DE69118926T2

DE69118926T2 - Antivirale Fraktion von einem wässerigen Extrakt von Lentinus edodes

Info

Publication number: DE69118926T2
Application number: DE69118926T
Authority: DE
Inventors: Hajime Hiratani; Junichi Koga; Yasuhiro Ohashi
Original assignee: Noda Shokkin Kogyo KK; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Noda Shokkin Kogyo KK; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1990-01-10
Filing date: 1991-01-09
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: EP0437346A1; EP0437346B1; JP2938916B2; CA2033814A1; DE69118926D1; CA2033814C; ES2088458T3; JPH03209333A

Description

Die Erfindung betrifft einen Inhibitor der starken Vermehrung (Proliferation) von mit Herpesviren infizierten Zeilen und der Reaktivierung latenter Herpesviren sowie der sich anschließenden erneuten Infektion in einem lebenden Organismus, der die Merkmale einer latenten Infektion dieser Viren angenommen hat.
Das humane Herpesvirus ist ein typisches Hüllenvirus mit doppelsträngiger DNS in seinem Nucleocapsid, von dem bekannt ist, daß es eine große Vielfalt von Infektionen in einem Organismus hervorruft, welcher damit angesteckt wurde. Aus dieser Kategorie humaner Herpesviren sind die folgenden Viren bekannt: Herpes simplex Viren vom Typ 1 und 2 (HSV 1 und 2), Varicella/Herpes zoster Viren (VZV), Cytomegaloviren (CMV), Epstein-Barr Viren (EBV) sowie der humane Herpesvirus Typ 6 (HHV 6). Diese Viren zeichnen sich dadurch aus, daß nach der Erstinfektion eines lebenden Organismus in früher Kindheit eine latente Infektion erfolgt, d.h. ununterbrochen während der Lebenszeit des Organismus am Leben bleiben. In dem Moment, in dem sich die Immunlage des Organismus verändert, kehrt die Infektion zurück und ist während des ganzen Lebens wiederholt zu behandeln. Auf diese Weise sind einige durch diese Viren hervorgerufenen Infektionen so schwerwiegend, daß der mit ihnen infizierte lebende Organismus stirbt. In bezug auf die Immunsuppression während der Organtransplantation beeinträchtigt die erneute Infektion und Reaktivierung dieses Virus das Ergebnis der Operation zum Zwecke der Organtransplantation selbst, so daß ein dringendes Bedürfnis nach der Entwicklung eines antiviralen Wirkstoffes gegen Herpesviren im Hinblick auf derartige Operationen besteht. Dieses Virus ist auch dafür bekannt, eine fatale Infektion oder ernsthafte Sekundäraffektionen wie z.B. Hirnentzündung (Encephalitis) bei einem Fötus oder Neugeborenen durch die Infektion vonseiten der Mutter oder bei dem Fötus auf dem Wege einer transplazentalen Infektion hervorzurufen. Immer mehr Details sind im Zusammenhang mit dem Manifestwerden von Symptomen venerischer Erkrankungen wie z.B. dem genitalen Herpes (Herpes simplex Virus Typ 2), dem Epipharynx-Syndrom, dem Burkittlymphom (EB-Virus), dem Kaposi-Sarkom (CMV) sowie AIDS (HHV 6) bekannt geworden. In neuester Zeit wurden im Verlauf der Entwicklung der Molekularbiologie eine große Anzahl von Entdeckungen im Zusammenhang mit Herpesvirus-Bestandteilen gemacht. Das Wissen ii ber den Mechanismus und die Rolle von Glykoprotein, das für diese Viren spezifisch ist, hat zugenommen. Das gilt auch für die Enzymaktivität in diesen Erregern, wie z.B. die Thymidinkinaseaktivität, der typische Mechanismus der Genom-DNS, die latenten Infektionen, die Basensequenzen in Zusammenhang mit der Krebsbildung der Zellen usw. Es verbleiben jedoch eine Menge von Fragen in bezug auf den Lebenszyklus von Herpesviren im Verhältnis dieses Virus zu der Zelle, die von ihm infiziert wurde, und der Immunität des Organismus während der latenten und der erneuten Infektion zu klären. Dies stellt Hindernisse für die Entwicklung eines Virusinhibitors dar.
Wie aus dem vorstehenden zu ersehen ist, stellt dieses Virus einen Erreger mit einem äußerst hohen pathogenen Potential dar, so daß ein dringender Bedarf an einem Arzneimittel dagegen besteht. Das Aciclovir ist jedoch der einzige Arzneistoff, der in Gebrauch ist. Negativ ist dabei noch zu vermerken, daß die Anwendung dieses Arzneimittels nur von begrenztem Umfange ist, da es Nebenwirkungen, wie z.B. einen teratogenen Effekt aufgrund seiner antagonistischen Eigenschaften gegen die Nudeinsäuresynthese besitzt.
Seit urdenklichen Zeiten sind verschiedene physiologische Wirkstoffe bekannt, die von Pilzen stammen, von denen einige heutzutage als Arzneimittel gebraucht werden. Beispielsweise werden das Klestin [Yanagawa et al., Cancer and Chemotherapy, 11, S. 2155 (1985)] und das Lentinan [Suga et al., Cancer Research, 44, S. 5162 (1984)] sowie das Shizofillan als Antitumormittel benutzt. Die aktiven Prinzipien dieser Wirkstoffe sind Polysaccharide oder Glykoprotein, die aus Bakterien stammen. Es wird angenommen, daß deren Wirksamkeit auf einen biologischen Antwortmodifikator (BRM) zurückgeht, der das Immunsystem eines lebenden Organismus stimuliert. Diese Wirkstoffe haben jedoch keinen direkten antiviralen Effekt.
Vor kurzem wurde berichtet, daß Polysaccharide mit Schwefelsäureresten, beispielsweise die Dextranschwefelsäure, eine antivirale Aktivität gegen AIDS-Viren (Mitsuya et al., Science 240, S. 646, 1988) zeigen. Ferner vermuten Tochikura und seine Arbeitsgruppe, daß LEM, das einen Warmwasserextrakt aus kultiviertem Lentinus edodes mycel darstellt (Med. Microbiol. Immunol., 177, S. 235, 1988) dieselbe Art von Aktivität besitzt. Takehara et al. (Japanese Journal of Bacteriology, 41, 5. 634,1986) berichten, daß durch die Reinigung von Fruchtkörpern von unter anderem Lentinus edodes hergestellte Polysaccharide im Hinblick auf eine Anti- Herpesvirusaktivität getestet wurden.
Das Verfahren zur Herstellung von LEM ist bereits in der japanischen Anmeldung JP-A-53-101 17 beschrieben. Es sind verschiedene Arten von in vivo-Wirksamkeit offenbart, wie sie von LEM gezeigt wird. Dieses Material ist als Pestizid gegen Tabakmosaikvirusinfektionen in Gebrauch. Es wird auch berichtet, daß es einen klinischen Effekt gegen Hepatitis besitzt.
Es ist bekannt, daß LEM aus einem Gemisch oder Komplex von Polysacchariden besteht, deren Hauptbestandteile durch Xylose und Arabinose, wasserlösliches Lignin und Peptid sowie verschiedene anorganische Substanzen gebildet werden. Es hat bereits eine lange Geschichte als Gesundheitsnahrung. In bezug auf seinen Ursprung, wie auch seiner Zusammensetzung ist es von Klestin, Lentinan und Shizofiran völlig verschieden, deren wirksame Bestandteile herkömmliche chemische Stoffe, wie z.B. Glucan und Glycoprotein darstellen.
Wie bereits eingangs beschrieben, verursachen die humanen Herpesviren schwerwiegende Infektionen, wobei Heilmittel dagegen in zu geringer Anzahl vorliegen und deren Anwendung nur begrenzt ist. Die Entwicklung einer Therapie für Infektionen, die durch diese Viren hervorgerufen werden, sowie eines Arzneimittels dagegen stellt aus diesem Grunde ein äußerst dringliches Problem dar.
Aktuell in Gebrauch befindliche Wirkstoffe gegen diese Viren, nämlich das Aciclovir und BV-araU, mit denen gegenwärtig klinische Versuche durchgeführt werden, stellen Nukleinsäureanaloga dar, wobei das Ziel ein Enzym darstellt, das in einem Nukleinsäuresynthesesystem existiert, das für diese Viren spezifisch ist, um so die Nukleinsäuresynthese zu inhibieren. Dieses Prinzip funktioniert jedoch notwendigerweise nicht ohne daß das Nukleinsäuresynthesesystem des lebenden Organismus beeinträchtigt wird. Sie stellen in der Tat chemische Verbindungen dar, deren Nebenwirkungen nicht geleugnet werden können. Somit wird heutzutage ein sichereres und effizienteres Arzneimittel benötigt.
Die erfindungsgemäße Aufgabe besteht deshalb darin, ein sicheres und völlig neues Arzneimittel zu schaffen, das von herkömmlichen antiviralen Wirkstoffen gegen Herpesviren verschieden ist und das dazu dient, die Proliferation von Herpesviren in Zellen (seine starke Vermehrung) und seine Reaktivierung wie auch die erneute Infektion mit diesem Virus zu inhibieren, nachdem ein Organismus eine latente Infektion durch diese Viren erworben hat.
Die Erfinder des erfmdungsgemäßen Gegenstandes haben entdeckt, daß in LEM, welches das Ausgangsmaterial für das vorliegende aktive Material darstellt bzw. in dessen Fraktionen, Fraktionen vorhanden sind mit einer absorptionsinhibierenden Aktivität gegen Herpes simplex (siehe die EP-A-0 382 551, publiziert am 16.08.1990, nach dem für die vorliegende Anmeldung beanspruchten Prioritätsdatum). Im Verlauf unserer weiteren Forschungsarbeiten hat sich herausgestellt, daß eine der Fraktionen, erhalten durch Reinigungsverfahren, die mit LEM beginnen, überraschenderweise eine Irhibierungsaktivität auf die Proliferation dieser Viren in Zellen besitzt. Die Erfinder haben auch festgestellt, daß deren Reaktivierung durch die intraperitoneale Verabreichung dieser Fraktion (100 µg täglich für eine Dauer von 4 Tagen) an die Maus mit einer erworbenen latenten Infektion mit diesen Erregern inhibiert wurde. Darüber hinaus wurde deren Aktivierung durch die orale Gabe dieser Fraktion an eine Maus, die in ähnlicher Weise infiziert war, inhibiert (500 µg täglich für eine Dauer von 5 Tagen). Dies war von den Erfindern überhaupt nicht erwartet worden. In Anbetracht der Bestandteile der Fraktion, welche Makromoleküle darstellen (10 000 bis 1 Mio. Dalton) und deren antigener Eigenschaften, scheint es schwierig zu sein, sich irgendeine andere medizinische Applikation dieser Substanz als die orale Verabreichung und den externen Gebrauch vorzustellen, so daß dieses experimentelle Ergebnis eine ganz bedeutende Erkenntnis in bezug auf die klinische Anwendung ist. Ein akuter Toxizitätstest ergab, daß dieser Wirkstoff wenig toxisch ist: LD&sub5;&sub0; = 15 g täglich (Ratte und Maus). Die Erfinder haben das aktive Material mit JLS-18 bezeichnet. Es stammt aus der Fraktionierung aus LEM, das einen Warmwasserextrakt von kultivierten Lentinus edodes Mycelien darstellt. Das Verfahren zur Gewinnung von LEM wird in der JP-A-53-1 0117 beschrieben. Nach diesem Verfahren werden Mycelien von Lentinus edodes in einem Medium aus Bagasse und Reiskleie kultiviert und anschließend die Warmwasserextraktion des aktiven Prinzips aus dem Mycel genau in dem Moment zur Gewinnung von LEM durchgeführt, bevor sich die Fruchtkörper bilden.
Durch das Fraktionieren dieses LEM als Ausgangsflüssigkeit wird JLS-18 gewonnen. Die Fraktionierung wird durch das Kombinieren von Aussalzen, wahlweisen Ausfällens mit organischem Lösungsmittel, Ionenaustauscherchromatographie, hydrophober Chromatographie und Gelfiltrationschromatographie durchgeführt. Das so erhaltene aktive Material in Form des JLS-18 besitzt konstante analytische Werte in bezug auf die Kohlenhydratzusammensetzung, die Aminosäurezusammensetzung und das Ligninverhältnis, wodurch die Bildung eines Komplexes mit den konstanten Mengenverhältnissen aus diesen drei Bestandteilen nahegelegt wird. Es ist schwierig, das Molekulargewicht dieses Materials zu spezifizieren, weil das Molekulargewicht dieser Substanz im Bereich von mehreren Hundert bis zu mehreren Millionen Dalton entsprechend dem Polymerisationsgrad des Lignins variiert, welches das Gerüstwerk der Substanz bildet. Die antivirale Wirksamkeit ist jedoch bei dem Material am stärksten, das zwischen 10 000 und 100 000 Dalton wiegt. Somit wird davon ausgegangen, daß ein Material mit einem derartigen Molekulargewicht das Problem eines antiviralen Wirkstoffes gegen Herpesviren erfindungsgemäß löst.
Die Erfindung stützt sich auf die obenstehend erwähnten Erkenntnisse und wird durch einen Inhibitor der starken Vermehrung (Proliferation) von Herpesviren verkörpert, welcher JLS-18 enthält, sowie durch einen Inhibitor, der zusätzlich JLS-18 enthält und zwar in bezug auf die Inhibierung der Reaktivierung bzw. der erneuten Infektion mit diesen Viren in einem lebenden Organismus, der mit diesen Erregern eine latente Infektion erworben hat. Diese Arzneistoffe lassen sich sowohl extern (topisch) oder auch peroral verabreichen. In bezug auf den externen Gebrauch sollte das JLS-18 in Arzneimitteln vorliegen, welche sich für die äußerliche Verabreichung in einem offensichtlich oder möglicherweise mit Herpesviren infizierten Bereich eignen. Wahrscheinliche Haut- oder Membranstellen sind Öffnungen, wie z.B. die Mundhöhle, der Schlund, die Nasen höhlen, das Augenlid, der Anus und das Rektum, die Urethra und Vagina sowie Körperwunden bzw. deren Umgebung. Ein erfindungsgemäßes Mittel für äußerlichen Gebrauch zur Verabreichung in Arzneimitteln stellt beispielsweise Suppositorien, runde oder ovale Pastillen (troches), Gel (Gelee), Creme, Umschlagspasten, Salben, Pflaster, Linimente, Lösungen, Vernebelungssprays, Aerosole sowie Pulver bzw. Puder für externen Gebrauch, welche je nach der bestehenden Notwendigkeit ausgewählt werden. Diese Arzneimittel für den äußerlichen Gebrauch werden mittels bekannter Verfahren hergestellt. Im Hinblick darauf, daß das JLS-18 sehr stabil ist, bereitet die Konservierung nach der Dispensation als Wirkstoff zum äußerlichen Gebrauch keine Schwierigkeiten. Das JLS-18 ist als Inhibitor von Herpesviren bei ihrer Reaktivierung bzw. einer erneuten Infektion mit ihnen wirksam, wenn es aus Anlaß einer derartigen Reaktivierung oder zum Zwecke der Verhütung des Eintretens einer Infektion eingenommen wird. Aufgrund der hohen Stabilität von JLS-18 besteht keinerlei Beschränkung im Hinblick auf die Auswahl der Arzneiform aus einem Puder, Granulat, Dragees, Tabletten, einer Tinktur oder Limonaden usw.
JLS-18 wird bevorzugt in der Weise eingesetzt, daß ein Arzneimittel zum äußerlichen Gebrauch aus etwa 0,01 bis 1 % JLS-18 besteht. Für die perorale Verabreichung ist eine Dosis von 10 mg bis zu 10 g täglich wünschenswert.
Der erfindungsgemäße Wirkstoff JLS-18 inhibiert nicht nur Herpesviren in bezug auf ihr Andocken an Targetzellen, sondern auch deren starke Vermehrung (Proliferation) in Zellen, so daß das Manifestwerden von Erkrankungen von diesem Ursprung und das Anwachsen inifizierter Regionen in bezug auf Anzahl und Ausdehnung verhindert wird. Ferner verhütet die perorale Verabreichung dieses Wirkstoffes die Reaktivierung von Herpesviren, durch die ein Organismus eine persistierende oder latente Infektion erwoben hat, wobei diese Art von Verabreichung auch dazu beiträgt, die Symptome nach einer erneuten Infektion mit diesen Viren zu beseitigen. Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

JLS-18 wurde in der Weise aus LEM durch Reinigung gewonnen, daß zuerst ein Liter 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,4) mit einem Gehalt an 2 M Ammoniumsulfat zu einem Liter flüssigen LEM hinzugefügt wurde, das Gemisch kräftig gerührt und mit einem 0,45 µm Film abfiltriert wurde. Im Anschluß daran wurde das Filtrat durch Phenyltoyopearl (Tosoh) gegeben, das mit Hilfe von 50 mM Phosphatpuffer lösung (pH 7,4) mit einem Gehalt an 1 M Ammoniumsulfat gepuffert war. Die absorbierten Bestandteile mit antiviraler Wirksamkeit wurden fraktioniert, während gleichzeitig die Salzkonzentration schrittweise erniedrigt wurde. Als Endergebnis dieser Chromatographie wurden die meisten hydrophoben Fraktionen der Wirksamkeitsbestandteile im Bereich einer Phosphatkonzentration von nicht mehr als 10 mM eluiert. Nach dem Einengen durch Gefriertrocknung wurden diese Fraktionen der Molekulargewichtsfraktionierung durch die Gelfiltration unter Verwendung von HW-55 (Tosoh) unterzogen. Jede so erhaltene Fraktion wurde auf die antivirale Aktivität hin überprüft (proliferationsinhibierende Aktivität), wie in Beispiel 2 beschrieben. Eine Fraktion (Bereich) mit der größten Aktivität gemäß untenstehender Darstellung wurde mit der Bezeichnung JLS-18 benannt. Die Resultate der Analyse dieses Wirkstoffes ist in der untenstehenden Tabelle in detaillierter Form wiedergegeben, und zwar als Ergebnis der Chromatographie in Abbildung 1 zusammen mit dem Ergebnis der Überprüfung gemäß Ausführung in Beispiel 2. Die antivirale Aktivität war unter den mittels der Molekulargewichtsfraktionierung erhaltenen Fraktionen sehr breit verteilt, wobei diese Wirksamkeit im Bereich des Molekulargewichtes von 10 000 bis 100 000 Dalton am größten war. Anschließend wurden die Fraktionen mit einem derartigen Molekulargewicht entsalzt und gefriergetrocknet. Die analytischen Werte für JLS-18 waren wie folgt: (1) Zusammensetzung in % Protein Kohlenhydrate Lignin bis (2) Aminosäurezusammensetzung im Protein in % (3) Kohlenhydratzusammensetzung in % Glukose Xylose Galaktose Arabinose Mannose bis

Beispiel 2

Hiermit wird die Art und Weise der Bestimmung der Inhibitorwirkung auf die Virusproliferation beschrieben. Zunächst wurde die BS-C-1-Zelle, welche eine Zellinie darstellt, die sich von der Affenniere ableitet, in einem Medium mit einem Minimalgehalt an essentiellen Stoffen (MEM) der Fa. Nissui Pharmaceutical Co. vermehrt, das 10 % fötales Kalbserum (Flow Corp.) in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 30 mm (Corning Glaswerke) enthielt. Die durch die Molekularfraktionierung gemäß Beschreibung in Beispiel 1 erhaltenen Fraktionen wurden jeweils zehnmal in dem MEM-Medium mit einem Gehalt an 10 % fötalem Kalbserum so verdünnt, daß sie als Proben verwendet werden konnten, wobei die Zellen in der Petrischale 24 Stunden lang in einem Medium kultiviert wurden, das jeweils die verdünnten Fraktionen enthielt. Ein Verdünnungsmittel aus 100 plaquebildenden Einheiten (PFU) pro ml Herpes simplex Viren wurde unter Benutzung eines Mediums mit 2 % fötalem Kalbserum hergestellt. Nachdem die Zellen mit Dulbecco's PBS gespült waren, wurden 0,5 ml an Herpes simplex Virenverdünnungsmittel jeweils in die Petrischalen pipettiert und zwei Stunden lang bei 37 0C zur Absorption der Viren an die Zellen gehalten. Nach dem Absorptionsvorgang wurden diese Zellen wiederum mit PBS gespült und jeweils 2 ml 2 % an frischem, fötales Kalbserum enthaltendes MEM in die Schale pipettiert und 48 Stunden lang kultiviert. Die kultivierten Viren wurden im Anschluß daran mit einer Zentrifuge bei einer Drehzahl von 3000 Upm zusammen mit den Zellen 10 Minuten lang bearbeitet, so daß die überstehende Flüssigkeit aus dem Schaleninhalt gewonnen werden konnte. Die Anzahl an Viren in der jeweiligen überstehenden Flüssigkeit wurde unter Benutzung der Plaque-Technik ausgezählt. Diese Plaque-Technik wurde in der gemäß in Beispiel 3 beschriebenen Weise angewendet.
Die Abbildung 1 stellt eine graphische Wiedergabe des Prüfungsergebnisses gemäß Ausführung in Beispiel 2 sowie der Virusinhibitoraktivität dar, welche die gemäß Beispiel 1 erhaltenen Molekulargewichtsfraktionen zeigen. Dieses Säulendiagramm zeigt die Absorption von Licht bei 280 mn jeweils in bezug auf die Fraktionen 1 bis 17 und die Inhibitoraktivität im Hinblick auf die Proliferation von Herpesviren. Das anhand der Eluierung durch Gelflltration geschätzte Molekulargewicht wird in dem oberen Teil der Zeichnung dargestellt.

Beispiel 3

Die gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fraktionen wurden bei dem Bioassay angewendet. Sobald eine Maus im Augenlid mit Herpesviren infiziert ist, wird sie alsbald darauf eine latente Infektion mit diesen Erregern im trigeminalen Ganglion aufweisen. Durch das Entfernen eines derartigen Ganglions bei der Maus und anschließendes Kultivieren dieses Ganglions in ein Teströhrchen ist es möglich, das Erscheinen der Viren in dem Gewebe zu deren Aufspüren zu benutzen. Der Bioassay-Test wurde in der Weise ausgeführt, daß von dieser Charakteristik des Virus Gebrauch gemacht wurde, wie im nachfolgenden beschrieben wird. 10 000 000 PFU der F-Zellinie von Herpes simplex Viren 1 (in der Verozelle vermehrt) wurden in die Augen von sechs Wochen alten ICR-Mäusen pipettiert. Mit Beginn des nächsten Tages wurden 500 µg JLS-18 täglich peroral für eine Dauer von fünf Tagen verabreicht. Die auf diese Weise behandelte Mäusegruppe wurde, wie auch eine Kontrollgruppe zu jeweils zehn Tieren zusammengefaßt. Nachdem sie drei Wochen lang nach der Behandlung gefüttert worden waren, wurden die Trigeminalganglien entfernt, wonach diese Gang lien jeweils drei Tage lang in einem Medium 199 der Flow Corp. kultiviert wurden, dem 5 ml 2 %iges fötales Kalbserum hinzugefügt worden war (zum Zwecke der Reaktivierung der latenten Viren). Nach der Kultivierung wurden die Gewebe mit physiologischer Kochsalzlösung in Form des Dalbecco's Phosphatpuffers (Nissui Pharmaceutical Co.) gespült und in einem Medium 199 zerkleinert, dem 2 % fötales Kalbserum hinzugefügt worden war, um die reaktivierten Viren aus den Geweben zu extrahieren. Anschließend wurden diese Viren unter Zuhilfenahme des Plaqueassaysystems unter Verwendung der Verözellen, die aus einer Affenniere stammten, überprüft, wie im folgenden beschrieben wird. Die in einem Eagle- MEM-Medium (Nissui Pharmaceutical) kultivierten Verozellen, denen 10 % fötales Kalbserum hinzugefügt worden waren, wurden unter Verwendung von Trypsin entfernt, wobei etwa 10 000 davon jeweils in einen Napf auf einer Mikroplatte mit 24 Näpfen verbracht wurden und anschließend zwei Tage lang kultiviert wurden, so daß sie eine gute Haftung auf der Platte aufwiesen. Diese Zellen wurden im Anschluß daran eine Stunde lang zur Virusabsorption unter Verwendung der schrittweise auf die geeignete Konzentration verdünnten Virusextrakten gebracht, wobei die Verdünnung mit einem Eagle-MEM-Medium vorgenommen wurde, dem 1 % fötales Kalbserum hinzugefügt worden war. Nachdem die Zellen mit der phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung nach Dalbecco gespült worden waren, wurde ein Eagle-MEM-Medium mit einem Zusatz an 1 % fötalem Kalbserum mit einem Gehalt an 0,2 % Agarose hinzugefügt, wonach deren Zusatz zu den Zellen zum Zwecke der Kultivierung für zwei Tage erfolgte. Die kultivierten Zellen wurden mit 10 %iger Formaldehyd lösung inaktiviert und mit Methylen blau angefärbt, wobei die Menge an PFU unter einem Mikroskop ausgezählt wurde. Das Ergebnis beständ darin, daß kein Virus in der mit JLS-18 behandelten Gruppe entdeckt wurde, obwohl eine Reaktivierung der Viren in den Trigeminalganglien bei allen Angehörigen der Gruppe von zehn Mäusen, die nicht behandelt worden waren, festgestellt wurde, wobei die Viruskonzentration nicht weniger als 1000 PFU pro ml betragen hatte. Zusätzlich zu dem oben Gesagten ist zu bemerken, daß ein Wechsel der Art der Verabreichung des Wirkstoffes von der peroralen zur abdominalen Applikation kein unterschiedliches Testergebnis erbrachte.
Nähere Einzelheiten des Ergebnisses sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
Die Aktivität von JLS-18 in bezug auf die Inhibierung der latenten Virusinfektion durch Reaktivierung stellt sich wie folgt dar: (1) Perorale Verabreichung Dosis (µg täglich) Anzahl der Mäuse Virusinfektion positiv in % (2) Abdominale Verabreichung Dosis (µg täglich) Anzahl der Mäuse Virusinfektion positiv in %

Beispiel 4

Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden die Mäuse mit Herpes simplex Viren infiziert und vier Wochen lang ohne jegliche Behandlung mit Arzneistoffen gefüttert, so daß sie eine latente Infektion entwickeln konnten. Nach der Enifernung ihrer Trigeminalganglien wurden die Ganglien drei Tage lang in dem Medium 199 kultiviert, zu dem 2 % fötales Kalbserum hinzugefügt worden war. Zu dem Kulturmedium für die zu behandelnde Gruppe wurden 300 µg pro ml JLS-18 hinzugefügt. Nach dem Kultivieren wurden die reaktivierten Viren aus den Gangliongeweben wie in Beispiel 2 wiedergewonnen. Anhand der nichtbehandelten Gruppe wurden nicht weniger als 10 000 PFU pro ml Viren gewonnen, nicht jedoch aus der mit JLS-18 behandelten Gruppe, bei der kein Virus aufzufinden war.

Beispiel 5

Es wurden Zubereitungen mit JLS-18 zur oralen Verabreichung in der Weise hergestellt, daß der Wirkstoff in Anteile von jeweils 500 mg aufgeteilt wurde und jede Einzelmenge in ein Papier oder ein Briefchen eingeschlagen wurde.

Beispiel 6

100 g Salbe mit JLS-18 wurden in der Weise hergestellt, daß 3 g JLS-18 in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst, eine hydrophile Salbengrundlage hinzugegeben und im Anschluß daran verrührt wurde.

Claims

1. Substanz mit Inhibitorwirkung gegen die starke Vermehrung von Herpesviren und Rückfallerkrankungen, die durch latente Infektionen der Herpesviren hervorgerufen werden, erhältlich durch die Fraktionierung durch Ionenaustausch, hydrophobe und Gelfitrationschromatographie eines auf pH 7,4 gepufferten, wäßrigen Extrakts aus kultivierten Lentinus edodes-Mycelien, der dadurch erhalten worden ist, daß die Mycelien von Lentinus edodes in einem Bagasse (zuckerfreie Zuckerrohrrückstände) und entfettete Reiskleie enthaltendem Medium kultiviert wurden, sowie durch Extraktion der so erhaltenen Kultur mit warmem Wasser unmittelbar vor der Ausbildung der Fruchtkörper in der Kultur, wobei die Substanz einen Komplex aus 65 bis 75 % wasserlöslichem Lignin, 15 bis 30 % Polysaccharid und 10 bis 20 % Peptid darstellt, deren Molekulargewicht 10&sup4; bis 10&sup6; Dalton beträgt, deren Aminosäurezusammensetzung

Asx 15,0 - 16,5 %

Thr 6,5 - 7,2 %

Ser 6,5 - 7,3 %

Glx 15,0 - 17,5 %

Pro 6,8 - 8,0 %

Gly 9,3 - 11,0 %

Als 7,3 - 8,8 %

Val 5,9 - 6,5 %

Met 0,3 - 0,7 %

Ile 3,8 - 4,9 %

Leu 4,9 - 6,6 %

Tyr 1,1 - 1,5 %

Phe 3,0 - 4,6 %

Lys 3,6 - 4,8 %

Arg 0,7 - 1,1 %

und deren Zuckerzusammensetzung

Glukose 35 - 55 %

Xylose 29 - 41 %

Galaktose 2 - 7 %

Arabinose 12 - 20 %

Mannose 1 - 4 %

betragen.

2. Arzneimittel mit einem Gehalt an einer Substanz nach Anspruch 1 neben einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Trägerstoff.

3. Mittel nach Anspruch 2 zur peroralen Verabreichung.

4. Mittel nach Anspruch 2 zur äußerlichen Verabreichung.

5. Mittel nach Anspruch 4 zur topischen Applikation.

6. Mittel nach Anspruch 4 in Form eines Suppositoriums.

7. Substanz nach Anspruch 1 zur Verwendung als wirksamer Arzneistoff.

8. Verwendung einer Substanz nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herpesvireninfektionen.

9. Verwendung nach Anspruch 8, bei der die Infektion einen latenten Infekt durch Herpes simplex-Viren vom Typ 1 oder 2 (HSV1 oder HSV2), Varicella zoster-Viren (VZV) oder Cytomegaloviren (CMV) darstellt.