JPS61177986A - ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS61177986A JPS61177986A JP60017940A JP1794085A JPS61177986A JP S61177986 A JPS61177986 A JP S61177986A JP 60017940 A JP60017940 A JP 60017940A JP 1794085 A JP1794085 A JP 1794085A JP S61177986 A JPS61177986 A JP S61177986A
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- oxidase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はピラノース・オキシダーゼの製造法に関する。
従来の技術
ポリポラス属微生物を用いる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＢｎｚｙｍｏｌ ｖｏｌ ＸＬｌ、 ｐ、１７０．
１９７５） 、コリオラス属。
ｎＢｎｚｙｍｏｌ ｖｏｌ ＸＬｌ、 ｐ、１７０．
１９７５） 、コリオラス属。
ダエダレオプシス属、プロイロタス属またはグロエオフ
ィルム属微生物を用いる方法（特開昭５８−４３７８５
号公報）が知られている。
ィルム属微生物を用いる方法（特開昭５８−４３７８５
号公報）が知られている。
発明の目的
従来知られている微生物以外でピラノース・オキシダー
ゼを製造する微生物を見い出した。
ゼを製造する微生物を見い出した。
問題点を解決するための手段
本発明方法によると、イルペックス属、オウリキュラリ
ア属、コプリナス属またはトラメテス属に属し、ピラノ
ース・オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養することにより、培養物中に収率よくピラノース・
オキシダーゼを帰ることができる。
ア属、コプリナス属またはトラメテス属に属し、ピラノ
ース・オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養することにより、培養物中に収率よくピラノース・
オキシダーゼを帰ることができる。
本発明に使用される微生物は、イルペックス属。
オウリキニラリア属、コプリナス属またはトラメテス属
に属し、ピラノース・オキシダーゼを生産する能力を有
するものであればいずれの菌株でもよい。好適な菌株の
例としては、イルペックス・ラフテラｘ （Ｉｒｐｅｘ
Ｉａｃｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２３゜オウリキニラ
リア・ポリトリ力（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｐｏｌｙｔ
ｒｉｃｈａ） Ｚ −２２９（微工研菌寄第７１１９号
）、コプリナス・ミカセウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍ１
ｃａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２２，）ラメテス・シン
ナバリナｘ （Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉ
ｎｕｓ） Ｉ Ｆ ０６１３９等があげられる。これら
の微生物の菌学的性質は、伊藤誠哉著「日本菌類誌Ｊ
（１９５５）養賢堂に記載されている。
に属し、ピラノース・オキシダーゼを生産する能力を有
するものであればいずれの菌株でもよい。好適な菌株の
例としては、イルペックス・ラフテラｘ （Ｉｒｐｅｘ
Ｉａｃｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２３゜オウリキニラ
リア・ポリトリ力（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｐｏｌｙｔ
ｒｉｃｈａ） Ｚ −２２９（微工研菌寄第７１１９号
）、コプリナス・ミカセウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍ１
ｃａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２２，）ラメテス・シン
ナバリナｘ （Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉ
ｎｕｓ） Ｉ Ｆ ０６１３９等があげられる。これら
の微生物の菌学的性質は、伊藤誠哉著「日本菌類誌Ｊ
（１９５５）養賢堂に記載されている。
本発明に使用される栄養培地は炭素源、窒素源。
無機物その他使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく
含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれも使
用可能である。
含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれも使
用可能である。
炭素源としては、グルコース、シニクロース。
デキストリン、でんぷん、グリセリン、糖蜜などの炭水
化物などが用いられる。
化物などが用いられる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、グルタミン
酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーン
・スチープ・リカーなどの窒素含を天然物が使用できる
。
、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、グルタミン
酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーン
・スチープ・リカーなどの窒素含を天然物が使用できる
。
無機物としては、リン酸−カリウム、リン酸二カリウム
、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
培養は、通常通気攪拌培養で行う。培養温度は２０〜３
５℃、培地のｐＨは３、Ｏ〜８，０の範囲にあることが
望ましく、培養期間は３〜７日で完了する。
５℃、培地のｐＨは３、Ｏ〜８，０の範囲にあることが
望ましく、培養期間は３〜７日で完了する。
上記の方法で培養することにより、培養物中、主に菌体
中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄積する。
中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄積する。
培養物中からのピラノース・オキシダーゼの採取は例え
ば次のように行う。
ば次のように行う。
培養終了後、培養液を濾過して菌体を得、ついでこの菌
体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心分離等によっ
てよ清液を得る。上清液を通常酵素精製に用いられる方
法、たとえば、塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換
カラムクロマト、ゲル濾過、凍結乾燥などの方法で処理
する。以上のようにして精製ピラノース・オキシダーゼ
を採取することができる。本発明におけるピラノース・
オキシダーゼの活性は次の方法で測定する。
体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心分離等によっ
てよ清液を得る。上清液を通常酵素精製に用いられる方
法、たとえば、塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換
カラムクロマト、ゲル濾過、凍結乾燥などの方法で処理
する。以上のようにして精製ピラノース・オキシダーゼ
を採取することができる。本発明におけるピラノース・
オキシダーゼの活性は次の方法で測定する。
０、１ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） １．
Ｏａ＋１゜発色液〔４−アミノアンチピリン、フェノー
ルを各＃ １０ ｍ ｍｏｌ／１含むＯ，ｌ Ｍ ）リ
スー塩酸ａｔ衡液（ｐＨ７，０）にパーオキシダーゼを
該溶液１００ａ１１当り２． ＯＯＯ単位含有させたも
の：ｌ Ｏ，２ｆｆｉｌ、 ＩＭグルコース溶液Ｑ、１
ｍｌ、ピラノース・オキシダーゼ溶液Ｑ、１ｍｌ、Ｑ、
ｌ ｍＭ ＦＡＤＯ，１ｍｌ、水１．５ｆｆｌｌより
成る全量３．０１１１１の酵素含有液を３７℃で反応し
、５００ｎｍの吸光度の増加を記録計で自動的に記録し
た。この条件下で生成するキノンイミン色素の分子吸光
係数を５．３Ｘ１０”とし、３７℃、ｐ Ｈ７，０にお
いて１分間に１ 、ＩＪＩＩＩＯＩ （７）過酸化水素
を生成する酵素量を１単位とすると、ピラノース・オキ
シダーゼの単位は として表示される。
Ｏａ＋１゜発色液〔４−アミノアンチピリン、フェノー
ルを各＃ １０ ｍ ｍｏｌ／１含むＯ，ｌ Ｍ ）リ
スー塩酸ａｔ衡液（ｐＨ７，０）にパーオキシダーゼを
該溶液１００ａ１１当り２． ＯＯＯ単位含有させたも
の：ｌ Ｏ，２ｆｆｉｌ、 ＩＭグルコース溶液Ｑ、１
ｍｌ、ピラノース・オキシダーゼ溶液Ｑ、１ｍｌ、Ｑ、
ｌ ｍＭ ＦＡＤＯ，１ｍｌ、水１．５ｆｆｌｌより
成る全量３．０１１１１の酵素含有液を３７℃で反応し
、５００ｎｍの吸光度の増加を記録計で自動的に記録し
た。この条件下で生成するキノンイミン色素の分子吸光
係数を５．３Ｘ１０”とし、３７℃、ｐ Ｈ７，０にお
いて１分間に１ 、ＩＪＩＩＩＯＩ （７）過酸化水素
を生成する酵素量を１単位とすると、ピラノース・オキ
シダーゼの単位は として表示される。
ΔＡｓｏｏ ：単位時間（１分間）当りの５００ｎｍの
吸光度増加量 次に、実施例１により得られたピラノース・オキシダー
ゼの性質を示す。
吸光度増加量 次に、実施例１により得られたピラノース・オキシダー
ゼの性質を示す。
（１）安定ｐＨ範囲
酵素標品を第１図に示した種々のｐＨを有するクエン酸
緩衝液、トリス緩衝液、はう酸緩衝液に１００ ｍｕｌ
ｏ、 ７ｍｌとなるよウニ溶解シ、これらの溶液を５０
℃に３０分間保持した。冷却後中和し、残存活性を測定
した。第１図から本酵素の安定ｐＨ範囲は５．０〜７．
４であることがわかる。
緩衝液、トリス緩衝液、はう酸緩衝液に１００ ｍｕｌ
ｏ、 ７ｍｌとなるよウニ溶解シ、これらの溶液を５０
℃に３０分間保持した。冷却後中和し、残存活性を測定
した。第１図から本酵素の安定ｐＨ範囲は５．０〜７．
４であることがわかる。
（２）最適ｐＨ
酵素標品を第２図に示した種々のｐＨを有するトリス緩
衝液に２５０ ｍｕ／３．７ｍｌとなるように溶解し酸
素吸収測定用セル（給水科学研究新製ＢＩＯＸＹＧＲＡ
ＰＨ） １．：入れ、１Ｍグルコース５０μｌを添加し
て酸素吸収量を測定した。第２図から本酵素の最適ｐＨ
は６．２付近にあることがわかる。
衝液に２５０ ｍｕ／３．７ｍｌとなるように溶解し酸
素吸収測定用セル（給水科学研究新製ＢＩＯＸＹＧＲＡ
ＰＨ） １．：入れ、１Ｍグルコース５０μｌを添加し
て酸素吸収量を測定した。第２図から本酵素の最適ｐＨ
は６．２付近にあることがわかる。
（３）最適温度
活性測定法と同じ組成を有する反応液で１００ｍｕのピ
ラノース・オキシダーゼを使用し、第３図に示した各温
度で５分間反応した。第３図より本酵素の最適温度は５
０℃にあることがわかる。
ラノース・オキシダーゼを使用し、第３図に示した各温
度で５分間反応した。第３図より本酵素の最適温度は５
０℃にあることがわかる。
（４）耐熱性
０、２ Ｍ ）リス緩衝液ｐＨ６，００，６＋＋＋１に
本酵素を１００ｍＵ１０．７＋ｎｌとなるように溶解し
、第４図に示した各温度で３０分間熱処理後、残存活性
を測定した。第４図より本酵素は６０℃、３０分間処理
後も９０％の残存活性を有することがわかる。
本酵素を１００ｍＵ１０．７＋ｎｌとなるように溶解し
、第４図に示した各温度で３０分間熱処理後、残存活性
を測定した。第４図より本酵素は６０℃、３０分間処理
後も９０％の残存活性を有することがわかる。
（５）基質特異性
活性測定法と同じ組成を有する反応液で、ピラノース・
オキシダーゼ２．５単位、反応の基質として第１表に示
した各種の糖溶液（１００ｍＭ）Ｑ、１ｍｌ使用した。
オキシダーゼ２．５単位、反応の基質として第１表に示
した各種の糖溶液（１００ｍＭ）Ｑ、１ｍｌ使用した。
活性は相対活性であられした。
第１表より本酵素はグルコースに対する特異性が高く、
他にソルボース、キシロースに作用した。
他にソルボース、キシロースに作用した。
第 １ 表
基 質 相対活性（％）
グルコース １００
マ ン ノ − ス
０．９ガラクトース ０．９ ソルボース ３．４ フラクトース ０ キ シ ロ − ス
２．６マルトース ０ トレハロース Ｏ ラ り ト − ス
０マンニトール ０ グルコサミン ０ グルコン酸 Ｏ 従来のポリポラス属の微生物から得られたピラノース・
オキシダーゼに比べてソルボース、キシロースに対する
基質特異性が極めて弱い（Ｂ。
０．９ガラクトース ０．９ ソルボース ３．４ フラクトース ０ キ シ ロ − ス
２．６マルトース ０ トレハロース Ｏ ラ り ト − ス
０マンニトール ０ グルコサミン ０ グルコン酸 Ｏ 従来のポリポラス属の微生物から得られたピラノース・
オキシダーゼに比べてソルボース、キシロースに対する
基質特異性が極めて弱い（Ｂ。
Ｂ、 Ａ、 １６７５０１〜５１０ （１９６８）の表
１参照）。
１参照）。
以下に、本発明の実施例を示す。
実施例１゜
グルコース０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．４ｇ／ｄｉ
。
。
麦芽エキスＩｇ／ｊ！、塩化第二鉄１■／ｄｌ（１）８
６．０）より成る種培養培地３Ｑｍｌを３０ Ｑｍｌ容
フラスコに入れ、１２０℃で１５分間殺菌する。この培
地にイルペックス・ラフテラス ＡＴＣＣ２０１２３を
１白金耳接種し、３０℃で５日間振盪培養する。得られ
る種培養液（第一種培策液）３９ｍｌを２１培養フラス
コに入れた前記と同じ組成を有する種培養培地３００ｍ
ｌに接種し、３０℃で４日間振盪培養する。得られる種
培養液（第二種培養液）１．２ｊ！を３０ｊ２ジャーフ
ァーメンタ−に入れた種培養培地と同じ組成の発酵培地
１８１に接種し、３０℃、２５０ｒｐｒｎ、通気量１β
／ｌ ／ｍｉｎで２日間本培養を行う。
６．０）より成る種培養培地３Ｑｍｌを３０ Ｑｍｌ容
フラスコに入れ、１２０℃で１５分間殺菌する。この培
地にイルペックス・ラフテラス ＡＴＣＣ２０１２３を
１白金耳接種し、３０℃で５日間振盪培養する。得られ
る種培養液（第一種培策液）３９ｍｌを２１培養フラス
コに入れた前記と同じ組成を有する種培養培地３００ｍ
ｌに接種し、３０℃で４日間振盪培養する。得られる種
培養液（第二種培養液）１．２ｊ！を３０ｊ２ジャーフ
ァーメンタ−に入れた種培養培地と同じ組成の発酵培地
１８１に接種し、３０℃、２５０ｒｐｒｎ、通気量１β
／ｌ ／ｍｉｎで２日間本培養を行う。
培養物中のピラノース・オキシダーゼは発酵液１ｍｌ当
り３２０ｍＵである。
り３２０ｍＵである。
培養液からのピラノース・オキシダーゼの採取は次のご
とく行う。培養物を吸引洲過して湿菌体約１ｋｇを得る
。この菌体を５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０
）（以下用いる緩衝液はすべてこの（１＠液である。）
１．１に懸濁した後、ホモジナイザーで菌体を細断する
。遠心分離して得た上清１．８１にアルカリを添加して
ｐ Ｈ７，０に調整した後、緩衝液で平衡化したＨＰＡ
−７５（三菱化成）の１１カラムに流し緩衝液で洗浄す
る。次に０．１ Ｍ硫安を含む緩衝液で洗浄し、０．２
５ Ｍ硫安を含む緩衝液で酵素の溶出を行う。活性画分
を合わせ、硫安８０％飽和とし遠心分離によって沈殿物
を得る。沈殿を３０ｍ１の緩衝液に溶解し、セファロー
ス４日のＩＺカラムにかけ、緩衝液で溶出する。活性画
分を合わせ、硫安８０％飽和沈殿を遠心分離によって集
める。これを３０ｍ１の緩衝液に溶解し、セファデック
スＧ−１００の５００ｍ１カラムにかけ、緩衝液で溶出
する。活性画分を凍結乾燥し、ピラノース・オキシダー
ゼの粉末１．６ｇを得る。菌体抽出液からの精製収率は
４３％、比活性９．６０／＠ｇ蛋白である。
とく行う。培養物を吸引洲過して湿菌体約１ｋｇを得る
。この菌体を５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０
）（以下用いる緩衝液はすべてこの（１＠液である。）
１．１に懸濁した後、ホモジナイザーで菌体を細断する
。遠心分離して得た上清１．８１にアルカリを添加して
ｐ Ｈ７，０に調整した後、緩衝液で平衡化したＨＰＡ
−７５（三菱化成）の１１カラムに流し緩衝液で洗浄す
る。次に０．１ Ｍ硫安を含む緩衝液で洗浄し、０．２
５ Ｍ硫安を含む緩衝液で酵素の溶出を行う。活性画分
を合わせ、硫安８０％飽和とし遠心分離によって沈殿物
を得る。沈殿を３０ｍ１の緩衝液に溶解し、セファロー
ス４日のＩＺカラムにかけ、緩衝液で溶出する。活性画
分を合わせ、硫安８０％飽和沈殿を遠心分離によって集
める。これを３０ｍ１の緩衝液に溶解し、セファデック
スＧ−１００の５００ｍ１カラムにかけ、緩衝液で溶出
する。活性画分を凍結乾燥し、ピラノース・オキシダー
ゼの粉末１．６ｇを得る。菌体抽出液からの精製収率は
４３％、比活性９．６０／＠ｇ蛋白である。
実施例２゜
実施例１において、第２表に示す菌株を用いる以外は、
実施例１と同様に培養する。培養物中のピラノース・オ
キシダーゼは第２表のとおりである。
実施例１と同様に培養する。培養物中のピラノース・オ
キシダーゼは第２表のとおりである。
第 ２ 表
発明の効果
本発明方法により、収率よくピラノース・オキシダーゼ
を得ることができる。
を得ることができる。
第１図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と安定ｐ
Ｈ範囲との関係を示す。 第２図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適ｐ
）Ｉとの関係を示す。 第３図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適温
度との関係を示す。 第４図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性
との関係を示す。
Ｈ範囲との関係を示す。 第２図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適ｐ
）Ｉとの関係を示す。 第３図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適温
度との関係を示す。 第４図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性
との関係を示す。
Claims (1)
- イルペックス属、オウリキュラリア属、コプリナス属ま
たはトラメテス属に属し、ピラノース・オキシダーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にピ
ラノース・オキシダーゼを生成蓄積させ、これを採取す
ることを特徴とするピラノース・オキシダーゼの製造法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60017940A JPS61177986A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60017940A JPS61177986A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61177986A true JPS61177986A (ja) | 1986-08-09 |
Family
ID=11957773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60017940A Pending JPS61177986A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61177986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
-
1985
- 1985-02-01 JP JP60017940A patent/JPS61177986A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
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