DE2731421C2

DE2731421C2 -

Info

Publication number: DE2731421C2
Application number: DE19772731421
Authority: DE
Inventors: Robert Carroll Menson; Venkatachalam Narayanswamy; Richard Charles Wilmington Del. Us Burns
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1976-07-13
Filing date: 1977-07-12
Publication date: 1988-07-07
Also published as: NL179399B; NL179399C; DK315777A; FR2358660B1; LU77751A1; CA1104912A; NL7707682A; DE2731421A1; IT1114891B; DK155751B; FR2358660A1; IE45395L; BE856737A; JPS5753079B2; JPS5311092A; DK155751C; CH633582A5; IE45395B1; GB1571642A

Description

Die Erfindung betrifft Amylaseaktivitätsbestimmungen und eine Reagenz-Testpackung für die Verwendung bei diesen Bestimmungen. Die Erfindung betrifft insbesondere Amylaseaktivitätsbestimmungen, bei denen ein substituiertes Oligosaccharid als Amylasesubstrat verwendet wird.

α -Amylase ist ein Enzym, das die α[1→4]-Bindungen zwischen den Glucoseeinheiten in Stärke und den niede ren Polymeren und Oligomeren von Glucose hydrolisiert. Dieses Enzym wird im menschlichen Körper, in erster Linie im Pankreas und in den Speicheldrüsen gebildet, und seine Aktivität in verschiedenen Körperflüssig keiten ist ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel für den Arzt. Beispielsweise sind bei gesunden Personen die α -Amylaseaktivitäten im Serum verhältnismäßig konstant, jedoch steigen sie als Reaktion auf patholo gische Zustände, z. B. akuter Pankreatitis.

Die US-PS 38 79 263 und die auf der US-Patentanmeldung 5 42 236 (20. 1. 1975) basierende US-PS 40 00 042 beschreiben eine Methode und eine Reagenzkombination für die Verwendung bei der Bestimmung der α -Amylaseaktivität einer Probe unter Verwendung der definierten Oligosaccharide Maltotetraose, Maltopenta ose oder Maltohexaose als Amylasesubstrat. Durch die Reaktion zwischen α -Amalyse und diesen Substraten vor zugsweise in Gegenwart einer Maltase wird eine bestimmte Menge Glucose gebildet, die mit Hilfe eines beliebigen üblichen Glucosenachweissystems gemessen werden kann. Der zusätzliche Schritt zum Nachweis der Glucose ist ein Nachteil. Ferner muß Glucose, die in der Probe vor handen ist, entweder entfernt oder kompensiert werden. Zwar kann dies nach üblichen Methoden geschehen, jedoch stellt dies eine zusätzliche Stufe beim Verfahren und einen Nachteil dar.

A. P. Jansen und P. G. A. B. Wydeveld stellen in Nature 182 (1958) 525 fest, daß α -(p-Nitrophenyl)maltosid als Substrat für die Amylaseaktivitätsbestimmung geeignet sein könnte. Diese Veröffentlichung zeigt jedoch, daß die Verfasser nie das aktive Agens, das für ihre Beobachtungen ver antwortlich ist, identifizierten. Sie berichten: 1) Durch Bebrüten von menschlichen Urin- oder Speichel proben mit α -(p-Nitrophenyl)maltosid bei 37°C für 16 Stunden wurde 4-Nitrophenol gebildet, das spektro- photometrisch durch Mischen des Hydrolysats mit 0,02-n- Natriumhydroxyd identifiziert wurde. 2) Die Hydrolyse wurde durch Fällungsmittel für Protein, z. B. 10%ige Trichloressigsäure und 0,5-n-Silbernitrat, verhindert. 3) Die Hydrolyse war pH-abhängig und am wirksamsten bei pH 5,9 bis 7,0. Die Verfasser geben an, daß dies der Nachweis für "das mögliche Vorhandensein einer nicht identifizierten Carbohydrase" war. Es wird nicht angenommen, daß α -(4-Nitrophenyl)maltosid für eine Amylase- aktivitätsbestimmung bei Menschen geeignet ist, weil die Spaltung dieser Verbindung durch α -Amylase extrem langsam verläuft.

Die DE-OS 24 42 561 beschreibt ein Diagnostikum zur Bestimmung der a -Amylaseaktivität einer Probe, das ein Substrat enthält, das mit α -Amylase unter Bildung von Glucose reagiert. Als geeignetes Substrat wird Malto tetraose oder Maltopentaose verwendet. Durch die Ein wirkung von α -Amylase wird das oben genannte Substrat zu Glucose umgesetzt, die in einer nachgeschalteten Enzymreaktion bestimmt wird. In diesem Falle, daß die Probe vor der Bestimmung Glucose enthält, muß dieser Gehalt vorher bestimmt werden oder die Glucose durch entsprechende Enzymreaktionen abgetrennt werden.

T. E. Barman, Enzyme Handbook, Vol II, Seite 560 be schreibt, das a -Amylase für die Spaltung von α -1,4- Glucosebindungen in Polysacchariden verwendet werden kann, wobei Stärke oder Glykogen, die natürlichen Sub strate, durch eine begrenzte Anzahl von niedermoleku largewichtigen Verbindungen ersetzt werden kann. Diese schließen Oligomere ein, die fünf, sechs, sieben oder acht Glucosereste oder α -p-Nitrophenolmatoside ent halten. Eine Definition, woraus sich der Plural bei der Beschreibung der Nitrophenolmaltoside bezieht, wird von T. E. Barman nicht gegeben. Weiter wird aus geführt, daß synthetische Substrate, wie auch immer, dazu tendieren, nur eine begrenzte Affinität für das Enzym zu besitzen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur photo metrischen Bestimmung der Amylaseaktivität in Proben, wie in Anspruch 1 definiert.

Bei den Ausführungsformen dienen als Sub strate Glykoside von Maltotetraose, Maltopentaose oder Maltohexaose, in der ein aromatischer Rest wie in Anspruch 1 definiert an die endständige Glykosideinheit gebunden ist. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist die endständige Glykosideinheit ein α -(4-Nitrophenyl)glykosid.

Die Erfindung umfaßt ferner eine Reagenz-Testpackung. Diese Testpackung enthält eines der vorstehend genannten Substrate und a -Glukosidase.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Reagenz- Testpackung ist die endständige Glykosideinheit ein α -(4-Nitrophenyl)glykosid, d. h. R ist ein 4-Nitro phenylrest.

Die folgende Beschreibung der Erfindung ist auf Oligomere von Glucose begrenzt, die α[1→4]-verknüpft sind, und in denen ein substi tuierter aromatischer Rest wie in Anspruch 1 definiert an die endständige (reduzierende) Glucoseinheit gebun den ist. Diese Verbindungen haben die allgemeine Formel

in der n den Wert 2, 3 oder 4 hat, R der substituierte aroma tische Rest und der verbleibende Teil der Verbindung der Glykosylrest ist, die jeweils in Anspruch 1 definiert sind. Wenn er vom Glykosylrest durch Hydro lyse abgespalten wird, wird der Rest R ein Phenol ROH oder ein Anion RO^- dieses Phenols (in Abhängigkeit vom Zustand der Lösung), die beide normalerweise als Aglykon bezeichnet werden.

α -Amylase wirkt als Katalysator bei der Hydrolyse von Polysacchariden zu kurzkettigen Oligosacchariden und schließlich zu Maltose. Es wurde gefunden und wird in den vorstehend genannten Patentschriften mitgeteilt, daß von allen Oligosacchariden Maltotetraose (G₄), Maltopentaose (G₅) und Maltohexaose (G₆) für die Ver wendung als Substrat bei einer Amylasebestimmung bevor zugt werden. G_n -Nomenklatur stellt eine bequeme Kurzbezeichnung für n α -[1→4]-verknüpfte Glucose einheiten dar.

Diese drei Substrate werden aus kinetischen und stöchiometrischen Gründen verwendet. Die Bindungs konstante von α -Amylase an Oligosaccharide wird mit steigender Zahl der α[1→4]-Bindungen bis etwa G₆ größer, wo sie sich abflacht. Für Homologe unter G₄ ist die Bindungskonstante zu klein, um annehmbare Reak tionsgeschwindigkeiten zu ergeben. Bei Homologen über G₆ verläuft die Reaktion zwar schnell, jedoch sind die Ergebnisse nicht stöchiometrisch. Unproduktive Reak tionen finden statt, so daß keine n Glucoseeinheiten gebildet werden, wenn α -Amylase mit G_n reagiert. Ferner wird die maximale Geschwindigkeit, mit der das Substrat aus der α -Amylase frei wird, mit kleiner werdendem Wert von n niedriger. Wenn zum Nachweissystem Glucose gehört und G_n als Substrat verwendet wird, müßten innerhalb annehmbarer Zeit n Glucoseeinheiten für jede Wechsel wirkung von α -Amylase mit G_n gebildet werden. Andern falls muß der prozentuale Anteil der insgesamt frei gewordenen Glucoseeinheiten im Vergleich zu den verfüg baren Einheiten geschätzt werden, und dies führt zu Fehlern. Auf Grund dieser Faktoren werden G₄, G₅ und G₆ Substrate verwendet.

Beim System gemäß der Erfindung, bei dem das Nachweis system von der Freigabe eines substituierten Phenols ROH und nicht von der Glucosebildung abhängt, sind stöchiometrische Erwägungen nicht sehr wesentlich.

Wie in der US-PS 38 79 263 dargelegt, ist die Ver wendung einer Maltase, z. B. α -Glucosidase, bei der Messung weder der α -Amylase im Pankreassekret noch der Gesamt- α-amylase erforderlich. Dies ist der Fall, wenn als Substrate die Substrate gemäß der Erfindung sowie G₄, G₅ und G₆ verwendet werden.

Durch Verwendung einer Maltase wird die Reaktionsgeschwindigkeit unter allen Umständen erhöht. Es ist besonders vorteilhaft, eine wirklich stöchiometrische Reaktion zu erreichen, weil die Geschwindigkeit der Reaktion der Maltase mit niederen Oligosacchariden höher ist als die Geschwindigkeit der Reaktion von α -Amylase mit diesen Substraten. α -Amylase bewirkt die Hydrolyse des Substrats zu kleineren Frak tionen, und die Maltase bewirkt die Vollendung der Hydrolyse zu Glocoseeinheiten, so daß die Freigabe des substituierten Phenols stöchiometrisch stattfindet. Aus diesem Grunde werden Oligosaccharide der vorstehen den Formel, in der n einen Wert von 2, 3 oder 4 hat, insbesondere solche, in denen n für 2 oder 3 steht, als Substrate für die Zwecke der Erfindung verwendet.

Bei Verwendung einer Maltase, z. B. α -Glucosidase, findet infolge der Reaktionsfähigkeit der Maltase mit dem Substrat eine Nebenreaktion statt, die zu einer Blind geschwindigkeit (blank rate) führt. Dies bedeutet, daß auch in Abwesenheit von α -Amylase das Phenol frei wird. Da die maximale Geschwindigkeit der Freigabe von Produkt aus Maltase mit steigendem Wert von n niedriger wird, ist der Anstieg einer Blindgeschwindigkeit langsamer als der Anstieg von n. Es ist somit zu erwarten, daß die Blindgeschwindigkeit für G₅ niedriger ist als die für G₄. Dies wird durch Versuche bestätigt. Ein zusätz licher Faktor spielt jedoch bei der Wahl zwischen höheren und niederen Oligosacchariden (d. h. G₄ und G₅) als Substrat eine Rolle. Bei allen Reaktionen des Sub strats mit Amylase und allen Reaktionen von Maltase mit dem Substrat steigt die Geschwindigkeit als Funk tion der Substratkonzentration auf ein Optimum, bei dem sie sich abflacht. Die Substratkonzentration, bei der die Optimierung eintritt, scheint mit steigendem Wert von n zu steigen, so daß mehr Substrat (und Maltase) verwendet werden muß, um die Standardkurve zu optimieren (linearisieren). Bei teueren Chemikalien ist dies ein wichtiger Gesichtspunkt.

Die Substrate gemäß der Erfindung sind die definierten Oligosaccharide der vorstehenden Formel, in der n und R wie in Anspruch 1 definiert sind.

Der Rest R hat, wenn er vom Oligosaccharid in Form eines Phenolations abgespalten ist, eine andere Spektralextink tion als das Substrat.

Die durch Abtrennung dieser Reste vom Glykosylrest gebildeten Anionen der Phenole haben eine maximale Extinktion λ _max zwischen etwa 290 und etwa 600 nm.

Die Einzelheiten der Verfahren zur Herstellung dieser bevorzugten Verbindungen sind in der DE-OS 27 31 372 der Anmel derin beschrieben, so daß hier auf eine Wiederholung verzichtet werden kann.

Von den bevorzugten Ausführungsformen werden besonders bevorzugt die Verbindungen der allgemeinen Formel, in denen R ein Nitrophenylrest ist. Diese Verbindungen, in denen n den Wert 2 oder 3 hat, α -(3-Nitro phenyl)maltotetraosid (G₄pNp) und α -(4-Nitrophenyl)- maltopentaosid (G₅pNp), werden zur Bestimmung der Amylaseak tivität einer Probe, z. B. Blutserum oder Urin, gemäß dem folgenden Reaktionsschema verwendet:

Das als Substrat dienende definierte Oligosaccharid wird einer Lösung zugesetzt, die eine gemessene Menge der zu testenden Probe enthält, worauf die Spektralextinktion der Lösung entweder als Endpunktsbestimmung oder als Geschwindigkeitsbestimmung mit Hilfe üblicher Methoden überwacht wird. Im allgemeinen wird, wie bei allen Enzymreaktionen, die Reaktionslösung bei im wesentlichen konstantem pH-Wert und bei im wesentlichen konstanter Temperatur gehalten. Bei Verwendung dieser Substanzen ist es zweckmäßig, die Bestimmung in einer Lösung durch zuführen, deren pH-Wert auf den basischen Bereich ein gestellt ist, um die Extinktion bei 410 nm zu steigern. Beispielsweise haben G₄pNp und G₅pNp (λ _max 290-305 nm) und 4-Nitrophenol g _max 313 nm) bei 410 nm einen niedri gen Extinktionskoeffizienten im Vergleich zum 4-Nitrophenolatanion (λ _max 410 nm).

Um dies am besten zu verwirklichen, wird eine Reagenz- Testpackung verwendet, die das vorstehend genannte definierte Substrat und eine Maltase enthält. Eine solche Testpackung wird als Beispiel in der US-PS 34 76 515 beschrieben. Diese Testpackung kann in dem in der US-PS 37 70 382 beschriebenen Analysengerät verwendet werden.

Beispiel 1

Eine Probe von α -(4-Nitrophenyl)maltotetraosid (G₄pNp), das gemäß Beispiel 1H der DE-OS 27 31 372 der Anmelderin hergestellt worden war, wurde in 66,7 mMol Natriumphosphatpuffer von pH 6,5 in solchen Mengen gelöst, daß verschiedene Substratkonzentrationen von 2 bis 8 mg/3 ml erhalten wurden. Wie in der genannten Patentanmeldung beschrie ben, war diese Substratprobe unter Verwendung einer Chromatographie-Säule aus "Sephadex® LH-20" gereinigt worden. α -Glucosidase in verschiedenen Konzentrationen von 2,5 bis 12,5 Internationalen Einheiten pro 3 ml Substratlösung (IE/3 ml) wurde dann der Substratlösung zugesetzt, deren Volumen auf 3,0 ml gebracht wurde. Die Lösung wurde 1 bis 10 Minuten bei 37°C bebrütet.

Nach Messung der Blindgeschwindigkeit bei 410 nm unter Verwendung eines Gilford-Spektrophotometers wurde die Re aktion durch Zugabe von 0,1 ml eines "Elevated Enzyme Con trol Product" (Handelsname der Anmelderin) (enthaltend Amy lase und Analyte in einer Pufferlösung mit einer Aktivität von 1150 Somogyi-Einheiten pro dl [SU/dl] Amylase), das 1 : 1 mit "Du Pont Enzyme Diluent" (Handelsname der Anmel derin; Enzym-Verdünnungsmittel, in Form einer wäßrigen Elektrolytlösung von Rinderalbumin, die beispielsweise hergestellt wird durch Auflösen von 5,25 g NaCl, 2,0 ml 1,0 N MgCl₂, 5,0 ml 1,0 N CaCo₃, 6 mg ZnCl₂, 334 mg KCl, 180 mg Na₂HPO₄, 123 mg Na₂SO₄ und 70 g Rinderalbumin in 700 ml Wasser und anschließendem Auffüllen auf 1000 ml Lösung, verdünnt war, ausgelöst. Diese Amylasekonzentration entspricht ungefähr der sechsfachen oberen normalen Konzentration im Serum. Die Gesamtreaktionsgeschwindig keit wurde dann unter Verwendung des Gilford-Spektro photometers gemessen. Durch Subtraktion der Blind geschwindigkeit von der Gesamtgeschwindigkeit wurde die reine Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt.

Eine statistische Optimierung mit zwei Variablen wurde für das Substrat und die α -Glucosidase vorgenommen. Die Ergebnisse dieser Bewertung sind in Tabelle I in willkürlichen Extinktionseinheiten (A) pro Minute genannt.

Tabelle I

Diese Bewertung zeigt, daß die Blindgeschwindigkeit mit steigenden Konzentrationen sowohl von G₄pNp als auch der α -Glucosidase steigt, daß die optimale Konzen tration von G₄pNp etwa 4,0 mg/3 ml beträgt, und daß die optimale Konzentration der α -Glucosidase bei etwa 7,5 IE/3 ml liegt.

Unter Verwendung dieser optimalen Werte von G₄pNp und α-Glucosidase in einer Reaktionslösung von 3 ml wurden die Reaktionsgeschwindigkeiten für verschiedene Konzen trationen der Amylase in der Probe gemessen. Mit Hilfe der Meßwerte wurde eine Standardkurve gezeichnet. Aus dieser Kurve wurde die Empfindlichkeit in mA/Min.SU/dl gemessen. Die Standardkurve für diese Probe ist in Fig. 1 dargestellt. Die Blindgeschwindigkeit und die Empfindlichkeit sind für diese Probe und andere Beispiele in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Beispiel 2

Eine geringe Menge der bei dem in Beispiel 1 beschrie benen Versuch verwendeten Substratprobe wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (High Performance Liquid Chromatography = HPLC), ein dem Fachmann wohl bekanntes Standard-Reinigungsverfahren, weiter gerei nigt. Unter Verwendung der gemäß Beispiel 1 ermittelten optimalen Werte für G₄pNp und α -Glucosidase und der in Beispiel 1 beschriebenen Amylaseprobe wurde eine Standardkurve unter Verwendung dieses gereinigten Sub strats gezeichnet. Die Empfindlichkeit wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Die Standardkurve ist in Fig. 1 dargestellt. Die Empfindlichkeitswerte sind in Tabelle II genannt. Wie Tabelle II zeigt, wurde die Empfind lichkeit der Bestimmung durch die Reinigung wesentlich gesteigert, ein Zeichen, daß die Substratprobe von Beispiel 1 irgendeinen Inhibitor enthielt.

Beispiel 3

Das bei diesem Versuch verwendete α -(4-Nitrophenyl)- maltotetraosid (G₄pNp) war durch Deacetylierung des durch HPLC gereinigten Acetats von Beispiel 1D der DE-OS 27 31 372 hergestellt worden. Im einzelnen wurde zu einer Probe dieses Acetats eine Lösung von Natriummethoxyd und Methanol gegeben. Die Lösung wurde 18 Stunden in einem geschlossenen Gefäß bei Raumtemperatur gerührt. Das Methanol wurde dann unter vermindertem Druck entfernt.

Das in dieser Weise gebildete G₄pNp wurde in 66,7 mMol Natriumphosphatpuffer von pH 6,5 in einer solchen Menge gelöst, daß eine Substratkonzentration von 4 mg/3 ml erhalten wurde. Dann wurden 7,5 IE/3 ml α -Glucosidase der Substratlösung zugesetzt. Das Volumen der Lösung wurde auf 3,0 ml gebracht. Die Lösung wurde 1 bis 10 Minuten bei 37°C bebrütet.

Nach der Messung der Blindgeschwindigkeit auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml "Du Pont Elevated Enzyme Control Product", siehe Beispiel 1, das mit dem Enzymverdünnungsmittel "Du Pont Enzyme Diluent"; siehe Beispiel 1, im Verhältnis von 1 : 1 ver dünnt war, ausgelöst. Die Reaktionsgeschwindigkeit für verschie dene Amylasekonzentrationen in der Probe wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise gemessen, worauf eine Standardkurve gezeichnet wurde. Aus dieser Kurve wurde die Empfindlichkeit in mA/Min./SU/dl ermittelt.

Die Standardkurve für dieses Substrat ist in Fig. 1 dargestellt, und die Blindgeschwindigkeit und die Empfindlichkeit sind in Tabelle II genannt.

Dies ist eine rohe Probe, die noch nicht durch chroma tographische Trennmethoden gereinigt worden ist. Als Folge hiervon ist die Blindgeschwindigkeit sehr hoch - sie liegt im Bereich von 10,3 bis 13,3 mA/Min. -, jedoch ist die Empfindlichkeit der in Beispiel 1 ange gebenen Empfindlichkeit des Substrats, bei dem eine vorherige Reinigung mit einer Säule aus "Sephadex® LH-20" vorgenommen worden war, gleichwertig.

Eine weitere Reihe von Reaktionen wurde unter den vor stehend genannten Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch die Reaktion 5 Min. nach ihrer Auslösung durch Zu gabe von 1,5 ml eines aliquoten Teils der Probelösung in entweder 1,5 ml 0,2 molarem Na₂CO₃ oder 5 ml 0,002 n NaOH abgebrochen wurde. Bei pH 6,5 ist der Ex tinktionskoeffizient des 4-Nitrophenols verhält nismäßig niedrig, weil nicht das gesamte 4-Nitro phenol ionisiert ist. Der Anstieg des pH-Werts als Folge des Abbruchs der Reaktion genügt, um das 4-Nitro phenol vollständig zu 4-Nitrophenolat zu ionisieren, wodurch der Extinktionskoeffizient erhöht wird. Dies führt zu einer "Endpunktsbestimmung"; für die die Standardkuven nicht geradlinig waren, wahrscheinlich weil das System für eine Geschwindigkeits- und nicht eine Endpunktsannäherung optimiert war. Eine fünf- bis zehnfache Steigerung der Empfindlichkeit wurde jedoch beobachtet.

Beispiel 4

Eine gemäß Beispiel 1G der DE-OS 27 31 372 hergestellte Probe von α -(4-Nitrophenyl)maltotetraosid wurde in 66,7 mMol Natriumphosphatpuffer von pH 6,5 in einer solchen Menge gelöst, daß eine Substratkonzentration von 4 mg/3 ml erhalten wurde. Dann wurden 7,5 IE/3 ml α -Glucosidase der Substratlösung zugesetzt. Das Volumen der Lösung wurde auf 3,0 ml gebracht. Die Lösung wurde 1 bis 10 Minuten bei 37°C bebrütet.

Nach Messung der Blindgeschwindigkeit in einem Gilford Spektrophotometer bei 410 nm wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml "Du Pont Elevated Enzyme Control Product, siehe Beispiel 1, das mit dem Enzymverdünnungsmittel "Du Pont Enzyme Diluent", siehe Beispiel 1, im Verhältnis von 1 : 1 verdünnt war, ausgelöst. Die Reaktionsgeschwindigkeiten für die ver schiedenen Amylasekonzentrationen der Proben wurden mit dem Gilford-Spektrophotometer gemessen, worauf eine Standardkurve gezeichnet wurde. Aus dieser Kurve wurde die Empfindlichkeit in mA/Min./SU/dl gemessen. Die Standardkurve für diese Probe ist in Fig. 1 dargestellt. Die Blindgeschwindigkeit und die Empfindlichkeit sind in Tabelle II genannt.

Auch dies ist ein Substrat, das durch eine Säule aus "Sephadex® LH-20" gereinigt worden war. Die Empfindlich keit der Bestimmung unter Verwendung des Substrats dieses Beispiels ist derjenigen der in den Beispielen 1 und 3 beschriebenen Bestimmungen gleichwertig. Die Blindgeschwindigkeit ist jedoch etwa geringer als die von Beispiel 1 und merklich geringer als die von Beispiel 3.

Beispiel 5

Eine Probe von α -(4-Nitrophenyl)maltopentaosid (G₅pNp), hergestellt gemäß Beispiel 2E der DE-OS 27 31 372, wurde in 66,7 mMol Natriumphosphatpuffer von pH 6,5 in solchen Mengen gelöst, daß verschiedene Substratkonzentrationen im Bereich von 4,0 bis 12,0 mg/3 ml erhalten wurden. α -Glucosidase mit unterschiedlicher Aktivität im Bereich von 15 bis 45 IE/3 ml wurde dann der Substrat lösung zugesetzt, deren Volumen dann auf 3,0 ml ge bracht wurde. Die Lösung wurde 1 bis 10 Minuten bei 37°C bebrütet.

Vorversuche wurden unter Verwendung von 4,0 mg/3 ml G₅pNp und drei α -Glucosidasekonzentrationen von 7,0, 14,0 und 28,0 IE/3 ml durchgeführt. Für jede dieser Konzentrationen wurden auf die in Beispiel 1 beschrie bene Weise die Standardkurven unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Amylaseprobe gezeichnet. In je dem Fall betrug die Blindgeschwindigkeit 3,0 mA/Min. Die Standardkurve für die drei α -Glucosidasekonzentrationen sind in Fig. 2 dargestellt. Alle Kurven waren nicht geradlinig, so daß eine Bestimmung der Empfindlichkeit schwierig war. Die Empfindlichkeit wird jedoch mit mehr als 0,160 mA/Min./IE/dl geschätzt. Die Linearität stieg mit steigender α -Glucosidasekonzentration, ein Zeichen, daß die α -Glucosidasekonzentration unter dem Optimum lag.

Eine Optimierung mit zwei Variablen wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise vorgenommen. Die Ergeb nisse dieser Optimierung sind in Tabelle III genannt.

Tabelle III

Diese Bewertung zeigt, daß die Blindgeschwindigkeit nur wenig steigt, wenn die G₅pNp- oder α -Glucosidasekonzen tration erhöht werden. Dies ist in Übereinstimmung mit der oben erläuterten Situation bei G₅. Diese Analy se zeigt ferner, daß der optimale Wert für G₅pNp oder α -Glucosidase bei 12,0 mg/3 ml bzw. 45 IE/3 ml nicht erreicht worden ist. Da G₅pNp eine niedrigere oder zumindest eine stabile Blindgeschwindigkeit als Funk tion der Substrat- und α -Glucosidasekonzentrationen hat, wird es als Substrat bevorzugt. Die für die Bestimmungen erforderlichen hohen Konzentrationen von G₅pNp und α -Glucosidase schränken jedoch ihren bevor zugten Status ein.

Claims

1. Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Amylaseaktivität in Proben unter Verwendung von am reduzierenden Ende der Oligosac charidkette durch ein Aglykon modifizierten Oligosaccharid-Substraten, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) zu einer Lösung, die eine gemessene Menge der Probe enthält, ein definiertes Oligosaccharid-Substrat der Formel gibt, in der n den Wert 2, 3 oder 4 hat und R ein aromatischer Rest der Formel ist, worin X für H, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, OR′ oder CO₂R′ steht, worin R′ ein Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen ist,
b) der Lösung außerdem alpha-Glucosidase zugesetzt, hydrolysiert und
c) bei einem im wesentlichen konstanten pH-Wert im basischen Bereich und bei im wesentlichen konstanter Temperatur die Spektralextinktion der Lösung überwacht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R ein 4-Nitrophenylrest ist.

3. Reagenz-Testpackung zur Bestimmung der Amylaseaktivität von Proben, enthaltend

a) ein definiertes Oligosaccharidsubstrat der Formel in der n einen Wert von 2, 3 oder 4 hat und R ein wie in Anspruch 1, definierter Rest ist, und
b) alpha-Glucosidase.

4. Reagenz-Testpackung nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß R ein 4-Nitrophenylrest ist.