DE1617659C3 - Interferonbildendes Arzneimittel und dessen Verwendung - Google Patents

Description

Interferone sind Proteine mit relativ niedrigem Molekulargewicht, die durch Zellen erzeugt werden. Es ist bekannt, daß diese Erzeugung durch Viren, bestimmte andere mikrobielle Mittel und durch einige Substanzen verschiedenen Ursprungs stimuliert wird. Die Interferone verleihen nicht infizierten Zellen während längerer Zeitspannen eine Beständigkeit gegen Vireninfektionen, sofern die Zellen vor der Einwirkung der Viren mit den Interferonen versehen werden. Die Interferone besitzen ein breites Spektrum gegenüber Virenarten, sie sind jedoch relativ Wirtsarten-spezifisch.

Es wurde mehrfach versucht, die Interferonbildung im Organismus anzuregen. In der FR-PS 4 269 M wird die therapeutische Verwendung von Nukleinsäuren gegen Viruserkrankungen des Respirationstrakts beschrieben. Beispielsweise wird eine Nukleinsäurelösung aus Hefe intranasal appliziert, um die Widerstandsfähigkeit gegenüber einem den Respirationstrakt angreifenden Virus zu erhöhen. Dabei erwies es sich, daß sehr hohe und häufige Dosierungen notwendig waren und die Sterblichkeitsraten sehr hoch lagen. In der GB-PS 10 46 770 werden therapeutische Zusammensetzungen, die ein Mycelmaterial enthalten, beschrieben. Dieses Mycelmaterial erhält man durch Bruch der Zellwandungen von Schimmelpilzen oder schimmelpilzartigen Bakterien. Auch hier sind hohe Dosierungen von 4 bis 10 g täglich zur Behandlung chronischer Mononukteosis notwendig. Nach Interferons, North-Holland, Pub. & Co. Amsterdam 1966, Seite 256 wurden an Mäuse Hefenukleinsäuren internasal in Dosierungen von 3 mg an 4 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, worauf mit Influenza-Virus infiziert wurde. Hierdurch wurde ein Schutz erzielt, jedoch bereits ein Sechstel dieser Konzentration ergab keinen direkten Einfluß auf den Influenza-Virus.

Die angewendeten hohen Dosierungen sind jedoch von geringer praktischer Bedeutung, da die hochviskosen Lösungen zu Asphyxie-Erscheinungen führen. Auch ist es nicht klar, ob überhaupt Interferone gebildet werden. In Proc. Soc. Exper. Biol. Med. Bd. 119 (1965), S. 9—12 werden Gemische von Mononukleotiden beschrieben, die eine vaccinöse Virusfleckenbildung bewirken sollen. Hierfür scheint jedoch keine Interferonbildung verantwortlich zu sein. Überraschenderweise hat es sich nunmehr gezeigt, daß aus bestimmten Homopolynukleotid-Einzelsträngen im Molverhältnis 1 :1 aufgebaute Polynucleotide, auf die sich in der genannten Literatur kein Hinweis entnehmen läßt, bei geringen Dosierungen eine wirksame Virenbekämpfung ermöglichen.

Die Erfindung betrifft daher den in den Ansprüchen beschriebenen Gegenstand.

Das erfindungsgemäße interferonbildende Arzneimittel weist neben der praxisbezogenen Dosierungsmöglichkeit zudem den Vorteil auf, daß es synthetisch erzielbare Produkte enthält.

ίο Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als induzierende Verbindungen für die Interferonerzeugung entweder in vivo oder in vitro eingesetzt werden. Ihr hauptsächlicher Verwendungszweck besteht in ihrer Einspritzung in einen tierischen oder menschlichen

i") Körper, so daß in vivo Interferon in großen Mengen gebildet wird und den Wirtskörper gegen eine Infektion durch eine Vielzahl von Viren schützt. Sie sind auch als Zugabe zu einem Kulturmedium, das lebende tierische oder menschliche Zellen enthält, geeignet, um die

2(i Bildung von Interferon in großen Mengen zu induzieren, so daß das Interferon abgetrennt und Tieren oder Menschen zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektion, die durch Viren erzeugt werden, eingespritzt werden kann.

_>j Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Arzneimittel hängt von ihrem hohen Reinheitsgrad, d. h. daß sie im wesentlichen frei von inhibierend wirkendem Protein und/oder anderen inhibierend wirkenden Substanzen sind, und von der Komplexbildung aus der Polyinosin-

i(i säure und der Polycytidylsäure im Molverhältnis 1 :1 ab. Ribonucleoproteine sowie andere einzelfaserige Polynucleotide haben sich als inaktiv erwiesen.

Die im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaltenen Polynucleotide werden durch Komplexbildung erhalten.

jj Man erhält die Komplexe beim Vermischen der zwei anspruchsgemäßen Homopolynucleotide, die selbst synthetisch und im Handel erhältlich sind und nach bekannten Methoden hergestellt werden können. Die Homopolynucleotide können auch Homooligonucleotide sein. Dies bedeutet, daß sie 2 bis tausende von Nucleotideinheiten aufweisen können. Sie werden durch enzymatische Behandlung entsprechender Nucleotiddiphosphate oder -triphosphate in vitro gebildet, wobei die Zahl der Nucleotideinheiten nicht mit Genauigkeit festgestellt werden kann.

Es ist bekannt, daß beim Vermischen bestimmter Homopolynucleotide in einer wäßrigen Lösung ein komplexes Polynucleotid gebildet wird, das sich durch verschiedene physikalische Tests identifizieren läßt und von den beiden Homopolynucleotiden, aus welchen das komplexe Polynucleotid gebildet wird, verschieden ist. Das Verhältnis, in welchem die zwei Homopolynucleotide vermischt werden, ist normalerweise im Hinblick auf das Verhältnis der zwei in den Komplex eingearbeiteten Homopolynucleotide nicht bestimmend. Eine Mischung aus einem Molverhältnis von 1 :1 kann ein Polynucleotid zur Folge haben, das die zwei stickstoffhaltigen Basen in einem Verhältnis von 1:1,1:2 und/oder 2 :1 oder in einem anderen Verhältnis kleiner ganzer Zahlen enthält, d. h., daß das erhaltene Verhältnis keine Funktion des Verhältnisses ist, in welchem die

■ Komponenten vermischt werden, sondern in gewissem Maße durch die natürliche Neigung zur Vereinigung bestimmt wird, welche den jeweils verwendeten Homopolynucleotiden zu eigen ist.

Die Polynucleotide, welche erfindungsgemäß als Interferon induzierende Substanzen verwendet werden, können beispielsweise durch Vermischen der zwei

voneinander verschiedenen Homopolynucleotide in einem Molverhältnis von 1 :1 im Hinblick auf ihre Basen bei Umgebungstemperatur in einem wäßrigen Puffersystem, das einen breiten pH-Bereich aufweist, d. h., daß der pH-Bereich zwischen ungefähr 5,0 und 10,0 liegt, wobei sich die Ionenstärke zwischen ungefähr 0,001 und 1,0 bewegt, hergestellt werden. Puffersysteme, die sich als geeignet erwiesen haben, sind 0,006 m Natriumphosphat in einer 0,85%igen Natriumchloridlösung und 0,01 m Glycylglycin in 0,59%igem Natriumchlorid. Es kann jeder nicht-toxische Puffer verwendet werden. Es braucht auch überhaupt kein Puffer eingesetzt zu werden, da es sich herausgestellt hat, daß die Pufferkapazität des physiologischen Systems des Tieres, welchem die Mischung aus den Homopolynu- i^r> cleotiden verabreicht wird, dazu ausreicht, um die gewünschte Komplexbildung nach der Verabreichung zu begünstigen und die gleiche Induzierung der Erzeugung von Interferon sowie den Schutz gegenüber einer Virusinfektion zu schaffen, wie dies dann der Fall ist, wenn die zwei Homopolynucleotide vorher zu einem Komplex verarbeitet werden.

Eine andere Methode zur Herstellung der komplexen Polynucleotide, welche angewendet werden kann, besteht darin, eine Mischung aus zwei entsprechenden 2^r> Nucleotiddiphosphaten in einem Phosphatpuffer mit einem pH von ungefähr 7 mit der entsprechenden Nucleinsäurepolymerase zu behandeln. Eine derartige Behandlung hat eine Polymerisation der zwei Monomeren zu zwei Homopolynucleotiden unter gleichzeitiger Bildung des Polynucleotide zur Folge.

Die in vitro gebildeten Polynucleotide können durch eine hypochrome Verschiebung im UV-Absorptionsspektrum, durch Rohrzucker-Dichtegradient-Fraktionierung, Chromatographie sowie die Fähigkeit, die Erzeugung von Interferon zu induzieren, eine Eigenschaft, die keiner der Homopolynucleotide zu eigen ist, aus welchen der Komplex gebildet wird, charakterisiert werden. Die Erzeugung von Interferon dient hauptsächlich zur Charakterisierung der Polynucleotide, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden, da physikalische Methoden oft eine ausreichende Empfindlichkeit vermissen lassen.

Die Herstellung von Interferon durch Verabreichung der komplexen Polymerisate geht aus dem Schutz von Wirtstieren sowie von Zellkulturen gegen einen Virus-Angriff hervor. Das auf diese Weise erzeugte Interferon kann ferner durch die Isolierung des induzierten Interferons nach bekannten Methoden sowie die anschließende in vitro-Bestimmung von ¹JO dessen Viren-inhibierenden Eigenschaften charakterisiert werden. Außerdem kommt eine Charakterisierung durch Bestimmung der Wirtsspezifität, der Trypsinempfindlichkeit, des isoelektrischen Punktes sowie des Molekulargewichtes in Frage. r>

Die Induzierung der Interferonbildung in vivo und/oder die Induzierung der Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion durch Viren wird durch Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels an ein Wirtstier, wie beispielsweise ein Kaninchen oder w) eine Maus erzielt. Die Verabreichung kann auf parenteralem oder durch die Hautoberfläche, insbesondere durch Aufbringung auf eine Mukosamembran, wie beispielsweise eine Verabreichung auf intranasalem Wege, durchgeführt werden, wobei die wirksame Dosis b^r> von der Wirtsart und in gewissem Ausmaß von dem Virus abhängt, gegen welchen man Schutz sucht. Bei Mäusen liegt die Schwellwertsdosis bei ungefähr

50

r>

40

45 0,5 mg/kg, während sie bei Kaninchen ungefähr 0,05 μg/kg beträgt. Bei diesen Dosen treten keine offensichtliche Zeichen einer Toxizität auf, auch nicht an der Einspritzstelle. Außerdem zeigt das Tier Anzeichen von Wohlbefinden. Die Wirksamkeit der Arzneimittel im Hinblick auf die Interferonbildung in dem Wirtstier kann auch durch parenterale Verabreichung des Arzneimittels an ein Tier, wobei nach ungefähr 1 bis 5 Stunden Blutproben entnommen werden, bestimmt werden.

Das Serum wird von den geronnenen Blutproben abgetrennt, sterilisiert und bei verschiedenen Verdünnungen in Kulturgläsern, die Zellen der gleichen Tierart wie die für den Wirt verwendeten enthalten, titriert. Nach einer Inkubation bei 35°C während ungefähr 18 bis 24 Stunden werden die Zellkulturen einem Immunitätstest unter Verwendung einer der bekannten cytopaten Viren unterzogen und erneut ungefähr 3 Tage lang bei 35° C inkubiert. Die Kulturen werden dann auf cytopatische Wirkungen untersucht. Außerdem wird der Interferontiter als reziproker Wert der Verdünnung, bei welcher 50% der Gefäße keine cytopatischen Wirkungen zeigen, bestimmt.

Die nach der vorstehend beschriebenen Methode erzeugten Interferone sind spezifisch für bestimmte Arten, wie ein Fleckverminderungs-Interferontest zeigt, welcher darin besteht, daß ein Aliquot des Interferonenthaltenden Serums mit einzelnen Zellkulturen verschiedener Arten inkubiert wird, wobei ein Immunitätstest mit einem Virus, beispielsweise mit einem vesikularem Stomatitisvirus oder einem anderen bekannten cytopathogenen Virus durchgeführt wird und zur Virusfleckenbildung inkubiert wird. Die Anzahl der Flecken auf mit Interferon behandelten Kulturen wird mit der Anzahl Flecken nichtbehandelter, mit Viren infizierter Vergleichskulturen verglichen. Bei derartigen Tests ist zu ersehen, daß die Interferonaktivität nur in den Fällen auftritt, in welchen die Zellkulturen von der gleichen Tierart abstammen, von welcher das Interferon-enthaltende Serum isoliert worden ist.

Die so induzierten Interferone sind, wie ein Fleckenverminderungs-Interferontest zeigt, trypsinempfindlich, d. h. daß die Interferonaktivität durch Behandlung mit Trypsin zerstört wird.

Das in der vorstehend beschriebenen Weise induzierte Interferon wird ferner nach bekannten Methoden durch seinen isoelektrischen Punkt sowie durch sein Molekulargewicht charakterisiert.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auf parenteralem, beispielsweise subkutanem, intradermalem, intraperitonealem, intravenösem oder intramuskulärem, oder auf topischem Wege verabreicht werden, und zwar vorzugsweise auf eine Mukosamembran, wie beispielsweise bei der Verabreichung auf intranasalem Wege.

Beispiel 1

A) Herstellung des Komplexes aus Polyinosinsäure
und Polycytidylsäure.» PoIy-(I: C)«

Eine Lösung aus Polyinosinsäure (I), die 550 μg/mI eines Puffers, der aus 0,01 m Glycylglycin und 0,1 m Natriumchlorid besteht, enthält, wird hergestellt. Eine Lösung aus Polycytidylsäure (C), welche 500 μ^/ΐηΐ des gleichen Puffers enthält, wird außerdem zubereitet. Die Lösungen aus Polyinosinsäure und Polycytidylsäure werden anschließend vermischt, wobei ein Molverhältnis von 1 :1 bezüglich der Basen eingehalten wird. Die

erhaltene Lösung wird direkt als Quelle für die komplexen Polynucleotide [»Poly-(1 : C)«] verwendet.

B) Physikalische und chemische Eigenschaften des
I :C-Komplex-Polynucleotids

Oben wurde bereits auf die hypochrome Verschiebung in dem UV-Spektrum hingewiesen, die dann auftritt, wenn das komplexe Polynucleotid aus seinen Monomeren gebildet wird. Andere Beweise für die I :C-Bildung sowie die Verhinderung der Komplexbildung wurden ermittelt. Daß I- und C-Polymerisate leicht Komplexe bilden, geht aus einer merklichen hypochromen Wirkung hervor, sofern man den Komplex mit einer Mischung aus Poly-1 und PoIy-C, die an einer Komplexbildung verhindert wird, vergleicht. Wird beispielsweise PoIy-C mit 0,4% Formaldehyd behandelt, so daß es keinen Komplex bilden kann, und anschließend mit Poly-1 vermischt, dann wird ein UV-Absorptionsspektrum erhalten, welches aus der Summe der Spektren von Poly-1 und PoIy-C in nichtkomplexem Zustand besteht. Eine ähnliche Lösung der 1 :C-Komplexpolymerisate zeigt eine merkliche Abnahme der optischen Dichte in der Lösung in dem 240 bis 260 ηιμ-Bereich. Die Aminogruppen von C werden vor der Behandlung mit 0,4% Formaldehyd (C-HCHO) gebunden, so daß die vermischten Polynucleotide nicht langer in der Lage sind, Wasserstoff zu binden und ein UV-Absorptionsspektrum ergeben, welches der Summe der einzelnen Absorptionen der zwei Polynucleotide gleich ist, während 26 μg Poly-1 : C in einfacher Weise Interferon in Kaninchen induzieren, tritt bei Verwendung von 26 μg einer Poly-1 + C—HCHO-Lösung keine Induzierung von Interferon auf.

Die Bestimmung von C wird unter Verwendung von 0,1 m Natriumnitrat bei einem pH von 4,0 während einer Zeitspanne von 1 h bei O⁰C durchgeführt. Überschüssige salpetrige Säure wird durch Zugabe von Harnstoff beseitigt, während Produkte mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse entfernt werden. Die Mischung aus Poly-1 + desaminiertem PoIy-C ist in einer Menge von 26 μg hinsichtlich einer Induzierung von Interferon unwirksam.

Eine Vorbehandlung des C (50 μg/ml) mit Rinderpankreas-RNase (1 μg/ml) während einer Zeitspanne von 4 h bei 25° C bewirkt einen Abbau des PoIy-C zu kürzeren Kettenlängen, wie aus einem Ansteigen der optischen Dichte während der Inkubierung hervorgeht. Das RNase-abgebaute PoIy-C tritt nicht mit I in Wechselwirkung, wie aus dem Fehlen einer Hypochromizität hervorgeht. 26 μg der Lösung sind als Interferon-induzierendes Mittel unwirksam.

Die Existenz des I : C-Komplexes geht aus dem Abbau durch RNase hervor. Um diese Tatsache zu untermauern, wird Poly-1 : C in einer Konzentration von 40μg/ml in einer Quarz-Küvette bei 25°C mit Rinderpankreas-RNase (0,4 μ§/πι1) bei einem pH von 7,0 inkubiert, wobei der auftretende Abbau des Komplexes durch Messen der Änderung der optischen Dichte mit einem Aufzeichnungs-Spektrophotometer, der mit einer regulierbaren Erhitzungskammer versehen ist, verfolgt wird. Ein merkliches Ansteigen der optischen Dichte, insbesondere in dem Bereich zwischen 220 und 260 πιμ, zeigt, daß Poly-1 : C durch RNase abgebaut wird. Unter den gleichen Bedingungen wird eine doppelfaserige RNS aus Reovirus Virionen (Typ 3) nicht in merklicher Weise beeinflußt. Das durch RNase abgebaute Poly-1 : C besitzt eine verminderte Fähigkeit, Interferon in Kaninchen zu induzieren.

Die Existenz des I: C-Komplexes geht ferner aus seiner pH-Empfindlichkeit hervor. Um dies zu zeigen, werden Poly-1 (27,5 μ^/πιΐ), Pol -C (24,0 μg/ml) und Poly-1: C (52,5 μg/ml) in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung mit einem pH von 7,0 mit steigenden Mengen Akali titriert. Eine Erhöhung der Alkalinität von einem pH von 7 auf einen pH von 10,8 zeigt, daß eine abrupte hyperchrome Wirkung bei einem pH von 9,5 bis 10,0 bei Poly-1 :C, jedoch nicht bei Poly-1 und

ίο PoIy-C allein auftritt. Im Gegensatz zu dem Absorptionsspektrum bei einem neutralen pH ist das Absorptionsspektrum der Lösung aus Poly-1 und PoIy-C bei einem pH von 10,8 mit dem Spektrum identisch, welches aus dem nicht-komplex-gebundenen Poly-1 und PoIy-C bei einem pH von 10,8 errechnet wird. Bei einem pH von 9,5 bis 10,0 unterliegt das Poly-1 : C einer Dissoziation unter Bildung einer Lösung aus nicht-komplex gebundenem Poly-1 und PoIy-C.

Mischungen aus Poly-1 und aus PoIy-C mit den gleichen Konzentrationen, jedoch einem pH von 7,5 und 10,8 werden im Hinblick auf die Interferon-Induzierung in Kaninchen titriert. Das Material liefert bei einem pH von 7,5 eine Interferon-Induzierung von 0,33 μg, während das auf einem pH von 10,8 gehaltene Material 1,31 μ§ benötigt, um in dem Kaninchen eine Induzierung zu erzeugen. Diese Tatsache kann dahingehend interpretiert werden, daß eine Komplexbildung aus Poly-1 und PoIy-C in der Umgebung des Kaninchenblutstromes stattfindet, jedoch nur bis zu einem geringeren

Ji) Ausmaß als dies der Fall ist, wenn die zwei Substanzen bei einem optimalen pH vorvermischt werden. Diese Interpretierung findet ihre Stütze in dem Beweis, daß Poly-1 und PoIy-C in nicht feststellbarer Form in destilliertem Wasser einen Komplex bilden. Noch 26 μg

r> der gemischten Polynucleotide in destilliertem Wasser induzieren Interferon in Kaninchen, so daß der Schluß naheliegt, daß in dem Kaninchenblut eine Komplexbildung stattfindet.

₄₍₎ C) Induzierung von Interferon in Kaninchen

Das vorstehend beschriebene Polynucleotid wird getrennt in Form von 0,5-ml-Aliquots an 2,0 bis 2,3 kg schwere Kaninchen durch intravenöse Einspritzung verabreicht. Nach ungefähr 2 h werden von jedem Kaninchen durch Herzpunktur Blutproben entnommen. Das Serum wird aus jeder der geronnenen Blutproben abgetrennt und getrennt durch Bestrahlung mit UV-Licht sterilisiert. Aliquots dieser sterilisierten Proben werden für die folgenden Tests verwendet.

D) Bestimmung der Interferontiter

Das sterilisierte Kaninchenserum aus jedem Kaninchenwirtstier wird getrennt durch reihenweise Zweifachverdünnungen von 1 :5 bis 1 :640 unter Verwendung eines Zeilkulturwachstummediums als Verdünnungsmittel titriert. Eine 1-ml-Probe einer jeden Verdünnung wird in jeweils 4 Gefäßkulturen aus Kaninchennierenzellen, die von verbrauchtem Wachstumsmedium abgezogen worden sind, zugesetzt. Nach

bo einer Inkubierung bei 35°C über Nacht werden die Gefäßkulturen erneut abgezogen und mit 10 bis 100 TCID50 [(Gewebekultur infizierende Dosis)so] eines Virus, der in 1 ml eines Wachstumsmediums enthalten ist, infiziert. Jede Gefäßkultur wird bei 35⁰C weitere 3

b5 Tage inkubiert und anschließend im Hinblick auf das Auftreten von cytopaten Virenwirkungen untersucht, wobei ein positives Auftreten derartiger Wirkungen mit » + « und ein Ausbleiben derartiger Wirkungen mit »0«

bezeichnet wird. Der Interferontiter wird für jede Serumprobe als reziproker Wert der Serumverdünnung angegeben, bei welcher 50% der Gefäße keine cytopate Wirkungen zeigen. Serum von nicht-behandelten Tieren (d. h. normalen Vergleichstieren) wird bei jedem Versuch zur Bestimmung der normalen Serumfaktoren titriert. Die auf diese Weise bestimmten Titer sind in der Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Interferontiter, die in Kaninchennieren-Zellkulturen bestimmt werden

Polynucleotid

Dosis/Tier Interferon-Titer

Poly-1: C 2 ;jig > 640

Poly-1: C 0,5 ug 20-40

Poly-1: C 0,25 jig < 5

Poly-1 allein 25 <jg < 5

PoIy-C allein 20 j/g · < 5

normale Vergleichs- keine < 5

proben

Die Tests werden unter Verwendung von Kaninchen durchgeführt, denen ^g 1 : C in einer einzigen intravenösen Dosis zugesetzt worden ist, worauf das Blut bei aufeinanderfolgenden Intervallen zeigt, daß ein erheblicher Interferonspiegel in einer Stunde auftritt, der kurz danach einen Peak erreicht und 4 bis 6 Stunden lang auf dieser Höhe verbleibt, worauf er abfällt.

Beispiel 2
Induktion von Interferon in Mäusen

Eine Lösung des PoIy-(I : C) (Substanz I) sowie Lösungen von Polyinosinsäure und Polycytidylsäure werden getrennt als 0,2-ml-Aliquots an 16 bis 18 g schwere Mäuse durch intravenöse Einspritzung verabreicht. Jede Lösung wird an 25 Mäuse verabreicht. Nach ungefähr 2 Stunden werden von jeder Maus Blutproben entnommen. Das Serum wird von jeder der geronnenen Blutproben abgetrennt. Die Seren von solchen Tieren, in welche ein Aliquot des gleichen Polynucleotide oder der gleichen komplexen Polymerisatlösung eingespritzt worden ist, werden gesammelt und durch Bestrahlung mit UV-Licht sterilisiert, worauf sie durch die Fleckenverminderungsmethode auf Mäuseembryozellen gegen einen Angriff vesikularer Stomatitis-Viren

Tabelle III

titriert werden. Die gesammelten Seren der nicht-behandelten Tiere werden in ähnlicher Weise titriert.

Tabelle II

Stimulierung der Interferonerzeugung in Mäusen, ermittelt durch die Fleckenverminderungsmethode

Komplexes Polymerisat

Dosis/Tier

Interferon-Titer

Poly-1 55,0 [ig < 8

PoIy-C 50,0[Jg < 8

Poly-1: C 52,5 [j% 256

Normales gepuffertes - < 8
Vergleichsverdünnungsmittel

Beispiel 3

Induzierte Beständigkeit gegen eine Infektion
von Mäusen durch Columbia SK-Viren

Eine Infektion durch Columbia SK-Viren hat bei Mäusen die Symptome eines zersausten Felles, einer Lethargie und einer schwachen Paralyse zur Folge, wobei die Hauptmenge der Tiere 3 bis 5 Tage nach der Einspritzung eingeht. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der komplexen Polymerisate hinsichtlich der Induzierung einer schützend wirkenden Menge an Interferon wird folgende experimentelle Methode angewendet:

0,5 ml der Testlösung der komplexen Homopolynucleotid-Polymerisate, wie sie in der Tabelle III angegeben sind, werden auf intraperitonealem Wege 18 Stunden lang vor der Infizierung an jeweils 15 Mäuse verabreicht, von denen jede zwischen 14 und 16 g wiegt. Dann wird eine Menge an Columbia SK-Virus, die zum Abtöten von 90% der Mäuse innerhalb von 5 Tagen nach der Infizierung ausreicht, auf subkutanem Wege in ein 0,5-ml-Aliquot eingespritzt, worauf jede Maus mit 0,5 ml der auf intraperitonealem Wege 3 Stunden nach der Infektion eingespritzten Lösung behandelt wird. Tiere, die in ähnlicher Weise mit komplexem Polymerisat oder Homopolynucleotid behandelt worden sind, jedoch nicht durch Viren infiziert worden sind, werden hinsichtlich des Auftretens einer durch diese Chemikalien verursachten Toxizität untersucht. Bei keinem der behandelten, jedoch nicht infizierten Tiere, wird ein Anzeichen von Toxizität festgestellt. Die Tiere behalten ihre üblichen Freßgewohnheiten bei, wachsen weiter und erscheinen im Hinblick auf ihr äußeres Verhalten normal.

Täglich wird die Anzahl der lebenden und toten Tiere ermittelt. Die Tiere werden 14 Tage lang beobachtet.

Induzierte Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion von Mäusen durch Columbia SK-Viren

Chemische Mitte!

Gesamt mg-Dosis pro Tier

% Überlebende
Tiere

Durchschnittlich
pro Tag überlebende Tiere

Phosphatpuffer	—	3,3	4,7
Polyinosinsäure	0,91	0,0	4,3
Polycytidylsäure	1,00	0,0	4,2
PoIy-(I: C)	0,525	53,3	>14,0

130 121/2

	Fortsetzung	16 17	659	Tiere	10
9	Chemische Mittel
			60,0	Durchschnittlich
	Gesamt mg-Dosis % Überlebende	53,3	pro Tag über
PoIy-(I: C)	pro Tier	46,7	lebende Tiere
PoIy-(I: C)		33,3	>14,0
PoIy-(I: C)	0,263	40,2	>14,0
PoIy-(I: C)	0,131	2,2	13,0
PoIy-(I: C)	0,065		8,0
Vergleichsmittel	0,033	7,0
0,017	5,0
-

Bei Anwendung der gleichen Methode, mit der Ausnahme, daß die Nachinfizierungsdosis weggelassen wird, erhält man Ergebnisse, die mit den in der Tabelle III zusammengefaßten Ergebnissen vergleichbar sind.

Bei einem anderen Versuch, bei welchem an getrennte Gruppen von Mäusen 525, 263 und 131 μg Poly-1 : C pro Maus verabreicht wird, wird ein Überleben von 86%, 93% bzw. 80% ermittelt, wenn ein Immunitätstest mit den Columbia SK-Viren durchgeführt wird. I und C allein sind in Dosen von 550 μg bzw. 500 μg inaktiv.

Beispiel 4

Induzierte Widerstandsfähigkeit

gegen eine Infektion von Mäusen durch

Pneumonia-Viren (PVM)

Eine Infizierung von Mäusen auf intranasalem Wege durch Mäusepneumonia-Viren (PVM) hat eine Infektion

Tabelle IV

der Atmungswege zur Folge, die ihren Höhepunkt in einer Pneumonia hat, wobei der Tod nach 6 bis 7 Tagen nach der Infizierung bei der Hauptmenge der Tiere eintritt.

Lösungen der komplexen Polymerisate sowie von Homopolynucleotiden werden auf ihr Vermögen getestet, einen Schutz gegen PVM-Infektion zu verleihen, indem 8 bis 10 g schwere Mäuse auf intranasalem Wege mit 0,03 ml der Lösung, welche das

2) in der Tabelle IV angegebene Testmaterial enthält, vor der intranasalen Einführung der Viren vorbehandelt werden. Es wird eine Virusmenge verwendet, die dazu ausreicht, 75% der Mäuse 6 bis 7 Tage nach der Zuführung der Viren abzutöten. Nach Beendigung des

jo Versuches (14 Tage) sind 59 der 60 infizierten, jedoch nicht-behandelten Mäuse, an der Virusinfektion eingegangen.

Täglich wird die Anzahl der lebenden sowie der toten Mäuse ermittelt. Die Tiere werden 14 Tage lang

3) beobachtet.

Induzierte Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion von Mäusen, welche durch Pneumoniamäuseviren (intranasal) verursacht wird

Chemisches Mittel

Dosis in {)
pro Maus

% Überlebende
Tiere

Durchschnittlich
pro Tag überlebende Tiere

PoIy-(I: C)	15,75	100	>14,0
PoIy-(I: C)	8	95	>14,0
PoIy-(I: C)	4	95	>14,0
PoIy-(I: C)	2	82	>14,0
PoIy-(I: C)	1	80	>14,0
PoIy-(I: C)	0,5	47,3	12,0
PoIy-(I: C)	0,25	40	11,0
PoIy-(I: C)	0,13	5,3	8,0
PoIy-(I: C)	0,06	5,0	8,0
PoIy-(I: C)	0,03	2,2	8,0
Phosphatpuffer	-	0,0	7,0

Beispiel 5

In-Vitro-Aktivität der komplexen Polymerisate
als vireninhibierende Substanzen

Zur Bestimmung der Kinetik der Interferon-Induktion durch Poly-1: C in einem in vitro-System wird Poly-1: C in einer Menge von 10μg/ml mit Trypsin behandelten Milzzellen 6 Wochen alter Kaninchen, die

in einem Eagle's Kulturmedium (Eagle's spinner cultur medium), das 10% Agamma-Kalbserum enthält, zugesetzt. Eine periodische Untersuchung hinsichtlich der Erzeugung von Interferon zeigt ein allmähliches Ansteigen bis zu 7,5 Stunden und eine gleiche quantitative Menge bei 19 Stunden.

Zur Bestimmung der Wirksamkeit der komplexen Polymerisate in verschiedenen Zellkulturen wird jede

der Zellkulturen, die in der Tabelle V angegeben sind, über Nacht mit einem der komplexen Polymerisate inkubiert, welche in dem Wachstumsmedium verdünnt sind, von dem bekannt ist, daß es für die verwendete Zellkultur erforderlich ist. Nach der Entfernung des Wachstumsmediums, das die komplexen Polymerisate enthält, wird jede Kultur mit vesikularen Stomatitisvirensuspensionen infiziert, inkubiert und im Hinblick auf die Fleckenbildung beobachtet, wie sie bei dem Test beschrieben wurde, welcher die Artspezifität zeigt. ι ο

Tabelle V

ug-Dosis des komplexen Polymerisats/ml, die zur Induzierung einer Widerstandsfähigkeit gegenüber ^, einer VSV-Fleckenbildung erforderlich ist

Zellkultur	Poly-1: C
Ursprüngliche Kaninchenniere	<0,00125
Ursprüngliche menschliche	0,04
Embryonalhülle
Ursprüngliche menschliche	1,25
Embryoniere
Ursprünglicher Kükenembryo	0,33
Ursprüngliche Rinderniere	5,00
Ursprüngliche Hundeniere	1,25
Ursprünglicher Mäuseembryo	>5,25

Die relativen Wirkungen der komplexen Polymerisate sowie ihrer getrennten Komponenten gehen aus der Tabelle VI hervor.

Tabelle VI

Konzentration des komplexen Polymerisats, das zur Induzierung einer Widerstandsfähigkeit gegenüber einer VSV-Fleckenbildung auf ursprünglichen Kaninchennierenzellen erforderlich ist

Polymerisat

[ig/ml

Poly-1
PoIy-C
Poly-1: C

< 0,00125

komplexen Polymerisate, welche nach der Beschreibung der Substanz III aufgeführt sind, anstelle der Substanzen I, II und III verwendet werden, werden ähnliche Ergebnisse erzielt.

Die Interferone werden als Proteinmoleküle mit relativ niedrigem Molekulargewicht identifiziert, wobei diese Verbindungen nur in Zellen der gleichen Art, aus welchen die Interferone hergestellt werden, die durch Viren verursachten Folgen (viral replication) zu beeinflussen vermögen. Zur Charakterisierung der Interferone bedient man sich des Nachweises der Artspezifität, der Antivirusaktivität, der Trypsinempfindlichkeit (ein Test für Proteine), des isoelektrischen Punktes sowie Methoden der Molekulargewichtsbestimmung.

Die folgenden Tests dienen zur Identifizierung der aktiven Viren-inhibierenden Substanzen als Interferone.

Unter Einhaltung der in den Beispielen 1 bis 5 beschriebenen Methode, wobei die Substanz IV oder die Nachweis der Artspezifität des induzierten
²⁽¹ Interferons

3-ml-Proben von Zweifach-Reihenverdünnungen in dem Kulturmedium der Interferon-Proben gemäß Beispiel 1, die durch Bestrahlung mit UV-Licht sterilisiert worden sind, werden Monoschichten verschiedener Zelltypen zugesetzt, die getrennt in 30-ml-Gewebe-Züchtungskolben gewachsen sind. Nach einer über Nacht erfolgte,! Inkubierung werden die Serumproben abgezogen und durch 0,5 ml einer Suspension vesikularer Stomatitis-Viren ersetzt, worauf die Kulturen erneut weitere 1,5 Stunden bei 35⁰C inkubiert werden. Dann wird eine Deckschicht aus 5 ml des Aufrechterhaltungs-Kulturmediums (maintenance culture medium), das Methylcellulose als Verfestigungsmittel enthält, zu jedem Kolben zugesetzt, worauf die Inkubation weitere 3 bis 4 Tage bei 35°C zur Bildung von Virusflecken fortgesetzt wird. Das Deckmedium wird anschließend entfernt, worauf die Zellen mit Carbolfuchsin angefärbt werden. Die Fleckenzahlen der mit Interferon behandelten Monoschichten werden mit den Fleckenzahlen von nicht-behandelten, mit Viren infizierten Vergleichsmonoschichten verglichen. Die reziproke Interferonverdünnung, welche eine zumindest 50% ige Verminderung der Fleckenanzahl ergeben, wird als der Interferontiter der betreffenden Probe betrachtet. Die auf diese Weise bestimmten Titer zeigen die Artspezifität, d.h. daß ein in einem Tier einer gegebenen Art induziertes Interferon nur in Zellen wirksam ist, die von einem Tier der gleichen Art abstammen. Diese Titer werden in der Tabelle VII gezeigt.

30

r> ■40

¹SO

Tabelle VII

Artspezifität der induzierten Interferone bei Versuchen, bei welchen ein Angriff unter Verwendung von vesikularen Stomatitis-Viren durchgeführt wird

Komplexes
Polymerisat

Serumquelle

Interferon-Titer, der auf der Zellkultur untersucht wird
Küken-Embryo Mäuseembryo Kaninchenniere

BSC*) Affe

Kaninchen

Maus

Kaninchen

<8

< 16	>2048
128	< 16
< 16	< 16

nicht behandelt

*) BSC - eine nachgewiesene Zeil-Art, die von Nierenzellen von afrikanischen Grünaffen abstammt.

Nachweis derTrypsinempfindlichkeit des
induzierten Interferons

Ein Interferon-enthaltendes Serum aus Tieren, die mit einem komplexen Polymerisat induziert worden sind, wird durch Chromatographie an CM-Sephadex (ein Kationenaustauschermaterial, das durch Einführung von Carboxymethylgruppen in Sephadex erhalten wird) isoliert. Eine Probe des isolierten Interferons wird mit einer kristallinen Trypsinlösung (50 μg/ml Endkonzentration) 4 Stunden lang bei 35° C behandelt. Eine ähnliche nicht-behandelte Interferon-Probe wird ebenfalls 4 Stunden lang bei 35⁰C inkubiert. Nach der 4stündigen Inkubationsperiode wird ein Sojabohnen-Trypsininhibitor jeder Probe einschließlich der Kontrollprobe zugesetzt. Die Proben werden im Hinblick auf ihre Interferon-Aktivität nach der Fleckenverminderungsmethode titriert. Die Trypsinlösung, welcher der Sojabohnen-Trypsininhibitor zugesetzt worden ist, wird ebenfalls im Hinblick auf ihre Antiviren-Aktivität titriert. Die Ergebnisse des Trypsin-Empfindlichkeitstests sind in der Tabelle VIII zusammengefaßt.

Tabelle VIII

Trypsinempfindlichkeit des induzierten Interferons

Behandlung

Interleron-Titcr

Poly-1:C induziertes Interferon+ 16

Trypsin

Poly-1: C induziertes Interferon 256

Trypsin-Vergleichsprobe 16

Bestimmung des Molekulargewichts des
induzierten Interferons

Die Molekulargewichte des durch die komplexen Polymerisate induzierten Interferons werden nach folgender Methode bestimmt. Säulen mit einer Größe von 2 χ 35 cm werden mit hydratisierten Sephadex G-200-Kugeln gepackt, worauf langsam 2 bis 3 Tage lang ein 0,006 m Natriumphosphat/0,15 m NaCl-Puffer (pH 7) zur Erzielung einer Gleichgewichtseinstellung durchsickern gelassen wird (Sephadex ist eine hydrophile unlösliche Substanz, die durch Vernetzen von Polysaccharidsdextran gebildet wird. Die Bezeichnung »G-200« bezieht sich auf das Ausmaß der Vernetzung und damit der Porosität des hydratisierten Gels).

1-ml-Mengen des Serums, welche induziertes Interferon, das gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist, enthalten, wird auf die Säulen aufgegeben. Die Fließgeschwindigkeit in der Säule wird auf 20 bis 25 ml pro Stunde eingestellt, wobei Fraktionen in 3-ml-Mengen gesammelt werden. Die Fraktionen werden auf ihren Interferon-Gehalt nach der Fleckenverminderungsmethode untersucht; wobei das Molekulargewicht

ίο einer jeden Probe nach der Formel M¹'³ — 146 [1,480— V/Vo^1/3] berechnet wird, worin »M« für das Molekulargewicht steht, »V« das Eluierungsvolumen des getesteten Materials ist und » Vo« das Leervolumen der Säule darstellt. Diese Methode liefert Werte, die innerhalb 10% der Molekulargewichte liegen, die beim Testen mit gereinigten Proteinen angegeben werden.

Die Ergebnisse der Molekulargewichts-Bestimmungen sind wie folgt:

Kaninchen-Interferon

Molekulargewicht

Poly-1: C, induziert

49 000 bis 52 000

Bestimmung des isoelektrischen Punktes von
Interferon

Die Serum-Proben, welche Interferon enthalten, das nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt worden ist, werden über Nacht gegen einen 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH 6 oder einfach verdünnt auf 1:3 mit Puffer) dialysiert. 20 ml einer jeden Probe werden auf eine 1,5 χ 10 cm CM-Sephadex-Säule aufgebracht, die mittels des gleichen Puffers in einen Gleichgewichtszustand überführt worden ist. Das Interferon wird durch nacheinanderfolgende Zugabe von 5-ml-Mengen eines 0,1 m Natriumphosphats mit steigender Erhöhung des pH-Wertes um 0,2 Einheiten eluiert. Der Abfluß wird in 5-ml-Fraktionen gesammelt, worauf der pH und die Interferon-Aktivität einer jeden Fraktion gemessen wird. Der pH der Fraktion mit einer Spitzenaktivität wird aufgezeichnet, worauf der isoelektrische Punkt durch Zugabe einer 0,4-pH-Einheit berechnet wird. Der auf diese Weise bestimmte isoelektrische Punkt für Interferone, die in einem Kaninchen durch Verabreichung von Poly-1 : C bestimmt wird, beträgt 6,8 bis 6,9.

In der Tabelle IX ist zusammenfassend die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Arzneimittel aufgeführt.

Tabelle IX

Zusammenfassung der biologischen Wirksamkeit des erfindungsgemäßen doppelfaserigen Polynucleotids

Eingespritzte RNS

Minimal wirksame Wirkung Interferon- Beeinflussung

induktion in
Kaninchen

der VSV in Kanin-

chennierenzell-

kulturen Schützende Dosis für Mäuse gegen Viren*)

PVM CoI.

Sk

Scndai**)

Synthetisch

Polyinosinpolycytidyl (I :C-Komplex) 0,5 tag 0,00125 (Jtg 7,9 [ig 131 [ig 16 [Jg***)

*) Nichtbestimmte minimal erforderliche Dosis.

**) Sendai-Stammparainfluenza-l-virus wird bei einem nasalen Immunitätstest verabreicht. ***) Bisher nicht veröffentlicht.

Die Tabelle X zeigt die außergewöhliche Wirksamkeit des I: C-Komplexes zum Schutz von Mäusen gegen wechselnde Mengen einer in einem Immunitätstest verwendeten PVM-Dosis.

Tabelle X

Wirksamkeitsgrad einer induzierten Wirtsbeständigkeit gegen Mäusepneumoniaviren

I: C-Dosis intranasal	Virusimmunitätstest	% überlebende Tiere	durchschnittliche
	in LD50		Tageszahl
15,7 g/[jg	10 000	93,3	14,0
15,7 g/|ig	3 150	73,3	14,0
15,7 g/[JJg	1000	86,7	14,0
15,7 g/fjtg	315	100	14,0
15,7 g/jjig	100	93,3	14,0
15,7 g/jjtg	31,5	100	14,0
keine	10 000	0	5,0
keine	3 150	3,3	6,0
keine	1000	0	6,0
keine	315	0	7,0
keine	100	6,6	7,0
keine	31,5	3,3	7,0

Anwendbarkeit bei Menschen

Die vorstehend geschilderten Tierexperimente zeigen die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Mittel zur Induzierung von Interferon in Tieren für einen prophylaktischen und therapeutischen Schutz gegen Infektion. Die Wirksamkeit der komplexen Polymerisate I : C zur Induzierung von Interferon in Gewebekulturen aus menschlichen Zellen wurde erforscht. Bewegte Kulturen menschlicher embryonaler Nierenzellen wurden über Nacht bei 35°C mit einem Medium inkubiert, das I :C enthält. Nach der Entfernung dieses Mediums werden die behandelten Kulturen mit einer ausreichenden Virusmenge einem Immunitätstest zur Infizierung aller Kulturen behandelt, bei 33⁰C inkubiert und hinsichtlich des Auftretens cytopather Wirkungen während einer Zeitspanne bis zu 7 Tagen beobachtet. Die minimal wirksame Konzentration an I:C ist diejenige Konzentration, welche eine 100%ige Unterdrückung der cytopathen Virenwirkung in 50% oder mehr der bewegten Kulturen zeigt.

Die mit I:C behandelten bewegten Kulturen, die jedoch nicht mit dem Virus einem Immunitätstest unterzogen worden sind, werden auf Anzeichen einer Toxizität beobachtet. Es wird jedoch kein Anzeichen einer Toxizität beobachtet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle XI zusammengefaßt.

Tabelle XI

Immunitiitstcst-Virus

Minimal wirksame
Konzentration (ug/ml)

Rhino I
Rhino Il
Rhino 20
Rhino 42
Rhino 47

2,6 - 5,24
3,25 oder weniger
3,25 oder weniger
0,8 oder weniger
0,8 oder weniger

Formulierungsbeispiel 1
Oral-nasales Präparat

Als prophylaktisches intranasales Präparat gegen die Atmungswege befallende Viren, beispielsweise Erkältungsviren, wird eine Dosis aus 1 bis 100 mg eines komplexen I : C-Polymerisats alle 2 bis 3 Tage auf die nasalen und oralen Membranen aufgebracht. Diese Verabreichungsperiode kann infolge der längeren Dauerhaftigkeit des induzierten Interferons eingehalten werden.

Die Verabreichung kann in Form einer wäßrigen Suspension in einem Aspirator-Spray durchgeführt werden, wobei durch eine oder zwei Sprühungen ungefähr 5 bis 10 mg verabreicht werden. Ferner können Aerosolpräparate unter Verwendung üblicher Fluorchlorkohlenwasserstoffe als Treibmittel hergestellt und verwendet werden. Zusätzlich kann das Präparat in Form einer pharmazeutischen Nasentropfenflüssigkeit verabreicht werden.

Dieses Präparat kann auch in Fällen einer tatsächlichen Infektion der Atemwege ungefähr alle 2 bis 3 Tage auf therapeutischem Wege verwendet werden. Ein behandelnder Arzt kann entscheiden, ob eine häufigere (beispielsweise tägliche) oder weniger häufigere (beispielsweise alle 4 Tage) erfolgende Verabreichung erforderlich ist.

Formulierungsbeispiel 2
Augenpräparat

Für eine prophylaktische und therapeutische Verwendung für die Augen wird ein übliches Augentropfenpräparat, beispielsweise aus einem sterilen Erdnußöl, derart hergestellt, daß ein einziger Tropfen 1 bis 100 mg des komplexen Polymerisats I : C oder eines der anderen induzierend wirkenden Mittel enthält. Ein einziger Tropfen wird alle 2 bis 3 Tage auf die Augen aufgebracht.

Die Tropfen werden aufgebracht, um ihre therapeuti-

bo sehe Wirksamkeit gegen Augen zu entfalten, die mit Herpes, Adenovirus und Vaccina sowie mit Tracboma infiziert sind. Außerdem können die Tropfen auf nichtinfizierte Augen als prophylaktischer Schutz während des gleichen Zeitintervalls aufgebracht werden.

Eine übliche Augensalbe wird in der Weise hergestellt, daß eine kleine Menge, wie sie normalerweise aufgebracht wird, 1 bis 100 mg des I :C enthält. Diese

130 121/2

Salbe kann beispielsweise aus einem Polyäthylen/Petrolatum (flüssig)-Gel bestehen.

Formulierungsbeispiel 3
Hautpräparat

Für die Aufbringung auf die Haut an abgeschürften Stellen kann das Interferon-induzierende Mittel üblichen Grundlagen für Salben, Cremes, Lotions oder flüssige Präparate in der Weise zugesetzt werden, daß Ig beispielsweise 1 bis 100mg I:C enthält. Ein derartiges Präparat wird alle 2 bis 3 Tage aufgebracht.

Formulierungsbeispiel 4
Sterile Injektion

Als Beispiel für ein Präparat für eine parenterale Verabreichung sei eine übliche sterile ölige oder wäßrige Lösung oder Suspension, beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, erwähnt 1 ecm einer derartigen Lösung oder Suspension enthält 1 bis 100 mg eines erfindungsgemäß verwendeten I: C-Komplexes und wird im Falle einer Virusinfektion alle 2 bis 3 Tage eingespritzt.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Interferonbildendes Arzneimittel, enthaltend ein im wesentlichen von inhibierend wirkenden Substanzen freies Polynucleotid, das bei der Komplexbildung aus Polyinosinsäure und Polycytidylsäure im Molverhältnis 1:1, bezogen auf die Basen, erhalten worden ist, und einen pharmazeutischen Träger.

2. Verwendung eines im wesentlichen von inhibierend wirkenden Substanzen freien Polynucleotids, das bei der Komplexbildung aus Polyinosinsäure und Polycytidylsäure im Molverhältnis 1:1, bezogen auf die Basen, erhalten worden ist, bei der Induzierung von Interferonen.