JPS5843785A - 発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS5843785A JPS5843785A JP14168381A JP14168381A JPS5843785A JP S5843785 A JPS5843785 A JP S5843785A JP 14168381 A JP14168381 A JP 14168381A JP 14168381 A JP14168381 A JP 14168381A JP S5843785 A JPS5843785 A JP S5843785A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発Ｗ１４拡発酵法によるピラノース・オキシダーゼの
製造法に関する。さらに詳しくは、本発明は；リオツス
属、ダエダレオプシス属、ブロイ讐タス属またはグルニ
オフィルム属に属しピラノース・オキシダーゼ生産能を
有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にピッノー
ス・オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採職するヒ
とを特徴とする発−法によるピラノース・オキシダーゼ
の製造法に関する。ピラノース・鳴 オキシダーゼ（１１１１１１１１号１１．１１０）は、
グルコースをグルコソンに、キシｐ−スをキシ四ソンに
、ンルｌ−スを５−ケトフックドースＫｌｌ化する反応
を触媒する酵素であ＃）（Ｍ＠ｔｈｏａ＊ ｉｎ’ｘｎ
ｘｙｍｏ１’１１０１ＸＬＸ、 ＰＩ ７０．１９７５
） 、各々の物質を酸化する際に酸素を吸収し、過酸化
水素を生成する。
製造法に関する。さらに詳しくは、本発明は；リオツス
属、ダエダレオプシス属、ブロイ讐タス属またはグルニ
オフィルム属に属しピラノース・オキシダーゼ生産能を
有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にピッノー
ス・オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採職するヒ
とを特徴とする発−法によるピラノース・オキシダーゼ
の製造法に関する。ピラノース・鳴 オキシダーゼ（１１１１１１１１号１１．１１０）は、
グルコースをグルコソンに、キシｐ−スをキシ四ソンに
、ンルｌ−スを５−ケトフックドースＫｌｌ化する反応
を触媒する酵素であ＃）（Ｍ＠ｔｈｏａ＊ ｉｎ’ｘｎ
ｘｙｍｏ１’１１０１ＸＬＸ、 ＰＩ ７０．１９７５
） 、各々の物質を酸化する際に酸素を吸収し、過酸化
水素を生成する。
従来、発ｌＩｌ決によるピラノース・オキシダーゼ生産
能法としては、ポリポラス属に属する微生物を培養して
得る方法が知られている。（ｍｗｉｎ Ｂｓｒｙｍｏｘ
ｖｏＩＸＸ、工、１１１７Ｇ（１１７！り）。
能法としては、ポリポラス属に属する微生物を培養して
得る方法が知られている。（ｍｗｉｎ Ｂｓｒｙｍｏｘ
ｖｏＩＸＸ、工、１１１７Ｇ（１１７！り）。
本発明者ら紘発酵法によるピラノース・オキシダーゼの
製造法について種々検討した結果、；リオラス属、ダエ
ダレオプシス属、プ四イ四タス属また紘グロエオフイル
ム属に属し、ピッノース・オキシダーゼ生産能を有する
微生物を培地にｍｓするととｋよ）培養物中にピツノー
ス・オキシダーゼが生成するヒとを見い出し本発明を完
成した。
製造法について種々検討した結果、；リオラス属、ダエ
ダレオプシス属、プ四イ四タス属また紘グロエオフイル
ム属に属し、ピッノース・オキシダーゼ生産能を有する
微生物を培地にｍｓするととｋよ）培養物中にピツノー
ス・オキシダーゼが生成するヒとを見い出し本発明を完
成した。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発判ＫＩ！用される微生物は、プリオラス属、ダエダ
レオプシス属、ブロイレタス属、グ四ニオフィルム属に
属し、ピッノース・オキシダーゼを生産する能力を有す
るものであればいずれの菌株でもよい。好適な菌株の例
としてはコリオラｘ−ぺＡ’／カラー（ｃｏｒｌｏｘｕ
ｓ ｖ＊ｒｓｉｃｏｌｏｒ）１７０４９３７、ダエダレ
オプシス・メチ２シナ（ｐａｅｌａｌｅｏｐｓｉｓ ａ
ｔｙｒａｃｉｎｌＬ ） Ｘ Ｆ ０４９１０ ％グａ
ｘオフイ／Ｉ／Ａ−セビアリウム（ＧｌｏｅＯｐｈｙｌ
ｌｕｍａｅｐｉａｒｉｕｍ）！−４１ＣＭＲＲＸａ
１２５０６）、 グａイνりｘ−オストレアタス（ｐｌ
＠ｕｒｏｔｕｓ ０ｓｔ−ｒ＠ａｔｕｓ ） Ｚ−６４
（ＭＲＲＬ １２５０７）等がＩｔ−ｊ’られる。
レオプシス属、ブロイレタス属、グ四ニオフィルム属に
属し、ピッノース・オキシダーゼを生産する能力を有す
るものであればいずれの菌株でもよい。好適な菌株の例
としてはコリオラｘ−ぺＡ’／カラー（ｃｏｒｌｏｘｕ
ｓ ｖ＊ｒｓｉｃｏｌｏｒ）１７０４９３７、ダエダレ
オプシス・メチ２シナ（ｐａｅｌａｌｅｏｐｓｉｓ ａ
ｔｙｒａｃｉｎｌＬ ） Ｘ Ｆ ０４９１０ ％グａ
ｘオフイ／Ｉ／Ａ−セビアリウム（ＧｌｏｅＯｐｈｙｌ
ｌｕｍａｅｐｉａｒｉｕｍ）！−４１ＣＭＲＲＸａ
１２５０６）、 グａイνりｘ−オストレアタス（ｐｌ
＠ｕｒｏｔｕｓ ０ｓｔ−ｒ＠ａｔｕｓ ） Ｚ−６４
（ＭＲＲＬ １２５０７）等がＩｔ−ｊ’られる。
これらの微生物の曹−的性質は次の文献に記載されてい
る。 □′□ 本発明に使用される栄養培地唸炭素源、窒素源、無機物
その他値用曹株Ｏ必要とする微量栄養素を１よく含有す
るもので参れｄ會成培地、天然培地のいずれも使用可能
である。
る。 □′□ 本発明に使用される栄養培地唸炭素源、窒素源、無機物
その他値用曹株Ｏ必要とする微量栄養素を１よく含有す
るもので参れｄ會成培地、天然培地のいずれも使用可能
である。
炭素源としては、ダル；−ス、シェフ四−ス、デキスト
リン、でんぷん、グリセリン、糖蜜などの炭水化愉など
が用いられる。
リン、でんぷん、グリセリン、糖蜜などの炭水化愉など
が用いられる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモエクム
、リン酸ア／ＪＩ＆ニウムｓ 硝酸７ｙ−ｖ：ニウム、
グルタ電ン酸などＯアしＬ酸など無機あるい社有機の窒
素化金物、ペプトン、崗エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、コーン・スチープ・リカーなどの窒素含有天然物が
使用できる。
、リン酸ア／ＪＩ＆ニウムｓ 硝酸７ｙ−ｖ：ニウム、
グルタ電ン酸などＯアしＬ酸など無機あるい社有機の窒
素化金物、ペプトン、崗エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、コーン・スチープ・リカーなどの窒素含有天然物が
使用できる。
無機物としては、リン酸−カリウム、リン酸二カリクム
、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄な「、。
、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄な「、。
どが使用できる。
培養は通常振盪培養あるいは通気攪拌培養で行なう。
培養温度ｄ２０〜３５℃、好適には２５〜３０℃で行な
う。培地のｐＨｉｊ＆０〜亀Ｏ１好適には４５〜＆５の
範囲にあることが菫ましい。培養期間は１〜７日、通常
は２〜４日間で完了する。
う。培地のｐＨｉｊ＆０〜亀Ｏ１好適には４５〜＆５の
範囲にあることが菫ましい。培養期間は１〜７日、通常
は２〜４日間で完了する。
上記の方法で培養するととによ〉、培養物中、主に画体
中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄積する。
′ 培養物中からのピラノース・オキシダーゼの採敗は例え
ば次のように行なう。
中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄積する。
′ 培養物中からのピラノース・オキシダーゼの採敗は例え
ば次のように行なう。
培養終了後、培養液を濾過して菌体を得、ついでこの菌
体ｔ！１＃！１１手段で破砕し、破砕液から遠心分離等
によって上清液を得る。上清液を通常酵素精製に用いら
れる方法、たとえｄ１塩析、有機Ｓ媒沈殿、透析、イオ
ン交換カラムクロマト、ダルＰ５過、凍結乾燥などの方
法で処理する。以上のようにして精製ピラノース・オキ
シダーゼを採取することができる。本発明におけるピッ
ノース・オキシダーゼＯ活性は次の方法で一定する。
体ｔ！１＃！１１手段で破砕し、破砕液から遠心分離等
によって上清液を得る。上清液を通常酵素精製に用いら
れる方法、たとえｄ１塩析、有機Ｓ媒沈殿、透析、イオ
ン交換カラムクロマト、ダルＰ５過、凍結乾燥などの方
法で処理する。以上のようにして精製ピラノース・オキ
シダーゼを採取することができる。本発明におけるピッ
ノース・オキシダーゼＯ活性は次の方法で一定する。
（ＬＩＭ）リス−塩酸緩衝液（ＰＨ７，０）１．０ｍｇ
、発色液〔４−アミノアンチピリン、フェノールを各ｋ
１０ ｍ ｍｏｌ／ｊ含むα１Ｍ）リスー塩酸緩ＩＩ
ｒ液（ＰＨ７、Ｏ）Ｋパーオキシダーゼを腋溶液１０Ｇ
−当）λ０００単位含有させたもの〕Ｑ、２２−１Ｉグ
ルコース溶液０．’１ｌｌｊ、ピラノース・オキシダー
ゼ溶液（ｌ１ｍ、α１ｍＭＦＡＤα１−１水Ｌ５ｍよ〉
成る全量３．Ｏｄの酵素含有液を３７℃で反応し、５６
ｏＯｎｍの吸光度の増加を記録針で自動的に記録した。
、発色液〔４−アミノアンチピリン、フェノールを各ｋ
１０ ｍ ｍｏｌ／ｊ含むα１Ｍ）リスー塩酸緩ＩＩ
ｒ液（ＰＨ７、Ｏ）Ｋパーオキシダーゼを腋溶液１０Ｇ
−当）λ０００単位含有させたもの〕Ｑ、２２−１Ｉグ
ルコース溶液０．’１ｌｌｊ、ピラノース・オキシダー
ゼ溶液（ｌ１ｍ、α１ｍＭＦＡＤα１−１水Ｌ５ｍよ〉
成る全量３．Ｏｄの酵素含有液を３７℃で反応し、５６
ｏＯｎｍの吸光度の増加を記録針で自動的に記録した。
この条件下で生成するキノンイミン色素の分子吸光係数
をｕＸｌＧ”とし、３７℃、ｐ ｍ！７．０において１
分間に１１に１の過酸化水素を生成する酵素量を１単位
とすると、ピラノース・オキシダーゼの単位はとして表
示される。
をｕＸｌＧ”とし、３７℃、ｐ ｍ！７．０において１
分間に１１に１の過酸化水素を生成する酵素量を１単位
とすると、ピラノース・オキシダーゼの単位はとして表
示される。
Δム、。、：単位時間（１分間）当りのｓｏｏｎｍＯ吸
光度増加量 次に、実施例１よシ得られたビ２ノーメ・オキシダーゼ
の性質を示す。
光度増加量 次に、実施例１よシ得られたビ２ノーメ・オキシダーゼ
の性質を示す。
（１）安定ｐＨ範囲
酵素標品を第１図に示した種々のｐＨを有するクエン酸
緩衝液、トリス緩衝液、はう蒙緩衝液ＫｔｏｏｍＵ／α
７−となるように溶解し、これらの滴液を５０’ＣＫ”
３０分間保持した。冷却後中和し、残存活性を一定した
。第１図から本酵素の安定ｐｇｍｓ＃ｉ翫Ｏ〜７．４で
あることがわかる。
緩衝液、トリス緩衝液、はう蒙緩衝液ＫｔｏｏｍＵ／α
７−となるように溶解し、これらの滴液を５０’ＣＫ”
３０分間保持した。冷却後中和し、残存活性を一定した
。第１図から本酵素の安定ｐｇｍｓ＃ｉ翫Ｏ〜７．４で
あることがわかる。
（２）最適ｐＨ
酵素標品を第２図に示した種々の）Ｈを有するトリス緩
衝液に２５０ｍＵ／λ７−となるように溶解し酸素吸収
測定用セル（給水科学研究所製ＢＩＯＸＹＧＲＡＰＨ）
Ｋ入れ、１Ｍグルコース５０μｌを添加して酸素吸収
量を一定した。第２ｒｊＡから本酵素の最適ｐＢｄ６！
付近にあることがわかる。
衝液に２５０ｍＵ／λ７−となるように溶解し酸素吸収
測定用セル（給水科学研究所製ＢＩＯＸＹＧＲＡＰＨ）
Ｋ入れ、１Ｍグルコース５０μｌを添加して酸素吸収
量を一定した。第２ｒｊＡから本酵素の最適ｐＢｄ６！
付近にあることがわかる。
（３）最適温度
活性測定法と同じ組成を有する反応液でし、第３−に示
した各温度で５分間反応した。
した各温度で５分間反応した。
第３図よ）本酵素の最適温度は５０″ＣＫあることがわ
かる。
かる。
（４）耐熱性
（ＩＭ）リス緩衝ｔｌｐｍｆＬｏ ａ、ｅｗｉ＜本酵素
を１００３ＥＩＵ／（Ｌ７−となるようにｓ等し、第４
図に示した各温度で３０分間熱処理後、残存活性を測定
し九、第４図よル本酵素は６０℃３０分閑魁罵後％９０
嘔の残存活性を有することがわかる。
を１００３ＥＩＵ／（Ｌ７−となるようにｓ等し、第４
図に示した各温度で３０分間熱処理後、残存活性を測定
し九、第４図よル本酵素は６０℃３０分閑魁罵後％９０
嘔の残存活性を有することがわかる。
（５）基質特異性
活性測定法と同じ組成を有する反応液で、ビクノース・
オキシダーゼ１５単位、反応の基質として第１表に示し
た各種Ｏ糖製１ｌ（１００！ＩＩＭ）（Ｌｌ−使用した
ー活性は相対活性であられし九。第１表よ〉本−素はグ
ルコースに対する特異性が高く、弛にソルボース、キシ
四−スに作用した。
オキシダーゼ１５単位、反応の基質として第１表に示し
た各種Ｏ糖製１ｌ（１００！ＩＩＭ）（Ｌｌ−使用した
ー活性は相対活性であられし九。第１表よ〉本−素はグ
ルコースに対する特異性が高く、弛にソルボース、キシ
四−スに作用した。
第 １ 表
グルコース １００
マンノース （Ｌｌ
ガラクトース α９
ソルボース ユ４
フックドース ０
キシロース ２６
マルトース Ｏ
トレハロース Ｏ
ラクトース Ｏ
マンニトール Ｏ
グルコサミン Ｏ
従来のボリボ２ス真の微生物から得られ九ピッノール・
オキシダーゼに比べてソルボース。
オキシダーゼに比べてソルボース。
キシレースに対する基質特異性が極めて弱い（Ｂ、 Ｂ
、ム、上見工５０１−５１０ （１９６８）の表１参照
）。
、ム、上見工５０１−５１０ （１９６８）の表１参照
）。
（６）電子受容体
５０１１Ｍ）リスー塩酸緩債液ＰＨ７，０１，４に示し
た各渋皮を有する種々の電子受容体製１１ａ５−をツン
ペルグ管付セルに入れ、吸引して溶存酸素を除去した後
、側室のαＩＭグルコース＠＠ （Ｌ ５−を混合する
。混合後、３０秒から９０秒間の１分間の吸光度の変化
量を測定し、各電子受容体の活性を相対活性で表わした
。第２表よシ１本酵素の分子状酸素を最適の電子受容体
とするが、九・−ディクロ四フェノールインドフェノー
ルおよびチトクｐ−ム０をも電子受容体とし得ることが
わかる。
た各渋皮を有する種々の電子受容体製１１ａ５−をツン
ペルグ管付セルに入れ、吸引して溶存酸素を除去した後
、側室のαＩＭグルコース＠＠ （Ｌ ５−を混合する
。混合後、３０秒から９０秒間の１分間の吸光度の変化
量を測定し、各電子受容体の活性を相対活性で表わした
。第２表よシ１本酵素の分子状酸素を最適の電子受容体
とするが、九・−ディクロ四フェノールインドフェノー
ルおよびチトクｐ−ム０をも電子受容体とし得ることが
わかる。
第 ２ 表
酸 素 溶存酸素 Ｚｏ。
２、６−シクロロフエノールイントフエノール ＆
６４ ２．５ニトロブルーテトラゾリウム
１１ ０チトクロームｏ
ａｉ α３３ＭＡＤ
α１ＯＮＡＤＰ
Ｑ、１ ０フエリシアン化物
（Ｌ５ ０（７）阻害剤 （２）の最適ｐＨ測定と同様酸素吸収測定によって求め
丸。５０ｍＭ）９スー塩酸緩衝液（ｐｎ７．ｏ）ａ、４
ｍｇ、酵素溶液０．１ ｓｇ （２８０ｍＵ）、阻害剤
溶液（１＆５ｍＭ）ＱＪ−より成る反応液を酸素吸収測
定用量ＮＫ入れ、３７℃で１Ｍグル；テ、−ス５０μｌ
を添加して反応を行なった。結果を第３表に示し九０本
酵素はＱｕ 、ムｇ ％Ｎｉ 、ＰＯＭＢによっ
て阻害されることがわかる。
６４ ２．５ニトロブルーテトラゾリウム
１１ ０チトクロームｏ
ａｉ α３３ＭＡＤ
α１ＯＮＡＤＰ
Ｑ、１ ０フエリシアン化物
（Ｌ５ ０（７）阻害剤 （２）の最適ｐＨ測定と同様酸素吸収測定によって求め
丸。５０ｍＭ）９スー塩酸緩衝液（ｐｎ７．ｏ）ａ、４
ｍｇ、酵素溶液０．１ ｓｇ （２８０ｍＵ）、阻害剤
溶液（１＆５ｍＭ）ＱＪ−より成る反応液を酸素吸収測
定用量ＮＫ入れ、３７℃で１Ｍグル；テ、−ス５０μｌ
を添加して反応を行なった。結果を第３表に示し九０本
酵素はＱｕ 、ムｇ ％Ｎｉ 、ＰＯＭＢによっ
て阻害されることがわかる。
硫酸コバルト １ユ３硫酸鋼
３５．７ 硝酸銀 ５′＆３ 塩化ニッケル ２＆６８−ヒドロキ
シキノリン １３．．３過酸化水素
２α０（８）等電点 ｐｉｔｓ〜１ａＯＱキャリアアン７オツイトを用いたイ
ソエレクトリック７オカシング法によシ本酵素Ｏ等電点
を求めた結果１表２であつ九、□ （９）分子− セファデツ）スト２００によるゲルー過法で求めた。標
準蛋白質として卵アルブミン、牛血清アルブミン、アル
コール脱水素酵素、ｒ−グ四プリン、牛乳のキサンチン
・オキシダーゼを用いた。その結果、本酵素の分子量は
約２２へｏｏｏと求められた。
３５．７ 硝酸銀 ５′＆３ 塩化ニッケル ２＆６８−ヒドロキ
シキノリン １３．．３過酸化水素
２α０（８）等電点 ｐｉｔｓ〜１ａＯＱキャリアアン７オツイトを用いたイ
ソエレクトリック７オカシング法によシ本酵素Ｏ等電点
を求めた結果１表２であつ九、□ （９）分子− セファデツ）スト２００によるゲルー過法で求めた。標
準蛋白質として卵アルブミン、牛血清アルブミン、アル
コール脱水素酵素、ｒ−グ四プリン、牛乳のキサンチン
・オキシダーゼを用いた。その結果、本酵素の分子量は
約２２へｏｏｏと求められた。
輪 にｍ値
ピラノース・オキシダーゼを２５単位使用してラインラ
イバー−パーク（Ｌｉｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ）
プロットによシグルコースに対ｆる一値を求めた。
イバー−パーク（Ｌｉｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ）
プロットによシグルコースに対ｆる一値を求めた。
その結果、グルコースに対するＫｌｌ値はａＪＩ３ｍＭ
であった。
であった。
この値はグルコースオキシダーゼの場合のＫｍ値（１０
〜ｚｏｍＭ）Ｋ比べて約”ｆ２〜”２４である。
〜ｚｏｍＭ）Ｋ比べて約”ｆ２〜”２４である。
次に、本発明の方法によって得られ九ピラノース・オキ
シダーゼを用いるピラノース・オキシダーゼの基質の測
定について説明する。
シダーゼを用いるピラノース・オキシダーゼの基質の測
定について説明する。
ピラノース・オキシダーゼのｊｌ［Ｋコリオラス属、ダ
エダレオプシス属、プロイロタスＸｔたはダロエオフイ
ルム属の微生物起源のピラノース・オキシダーゼを適当
な緩衝液中で作用せしめ、生成する過酸化水素を色素系
に導いて、色素による機状を一定することによって基質
を定量することができる。
エダレオプシス属、プロイロタスＸｔたはダロエオフイ
ルム属の微生物起源のピラノース・オキシダーゼを適当
な緩衝液中で作用せしめ、生成する過酸化水素を色素系
に導いて、色素による機状を一定することによって基質
を定量することができる。
一例として、グルコースが基質の場合のピラノース・オ
キシダーゼの反応式が次に示される。
キシダーゼの反応式が次に示される。
β−Ｄ−グルコース ＯＨ！ＯＨ
グルコソン 又、グル；−スを含有する試料中のグルコースの定量の
みならず、反応、分解等によりてグル；−スを定量的に
生成せしめうるような系における反応に６ずかる化合物
、反応を触媒する酵素ｏ＃１性勢ＯＩｍ定に応用できる
。
グルコソン 又、グル；−スを含有する試料中のグルコースの定量の
みならず、反応、分解等によりてグル；−スを定量的に
生成せしめうるような系における反応に６ずかる化合物
、反応を触媒する酵素ｏ＃１性勢ＯＩｍ定に応用できる
。
例え試マルトース、メチルグルコシド勢のグルコース卿
導体の定量に応用できる。これらのグルツース誘導体は
酸あるいは酵素によって分解シ、グルコースに変換され
るのでこれらを定量すればよい。
導体の定量に応用できる。これらのグルツース誘導体は
酸あるいは酵素によって分解シ、グルコースに変換され
るのでこれらを定量すればよい。
具体的なグルコース誘導体の分解酵素としてグルコシダ
ーゼ、マルトース・ホスホリラーゼ、アミラーゼ等が例
示される。
ーゼ、マルトース・ホスホリラーゼ、アミラーゼ等が例
示される。
例エバマルトースにマルトース・ホスホリラーゼを作用
させるとグルコースとグルブース−１−リン酸が生成し
、マルトースにグルコシ／ −ゼを作用させると２モル
のグルコースが生成し、メチル−ｄ−Ｄ−グルコシドに
グルコシダーゼを作用させるとグルコースが生成し、デ
ンプンにα−アミラーゼとマルトース・ホスホリラーゼ
を作用させるとグルコニスとグルコース−１−リン酸が
生成する。これらの反応における生成物のグルコースを
定量すれば元の化合物の定量、用いられ九酵素の活性が
一定できる。
させるとグルコースとグルブース−１−リン酸が生成し
、マルトースにグルコシ／ −ゼを作用させると２モル
のグルコースが生成し、メチル−ｄ−Ｄ−グルコシドに
グルコシダーゼを作用させるとグルコースが生成し、デ
ンプンにα−アミラーゼとマルトース・ホスホリラーゼ
を作用させるとグルコニスとグルコース−１−リン酸が
生成する。これらの反応における生成物のグルコースを
定量すれば元の化合物の定量、用いられ九酵素の活性が
一定できる。
（・、゛
基質を定量するに際しては、基質を含有する試料および
ピラノース・オー′□シダーゼを約１）Ｈ７、０−ＩＬ
Ｏの緩衝液に加えて反応させればよい。
ピラノース・オー′□シダーゼを約１）Ｈ７、０−ＩＬ
Ｏの緩衝液に加えて反応させればよい。
ピッノース・オキシダーゼは必要によってマイクマカプ
セル化、あるいは担体に固定化して用いることもできる
。
セル化、あるいは担体に固定化して用いることもできる
。
緩ａｍとしてはリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが
用いられる。酵素は通常基質のα１〜１７１！ＥＩＯＩ
Ｋ対し０．５〜１５Ｕが用イられ、反応は全量を水で
３ｓ＋１とした濃度で行われる。
用いられる。酵素は通常基質のα１〜１７１！ＥＩＯＩ
Ｋ対し０．５〜１５Ｕが用イられ、反応は全量を水で
３ｓ＋１とした濃度で行われる。
生成した過酸化水素を色素系に導びくについては公知の
いずれの手段も適用できる。例えばパーオキシダーゼお
よび発色剤を加えて色素を生成せしめる。
いずれの手段も適用できる。例えばパーオキシダーゼお
よび発色剤を加えて色素を生成せしめる。
発色剤としては４−アミノアンチピリンとフェノール、
４−アミノアンチピリンとＭ、Ｎ−ジメチルアニリン、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下
ＭＢＴＨと略す）と０−）ルイジン、ＭＢテ■とＮ、１
１１−ジメチルアニリンなどが例示される。
４−アミノアンチピリンとＭ、Ｎ−ジメチルアニリン、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下
ＭＢＴＨと略す）と０−）ルイジン、ＭＢテ■とＮ、１
１１−ジメチルアニリンなどが例示される。
□
パーオキシダーゼか、よび発色剤は前記３−の、′”
反応液に鵞〜ＩＯＵおよび５〜２０μｍｏｂ存在させて
反応が行われる０反応は３０〜５０℃で行なわれ５〜２
０分で完了する。
反応が行われる０反応は３０〜５０℃で行なわれ５〜２
０分で完了する。
生成し九色素による反応液の可視部における吸収を測定
する。通常４００〜＠ Ｑ Ｑｎｍにおける吸収が測ら
れる。基質の含有量と吸光度との関係をあらかじめ標準
物質について検量線として求めておき、試料について得
られた吸光度から基質の含有量を求めることができる。
する。通常４００〜＠ Ｑ Ｑｎｍにおける吸収が測ら
れる。基質の含有量と吸光度との関係をあらかじめ標準
物質について検量線として求めておき、試料について得
られた吸光度から基質の含有量を求めることができる。
基質の定量法としては、基質の酸化反応と、生成した過
酸化水素を色素へ導びく反応とを別々に行なうこともで
きるが、好ましくはピラノース・オキシダーゼおよび過
酸化水素定量用組成物を一緒に試料に加えて一段階反応
で着色した反応液を得、この反応液の可視部における吸
収を測定することによって簡便に目的が達成される。
酸化水素を色素へ導びく反応とを別々に行なうこともで
きるが、好ましくはピラノース・オキシダーゼおよび過
酸化水素定量用組成物を一緒に試料に加えて一段階反応
で着色した反応液を得、この反応液の可視部における吸
収を測定することによって簡便に目的が達成される。
本発明は測定用組成物およびそれを利用するキットをも
包含する。
包含する。
この組成物はピラノース・オキシダーゼ、パーオキシダ
ーゼおよび発色剤がα５〜１５Ｕ。
ーゼおよび発色剤がα５〜１５Ｕ。
２〜ＩＯＵおよび５〜２０μｍｏ’ｌからなシ、キット
はこの組成物と緩衝液１〜３−との綴金せから愈る。
はこの組成物と緩衝液１〜３−との綴金せから愈る。
この組成物は、グルブース誘導体をグルコースに分解で
きる酵素あるいは分解剤を含むととができる０例えばα
−アξラーゼ測定用組成物としてデンプンを含む組成物
にマルトース・ホスホリラーゼ１〜ＩＯＵを含んだ組成
物が例示される。
きる酵素あるいは分解剤を含むととができる０例えばα
−アξラーゼ測定用組成物としてデンプンを含む組成物
にマルトース・ホスホリラーゼ１〜ＩＯＵを含んだ組成
物が例示される。
以下に、本発明の実施例および参考例（実施例１で得ら
れ九ピラノース・オキシダーゼを用いるグルコース０定
量）を示す。
れ九ピラノース・オキシダーゼを用いるグルコース０定
量）を示す。
実施例Ｌ
ｆル＊ −ｘ （Ｌ ５１７ｄｌ、酵母ｘ キス（Ｌ
４１／ｄｌ−麦芽ｘ＊ｘ ｌＩ／ｄｉ、 塩化ｊｌに鉄
１ ｍｙ／１ｕ（ｐａ亀Ｏ）よ）成る種培養培地３Ｇ−
を３００−容７ツスコに入れ、１２０℃で１５分間殺画
才る。
４１／ｄｌ−麦芽ｘ＊ｘ ｌＩ／ｄｉ、 塩化ｊｌに鉄
１ ｍｙ／１ｕ（ｐａ亀Ｏ）よ）成る種培養培地３Ｇ−
を３００−容７ツスコに入れ、１２０℃で１５分間殺画
才る。
こＯ培地にコリオラス・ベルシカラー１１Ｆ０４９３７
を１白金耳接種し、ＳＯ℃で５日間振盪培養する。得ら
れる種培養液（第一種培養液）３０−を２１培養フツス
″：ＩＫ入れた前記と同じ組成を有する種培養培地５ｏ
ｏｙ＜接種し％３０℃で４日間振盪培養する。得られる
種培養液（第二種培養液）１．２ｊを３０４ジャーファ
ーメンタ−に入れ九種培養培地と同じ組成の発酵培地１
８ｚｔｃ＊１１し、３０℃、２５０ｒｐｍ％通気量１
ｌ ／ ｊ ／ｗｉｎで２日間本培養を行表う。
を１白金耳接種し、ＳＯ℃で５日間振盪培養する。得ら
れる種培養液（第一種培養液）３０−を２１培養フツス
″：ＩＫ入れた前記と同じ組成を有する種培養培地５ｏ
ｏｙ＜接種し％３０℃で４日間振盪培養する。得られる
種培養液（第二種培養液）１．２ｊを３０４ジャーファ
ーメンタ−に入れ九種培養培地と同じ組成の発酵培地１
８ｚｔｃ＊１１し、３０℃、２５０ｒｐｍ％通気量１
ｌ ／ ｊ ／ｗｉｎで２日間本培養を行表う。
培養物中めピラノース・オキシダーゼは発酵液１ｗｔ当
ｂ １’６１ ｍ Ｕテｈｂ。
ｂ １’６１ ｍ Ｕテｈｂ。
培養液からのピラノース・オキシダーゼの採取は次のご
とく行なう。培養物を吸引炉遇して湿菌体約１ｋｆを得
る。この菌体を５０ｍＭ）９スー塩酸緩衝液（１）Ｈ７
，Ｏ）（以下用いる緩衝液はすべてこの緩衝液である。
とく行なう。培養物を吸引炉遇して湿菌体約１ｋｆを得
る。この菌体を５０ｍＭ）９スー塩酸緩衝液（１）Ｈ７
，Ｏ）（以下用いる緩衝液はすべてこの緩衝液である。
）Ｌ８ｊＫＪＩｌ濁した後、ホモジナイザーで菌体を細
断する。遠心分離して得た上清１．８１にアルカリを添
加してｐ Ｈ７，０にＩＩ＆ａ整した後、緩衝液で平衡
化したＨＰム−７５（三菱化成）のｌｔカラムに流し緩
衝液で洗浄する。次に１１Ｍ硫安を含む緩衝１゜ 液で洗浄し、α２５Ｍ硫安を含む緩衝液で酵素の溶出を
行なう。ｌａ”４画分を合わせ、硫安８０襲飽和とし遠
心分離によって沈ｋＲＩＩＩＪを得る。沈殿を３０−の
緩衝液に溶解し、セファロース４Ｂの１ツカラムにかけ
、緩衝液で溶出する。活性画分を合わぜ、硫安ｓｏｂ飽
和沈殿を遠心分離によって集める。これを３０−の緩衝
液に溶解しセファデックスＧ−１００の５００−カラム
Ｋかけ、緩ｗｍで溶出する。活性画分を凍結乾燥シ、ピ
ラノース・オキシダーゼの粉末８１５萼を得る。画体抽
出液からの精製収率は４３−１比活性ＩＬ６ｔＴ／Ｉｌ
ｌ蛋白質である。
断する。遠心分離して得た上清１．８１にアルカリを添
加してｐ Ｈ７，０にＩＩ＆ａ整した後、緩衝液で平衡
化したＨＰム−７５（三菱化成）のｌｔカラムに流し緩
衝液で洗浄する。次に１１Ｍ硫安を含む緩衝１゜ 液で洗浄し、α２５Ｍ硫安を含む緩衝液で酵素の溶出を
行なう。ｌａ”４画分を合わせ、硫安８０襲飽和とし遠
心分離によって沈ｋＲＩＩＩＪを得る。沈殿を３０−の
緩衝液に溶解し、セファロース４Ｂの１ツカラムにかけ
、緩衝液で溶出する。活性画分を合わぜ、硫安ｓｏｂ飽
和沈殿を遠心分離によって集める。これを３０−の緩衝
液に溶解しセファデックスＧ−１００の５００−カラム
Ｋかけ、緩ｗｍで溶出する。活性画分を凍結乾燥シ、ピ
ラノース・オキシダーゼの粉末８１５萼を得る。画体抽
出液からの精製収率は４３−１比活性ＩＬ６ｔＴ／Ｉｌ
ｌ蛋白質である。
実施例２
実施例Ｉにおいて、菌株をグロエオフイルムセピアリウ
五Ｚ−４１に代え、ＩＩ施何例１同じ培地組成を有する
培地（２４培養フラスコ）で６日間培養する。培養物中
のピッノース・オキシダーゼはｓｓｓｍｖ／−である。
五Ｚ−４１に代え、ＩＩ施何例１同じ培地組成を有する
培地（２４培養フラスコ）で６日間培養する。培養物中
のピッノース・オキシダーゼはｓｓｓｍｖ／−である。
実施例ユ
実施例１において菌株をダエダレオプシス・、゛ぐ
スチラシナエ−９４１１１０に代えた以外は実施°１゜
例１と同様に培養する。培養物中のピラノース・オキシ
ダーゼはＩ ＩＩ ９ ｍＵ／−である。
ダーゼはＩ ＩＩ ９ ｍＵ／−である。
実施例表
実施例１において、菌株をプロイロタス・オストレアタ
スｚ−６４に代え九以外Ｆｉ実施例１と同様に培養する
。培養物中のどラノース・オキシダーゼは５９ｍＵ／−
である。
スｚ−６４に代え九以外Ｆｉ実施例１と同様に培養する
。培養物中のどラノース・オキシダーゼは５９ｍＵ／−
である。
参考例
基質としてグルコースを第５図の各測定点に示す濃度で
含有する溶液α２−にＬ５−のα１Ｍ リン酸カリウム
緩衝液１） ！ ？、 ５ 、・発色液〔４−アミノア
ンチピリン、フェノールヲ各々１０ｍ ｍｏ１／ ｊ含
むα１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐｕｔ、ｓ）にパーオ
キシダーゼを諌溶液１００ｄ当シ２．ｏｏｏ単位含有さ
せたもの〕α２Ｍ。
含有する溶液α２−にＬ５−のα１Ｍ リン酸カリウム
緩衝液１） ！ ？、 ５ 、・発色液〔４−アミノア
ンチピリン、フェノールヲ各々１０ｍ ｍｏ１／ ｊ含
むα１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐｕｔ、ｓ）にパーオ
キシダーゼを諌溶液１００ｄ当シ２．ｏｏｏ単位含有さ
せたもの〕α２Ｍ。
α１ｍＭＰＡＤ０．１ｍ、ピッノース・オキシダーゼ１
ｙ（ａ７ｔｒ）を加えた全量ユ０ｊＩｊの反応液で３７
℃で１０分間反応し５００ｎｍＤ款光度を測定した。結
果を第５図に示した。グルコース濃度と吸光度との間に
比例関係が認められ九。
ｙ（ａ７ｔｒ）を加えた全量ユ０ｊＩｊの反応液で３７
℃で１０分間反応し５００ｎｍＤ款光度を測定した。結
果を第５図に示した。グルコース濃度と吸光度との間に
比例関係が認められ九。
第１図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と安定ｐ
Ｈ４ｌ囲との関係を示す。 第２図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適］
＞Ｈとの関係を示す。 第３図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適温
度との関係を示す。 第４図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性
との関係を示す。 第５図は吸光度とグルコースの濃度との関係を示す。 ０ ｏ ＯＱ Ｏ巳 ｏ
ｏ リ ＋ 閂（Ｏ各Ｙ吋壜４耽
Ｈ４ｌ囲との関係を示す。 第２図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適］
＞Ｈとの関係を示す。 第３図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適温
度との関係を示す。 第４図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性
との関係を示す。 第５図は吸光度とグルコースの濃度との関係を示す。 ０ ｏ ＯＱ Ｏ巳 ｏ
ｏ リ ＋ 閂（Ｏ各Ｙ吋壜４耽
Claims (1)
- フリオラス属、ダエダレオプシス属、プロイロタス属ま
たはグロエオフイルム属に属しピラノース・オキシダー
ゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中
にピラノース・オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを
揮散することを特徴とする発酵法によるピラノース・オ
キシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14168381A JPS5843785A (ja) | 1981-09-10 | 1981-09-10 | 発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14168381A JPS5843785A (ja) | 1981-09-10 | 1981-09-10 | 発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5843785A true JPS5843785A (ja) | 1983-03-14 |
| JPH0212557B2 JPH0212557B2 (ja) | 1990-03-20 |
Family
ID=15297774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14168381A Granted JPS5843785A (ja) | 1981-09-10 | 1981-09-10 | 発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5843785A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
-
1981
- 1981-09-10 JP JP14168381A patent/JPS5843785A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0212557B2 (ja) | 1990-03-20 |
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