DE3888437T2

DE3888437T2 - Immobilisierte Antikörper.

Info

Publication number: DE3888437T2
Application number: DE19883888437
Authority: DE
Inventors: Kyozo Hayashi; Hajime Hiratani; Masayuki Kurobe; Satoshi Nishimuro
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2008-10-01
Also published as: JPS6488367A; EP0310413A3; DE3888437D1; EP0310413B1; EP0310413A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immobilisierte Antikörper.
Die letzten Jahre haben auf dem Gebiet der Immunoassays unter Anwendung der Antigen/Antikörper-Reaktion deutliche Fortschritte erbracht. Die Enzym-Immunoassay- und Radioimmunoassay-Techniken, mit denen sich Tracersubstanzen im lebenden Organismus quantifizieren lassen können, werden bei der Diagnose von ansteckenden Krankheiten und endokrinen Krankheiten bereits in großem Umfang klinisch eingesetzt.
Der Immunoassay macht sich die folgenden charakteristischen Eigenschaften der Antigen/Antikörper-Reaktion zunutze: diese Reaktion kann bei niedrigen Konzentrationen stattfinden und der resultierende Antigen/Antikörper-Komplex dissoziiert kaum. Daher werden diejenigen immobilisierten Antikörper, die durch Binden eines Antikörpers an einen Träger wie einen Kunststoff, ein Silikon oder eine Glasware unter Nutzbarmachung des Phänomens der physikalischen Adsorption hergestellt werden, gegenwärtig weitreichend eingesetzt. Die immobilisierten Antikörper können jedoch nach Komplexbildung mit Antigenen nicht wiederholt verwendet werden, da die Behandlung der Komplexe mit einer Säure oder einer hochkonzentrierten Salzlösung zum Zwecke der Ablösung derselben zur Regeneration der immobilisierten Antikörper nicht nur zwangsläufig zu einer Auflösung der Antigen/Antikörper-Bindung, sondern auch zur Ablösung der Antikörper von den Trägerstoffen führt. Darüber hinaus ist es im Falle einer geringen Anzahl von Antikörpern, insbesondere in den Fällen, wo die Antigene sich von menschlichen Substanzen ableiten, die lediglich in sehr geringen Mengen auftauchen, wie das menschliche Wachstumshormon, das menschliche luteinisierende Hormon, das menschliche Glukagon und das menschliche Gastrin, schwierig, sie zu reinigen und sie enthaltende Ausgangsmaterialien zu erhalten. Die durch Immunisierung von Tieren mit derartigen Substanzen erhaltenen Antikörper sind sehr teuer und sollten daher gewünschtenfalls wiederholt verwendet werden können. Auf der anderen Seite führt ein Radioimmunoassay, bei dem die ein oder andere Strahlenquelle eingesetzt werden muß, zu Problemen bei der Beseitigung von radioaktivem Abfall.
Die GB-A-2 014 727 offenbart die Herstellung immobilisierter Antikörper, indem der Antikörper chemisch oder physikalisch an mattiertes Glas gebunden wird. Es wird Bezug genommen auf das chemische Binden mit Hilfe eines Silankopplungsmittels und nötigenfalls eines Vernetzungsmittels. Das Silankopplungsmittel kann ein Aminoalkylsilylierungsmittel sein und es erfolgt eine spezifische Bezugnahme auf u.a. 3-Aminopropyltriethoxysilan Spezifizierte Vernetzungsmittel schließen Dimaleimide und Maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidester ein, wobei das bevorzugte Vernetzungsmittei jedoch Glutaraldehyd ist. Die beispielhaft erwähnten Vernetzungsmittel schließen 4-(Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyo-N-hydroxysuccinimidester und N,N'-o-Phenylendimaleimid ein.
Die DE-A-2 042 976 (entsprechend der US-A-3 652 761) offenbart immobilisierte Antikörper, bei der der Antikörper mit Hilfe eines Silankopplungsmittels chemisch an Glas gebunden ist. Bevorzugte Kopplungsmittel sind Amino-funktionelle aliphatische Silane und die beispielhaft erwähnten Silane schließen 3-Aminopropyltriethoxysilan ein. Auf die Verwendung von Vernetzungs mitteln zwischen dem Antikörper und dem Silankopplungsmittel wird nicht eingegangen.
Die EP-A-0 227 351 offenbart einen immobilisierten Antikörper, bei dem eine partiell reduzierte Form eines für das humane Proinsulin C-Peptid spezifischen IgG-Moleküls mit Hilfe eines heterobifunktionellen Vernetzungsmittels an Glas gebunden ist. Die Glasoberfläche kann aminoalkylsilyliert sein und die spezifizierten Vernetzungsmittel schließen verschiedene Maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidester einschließlich 4-(N-Naleimidomethyl)-cyclohexan-1-carbonsäure N-Hydroxysuccinimidester ein.
Die Erfinder führten intensive Untersuchungen durch und waren erfolgreich bei der Herstellung immobilisierter Antikörper, die in der Lage sind, wiederholt in Enzym-Immunoassays eingesetzt zu werden. Somit gelang es ihnen, die Kosten durch den wiederholten Einsatz der immobilisierten Antikörper zu senken als auch die Abfallmenge zu reduzieren, was zu der vorliegenden Erfindung geführt hat.
Die vorliegende Erfindung betrifft immobilisierte Antikörper, umfassend eine Fab'-Antikörperfraktion, die durch ein Maleimidkopplungsmittel kovalent an eine Glasoberfläche gebunden ist, welche durch Reaktion mit einem Aminoalkylsilylierungsmittel aktiviert ist.
Der zur Ausführung der Erfindung als immobilisierender Träger zu verwendende Glaskörper kann die Form einer Perle, einer Faser, einer Scheibe oder eines Teströhrchens aufweisen. Zur Verwendung bei Radioimmunoassays sind im Handel erhältliche gläserne Teströhrchen mit einem Durchmesser von 5-10 mm und einer Länge von 5-10 mm besonders bevorzugt, da sie nicht nur als Behältnisse für die Antigen/Antikörper-Reaktion sondern auch als Meßgefäße verwendet werden können.
Die Reaktion eines Aminoalkylsilylierungsmittels wie 3-Aminopropyltriethoxysilan mit der Glasoberfläche führt als Ergebnis der Aminoalkylsilylierung der Glasoberfläche zur Einführung einer Aminogruppe.
Verwendbar als Fab'-Antikörper sind Fraktionen, die von IgG- Spezies erhalten werden, welche durch Immunisierung eines warmblütigen Tieres mit dem zu analysierenden Antigen hergestellt worden sind, als auch im Handel erhältliche Antikörper-IgG-Spezies.
Jede IgG-Spezies wird vorher in Fab' umgewandelt, so daß die Thiolgruppen exponiert werden können. Die Umwandlung von IgG zu Fab' kann in herkömmlicher Weise erfolgen, beispielsweise durch Reinigung des IgG's durch Aussalzen und Verwendung eines Ionenaustauschharzes und anschließenden Verdau desselben mit Pepsin, wonach das resultierende F(ab')&sub2; in Kontakt mit einem Reduktionsmittel gebracht wird.
Die Glas/Fab'-Bindung wird durchgeführt unter Verwendung eines Maleimidvernetzungs- oder -kopplungsmittels wie N,N'-o-Phenylendimaleimid, N,N'-o-Oxydimethylendimaleimid, N-(4-Carboxyphenylmethyl)-maleimid oder N-succinimidyl-4-(maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC). Ein besonders bevorzugtes Vernetzungsmittel ist SMCC.
Es ist bevorzugt, daß die Glasoberfläche zuerst mit dem Vernetzungsmittel und anschließend mit dem Antikörper Fab' umgesetzt wird.
Die Reaktionen können unter santen Bedingungen wie beispielsweise in einem Phosphatpuffer (pH) bei einer Temperatur von etwa 37ºC für etwa 1 Stunde durchgeführt werden.
Auf diese Weise wird ein immobilisierte Antikörper erhalten, wobei der Antikörper kovalent an Glas gebunden ist.
Der auf obige Weise erhaltene immobilisierte Antikörper kann in der Sandwichtechnik des Immunoassays verwendet werden, indem der immobilisierte Antikörper zuerst mit einem Antigen und anschließend mit einem Enzym oder einem radioaktiv markierten Antigen umgesetzt wird, anschließend die feste Phase von der flüssigen Phase getrennt wird, und eine der Phasen zur Ermittlung der Enzymquantität oder Radioaktivität gemessen wird, und im Falle des kompetitiven Immunoassayverfahrens verwendet werden durch Umsetzen eines Enzym oder eines radioaktiv markierten Antigens auf der einen Seite mit einem unmarkierten, sich kompetitiv zum immobilisierten Anitkörper verhaltenden Antigen auf der anderen Seite, und anschließendem Trennen der festen Phase von der flüssigen Phase und Messen einer der Phasen hinsichtlich der Enzymquantität oder Radioaktivität.
Bei beiden Immunoassayverfahren kann der immobilisierte Antikörper viele Male wiederholt eingesetzt werden nach lediglicher Waschung mit einer verdünnten Säure, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung von Essigsäure, im Anschluß an die Vollendung eines jeden Assays.
Erfindungsgemäß kann jede Antikörper-IgG-Spezies unabhängig von dem Antigentyp verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

Beispiel 1

(1) Herstellung von anti-humanem epidermalen Wachstumsfaktor- Antiserum

Die Herstellung des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (nachfolgende abgekürzt mit hEGF) erfolgte aus menschlichem Urin nach dem Verfahren, welches in der Japanischen Kokai Tokkyo Koho 58- 219124 und dem US-Patent 4 528 186 beschrieben wurde. hEGF (0,5 mg) wurde in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst, und es erfolgte die Zugabe eines gleichen Volumens von vollständigem Freund's Adjuvans, und nach Vermischen zum Emulgieren wurde die Mischungsemulsion einem Kaninchen in verschiedene Stellen des Rückens injiziert, gefolgt von drei subkutanen Injektionen derselben Emulsion mit derselben Dosis in 2-wöchigen Zeitabständen. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurde das gesamte Blut gesammelt, und man ließ es zur Koagulation bei Raumtemperatur stehen und zentrifugierte 10 Minuten lang mit 3000 UpM, um ein Anti-hEGF-Ahtikörper enthaltendes Antiserum zu erhalten.

(2) Herstellung von Fab'

Das gemäß (1) erhaltene Anti-hEGF-Antikörper enthaltende Antiserum wurde auf eine Säule mit Protein A-Sepharose CL-413 (Pharmacia Japan, Tokyo) geladen, um dadurch die Adsorption von IgG herbeizuführen. Anschließend wurde die Säule sorgfältig mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) enthaltend 0,15 M NaCl gewaschen, und danach wurde IgG aus der Säule mit 1 M Essigsäure eluiert.
Eine Menge von 10 mg dieses IgG's wurde mit Pepsin (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd., Tokyo) in 0,1 M Acetatpuffer (pH- Wert 4,0) verdaut. Der Verdau wurde unter Anwendung einer Säule mit Sephadex G-100 (Pharmacia Japan, Tokyo) gereinigt und anschließend erfolgte die Passage durch eine Säule mit Protein A- Sepharose CL-4B zur Entfernung des unverdauten Antikörpers. Das somit erhaltene F(ab')&sub2;-Fragment wurde ferner mit 2-Mercaptoethanolamin reduziert und das Reduktionsprodukt wurde zum Erhalt eines Fab'-Fragments auf einer Säule mit Sephadex G-25 (Pharmacia, Schweden) gereinigt.

(3) Herstellung des immobilisierten Antikörpers

Gläserne Teströhrchen (0,8 cm Durchmesser, 7,5 cm Länge; Corning Glass Works, New York) wurden 2 Stunden lang bei 180ºC getrocknet. Anschließend wurde jedem Teströhrchen 0,1 ml einer 2 % (Gew./Vol.) Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (Aldrich Chemical Co., Inc., V.St.A.) in Aceton zugegeben. Die überschüssige Acetonlösung wurde entfernt und das Teströhrchen wurde wiederholt mit Aceton gewaschen, wonach man es 2 Stunden lang bei 60ºC stehen ließ.
Zu dem auf diese Weise aminoalkylsilylierten gläsernen Teströhrchen wurden 0,1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0) enthaltend N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Pierce Chemical Co., V.St.A.) und N,N-Dimethylformamid in Konzentrationen von 7,2 mg bzw. 0,12 ml pro 6 ml zugegeben. Nach der Inkubation für eine Zeitdauer von 60 Minuten bei 37ºC wurde das Teströhrchen drei mal mit 0,5 ml umfassenden Mengen von 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen, und sofort danach wurden 0,1 ml 0,1 M Phosphatpuffer enthaltend das Fab'-Fragment zugegeben und die Inkubation wurde 60 Minuten lang bei 37ºC durchgeführt, gefolgt durch Waschen mit 3 Mengen 0,1 M Phosphatpuffer enthaltend 0,1 % bovines Serumalbumin, 0,3 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3; und 1 mM MgCl&sub2;. Somit wurde ein Glaskörper mit einem darauf immobilisierten Anti-hEGF Fab' hergestellt. Die auf der Grundlage der Verminderung der Absorption bei 280 nm der der Reaktion zugeführten Fab'-Lösung berechnete Menge an gebundenem Fab' pro Teströhrchen betrug 4,9 ug.

(4) Herstellung von Peroxidase-gekoppeltem Fab'

Peroxidase (2 mg; Nordic Immunologica Laboratories, Niederlande) wurde in 0,3 ml 0,1 M Phospatpuffer gelöst. Der Lösung wurden 0,02 ml einer N,N-Dimethylformamidlösung von 1,6 mg N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Pierce Chemical Co., V.St.A.) zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Nach der Entfernung des durch Zentrifugation erhaltenen Präzipitats wurde die Reaktionsmischung anschließend auf einer Sephadex G-25 Säule gereinigt, um eine maleimidierte Peroxidaselösung zu ergeben. Dieser wurden 2,86 mg des Anti- hEGF-Antikörper Fab'-Fragments zugegeben, und man ließ die Reaktion 30 Minuten lang bei 4ºC voranschreiten. Die Reaktionsmischung wurde auf einer Säule mit Ultrogel Ac44 (Pharmacia Japan, Tokyo), die mit 0,1 N Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0) equilibriert war, gereinigt, um Peroxidase-gekoppeltes Fab'-Fragment zu ergeben.

(5) Analyse von hEGF

Der gereinigte hEGF wurde in Konzentrationen von 10 pg bis 1000 pg pro Milliliter in Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) gelöst, welcher 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 % bovines Serumalbumin enthielt. Die auf diese Weise hergestellten Lösungen wurden als standardisierte hEGF-Lösungen eingesetzt. Ein 0,1 ml umfassender Anteil einer jeden Standardlösung wurde einem gemäß (3) hergestellten gläsernen Teströhrchen zugegeben. Nachdem man die Ansätze über Nacht bei 4ºC stehen gelassen hatte, wurde jedes Teströhrchen mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) gewaschen, welcher 0,1 % bovines Serumalbumin enthielt. Anschließend wurden 0,2 ml eines Puffers enthaltend 4,3 ng des gemäß (4) hergestellten Peroxidase-gekoppelten Fab' zugegeben, und es erfolgte eine weitere Inkubation für eine Zeitdauer von 6 Stunden bei Raumtemperatur. Nach gründlichem Waschen mit einem Puffer wurden 0,1 ml 0,6 %ige (Gew./Vol.) 3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure (Wako Junyaku Co., Ltd., Tokyo) zugegeben. Nach 5 Minuten wurden 0,1 ml von 0,015 % wäßrigem Wasserstoffperoxid zugegeben. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 25ºC wurden 0,2 ml 0,1 M Glycin- NaOH-Puffer (pH-Wert 10,3) zugegeben, um dadurch die Reaktion zu stoppen, und es erfolgte eine Fluoreszenzmessung mit einem Fluorophotometer (Hitachi Ltd., Tokyo; Modell 650-60) bei einer Exzitationswellenlänge von 320 nm und einer Meßwellenlänge von 405 nm.
Nach Vollendung des obigen Analyseverfahrens wurden die gläsernen, Antikörper gekoppelten Teströhrchen mit 3 Mengen einer 0,1 %-igen wäßrigen Essigsäure und anschließend mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) gewaschen und wieder zur Analyse von hEGF verwendet.
Die oben genannte Abfolge der Verfahrensschritte wurde insgesamt zehnmal wiederholt. Ein Vergleich der auf diese Weise erhaltenen Leistungskurven in bezug auf hEGF führten zu keinem signifikanten Unterschied.

Beispiel 2

(1) Herstellung von anti-humanem Choriongonadotropin-Antiserum

Humanes Choriongonadotropin (nachfolgend bezeichnet mit hCG) wurde hergestellt durch das in der Japanischen Kokai Tokkyo Koho 58-99421 und dem US-Patent 4 665 161 beschriebene Verfahren. Die Vorgehensweise des Beispiels 1 (1) wurde wiederholt unter Verwendung des hCG's (0,5 mg), um Anti-hCG-Antikörper enthaltendes Antiserum zu erhalten.

(2) Herstellung von Fab'

Die Vorgehensweise des Beispiels 1 (2) wurde wiederholt unter Verwendung des gemäß (1) erhaltenen Anti-hCG-Antikörper enthaltenden Antiserums wiederholt, um ein Fab'-Fragment zu erhalten.

(3) Herstellung des immobilisierten Antikörpers

Die Vorgehensweise von Beispiel 1 (3) wurde unter Verwendung des gemäß (2) erhaltenen Fab'-Fragments wiederholt, um einen Glaskörper mit einem daran immobilisierten Anti-hCG-Fab' zu erhalten. Die auf der Grundlage der Verminderung der Absorption bei 280 mm der der Reaktion zugeführten Fab'-Lösung berechnete Menge an gebundenem Fab'- pro Teströhrchen betrug 5,2 ug.

(4) Herstellung von Peroxidase-gekoppeltem Fab'

Die Vorgehensweise von Beispiel 1 (4) wurde unter Einsatz des gemäß (2) erhaltenen Anti-hCG-Antikörper Fab'-Fragments wiederholt, um ein Peroxidase-gekoppeltes Fab'-Fragment zu erhalten.

(5) Analyse von hCG

Die Vorgehensweise von Beispiel 1 (5) wurde wiederholt unter Verwendung von gereinigtem hCG, gelöst in Konzentrationen von 5 mIU bis 1000 mIU pro Milliliter im Phosphatpuffer, um standardisierte hCG-Lösungen zu erhalten. Ein Vergleich der Leistungskurven in bezug auf hCG führte zu keinem signifikanten Unterschied.

Beispiel 3

(1) Herstellung von anti-adrenokortikotropem Hormon (Anti-ACTH)- Fab'

Die Vorgehensweise von Beispiel 1 (2) wurde unter Einsatz eines handelsüblichen Anti-ACTH-Antikörper enthaltenden Antiserums (Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Japan) wiederholt, um ein Fab'-Fragment zu erhalten.

(2) Herstellung des immobilisierten Antikörpers

Die Vorgehensweise des Beispiels 1 (3) wurde unter Einsatz des gemäß (1) erhaltenen Fab'-Fragments wiederholt, um einen Glaskörper zu erhalten, auf dem Anti-ACTH-Fab' immobilisiert ist. Die auf der Grundlage der Abnahme der Absorption bei 280 nm der der Reaktion zugeführten Fab'-Lösung gebundene Fab'-Menge pro Teströhrchen betrug 5,1 ug.

(3) Analyse von ACTH

Das verwendete ¹²&sup5;I-ACTH und das standardisierte ACTH waren die in dem ACTH I-125 Kit (The Green Cross Corp., Japan) enthaltenen. Das standardisierte ACTH wurde auf 50 bis 800 pg/ml verdünnt.
Jedem der gemäß (2) hergestellten gläsernen Teströhrchen wurden 0,7 ml 0,02 M Veronalpuffer und anschließend 0,1 ml der ¹²&sup5;I- ACTH-Lösung und 0,1 ml einer standardisierten ACTH-Lösung in der genannten Reihenfolge zugegeben. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 4ºC wurde das Teströhrchen dreimal mit Veronalpuffer gewaschen, und die an dem gläsernen Teströhrchen adsorbierte Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler (Beckman Modell Gamma 5500) gemessen. Nach der Analyse wurden die gläsernen Teströhrchen mit drei Mengen von 0,1 % wäßriger Essigsäure und anschließend mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) gewaschen und wieder zur Analyse von ACTH verwendet. Die obige Abfolge der Arbeitsschritte wurde insgesamt zehnmal wiederholt. Ein Vergleich der auf diese Weise erhaltenen Leistungskurven in bezug auf ACTH ergab keine signifikanten Unterschiede.

Claims

1. Immobilisierter Antikörper, umfassend eine Fab'-Antikörperfraktion, die durch ein Maleimid-Kopplungsmittel kovalent an eine Glaskörperoberfläche gebunden ist, welche durch Reaktion mit einem Aminoalkylsilylierungsmittel aktiviert ist.

2. Immobilisierter Antikörper nach Anspruch 1, bei dem das Aminoalkylsilylierungsmittel 3-Aminopropyltriethoxysilan ist.

3. Immobilisierter Antikörper nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem das Maleimid N,N'-o-Phenylendimaleimid, N,N'-o- Oxydimethylendimaleimid, N-(4-Carboxyphenylmethyl)-maleimid oder N-Succinimidyl-4-maleimidomethyl-cylcohexan-1-carboxylat ist.

4. Immobilisierter Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fab'-Fraktion abgeleitet ist vom anti-humanen Wachstumsfaktor-Antiserum, anti-humanen Choriongonadotropin-Antiserum oder anti-adrenokortikotropen Hormon-Antiserum.

5. Immobilisierter Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Glasoberfläche mindestens ein Teil der inneren Oberfläche eines Teströhrchens ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Antikörpers gemäß Anspruch 1, umfassend das Aminoalkylsilylieren einer Glasoberfläche durch Reaktion mit einem Aminoalkylsilylierungsmittel, das Umsetzen der aminoalkylsilylierten Oberfläche mit einem Maleimid-Vernetzungsmittel, und das Umsetzen der resultierenden behandelten Oberfläche mit einer Fab'-Antikörperfraktion.

7. Verwendung eines immobilisierten Antikörpers gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Immunoassay.

8. Verwendung nach Anspruch 7, bei der der immobilisierte Antikörper aus einer vorherigen Verwendung durch Waschen mit einer verdünnten Säure regeneriert worden ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, bei der die verdünnte Säure wäßrige Essigsäure ist.