DE2554428C2

DE2554428C2 -

Info

Publication number: DE2554428C2
Application number: DE2554428A
Authority: DE
Inventors: Samuel Simon Hampton N.J. Us Asculai; Alfred B. Somerville N.J. Us Kupferberg
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1974-12-03
Filing date: 1975-12-03
Publication date: 1988-02-25
Also published as: FR2293219B1; FR2293219A1; ZA757591B; NL7513985A; US4139630A; AU504576B2; CA1067826A; DE2554428A1; AU8728075A; US4147803A; BE836192A; US4020183A

Description

Es sind zwei Arten von Herpes simplex-Viren bekannt. Bei der ersten Art tritt als vorherrschendes klinisches Symptom ein rezidivierender Herpes labialis (Fieberbläschen) auf. Die zweite Art verursacht beim Menschen vor allem eine rezidivierende herpetische Vulvovaginitis. Man nimmt an, daß beide Arten von Herpes simplex- Viren ursächlich bei verschiedenen Krebserkrankungen des Menschen beteiligt sind. Aus diesem Grund sollten Wirkstoffe, die die Infektiosität von Herpes simplex-Viren während offener Infektionen vermindern, auch die Wahrscheinlichkeit, daß sich anschließend eine maligne Krankheit entwickelt, verringern.

Die Infektiosität von Herpes simplex-Viren hängt teilweise von der Existenz einer intakten Virushülle ab. Chemische Stoffe, die die Virushülle beschädigen oder entfernen, sorgen somit für eine einschneidende Senkung der Infektiosität.

Es wurde gezeigt, daß die Virushüllen von Herpes simplex-Viren gegen Lipid-Lösungsmittel, Enzyme und Detergentien empfindlich sind, vgl. dazu insbes. Pharmazeutische Zeitung Nr. 47, 25. 11. 1971, S. 1825. Kationische Detergentien auf der Basis von quaternären Ammoniumverbindungen, wie Cetylpyridiniumchlorid und Benzalkoniumchlorid, sind hochwirksame Inaktivatoren von Herpes simplex-Viren. Bestimmte heterocyclische Farbstoffe beeinträchtigen die virale DNA bei Belichtung, wobei aber neben einer Senkung der Infektiosität auch ein Ansteigen der potentiellen tumorbildenden Wirkung von Herpes simplex-Viren zu beobachten ist. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt besteht ein Bedarf an wirksamen Arzneimitteln zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Herpes simplex-Viren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Arzneimittel zur lokalen Behandlung von Herpes simplex-Virus-Erkrankungen zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe besteht in der Verwendung nicht-ionogener Netzmittel (Tenside) als Wirkstoff zur Herstellung derartiger Arzneimittel.

Nicht-ionogene Netzmittel enthalten im Gegensatz zu kationischen, anionischen oder amphoteren grenzflächenaktiven Mitteln keine ionisierbaren Gruppen und weisen keine Oberflächenladung auf. Ihre grenzflächenaktive Wirkung beruht auf ihrer gesamten Molekülstruktur. Zur Bildung von nicht-ionogenen Netzmitteln können praktisch alle hydrophoben Verbindungen, die Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Amido- oder Aminogruppen mit einem freien Wasserstoffatom am Stickstoffatom aufweisen, mit Äthylenoxid umgesetzt werden. Nicht-ionogene Netzmittel können aufgrund ihrer Molekülstruktur klassifiziert werden. Man kennt zumindest drei Gruppen:

1) Netzmittel mit einer Ätherbindung, wie Polyoxyäthylenalkylphenole, Polyoxyäthylenalkohole, Polyoxyäthylenester von Fettsäuren, Polyoxyäthylenmercaptane und Polyoxyäthylenalkylamine;
2) Netzmittel mit einer Ester- oder Äther-Esterbindung, wie Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Sorbitantristearat, Sorbitanmonooleat, Sorbitansesquioleat und Sorbitantrioleat; Polyoxyäthylen-(4)-sorbitanmonolaurat, Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonolaurat, Polyoxyäthylen-(20)- sorbitanmonopalmitat, Polyoxyäthylen-(4)-sorbitanmonostearat, Polyoxyäthylen-(20)-sorbitantristearat, Polyoxyäthylen-(5)- sorbitanmonooleat, Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonooleat und Polyoxyäthylen- (20)-trioleat; und
3) Netzmittel mit einer Äther-Amidbindung, wie Kondensationsprodukte aus Fettsäuren und Alkanolamiden, z. B. Fettsäure-Äthanolamin- und -Isopropanolamin-Kondensate, Dialkylolamide und Laurinsäurediäthanolamid.
Bevorzugte nicht-ionogene Netzmittel sind p- Diisobutylphenoxypolyäthoxyäthanol, Nonylphenoxypolyäthoxyäthanol, Polyoxyäthylenoleyläther, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonooleat, Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonooleat und Fettsäure-Äthanolamin- und -Isopropanolamin- Kondensate. Die Äther-, Amid-, Ester- oder Äther-Esterbindung liegt zwischen den hydrophoben und hydrophilen Teilen des Moleküls.

Nicht-ionogene Netzmittel entwickeln sich zur Zeit zu einer wichtigen Klasse von pharmakologischen Wirkstoffen. Sie werden im allgemeinen als Emulgatoren und gelegentlich als "aktive Bestandteile (aktive ingredients)" bezeichnet.

Nicht-ionogene Netzmittel werden aufgrund ihrer spermiciden Wirkung als lokale Contraceptiva verwendet. Bisher wurden weder die gesamte Verbindungsklasse noch einzelne Verbindungen davon zur Bekämpfung von Herpes simplex-Viren (HSV) eingesetzt.

Wie bereits erwähnt, rufen die beiden Arten von Herpes simplex- Viren verschiedene klinische Symptome hervor, wobei das Herpes simplex-Virus-1 rezidivierende Fieberbläschen und das Herpes simplex-Virus-2 rezidivierende Vulvovaginitis hervorrufen. Herpes simplex-Virus-1 wird auch mit Lippenkrebs und Herpes simplex-Virus-2 mit Cervixkrebs in Zusammenhang gebracht. Der Mechanismus, nach dem das Herpes simplex-Virus seine tumorbildende Wirkung entfaltet, ist nicht bekannt. Es ist jedoch möglich, daß durch eine Verminderung der gesamten infektiösen Belastung während einer produktiven Infektion durch tumorbildende Herpes simplex-Viren die Wahrscheinlichkeit einer anschließenden Umwandlung in eine maligne Erkrankung stark verringert wird.

Letztlich liegt die Infektiosität von HSV in der DNA begründet. Mit Neutralrot, Toluidinblau und Proflavin (heterocyclische Farbstoffe, die mit DNA reagieren) behandeltes HSV erweist sich gegenüber einer photodynamischen Inaktivierung als empfindlich. Eine photodynamische Inaktivierung mit Neutralrot wurde zur Behandlung von rezidivierenden Herpes-Erkrankungen vorgeschlagen. Kürzlich wurde diese Behandlungsweise in Frage gestellt, da man feststellte, daß mit Neutralrot inaktivierte Herpes simplex- Viren in der Lage sind, Zellkulturen von Säugetieren zu transformieren. Es scheint jedoch festzustehen, daß die Infektiosität von Herpes simplex-Viren zumindest teilweise von der Existenz einer intakten Virushülle abhängt.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß nicht-ionogene Netzmittel mit einer Äther-, Amid- oder Esterbindung bzw. einer Kombination dieser Bindungen rasch die Infektiosität von Herpes simplex-Viren herabsetzen. Es ist anzunehmen, daß sie dabei die virale Lipidhülle beschädigen oder zerstören. Dieser Mechanismus findet in der cytotoxischen Wirkung von nicht- ionogenen Netzmitteln gegen Herpes simplex-Viren seine Stütze. Die Behandlung von Kaninchennierenzellen mit grenzflächenaktiven Mitteln in cytotoxischen Verdünnungen bewirkt eine Zerstörung der Lipoprotein-Plasmamembran, so daß nur freie Zellkerne auftreten. Da man annimmt, daß die Hüllen und Plasmamembranen von Herpes simplex-Viren in ihrer Struktur und Zusammensetzung ähnlich sind, kann man auch davon ausgehen, daß die Zerstörung der Virushülle auf ähnliche Weise wie die Zerstörung der Zellmembran vor sich geht. Die Behandlung von Herpes simplex-Virusinfektionen durch nicht-ionogene Netzmittel hat den Vorteil, daß die Viren rasch nach einem Mechanismus inaktiviert werden, bei dem das Genom der Viren nicht beteiligt ist.

Zur lokalen Behandlung von Herpes simplex-Virurs-Erkrankungen werden ein bzw. mehrere nicht-ionogene Netzmittel zusammen mit einem pharmakologisch verträglichen, nicht entzündend wirkenden Träger konfektioniert. Es können beispielsweise Lotions, Cremes, Öle oder Emulsionen hergestellt werden. Als Träger eignen sich beispielsweise Polyäthylenglykol, Paraffinöl, Paraffingelee und Propylenglykol. Die konfektionierten Arzneimittel werden sodann lokal auf die infizierte Stelle aufgebracht. Die Behandlung wird so lange fortgesetzt, bis die erkrankte Stelle abgeheilt ist. Die Menge an nicht-ionogenem Netzmittel im Arzneimittel beträgt im allgemeinen 0,5 bis 20, vorzugsweise 1 bis 5 Gewichtsprozent. Im folgenden werden Beispiele für Rezepturen von Arzneimitteln zur lokalen Anwendung angegeben.

Lotion

Propylenglykol24,75 ml Triäthanolamin 1,00 ml Wasser 7,00 ml Ölsäure 1,50 g Polyäthylenglykolmonostearat10,50 g Siliconöl10,00 ml 2%ige wäßrige Lösung eines Acrylsäure-Polymerisats50,00 ml

Creme

weißes Paraffingelee41,00 g mikrokristallines Paraffinwachs 3,00 g flüssiges Lanolin10,00 g Sorbitanmonooleat 4,75 g Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonooleat 0,25 g gereinigtes Wasser41,00 g

Creme

Walrat 7,5 g gelbliches Bienenwachs12,0 g Paraffinöl56,0 g Natriumborat 0,5 g Sorbitanmonooleat 5,0 g gereinigtes Wasser19,0 g

Herstellung von Kaninchennieren-Kulturen

Corticale Zellen von Kaninchennieren werden durch Trypsinierung aus entwöhnten Kaninchen (21 bis 28 Tage alt) hergestellt. Die dispergierten Zellen werden in Eagle-Basal-Medium (BME), das Earl-Salze enthält und mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS), 10 Prozent Tryptosephosphatbrühe sowie 100 Einheiten Penicillin und 100 µg Streptomycin pro ml versetzt ist, suspendiert. Einschichtige Zellkulturen werden in 75-cm²-Gewebekulturflaschen (T-75) aus Kunststoff zur Herstellung von Virusmaterial und in 60×15 mm-Petrischalen aus Kunststoff zur Virusbestimmung hergestellt. Die Kulturen werden in einer befeuchteten Atmosphäre in Luft mit 5 Prozent CO₂ bei 35°C gezüchtet.

Viruswachstum

Konfluente, einschichtige Zellkulturen von Kaninchennierenzellen, die in T-75-Flaschen gezüchtet sind, werden mit etwa 10⁶ Plaque- bildenden Einheiten (PFU) von HSV infiziert. Wenn sich 75 Prozent der Zellen als zytopathologisch erweisen, werden die Viren durch Abschaben der einschichtigen Zellkulturen mit einem Gummiwischer geerntet. Sodann werden die Zellen zweimal in einem Äthanol- Trockeneisbad eingefroren und wieder aufgetaut. Zur Sedimentation der Zellbruchstücke wird 5 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Das Virusmaterial wird in Mengen von jeweils 1 ml in eingefrorenem Zustand bei -70°C aufbewahrt.

Virustitrationen

Konfluente einschichtige Zellkulturen von Kaninchennierenzellen in 60-mm-Petrischalen aus Kunststoff werden zur Bestimmung der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Volumeneinheit des Virusmaterials verwendet. Es werden 10fache Serienverdünnungen des Virus in Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan (Tris)-Puffer vom pH-Wert 7,4 hergestellt. Jeweils 0,5 ml der einzelnen Lösungen werden zu doppelten Proben von Kaninchennieren-Kulturen gegeben. Anschließend versetzt man bei Raumtemperatur mit HSV-1 und HSV-2, wobei man durch häufiges Rütteln für eine einheitliche Verteilung des Inoculums sorgt. Nach 1½ Stunden wird das nicht adsorbierte Virus entfernt. Die infizierten Zellen werden mit 5 ml 0,5prozentiger Methylcellulose (4000 cps) in BME, versetzt mit 10 Prozent fötalem Kälberserum überschichtet. Nach einer viertägigen Inkubation bei 35°C wird die Überschichtung entfernt. Die Zellschicht wird 1 bis 2 Minuten einer 0,1prozentigen Lösung von Kristallviolett in Äthanol ausgesetzt. HSV-Plaques werden nach Entfernung des Farbstoffs und Lufttrocknung der Platten als klare Stellen auf einem blauen Hintergrund sichtbar.

Inaktivierung von HSV durch nicht-ionogene Netzmittel

Jeweils 1 ml des Virusmaterials wird mit jeweils 1 ml eines in Tris-Puffer entsprechend verdünnten nicht-ionogenen Netzmittels vermischt. Das Gemisch wird sofort in ein Wasserbad von 37°C eingetaucht und 1 Minute dort stehengelassen. Zur Bestimmung der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Volumeneinheit des behandelten Virusmaterials werden konfluente einschichtige Zellkulturen von Kaninchennierenzellen in 60-mm-Petrischalen aus Kunststoff verwendet. Von dem Gemisch werden 10fache Reihenverdünnungen in Tris-Puffer vom pH-Wert 7,4 hergestellt. Jeweils 0,5 ml der einzelnen Verdünnungen werden zu doppelten Proben von Kaninchennieren-Kulturen gegeben. Man versetzt bei Raumtemperatur mit HSV-1 und HSV-2 und sorgt durch häufiges Rütteln für eine gleichmäßige Verteilung des Inoculums. Nach 1½ Stunden werden nicht adsorbierte Viren entfernt. Die infizierten Zellen werden mit 5 ml einer 0,5prozentigen Methylcellulose (4000 cps) in BME, ergänzt mit 10 Prozent fötalen Kälberserum, überschichtet. Nach viertägiger Inkubation bei 35°C wird die Überschichtung entfernt. Die Zellen werden 1 bis 2 Minuten einer 0,1prozentigen Lösung von Kristallviolett in Äthanol ausgesetzt. Die Abwesenheit oder die Abnahme der Anzahl von Plaques ist ein Anzeichen für die Inaktivierung des Virus.

Die Wirkung von verschiedenen nicht-ionogenen Netzmitteln auf Herpes simplex-Virus geht aus Tabelle I hervor. Die Ergebnisse zeigen, daß nicht-ionogene Netzmittel die Infektiosität von HSV wirksam herabsetzen. Setzt man Kaninchennierenzellen genau 1 Stunde Lösungen der Netzmittel in Verdünnungen von weniger als 1 : 500 aus, so ergibt sich eine Zerstörung der Zellen. Diese Wirkung entspricht der antiviralen Aktivität des Netzmittels. Dies bedeutet, daß die Netzmittel die HSV inaktivieren, in Verdünnungen von weniger als 1 : 500 zytotoxisch sind.

Tabelle I

Inaktivierung von Herpes simplex-Viren durch nicht-ionogene Netzmittel

Claims

Verwendung nicht-ionogener Netzmittel zur lokalen Behandlung von Herpes simplex-Virus-Erkrankungen.