CN114921510A - 珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然产物有效成分提取技术领域,特别涉及珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用。通过采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉复合菌(酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2:3:1的比例混合),充分发挥各个菌种的作用,真菌、细菌生长所产生的酶对白首乌进行分解,从而释放出白首乌组织中的活性成分,同时真菌产生的酶还能分解白首乌粗多糖,降低白首乌粗多糖的分子量,使得发酵后的白首乌利于后续的纯化分离,因此利用本发明提取的白首乌多糖具有提取物纯度高,杂质易分离的特点,而且得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分提取技术领域,特别涉及珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用。
背景技术
白首乌来源于萝藦科鹅绒藤属植物戟叶牛皮消Cynanchum bungei Decne.的干燥块根,具有补肝肾、强筋骨、益精血、乌须发的功效,是一种传统的滋补类药材。古籍记载,白首乌用于晚唐,盛行于早明,沿用至今。因其补肾益肝、乌发生发、养血益精、抗衰老之功效,被历代名家视为摄生防老珍品。白首乌含有 C21甾苷类、多糖类、苯乙酮类等活性成分,这些成分与其抗肿瘤、保肝护肝、抗氧化 以及免疫调节等药理活性密切相关。
白首乌多用于保健品行业,针对白首乌活性成分的研究报道主要为C21甾苷类、苯乙酮类等,但对白首乌多糖却报道甚少。多糖作为生物体内重要的活性物质,在控制机体细胞生长、***和维持生命个体的正常生理机能等方面具有重要作用。白首乌多糖具有降血脂功能,对酒精性肝损伤有保护作用。
白首乌多糖提取以传统的水提醇沉法为主,随着研究的深入,现多在水提醇沉的基础上多辅以超声和微波技术,通过优化料水比、提取温度及时间来提高白首乌多糖提取率,但此类方法提取周期长,提取量少且水提过程中温度过高会破坏多糖的结构。
发明内容
针对现阶段白首乌多糖提取存在的问题,本发明提供一种新的白首乌多糖的提取方法,通过采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉复合菌,充分发挥各个菌种的作用,真菌、细菌生长所产生的酶对白首乌进行分解,从而释放出白首乌组织中的活性成分,同时真菌产生的酶还能分解白首乌粗多糖,降低白首乌粗多糖的分子量,使得发酵后的白首乌利于后续的纯化分离,因此利用本发明提取的白首乌多糖具有提取物纯度高,杂质易分离的特点,而且得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。
本发明的技术方案如下:
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用,采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉混合发酵白首乌,发酵液纯化脱色后得到白首乌多糖。
优选地,所述酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合。
优选地,具体过程包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,将酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌按比例接种于液体培养基中,摇床培养后得到含纤维素酶、淀粉酶的复合菌培养液;
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱烘干,用高速粉碎机粉碎,得到白首乌粉末;
(3)将步骤(2)的白首乌粉末加入水中,用胶体磨处理后加入到高压均质机中均质处理,离心喷雾干燥,灭菌后得到白首乌细粉;
(4)将步骤(3)制得的均质液投入步骤(1)制备的复合菌培养液中,充分搅拌,供氧发酵,继续培养得到发酵液;离心获得上清液;
(5)步骤(4)的上清液加脱色活性炭,静置吸附,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)步骤(5)的滤液中加入Sevage试剂,混合后充分振荡,离心,取上清液;
(7)将步骤(6)的上清液与乙醇混合,充分搅拌至产生沉淀,静置,离心后获得沉淀物,乙醇洗涤,真空干燥后得到白首乌多糖。
优选地,步骤(1)所述的液体培养基,按照质量百分比为:羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水;酵母菌的体积为培养基体积的1-10%;摇床培养的温度为26-30℃,转速160r/min,摇床培养时间为12h。
优选地,所述步骤(3)中,白首乌粉末与水的重量比为1:7;均质处理过程中,压力为25Mpa,处理时间为10-20min;喷雾干燥的温度为150-200℃。
优选地,所述步骤(4)中,在发酵罐中加入均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)的白首乌粉末质量5-10倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至5.5-6.5,充分搅拌,发酵温度为25-35℃,供氧发酵,氧浓度控制在0.020-0.040mol/L,继续培养24-72h得到发酵液。
优选地,所述步骤(5)中,向上清液中加入上清液质量5-8%的脱色活性炭,静置吸附1h以上。
优选地,所述步骤(6)中,将滤液与Sevage试剂按照体积比4-6:1进行混合,混合后充分振荡,离心,取上清液。
优选地,所述步骤(7)中,将步骤(6)获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:1-3进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置12-48h,离心,获得沉淀物,将沉淀物用乙醇洗涤3次,真空干燥,得到白首乌多糖。
菌种保藏信息
保藏时间:2017年6月1日;
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;
保藏编号:CGMCC No . 14129;
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101;
分类命名:Penicilliopsis clavariaeformis。
本发明的有益效果
本发明主要通过真菌及细菌发酵白首乌,再通过分离纯化得到白首乌多糖,发酵过程中真菌、细菌生长所产生的酶对白首乌进行分解,从而释放出白首乌组织中的活性成分,同时真菌产生的酶还能分解白首乌粗多糖,降低白首乌粗多糖的分子量,使得发酵后的白首乌利于后续的纯化分离,因此利用本发明提取的白首乌多糖具有提取物纯度高,杂质易分离的特点,而且得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。
本发明在发酵之前对白首乌粉末进行了高压均匀处理,该操作有利于白首乌多糖从白首乌中分离出来,能进一步提高本发明的得率。
珊瑚拟霉菌菌丝体中的多糖具有显著地还原力和清除自由基的能力,能够显著提高抗氧化酶活性;促进其他菌类成长的同时,提升白首乌多糖的得率。
附图说明
图1为不同体积复合菌对白首乌多糖提取率的影响图;
图2为不同体积复合菌培养液与粉末配比对白首乌多糖提取率的影响图;
图3为供氧发酵时不同氧浓度对白首乌多糖提取率的影响图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明,在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明,但并不作为对本发明的限定。
实施例1
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用,包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水,酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中,酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的5%,摇床培养12h,培养的温度为27℃,转速160r/min。
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱中50℃烘干20h,用高速粉碎机粉碎,过80目筛,得到白首乌粉末;
(3)将白首乌粉末加入水中,白首乌粉末与水的重量比为1:7,用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min,压力为25Mpa;得到均质液;
(4)在发酵罐中加入步骤(3)的均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5,充分搅拌10min,发酵温度为26℃,供氧发酵,氧浓度控制在0 .020mol/L继续培养68h得到发酵液;将发酵液3500r/min离心15min获得上清液;
(5)加入上清液质量6%的脱色活性炭,静置吸附1h,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合,混合后充分振荡30min,3000r/min离心10min,取上清液。
(7)将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:2进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置24h,3000r/min离心12min,获得沉淀物,将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次,60℃下真空干燥24h,得到白首乌多糖。
实施例2
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用,包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水,酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中,酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的7%,摇床培养12h,培养的温度为30℃,转速160r/min。
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱中55℃烘干20h,用高速粉碎机粉碎,过80目筛,得到白首乌粉末;
(3)将白首乌粉末加入水中,白首乌粉末与水的重量比为1:7,用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min,压力为25Mpa,得到均质液;
(4)在发酵罐中加入均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5,充分搅拌10min,发酵温度为28℃,供氧发酵,氧浓度控制在0.020mol/L,继续培养60h得到发酵液;将获得的发酵液4000r/min离心15min获得上清液;
(5)加入上清液质量6%的脱色活性炭,静置吸附1h,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合,混合后充分振荡30min,3000r/min离心10min,取上清液。
(7)将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:2进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置20h,3000r/min离心10min,获得沉淀物,将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次,60℃下真空干燥24h,得到白首乌多糖。
实施例3
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用,包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水,酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中,酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的6%,摇床培养12h,培养的温度为27℃,转速160r/min。
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱中57℃烘干20h,用高速粉碎机粉碎,过80目筛,得到白首乌粉末;
(3)将白首乌粉末加入水中,白首乌粉末与水的重量比为1:7,用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min,压力为25Mpa,得到均质液;
(4)在发酵罐中加入均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5,充分搅拌10min,发酵温度为30℃,供氧发酵,氧浓度控制在0.020mol/L继续培养55h得到发酵液;将获得的发酵液3200r/min离心15min获得上清液;
(5)加入上清液质量7%的脱色活性炭,静置吸附1h,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)将滤液与Sevage试剂按照体积比5:1进行混合,混合后充分振荡30min,3000r/min离心10min,取上清液。
(7)将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:1进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置32h,3000r/min离心15min,获得沉淀物,将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次,60℃下真空干燥24h,得到白首乌多糖。
实施例4
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用,包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水,酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中,酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的9%,摇床培养12h,培养的温度为26℃,转速160r/min。
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱中60℃烘干20h,用高速粉碎机粉碎,过80目筛,得到白首乌粉末;
(3)将白首乌粉末加入水中,白首乌粉末与水的重量比为1:7,用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min,压力为25Mpa,得到均质液;
(4)在发酵罐中加入均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5,充分搅拌10min,发酵温度为33℃,供氧发酵,氧浓度控制在0.020mol/L继续培养40h得到发酵液;将获得的发酵液5000r/min离心15min获得上清液;
(5)加入上清液质量7%的脱色活性炭,静置吸附1h,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合,混合后充分振荡30min,3000r/min离心10min,取上清液。
(7)将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:3进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置20h,3000r/min离心15min,获得沉淀物,将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次,60℃下真空干燥24h,得到白首乌多糖。
对比例1 与实施例4工艺相同,不加入珊瑚拟青霉
白首乌多糖提取方法,包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水,酵母菌、枯草芽孢杆菌与按2: 3的比例混合接种于培养基中,酵母菌及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的9%,摇床培养12h,培养的温度为26℃,转速160r/min。
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱中60℃烘干20h,用高速粉碎机粉碎,过80目筛,得到白首乌粉末;
(3)将白首乌粉末加入水中,白首乌粉末与水的重量比为1:7,用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min,压力为25Mpa,得到均质液;
(4)在发酵罐中加入均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5,充分搅拌10min,发酵温度为33℃,供氧发酵,氧浓度控制在0.020mol/L继续培养40h得到发酵液;将获得的发酵液5000r/min离心15min获得上清液;
(5)加入上清液质量7%的脱色活性炭,静置吸附1h,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合,混合后充分振荡30min,3000r/min离心10min,取上清液。
(7)将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:3进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置20h,3000r/min离心15min,获得沉淀物,将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次,60℃下真空干燥24h,得到白首乌多糖。
与实施例4相比,对比例1得到白首乌多糖的得率少30%。
对比例2
烟曲霉在白首乌多糖提取上的应用,包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水,酵母菌、枯草芽孢杆菌与烟曲霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中,酵母菌、烟曲霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的9%,摇床培养12h,培养的温度为26℃,转速160r/min。
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱中60℃烘干20h,用高速粉碎机粉碎,过80目筛,得到白首乌粉末;
(3)将白首乌粉末加入水中,白首乌粉末与水的重量比为1:7,用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min,压力为25Mpa得到均质液;
(4)在发酵罐中加入均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5,充分搅拌10min,发酵温度为33℃,供氧发酵,氧浓度控制在0.020mol/L继续培养40h得到发酵液;将获得的发酵液5000r/min离心15min获得上清液;
(5)加入上清液质量7%的脱色活性炭,静置吸附1h,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合,混合后充分振荡30min,3000r/min离心10min,取上清液。
(7)将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:3进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置20h,3000r/min离心15min,获得沉淀物,将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次,60℃下真空干燥24h,得到白首乌多糖。
与实施例4相比,对比例1得到白首乌多糖的得率少40%。
Claims (9)
1.珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用,其特征在于,采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉混合发酵白首乌,发酵液纯化脱色后得到白首乌多糖。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合。
3.根据权利要求1所述得应用,其特征在于,具体过程包括以下步骤:
(1)在无菌条件下,取适量液体培养基,将酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌按比例接种于液体培养基中,摇床培养后得到含纤维素酶、淀粉酶的复合菌培养液;
(2)将新鲜白首乌切片,置于烘箱烘干,用高速粉碎机粉碎,得到白首乌粉末;
(3)将步骤(2)的白首乌粉末加入水中,用胶体磨处理后加入到高压均质机中均质处理;
(4)将步骤(3)制得的均质液投入步骤(1)制备的复合菌培养液中,充分搅拌,供氧发酵,继续培养得到发酵液;离心获得上清液;
(5)步骤(4)的上清液加脱色活性炭,静置吸附,真空抽滤去渣,得滤液;
(6)步骤(5)的滤液中加入Sevage试剂,混合后充分振荡,离心,取上清液;
(7)将步骤(6)的上清液与乙醇混合,充分搅拌至产生沉淀,静置,离心后获得沉淀物,乙醇洗涤,真空干燥后得到白首乌多糖。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(1)所述的液体培养基,按照质量百分比为:羧甲基纤维素20%,葡萄糖2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,其余为水;酵母菌的体积为培养基体积的1-10%;摇床培养的温度为26-30℃,转速160r/min,摇床培养时间为12h。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中,白首乌粉末与水的重量比为1:7;均质处理过程中,压力为25Mpa,处理时间为10-20min;喷雾干燥的温度为150-200℃。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中,在发酵罐中加入均质液并注入步骤(1)制备的复合菌培养液,量取步骤(2)白首乌粉末质量5-10倍的复合菌培养液加入发酵罐中,加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至5.5-6.5,充分搅拌,发酵温度为25-35℃,供氧发酵,氧浓度控制在0.020-0.040mol/L,继续培养24-72h得到发酵液。
7.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(5)中,向上清液中加入上清液质量5-8%的脱色活性炭,静置吸附1h以上。
8.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(6)中,将滤液与Sevage试剂按照体积比4-6:1进行混合,混合后充分振荡,离心,取上清液。
9.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(7)中,将步骤(6)获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:1-3进行混合,充分搅拌至产生沉淀,静置,离心,获得沉淀物,将沉淀物用乙醇洗涤,真空干燥,得到白首乌多糖。
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