DE3913040A1

DE3913040A1 - Pharmazeutische zubereitung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE3913040A1
Application number: DE19893913040
Authority: DE
Inventors: Ludwig Dr Roth; Christian Roth; Hanns K Prof Dr Rer Nat Frank; Herbert Theodor Prof Bruester; Peter Dr Wernet
Original assignee: Ludwig Roth Dr GmbH
Current assignee: Ludwig Roth Dr GmbH
Priority date: 1989-04-20
Filing date: 1989-04-20
Publication date: 1990-10-25

Description

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen, insbe sondere mit einer Hemmwirkung gegenüber Viren und/oder Retro viren, und ihre Verwendung.

Viruserkrankungen stellen, insbesondere auf Grund ihrer raschen Ausbreitung in der Bevölkerung, ein großes gesundheitliches Problem dar. Dies gilt insbesondere für das erworbene Immun schwächesyndrom AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome). Bisher ist es noch weder möglich, einen Impfstoff gegen die die Krankheit verursachenden Viren HIV (Human Immunodeficiency Virus) herzustellen, noch nach Ausbruch der Krankheitssymptome die Krankheit ausreichend medikamentös zu behandeln. So sind zwar inzwischen einige Substanzen in der medizinischen Erpro bung und teilweise auch bereits zur Anwendung gelangt, die die Vermehrung der Viren hemmen, indem sie bei der Umwandlung des RNA-Genoms der Viren in DNA durch Einbau modifizierter Nukleotide die DNA-Synthese abbrechen, und dadurch die Ver mehrung der Viren hemmen. Diese Arzneimittel rufen jedoch starke Nebenwirkungen hervor, da auch in gesunden menschlichen Zellen die modifizierten Nukleotidanaloga eingebaut werden können und auch dort zum Abbruch einer normalen und nötigen DNA-Synthese führen können.

Es besteht daher nach wie vor ein hoher Bedarf an weiteren Mitteln zur Behandlung von AIDS und anderen Viruserkrankungen, z.B. Infektionen mit Non A, Non-B-Hepatitis-Virus, Parvo- Viren usw.

Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereitstellung weiterer pharmakologisch wirksamer Zubereitun gen, die sowohl die Behandlung von Infektionen mit Viren wie Non A, Non-B -Heptatitis-Viren, als auch die Behandlung von AIDS oder ARC (Aids-related complex, einer Vorstufe der Aids- Erkrankung) erlauben.

Es wurde nun gefunden, daß es unter Verwendung von Anthra chinon- oder Dianthron-Farbstoffe produzierenden Pilzen möglich ist, auf einfache Weise pharmakologisch wirksame Zubereitungen herzustellen, die insbesondere eine ausgeprägte Hemmwirkung auf Viren und/oder Retroviren zeigen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Ver wendung von Anthrachinon- oder Dianthron-Farbstoffe bildenden Pilzen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, insbesondere zur Herstellung von Zubereitungen mit einer Hemmwirkung auf Viren und/oder Retroviren.

Als Pilze werden vorzugsweise solche verwendet, die photo sensibilisierende und/oder fluoreszierende Farbstoffe pro duzieren. Insbesondere werden Pilze der Familie Ascomyceten verwendet, wie z.B. Emodin oder Scyrin bildende Ascomyceten, und in erster Linie Penicilliopsis clavariaeformis Solms oder dessen Stoffwechselprodukte. Es kommen aber auch Pilze wie Dermocybe austroveneta, Dermocybe luteostriatula, Dermocybe olivipes, Dermocybe obscureolivea var. brunnea, Dermocybe hypoxantha, Dermocybe alcalisensibilis, Cortinarius atro virens, Cortinarius ionochlorus, Cortinarius odoratus, Hypomyces aurantius, Hypomyces lactifluorum, Hypomyces trichothecoides, D. alcalisensibilis, Dermocybe alienata und D. luteostriatula in Frage.

Durch Extraktion dieser Pilze lassen sich pharmakologisch wirksame Zubereitungen, insbesondere mit einer Hemmwirkung auf Viren und/oder Retroviren herstellen.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch pharmazeutische Zubereitungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Extrakte und/oder Inhaltsstoffe von Anthrachinon- oder Di anthron-Farbstoffe bildenden Pilzen enthalten oder aus ihnen bestehen. Insbesondere enthalten diese Zubereitungen Extrakte der vorstehend als bevorzugt genannten Pilze, und in erster Linie von Penicilliopsis clavariaeformis Solms.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können gegebenenfalls weitere für derartige Zubereitungen übliche Träger- und/oder Zusatzstoffe enthalten. Ein Zusatz solcher Stoffe richtet sich insbesondere nach der Art der gewünschten Verabreichungsform, z.B. als Tabletten, Kapseln, Pillen, Sirupe, Suspensionen, usw., die die erfindungsgemäßen Extrakte ent halten.

In der deutschen Patentanmeldung P 38 41 562 der gleichen Anmelderin wird ein Arzneimittel beschrieben, das mindestens ein Konjugat von Albumin mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I enthält,

in der R₁ und R₂ oder/und R₃ und R₄ oder/und R₅ und R₆ oder/ und R₇ und R₈ entweder Wasserstoff sind oder aber R₁ und R₂ oder/und R₇ und R₈ jeweils zusammen eine C-C-Einfachbindung darstellen und/oder R₃ und R₄ zusammen mit R₅ und R₆ eine C-C-Doppelbindung bedeuten, wobei mindestens eine C-C-Einfach- oder C-C-Doppelbindung vorhanden sein muß, R₉ und R₁₀ jeweils entweder CH₃ oder -CH(OH)-CH₃ bedeuten und R₁₁ und R₁₂ jeweils H oder eine Verbindung der Formel II

sind, die in ortho-Stellung zum Stickstoffhetereoatom an die Verbindung der Formel (I) gebunden ist, worin R′ H oder Acetyl ist, und gegebenenfalls weitere übliche Träger- und Zusatzstoffe enthält.

Es wurde festgestellt, daß diese Verbindungen (Konjugat mit Albumin) gut wirksam bei der Behandlung verschiedener Virus erkrankungen, insbesondere von AIDS, sind. Jedoch können auch durch andere humanpathogene Viren, wie z.B. Non-A, Non-B- Hepatitis oder Parvo-Viren hervorgerufene Erkrankungen wirksam bekämpft werden.

Zur Kupplung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) an Albumin wird diese zweckmäßig in Natronlauge pH = 13 gelöst und mit einer Lösung von monomerem Humanalbumin 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Lösung der Verbindung von Formel (I) und die Albuminlösung (5 g/dl) werden dabei zu gleichen Teilen eingesetzt. Nach der Inkubation wird mit gepufferter 1 M HCl auf pH 7,0 eingestellt.

Verwendet werden z.B. Konjugate mit Hypericin, Pseudo-Hypericin, Oxypenicilliopsin, Penicilliopsin, Protohypericin oder/und Fagopyrin.

Es wurde festgestellt, daß diese Substanzen gegen Viren, und insbesondere auch gegen HIV-Viren Wirksamkeit aufweisen.

Die pharmakologische Wirksamkeit wurde an H 9-III Zellen einer HIV-infizierten Zellinie überprüft durch Bestimmung der auf der Zellinie produzierten Menge des HIV-Hüllproteins p 24. p 24 wird hierbei unter Verwendung monoklonaler Antikörper nach der ELISA-Technik nachgewiesen. Die p 24-Konzentration, die ein Maß für die AIDS-Virusbildung darstellt, steigt ohne Zusatz des Konjugats HC-S (synthetisches Hypericin) stark an, mit Zusatz desselben fällt sie jedoch stark ab. Bemerkenswert ist hierbei, daß die Stabilität der Zellen mit HC-S-Zusatz nicht gestört wurde.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die erfindungs gemäßen, einfach und leicht, ohne Notwendigkeit einer Isolie rung einzelner Inhaltsstoffe, herzustellenden Zubereitungen eine deutliche Hemmwirkung gegenüber Viren und/oder Retroviren zeigen und in ihrer Hemmwirkung, insbesondere auf HIV, den in der deutschen Patentanmeldung P 38 41 562.3 beschriebenen Konjugaten sogar noch überlegen sind.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen, sowie zum Abtöten von Viren und als virostatisches Mittel in vitro.

Ein weiterer Gegenstand ist auch die Verwendung von Pilzfarb stoffen von Anthrachinon- oder Dianthron-Farbstoffe bildenden Pilzen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen mit einer Hemmwirkung auf Viren und/oder Retroviren.

Es wurde gefunden, daß auch eine Zubereitung, die durch Ver reiben von Pilzfarbstoffen vom Anthrachinon- und/oder Dianthron- Typus mit einem Extraktionsmittel zur Herstellung der vor stehend beschriebenen erfindungsgemäßen Extrakte, und insbe sondere mit Glycolen, Glucosesirup, Glycerin und/oder flüssigem Polyethylenglycol erhalten wird, Hemmwirkungen auf Viren und/ oder Retroviren zeigt, die mit denen der vorstehend beschrie benen pharmazeutischen Zubereitungen vergleichbar ist. Gegen stand der Erfindung ist deshalb auch eine pharmazeutische Zubereitung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine durch Verreibung von Pilzfarbstoffen vom Anthrachinon- und/ oder Dianthron-Typus mitGlycolen, Glycosesirup, Glycerin und/ oder flüssigem Polyethylenglycol erhaltene Lösung enthält oder aus ihr besteht.

Die erfindungsgemäße Verwendung umfaßt z.B. die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zubereitung zur prophylaktischen Ver abreichung an infektionsgefährdete Personen, zur Behandlung von Blutkomponenten, wie z.B. Blutkonserven oder Blutplasma, Blutderivaten, wie Albumin-, Gerinnungsfaktor VIII und IX und Immunoglobulin-Präparaten. Zur Behandlung von Blutkonserven und Blutderivaten werden z.B. kleine Mengen der erfindungsge mäßen Zubereitung beigegeben, oder aber die Innenwand für Aufbewahrungsgefäße solcher Substanzen mit der erfindungsge mäßen Zubereitung beschichtet. Im Sinne einer allgemeinen Sicherheit sollten alle in den Kliniken, Blutbanken und Arzt praxen verwendeten Blutabnahmeröhrchen von vorneherein so abgesichert sein. Dadurch wäre eine neue Stufe der Sicherheit des im medizinischen und im Gesundheitsbereich tätigen Perso nals gegen HIV und anderen Virusinfektionen geschaffen. Außer dem könnte die Transfusionsmedizin erneut eine hohe Sicher heitsstufe und das Vertrauen der Bevölkerung zurückgewinnen.

Anthrachinon- oder Dianthron-Farbstoffe bildende Pilze sind aus der Literatur bekannt (vgl. z.B. E. Gäumann, Die Pilze, Basel 1949; Steglich und Arnold, Angewandte Chemie 85 (1973) 88f; Steglich et al, Angewandte Chemie 89 (1977) 56f; Giese, Photochem. Photobiol. Rev. 5 (1980) 229 bis 256). Zum erfin dungsgemäß bevorzugt eingesetzten Pilz Penicilliopsis clavariaeformis Solms vgl. z.B. H. Graf zu Solms-Laubach, Annales du jardin botanique Buitenzorg VI (1887), Seite 53; J. Reinke, Annales du jardin bitanique Buitenzorg VI (1887), Seite 73; Ch. Dhere, Acad. sci. Paris 197 (1933), Seite 948, ref. Chem. Zentralblatt 1934, I.Teil, Seite 1894; Ch. Dhere und V. Castelli, C.R. Seanc. Soc. biol. fil. ass. 131, 669, ref. Chem. Zentralblatt 1941, II. Teil, Seite 2331; A.E. Oxford und H. Raistrick, Biochem. Journ. 34 (1940), Seite 790; Photochemistry and Photobiology, Vol. 43, Nr. 6, Seiten 677- 680 (1986); Journal of Natural Products, Vol. 51, Nr. 6, Seiten 1251/1256, Nov.-Dez. 1988; Photochemistry and Photo biology, Vol. 37, Nr. 3, Seiten 313-319 (1983)).

Das Extrakt für eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zube reitung kann dadurch erhalten werden, daß man frisch geerntete Koremien der Pilze mit einem Extraktionsmittel verreibt.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes für eine erfindungsgemäße pharma zeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß man frisch geerntete Koremien der Pilze mit einem Extraktionsmittel ver reibt.

Vorzugsweise werden als Extraktionsmittel Glycole, Glucose sirup, Glycerin oder flüssiges Polyethylenglycol verwendet, insbesondere Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 400, und in erster Linie mit einem Molekularge wicht von 200 (PEG 200).

Das Verfahren wird vorzugsweise so durchgeführt, daß man frisch geerntete Koremien (Konidien) in einer Prozellan-Reib schale oder einer Prozellankugelmühle mit dem Extraktions mittel verreibt, vorzugsweise in einem Verhältnis von 5 bis 10 ml/100 mg Koremien. Nach dem innigen Verreiben (Dauer einige Minuten) lä8t man den Ansatz einige Stunden, vor zugsweise 8 bis 10 Stunden, z.B. über Nacht, an der Luft stehen; das erhaltene Extrakt wird dann, gegebenenfalls nach dem Abdekantieren von am Boden abgelagerten oder filtrier ten festen Stoffen und/oder Verdünnen mit Wasser, vorzugs weise im Verhältnis 1:1, einer Sterilfiltration unterworfen. Es kann bei Raumtemperatur gearbeitet werden.

Die Herstellung der Pilzkulturen für die Herstellung der er findungsgemä8en Extrakte und Zubereitungen kann auf an sich übliche Weise und unter Verwendung der üblichen Nährmedien erfolgen (vgl. A.E. Oxford und H. Raistrick, Biochem. Journ. 34 (1940), Seite 790). Jedoch wurde abweichend von der Lite ratur festgestellt, daß ungehopfte Bierwürze mit 1,04 spez. Gewicht ein gut geeignetes und preiswertes Substrat ist. Mit einem solchen Nährboden erfolgt in der Regel schon ab dem vierten Tag eine Koremienbildung.

Vorzugsweise wird bei einer Temperatur von 24°C gearbeitet, obwohl auch davon abweichende Temperaturen, z.B. eine so niedrige Temperatur wie 16°C, möglich sind. Die Pilze wach sen meist 14 Tage lang, gelegentlich aber auch 6 bis 10 Wochen, auf den Substraten. Die Pilzhyphen und Fruchtkörper werden von der Nährlösung abgeschieden und können direkt verarbeitet werden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zube reitung aus Penicilliopsis clavariaeformis Solms

Zur Kultur dieses Pilzes wurde ungehopfte Bierwürze (d = 1,04) verwendet. Temperatur 22 bis 25°C, Wachstumszeit 1/2 bis 2 Monate. Die Hyphen, Koremien und Fruchtkörper wurden aus dem Kolben genommen. Die Pilze lassen sich dann gut zerkleinern.

Die frisch geernteten Koremien von Penicilliopsis clavariae formis Solms wurden mit Polyethylenglycol 200 (50-200 mg/ 5 ml) in einer Prozellan-Reibschale zerrieben, der Ansatz wurde über Nacht an der Luft stehen gelassen, dann mit destilliertem Wasser (1/1) verdünnt und über einen Steril filter filtriert (Ansatz LR).

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 hergestellte Zubereitung (Ansatz LR) wurde, zusammen mit Vergleichsproben auf ihre Hemmwirkung auf HIV- Viren untersucht.

a) Versuchsablauf

Für die Versuche wurden 4 identische Platten verwendet. Zwei davon dienen zur Profilerationsmessung am Tag 8 und Tag 10. Die zwei anderen dienen zur p24-Ag-Bestimmung am Tag 8 und Tag 10 (3× 66 µl gepoolt).

b) Ergebnisse

Am 8. und am 10. Tag sahen die Zellen in allen Wells noch so gut aus, wie bei den Kontrollen (Lichtmikroskop), außer bei dem erfindungsgemäßen Ansatz LR (3,5 µg/ml), wo eine deutlich verminderte Zellzahl festgestellt wurde (etwa nur noch 25% im Vergleich zur Kontrolle), wobei man die verminderte Zell zahl auch am geringeren Mediumverbrauch feststellen konnte, d.h. der Farbindikator im Medium zeigte noch keine Ansäuerung. Hypericin ab einer Dosierung von 0,5 µg/ml bewirkte eine deut liche p24-AG-Abnahme.

Beispiel 3

Vergleich und Untersuchung des Einflusses von synthetischem Hypericin (HS+A), Hypericinextrakt (HE±A) mit und ohne Albumin (A), Albuminmonomer ohne Hypericin (A), erfindungs gemäßer Ansatz (LR), Emodin (Em), Phosphatidylcholin und Phosphatidylcholin mit Hypericin (P und P-HS) auf HIV-infe zierte Lymphocyten.

Methode: Über Ficollgradienten gewonnene Lymphocyten eines Normalspenders (buffy coat-Leucocyten angereichertes Blut) werden in zwei T-600-Flaschen in jeweils 75 ml Iscoves Medium/ 15% FCS 3,3×10⁵ Z/ml mit 0,5% PHA inkubiert und nach ein wöchiger Inkubation bei 37°C, 5% CO₂ mit H9-III Überstand infiziert (einstündige Inkubation zur Infizierung).

1. Die so gewonnenen infizierten PHA-Blasten werden auf die Mikrotiterplatten (4 Stück) geklickt (50 µl mit 6,3×10⁵ Z/ml=2,1×10⁵ Z/ml Endkonzentration) .
2. Dazu werden 50 µl Medium und

3. 50 µl Wirkstofflösung geklickt:

HS + A
0,053; 0,375; 1,5; 2,25 µg/ml
HE + A	0,375; 1,5
HE - A	0,375; 1,4
A	gleiche Konzentration wie bei HS + A; 2,25 µg/ml
LR	0,2; 1,0; 10 µg/ml
Em	9 µg/ml
P	0,24; 0,6; 1,5
P-HS	P 0,6 + HS 0,375; P 0,6 + HS 1,5

Alle Lösungen (1, 2, 3) werden zur Proliferationsstimulation im Medium RPMI/15% FCS 20 IU/ml TLF-IL2 angesetzt. Inkubation bei 37°C, 5% CO₂.

Zur Proliferationsmessung wird mit radioaktiver ³H-Thymidin lösung (1 µl ³H-Methyl-Thymidin, Amersham) 12 1/2 Stunden inkubiert. Danach werden die Zellen auf Glasfibermatten ge erntet und im β-Counter gezählt (b-Plate System).

p24-AG-Messung mit ELISA (Firma Du Pont).

Im Hinblick auf die HIV-Hemmung zeigte der erfindungsgemäße Ansatz (LR) die besten Resultate.

Claims

1. Verwendung von Anthrachinon- oder Dianthron-Farbstoffe bildenden Pilzen zur Herstellung von pharmazeutischen Zube reitungen.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung von Zube reitungen mit einer Hemmwirkung auf Viren und/oder Retroviren.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Pilze der Familie Ascomyceten einsetzt.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Emodin oder Scyrin bildende Ascomyceten einsetzt.

5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Penicilliopsis clavariaeformis Solms und/oder seine Stoffwechselprodukte einsetzt.

6. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie Extrakte und/oder Inhaltsstoffe von Anthrachinon oder Dianthron-Farbstoffe bildenden Pilzen enthält oder aus solchen besteht.

7. Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie Extrakte und/oder Inhaltsstoffe von Pilzen der Familie Ascomyceten enthält.

8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie Extrakte und/oder Inhaltsstoffe von Emodin oder Scyrin bildenden Ascomyceten enthält.

9. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie Extrakte und/oder Inhaltsstoffe von Penicilliopsis clavariaeformis Solms enthält.

10. Verwendung von Pilzfarbstoffen von Anthrachinon oder Dianthron-Farbstoffe bildenden Pilzen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen mit einer Hemmwirkung auf Viren und/oder Retroviren.

11. Pharmazeutische Zubereitung mit einer Hemmwirkung auf Viren und/oder Retroviren, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine durch Verreiben von Pilzfarbstoffen von Anthrachinon und/oder Dianthron-Typus mit Glycolen, Glucosesirup, Glycerin und/oder flüssigem Polyethylenglycol erhaltene Lösung enthält oder aus ihr besteht.

12. Verwendung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und 11 zur Behandlung und Prophylaxe von Viruser krankungen.

13. Verwendung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und 11 zum Abtöten von Viren und als viro statisches Mittel in vitro.

14. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes für eine Zubereitung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, daß man frisch geerntete Koremien der Pilze mit einem Extraktionsmittel verreibt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel ein solches ist aus der Gruppe Glycol, Glucosesirup, Glycerin und flüssiges Polyethylen glycol.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel Polyethylenglycol 200, 300 oder 400 ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man den Ansatz nach dem Verreiben einige Stunden an der Luft stehen läßt und das erhaltene Extrakt, gegebenenfalls nach Verdünnen mit Wasser, steril filtriert.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährboden für die Pilzkulturen Bierwürze mit einem spezifischen Gewicht von 1,04 verwendet.

19. Die in den Beispielen beschriebenen pharmakologisch wirksamen Zubereitungen.

20. Das in den Beispielen beschriebene Verfahren zur Her stellung pharmakologisch wirksamer Zubereitungen.