkylgruppen, Sulfoalkylgruppen oder ω-Sulfohydroxyalkylgruppen bedeuten und R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe darstellt.

3. Verfahren zur quantitativen Analyse von Peroxidase unter Verwendung eines Reagenzes, das eine zweiwertige Kobaltverbindung, einen Indikator für dreiwertiges Kobalt und Wasserstoffperoxid enthält, wobei der Indikator für dreiwertiges Kobalt eine Verbindung nachstehender Formel (I) oder ein Salz davon ist:

worin R&sub1;