DE2905657A1 - Konjugate aus immunologisch aktiver substanz und glas, verfahren zu deren herstellung und verwendung derselben - Google Patents
Konjugate aus immunologisch aktiver substanz und glas, verfahren zu deren herstellung und verwendung derselbenInfo
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Description
O _
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen näher gekennzeichneten
Gegenstand. Bei den erfindungsgemäßen Konjugaten handelt es sich um solche aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas, die die Bestimmung
aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten, z. B. von Hormonen und Proteinen, mit sehr hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit ermöglichen
und in vorteilhafter Weise in diagnostischen Reagentien
verwendbar sind.
Die Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen, z. B. Hormonen und
Proteinen, die in Körperflüssigkeiten, z. B. Urin und Serum, enthalten
sind, ist vom diagnostischen Standpunkt aus sehr wichtig und entweder
durch die auch im deutschen Sprachgebrauch als Radio-Immunoassay
(im folgenden abgekürzt RIA) bezeichnete Bestimmungsmethode oder durch Enzym-Immunoassay (im folgenden abgekürzt als EIA) durchführbar. Sowohl
RIA als auch EIA basieren auf dem gleichen Prinzip, nämlich auf der Spezifität von Antigen-Antikörperreaktionen.
Geeignete, für RIA und EIA üblicherweise verwendete Bestimmungssysteme
sind Festphasensysteme, in denen immunologisch aktive Substanzen zur Anwendung gelangen, die mit Hilfe von wasserunlöslichen Trägerstoffen
insolubisiert sind. Bei den bisher verwendeten wasserunlöslichen Trägerstoffen handelt es sich um (1) Kunststoffe, wie Polystyrol und Polyäthylen,
(2) natürliche Polymere, wie Sepharose und Cellulose, (3) Gläser usw. Die Verwendung von Kunststoffen (z. B. Polystyrol und Polyäthylen)
als wasserlösliche Trägerstoffe erweist sich als nachteilig wegen deren unbefriedigender Lagerungsstabilität und Versuchsgenauigkeit.
Immunologisch aktive Substanzen, die an natürliche Polymere, wie Sepharose oder Cellulose, gebunden sind, sind flockig oder flaumig und
schwierig zu handhaben und erfordern überdurchschnittliches Geschick, um damit die Bestimmungen erfolgreich durchführen zu können. Andererseits
unterscheiden sich Gläser von den angegebenen wasserunlöslichen Trägerstoffen dadurch, daß immunologisch aktive Substanzen daran durch
covalente Bindungen gebunden werden können und daß die an Gläser gebundenen immunologischen aktiven Substanzen stabil und sehr leicht zu handhaben
sind. Die bishar verwendeten Gläser haben jedoch den Nachteil, daß
die Menge em immunologisch aktiver Substanz, die daran gebunden werden
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kann, nur gering ist und daß deshalb die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung nicht voll befriedigt und das Versuchsbereich ziemlich eng ist.
Aufgabe der Erfindung isL es die aufgezeigten Nachteile auszuschalten
und Mittel und Wege anzugeben, mit deren Hilfe die Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten mit hoher
Empfindlichkeit und Genauigkeit in einem viel breiteren Versuchsbereich
gelingt.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt in der in den Patentansprüchen gek
·:■: η η ■-: <-t 1 c h r»^ u e n. Vi e i s r>
i :i i ζ Hilfe ν ο η K ο η j u g a t a η , i p. d e r\ a η i mmu η ο 1 ο g 1 s c h
aktive Substanzen physikalisch oder chemisch an die Oberfläche eines mattierten Glases gebunden sind.
Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher veranschaulicht,
in der darstellen
Figur 1 eine Standardkurve zur Bestimmung von menschlichem Insulin nach der Sandwich-EIA-Methode (vgl. das unten angegebene Beispiel 3), und
Figur 1 eine Standardkurve zur Bestimmung von menschlichem Insulin nach der Sandwich-EIA-Methode (vgl. das unten angegebene Beispiel 3), und
Figur 2 eine Standardkurve zur Bestimmung von menschlichem c.-Fetoprotein
mich der Sandwich-EIA-Methode {vgl. das unten angegebene
Beispiel 7).
Der Typ der erfindungsgemäß verwendeten immunologisch aktiven Substanz
ist nicht sonderlich kritisch. Geeignete derartige Substanzen sind z. B. Antigene und Antikörper. Beispiele für Antigene sind Hormone, z. B.
Insulin, Gonadotropin, 17-Ketosteroide, Wuchshormone, Thyroxin, Trijodthyronin
und Thyroid-stimmuliorende Hormone; Proteine, z. B. IgG,
IgA, IgM, IgE,κ -Fetoprotein, CEA (Carcinoembryonales Antigen) und
Protamine; und antigene Komponenten von Pathogenen, z. B. pathogenen Bakterien (z. B. Streptococcen) , Viren (?;. B. Hepatitis-Virus und
Rubella-Virus), Protozoen (z. B. Toxoplasma gondii und Malaria-Parasiten)
und dergleichen. Geeignete Antikörper sind z. B. Antisera, die in üblicher bekannter Weise durch Immunisierung von Säugetieren (ζ. B,
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Kaninchen und Ziegen) mit Hilfe der angegebenen Antigene erhalten werden können. Vorzugsweise handelt es sich bei den Antikörpern um
solche, die aus den Antiseren nach üblichen bekannten Reinigungsmethoden, z. B. Franktionierung unter Verwendung von gesättigem Ammoniumsulfat,
DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie und Affinitätschromatographie,
erhalten werden.
Der Typ des erfindungsgemäß verwendeten Mattglases ist ebenfalls nicht
sonderlich kritisch. So sind z. B. physikalisch (mechanisch) mattierte Gläser sowie chemisch wattierte Gläser verwendbar, wie sie z. B. in
Encyclopedia Chimica, Band 5, Seite 999, Kyoritsu Publishing Co., 1963, beschrieben werden. In dfr Regel wer<lan solche Gläser verwendet, die
eine unregelmäßige und in winzigen Dimensionen unebene Oberfläche, die durch eine physikalische oder chemische Behandlung verursacht ist,
aufweisen. Geeignete physikalische Methoden sind z. B. das Abschleifen der Glasoberflache unter Verwendung eines Schleifrnaterials (z. B.
Schleifmittel, Schleifpapier oder mit Schleifmittel beschichtete Textilien)
, das Aufsprühen eines Schleifmaterials (z. B. Schmirgel oder körniger Korund) mit Hilfe von Druckluft auf die Glasoberflache (Sandblasen)
oder das Abschleifen der Glasoberfläche mit einem Schleifmaterial
in einer geeigneten Vorrichtung z. B. einer Kugelmühle. Eine geeignete chemische Behandlung iot z. B. das Ätzen mit Fluorwasserstoffsäure,
Ammoniumfliorid oder einem Alkali. Im Hinblick auf die
Verarbeitbarkeit und Effizienz der Mattierungs-operation werden das Sandblasverfahren und die unter Verwendung einer Mattierungslösung,
die Fluorwasserstoffsäure oder Ammoniumfluorid enthält, durchgeführte
Methode bevorzugt als physikalische bzw. chemische Behandlungsmethode.
Die Gestalt der Glaskörper ist nicht kritisch und geeignete Formen sind z. B. zylindrische, kugelförmige, röhrenförmige und kubische Ausgestaltungen.
Die Größe der Glaskörper ist nicht sonderlich kritisch, doch beträgt dar maximale Durchmesser in der Regel 1 bis 20 mm und der
minimale Durchmesser moistens 1 mm oder mehr.
Geeignete mattierte Gläser sind z. B. solche mit einem Mattierungsgrad
von in der Regel 1,5 bis 10,0, vorzugsweise 2,0 bis 9,0. Hier und im
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folgenden v/ird der Mattierungsgrad definiert als das Verhältnis von
Enzymaktivität eines an mattiertes Glas gebundenen Enzyms zu derjenigen
eines an unmattiertes Glas (mit der gleichen Gestalt und Größe) gebundenen Enzyms. Dabei werden die Enzymaktivitäten nach der folgenden
Methode bestimmt:
(a) Herstellung von Enzym/Glas-Konjugaten:
Gleiche Mengen des mattierten Glases und des unmattierten Glases, das die gleiche Gestalt und Größe wie das mattierte Glas hat,
v/erden in eine 10%ige Lösung von >
-x\minopropyl-triäthoxysilan in Aceton eingetaucht. Nach 1 Stunden langer Inkubation bei 25 0C
werden die Glaser abfiltiert und mit entionisiertem Wasser gewaschen.
Zu den behandelten Gläsern wird eine 20%ige wässrige Lösung von Glutaraldehyd zugegeben. Nach 1 Stunde langem Stehen bei 25 0C
v/erden die Gläser mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die so behandelten Gläser werden sodann in 0,5 mg/ml einer wässrigen Lösung
von Glucoseoxidase (GOD) eingetaucht (Enzymaktivität von 34,0 E/mg,
Toyo Boseki K.K.). Nach 1 Stunden langer Inkubation bei 25 0C und
anschließender 15 stündiger Inkubation ei 4 0C werden die Gläser
abfiltriert und mit deionisiertem Wasser gewaschen unter Erzielung eines GOU/Hattglas-Konjugats und eines Konjugats aus GOD und unmattiertem
Glas, die sodann zur Messung der Absorption bzw. Extinktion herangezogen werden.
(b) Messung der Absorption:
Eine bestimmte Anzahl (in der Regel 1 Stück) des GOD/Mattglas-Konjugats
wird in jedes von insgesamt 10 Reagenzgläsern eingebracht. Eine Enzymsubstratlösung mit einem Gehalt an ß-D-Glucose wird zu
jedem Reagenzglas zugegeben, worauf eine Farbbildungslösung zugesetzt
wird, die 3-Methyl-2-benzo-thiazolinonhydrazon-hydrochlorid (MBT[I), N,N-Üiäthylanilin (DEA) und Peroxidase (POD) enthält. Nach
Inkubation wird die Absorption bei 590 mn der Überstände in jedem
Reagenzglas gemessen. Die angegebene Verfahrensweise wird wiederholt mit der Ausnahme, daß anstelle des GOD/Mattglas-Korijugats
das Konjugat aus GOD und unmattiertem Glas verwendet wird.
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Der Durchschnittswert der Adsorption bei 590 nm der Überstände in
jedem Reagenzglas wird als die Enzymaktivität der Konjugate aus Enzym
und mattiertem Glas bzw. aus Enzym und unmattiertem Glas angenommen.
Der Mattierungsgrad des mattierten Glases (X) wird nach der folgenden
Gleichung (1) berechnet:
Enzymaktivität des an das mattierte Glas gebundenen Enzvms
Enzymaktivität des art das unmattierte Glas gebundenen Enzyms
Das angewandte Gewichtsverhäitnis von immunologisch aktiver Substanz
zu Mattglas ist nicht sonderlich kritisch, sondern kann in weiten Grenzen
ja nach Erfordernis variieren. So werden z. B. 10 bis 1 000 Teile, vorzugsweise 50 bis 300 Teile,einer Lösung der immunologisch aktiven
Substanz pro 100 Teile des mattierten Glases verwendet, wobei die Konzentration der Lösung in der Regel 0,001 bis 40 g/100ml, vorzugsweise
0,01 bis 0,1 g/100ml, beträgt.
Etrfindungsgemäß ist es wichtig, einen speziellen Trägerstoff, nämlich
ein mattiertes Glas, zu Insolubilisierung der immunologisch aktiven
Substanz zu verwenden. Die angewandten Methoden zum Binden der immunologisch aktiven Substanz an das Mattglas sind nicht sonderlich kritisch,
Die immunologisch aktive Substanz kann an die Mattglasoberfläche nach
physikalischen oder chemischen Methoden gebunden werden. Letztgenannte
Methoden werden bevorzugt im Hinblick auf die Tatsache, daß damit eine große Menge an der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte Glas
fest und dauerhaft gebunden wird.
Das Binden durch eine physikalische Methode kann hauptsächlich durch
physikalische Adsorption (van der Waals-AdsorptLon) erzielt werden. So
kann z. B. das mattierte Glas in eine Lösung der immunologisch aktiven Substanz eingetaucht und inkubiert oder stehengelassen werden während
einer zur Bildung der physikalischen Bindung geeigneten Zeitspanne.
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Die verwendete Losung hat eine Konzentration von in der Regel
0,001 bis 40 g/100ml, vorzugsweise 0,01 bis 0,1 g/100ml. Die Eintauchoder
Untertauchbehandlung kann z. B. bei einer Temperatur von 0 bis 45 0C 1 bis 48 Stunden lang durchgeführt werden.
Eine geeignete chemische Methode ist z. B. eine solche, bei der die
immunologisch aktive Substanz an die Mattglasoberfläche gebunden wird
mit Hilfe eines Silanbindemittels und erforderlichenfalls eines Vernetzungsmittels
.
Verwendbar ist jedes beliebige Silanbindemittel, das in seinem Molekül
sowohl >:iiie funke lonelle Gruppe, di.e mit den mattierten Glas zu
reagieren vermag, als auch eine funktioneile Gruppe, die mit der immunologisch aktiven Substanz und/oder dem Vernetzungsmittel zu reagieren
vermag, aufweist. Beispiele für geeignete, mit dem Mattglas reaktive funktioneilt: Gruppen sind z. B. solche, die mit einer Silanolgruppe
des mattierten Glases reagieren; hierzu gehören z. B. Alkoxysilylgruppen
(z. B. Methoxy- oder Äthoxy-substituierte Silylgrupper), Halogensily!gruppen
(ζ. B. Chlor-substituierte Silylgruppen) und dergleichen. Beispiele für geeignete funktioneile Gruppen, die mit der immunologisch
aktiven Substanz und/oder dem Vernetzungsmittel zu reagieren vermögen,
sind solche, die mit Amino-Carboxyl·- und/oder Thiolgruppen reaktiv sind;
hierzu gehören z. B. Carboxyl- Epoxy-, Halogenalkyl-(ζ. B. Chloräthyl-
und Chlorpropy!gruppen), Aldehyd^Amino- (primäre und sekundäre Aminogruppen)
, Thiol-, Isocyanat-, Carboxylat-, Imino- und Nitril- (oder
Cyano-)Gruppen. Spezielle Beispiele für geeignete funktioneile Gruppen,
die mit der Aminogruppe reagieren,sind z. B. Carboxyl-, Epoxy-, Halogenalkyl-
und Aldehydgruppen; geeignete funktionelle Gruppen, die mit der Carboxylgruppe reagieren,sind z. B. Aminogruppen (primäre und sekundäre
Aminogruppen) und Epoxygruppen; geeignete funktionelle Gruppen,
die mit dar Thiolgruppe reagieren, sind z. B. Thiol-, Epoxy- Halogenalkyl-
und Aldehydgruppen.
Typische erfindungsgemäß geeignete Silanbindemittel sind z. B.:
(1) Silanbindemittel·, die Amino- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
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Aminoalkyl-trialkoxysilane (z. B. χ -Aminopropyl-trimethoxysilan,
y-Aminoprpyl-triäthoxysilan), N-(ß-Aminoäthyl)-y-aminopropyl-methyl-dimethoxysilan,
N-(ß-Aminoäthyl)-yaminopropyl-trimethoxysilan
und dergleichen;
(2) Silanbindemittel, die Thiol- und Alkoxysilylgruppen enthalten
:
Mercaptoalkyl-trialkoxysilane (z. B. ^'-Mercaotopropyl-trimethoxysilan)
und dergleichen;
(3) Silanbindemittel, die Epoxy- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
>-Glycidoxypropyl-trimethoxysilan, Triäthoxysilylmethyl-■üthylenoxid,
B- (3 , 4 -Epoxycyclohexyl) äthy"L-1rimethoxysilan
und dergleichen;
(4) Silanbindemittel, die Carboxyl- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
2- (Tr i.methoxysilyl) propionsäure und dergleichen; und
(5) Silanbindemittel, die Halogenalkyl-und Alkoxysilylgruppen
enthalten:
>-Chloropropyl-trimethoxysilan und dergleichen.
Beim Binden der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte Glas
kann das Silanbindemirtel mit oder ohne einen. Vernetzungsmittel angewandt
werden«.
Bei Verwendung eines Vernetzungsmittels wird dieses je nach Typ des
Silanbindemittels und je nach Typ der zu bindenden immunologisch aktiven Substanz ausgewählt. Verwendbar sind praktisch alle Vernetzungsmittel,
die das Silanbindemittel reit der immunologisch aktiven Substanz zu vernetzen mögen. Geeignete Venetzungsmittel sind z. B. Verbindungen,
die die Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe des Silanbindemittels mit der Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe der immunologisch aktiven
Substanz zu vernetzen vermögen, z. B. solche, die zur Erzeugung einer Vernetzungsbindung zwischen Thiolgruppe und Thiolgruppe oder
zwischen Ami-nogruppe und Thiolgruppe befähigt sind. Geeignete Ver-
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bindungen, die Aminogruppe und Aminogruppe zu vernetzen vermögen,
sind ζ. B. aliphatische Dialdehyde (ζ. B. Glyoxal, Malonaldehyd, Succinaldehyd und Glutaraldehyd) und Dichlorotriazine (2-Amino-4,6-dichloro-s-triazin)
und dergleichen. Geeignete Vernetzungsmittel zur Herstellung von Bindungen zwischen Thiolgruppe und Thiolgruppe
sind z. B. Dimaleimidverbindung (z. B. N,N'-o-Phenylendimalaimid
und N ,N ' -ni-Phenylendimaleimid) . Geeignete Vernetzungsmittel zwischen
Amiongruppe und Thiolgruppe sind z. B. Maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidester
(z. B. m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester
und 4-(Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyl-N-hydroxysuccinimidester).
Zur Herstellung dar erfindungsgemäßen Konjugate nach chemischen Methoden
bieten sich die beiden folgenden Verfahrensweisen an:
(1) Binden der immunologisch aktiven Substanz an die Mattglasoberfläche durch das Silankupplungs- oder
-Bindemittel, und
(2) Binden der immunologisch aktiven Substanz an die Mattglasoberfläche durch das Silanbindemittel und
das Vernetzungsmittel.
Nach der ersten Verfahrenaweire ist das Konjugat z. B. nach folgender
Methode herstellbair: Das Silanbindemittel wird zuerst an das
mattierte Glas gebunden durch Behandlung des Glases mit dem Silanbindemittel unter Umsetzung des Bindemittels mit den Silanolgruppen
dor Mattglasoberfläche, worauf das erhaltene Zwischenprodukt mit der
immunologisch aktiven Substanz umgesetzt wird unter Ausbildung einer Bindung zwischen der immunologisch aktiven Substanz und dem mattierten
Glas über das Silanbindemittel. Wird ein aminohaltiges Silanbindemittel
verwendet, so bildet dieses eine Peptidbindung mit der Carboxylgruppe
der immunologisch aktiven Substanz. Die Verwendung eines carboxylhaltigen Silanbindemittels führt zur Bildung einer Peptidbindung
mit der Aminogruppe der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines epoxyhaltigen Sileuibindemittels bewirkt eine Additionsreaktion
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mit der Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe der immunologisch aktiven
Substanz; die Verwendung eines thiolhaltigen Silanbindemittels führt
zur Bildung einer S-S-Bindung mit der Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines halogenalkylhaltigen Silanbindemittels
hat eine elektrophile Subs hituionsreaktion an der Amino-
oder Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz zur Folge, und die Verwendung eines aldehydhaltigen Siliinbindemittel führt zur Bildung
eines Thioacetals oder Heinithioacetals mit der Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz.
Vom Standpunkt einer festen und dauerhaften Bindung der immunologisch
aktiven Substanz an das ma cciac te Glas i^rden Üilanbindemittel bevorzugt,
die sowohl eine Aminogruppe als auch eine Alkoxysilylgruppe oder sowohl eine Carboxylgruppe als auch eine Alkoxysilylgruppe enthalten.
Die Reaktion, die in der Regel abläuft zwischen dem Silanbindemittel und der immunologisch aktiven Substanz, ist eine Peptidbildungsreaktion
und es erweist sich als besonders vorteilhaft, dabei ein wasserlösliches Carbo-diimid, das als Dehydratationskondensationsmittel wirkt, z. B.
N-A" chyl--N ' -demethylaminocarbodiimid , 1 -Äthyl-S-diisopropylaminocarbodiimid
oder 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid, zu verwenden
.
Nach der zweiten Verfahrensweise kann das Konjugat z. B. nach folgender
Methode hergestellt werden: zuerst wird das Silanbindemittel an das
mattierte Glas gebunden, dann wird das Silan-Glas-Reaktionsprodukt mit
dem Vernetzungsmittel umgesetzt, und schließlich wird das erhaltene
Zwischenprodukt mit der immunologisch aktiven Substanz umgesetzt. Vom Standpunkt einer festen und dauerhaften Bindung der immunologisch aktiven
Substanz mit dem Mattglas her betrachtet,sind bevorzugte Silanbindemittel
amino- und alkoxysilylhaltige Silanbindemittel, insbesondere Aminoalkyl-trialkoxysilane,
und bevorzugte Vernetzungsmittel aliphatische Dialdo.hyda, insbesondere Glutaraldehyd.
Die Menge des in den chemischen Methoden verwendeten Silanbindemittels
ist nicht kritisch und kann im Rahmen der Erfindung in weiten Grenzen variieren. Das Gewichtsverhältnis einer Lösung des Silanbindemittels
zum Mattglas kann z. B. 30/100 bis 1000/100 betragen, wobei die Lösung
eine Konzentration von in der Regel 0,01 bis 50 Vol-%, Vorzugs-
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weise 0,1 bis 10 Vol-%, aufweist.
Die Menge des nach der zweiten Verfahrensweise verwendeten Vernetzungsmittels
ist ebenfalls nicht kritisch und kann in weiten Grenzen variieren. Das Gewichtsverhältnis einer Lösung des Vernetzungsmittels zum Mattglas kann z. B. 30/100 bis 1000/100 betragen, wobei
die Lösung eine Konzentration von in der Regel 0,0001 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise von 0,1 bis 20 Gew.-%, hat.
Die Verfahren zum Binden der immunologisch aktiven Substanz an das
mattierte Glas mit Hilfe des Silankupplungsmittels und erforderlichenfctlLo
des Vernetzunysrnittels können ähnlich den bekannten, bisher verwendeten
Verfahren sein, mit der Ausnahme, daß als Trägerglas das mattierte Glas verwendet wird.
Kin Beispiel für derartige Verfahren, hai dem die immunologisch aktive
Substanz an die Mattglasoberfläche mit Hilfe des Silanbindemittels
nach der ersten Verfahrensweise gebunden wird, ist das folgende: Das
mattierte Glas wird gut eingetaucht in nine Lösung des Silanbindemittels, die eine Lösung mit einer Konzentration von 0,01 bis 50 V/V %
(vorzugsweise 0,1 bis 10 V/V o) in einem organischen Lösungsmittel
(z. B. aceton oder Toluol) darstellt, bei einer Temperatur von 0 bis 80 0C während einer Zeitdauer von 10 Minuten bis 24 Stunden, um das
SilanbLndemittel mit dem Mattglas reagieren zu lassen. Das auf diese
Weise behandelte Mattglas wird vom Reaktionsgemisch abgetrennt und nacheinander mit Methanol und deionisertem Wasser gründlich gewaschen.
Zu dem erhaltenen Mattglas werden 10 bis 1000 Teile (vorzugsweise 50 bis 300 Teile) einer Lösung der immunologisch aktiven Substanz mit
einer Konzentration von 0,001 bis 40 g/100ml (verzugsweise 0,01 bis
0,1 g/100ml) pro 100 Teile Mattglas zugegeben und die Reaktion wird
bei etwa 0 bis 40 0C 10 Minuten bis 24 Stunden lang (vorzugsweise
1 bis 3 Stunden lang) ablaufen gelassen, so daß das Mattglas und die
immunologisch aktive Substanz aneinander gebunden werden durch das
Silanbindemittel. Es erweist sich als besonders vorteilhaft, eine Lö-
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.sung eines wasserlöslichen Carbodiimids bei einer Konzentration von
0,1 bis 10 y/100ml bei der Umsetzung der immunologisch aktiven Substanz
mit dem Mattglas,an das ein amino- oder carboxylhaltiges Silanbindemittel
gebunden worden ist, zu verwenden.
Kin Beispiel für Verfahren des angegebenen Typs bei dem die immunologisch
aktive Substanz an die Mattglasoberflache mit Hilfe des Silanbindemittels
und des Vernetzungsruittels gemäß der zweiten Verfahrensweise
gebunden wird, ist wie folgt: Das Mattglas wird gut eingetaucht in eine Lösung dos Silanbindemittels, bei der es sich um eine Lösung
mit einer Konzentration von 0,01 bis 50 V/V % (vorzugsweise 0,1 bis
!0 V/V i) in einem organischen Lösung j lii i ttel (z. E. Aceton ode;
Toluol) handelt, bei einer Temperatur von 0 bis 80 0C während einer
Zeitdauer von 10 Minuten bis 24 Stunden, so daß das Silanbindemittel 'nit dem Mattglas reagieren und daran gebunden v/erden kann. Dann wird
das auf diese Ueise behandelte Mattglas vom Reaktionsgemisch abgetrennt
und nacheinander mit Methanol und deionisiertem V/asser gründlich gewaschen.
Das erhaltene Mattglas wird sodann gut eingetaucht in eins wässrige Lösung des Vernetzungsmittels mit einer Konzentration von
0,0001 bis 50 G/G % (vorzugsweise 0,1 bis 20 G/G %) bei etwa 0 bis
4 0 0C während einer Zeitspanne von 3 0 Minuten bis 10 Stunden, wobei
das Vernetzungsmittel an das zuvor an das Mattglas gebundene Silanbindemittel
gebunden wird. Das auf diese Weise behandelte Mattglas wird sodann vom Reaktionsgemisch abgetrennt und gründlich mit deionisiertem
Wasser gewaschen. Das erhaltene Mattglas wird mit 10 bis 1000 Teilen (vorzugsweise mit 50 bis 300 Teilern) einer Lösung der immunologisch
aktiven Substanz mit einer Konzentration vom 0,001 bis 40 g/100ml
(vorzugsweise vom 0,01 bis 0,1 g/100ml) pro 100 Teile Mattglas versetzt
und die Reaktion wird bei etwa 0 bis 40 0C 10 Minuten bis 24
Stunden lang (vorzugswei.se 1 bis 3 Stunden lang) ablaufen gelassen,
wobei die immunologisch aktive Substanz an das Mattglas durch das .Silanbindemittel
und das Vernetzungsmittel gebunden wird.
Die erfJndungsgemäßen Konjugato aus immunologisch aktiver Substanz
und Glas enthalten in der Regel 0,1 bis 100t! μg, vorzugsweise 50 bis
500 (ig (pro g Mattglas) immunologisch aktive Substanz an das Glas ge-
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- 14 -
blinden. Die Menge an Silanbindemittel, die an öas Mattglas nach der
chemischen Methode gebunden wird, kann z. B. 10 bis 1 μΐηοΐ (vor-
-4 -2
zugsweise 10 bis 10 μΐηοΐ) pro g Glas betragen. Die Menge an Vernetzungsmittel,
das an das Konjugat nach der zweiten Verfahrensweise
die
gebunden wird, macht vorzugsweise/stöchiometrische Menge aus zum Vernetzen
der funktioneilen Gruppe des Silanbindemittels mit der funktioneilen
Gruppe der immunologisch aktiven Substanz, sie kann jedoch variieren, beispielsweise von 20 bis 100 o, bezogen auf die stöc'niometrischa
Menge.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Konjugate aus
immunologisch aktiver Substanz und Mattglas sind stabil und können länger als 1 Jahr gelagert werden, z.B. in einer mit 0,01M-Phosphat
gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH7,2), die 1 % Natriumnitrit
und 1 % Rinderserumalbumin enthält, bei 4 0C.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und
Mattglas sind als diagnostische Reagenzien zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten, z. B. Urin und Serum, verwendbar.
Beispiele für dereirtige physiologisch aktive Substanzen, die
mit den erfindungsgemäßen Konjugaten bestimmt werden können, sind Hormone,
z. B. Insulin, Gonadotropin, 17-Kotosceroide, Wachstumshormone,
Thyroxin, Trijodthyronin und Thyroid-stimmulierende Hormone; Px"oteina,
z. B. IgA, IgG, IgE, IgM, iX-Fetoprotein, CEA und Protamine; antigene
Elemente oder Fraktionen von pathogenen Bacterien, Viren und Protozoan,
ζ. B. Streptococcen, Hepatitis-Virus, Rubella-Virus, Toxoplasma
gondii und Malariaparasiten; und Antikörper gegen Bacterien, Viren, Protozoen, Medikamente und so weiter.
Die erfLndungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und
Mattglas sind zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen in Körper!
Hiss igke L t-jn nach üblichen bekannten Methoden des RiA oder ΕΙΛ
untor Verwendung von Feststof^systemen verwendbar. Typische derartige
Methoden sind z. tt. :
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(1) Die konkurrierende Reaktionsmethode, bei der die zu bestimmende
Substanz und eine bestimmte Menge an enyzm- oder isotopenmarkierter
immunologisch aktiver Substanz (bei der es sich um die gleiche
Substanz handelt, wie die, welche bestimmt werden soll) konkurrierend
umgesetzt werden mit einem Konjugeit aus immunologisch
aktiver Substanz und Mattglas, wobei ein Antigen oder ein Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz an das Mattglas gebunden wird,
worauf die Enzymaktivität oder Radioaktivität derjenigen Substanz, die an das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas
entweder gebunden wurde oder daran nicht gebunden wurde, bestimmt wird; durch Vergleich des Bestimmungsergebnissos mit den Ergebnissen,
die nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung bekannter Mengen der gleichen Substanz wie derjenigen, die zu bestimmen
war, erhalten wurden, wird das Testergebnis erzielt;
(2) die Sandwich-Methode, bei der die zu bestimmende Substanz mit einem Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas
reagieren gelassen wird, wobei ein Antigen oder Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz an das Mattglas gebunden wird, worauf
die gebundene Substanz mit einer immunologisch aktiven Substanz (Antigen oder Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz), welche
mit einem Enzym oder einem Isotop markiert ist, umgesetzt wird, und worauf schließlich die Enzymaktivität oder Radioaktivität der Substanz,
die an das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas gebunden wurde, bestimmt wird; durch Vergleich des Be--.
Stimmungsergebnisses mit den Ergebnissen, die nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung bekannter Mengen der gleichen Substanz
wie derjenigen, die zu bestimmen war, erhalten wurden, wird das Testergebnis erzielt; und
(3) eine Methode, bei der die zu bestimmende Substanz und eine bestimmte
Menge an mit einem Enzym oder Isotop markierter immunologisch aktiver Substanz (welche ursprünglich die gleiche ist, wie
die zu bestimmende Substanz) konkurrierend umgesetzt werden mit einem Antigen oder Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz,
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worauf das gebundene Antigen oder der gebundene Antikörper mit einem Konjugat itus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas
reagieren gelassen werden, wobei ein Antikörper gegen das Antigen oder der Antikörper an das Mattglas gebunden wird, .worauf
schließlich die Enzymaktivität oder Radioaktivität der Substanz, die an das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas
entweder gebunden wurde oder daran nicht gebunden wurde, bestimmt wird; durch Vergleich des Bestimmungsergebnisses mit den
Ergebnissen, die nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung bekannter
Mengen der gleichen Substanz wie derjenigen, die zu bestimmen war, erhalten wurden, wird das Testergebnis erzielt.
Selbstverständlich sind die angegebenen Verwendungsmöglichkeiten der
erfindungsgemäßen Konjugate auf die angegebenen Methoden nicht beschränkt.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und
Mattglas können anstelle verschiedener bekannter, insolubilisierher,
immunologisch aktiver Substanzen in EIA und RIA verwendet werden. So
sind z. D. die erfinduncjsgemäßen Konjugate anstelle folgender Substanzen
verwendbar:
(1) dem an Polystyroiröhren gebundenen anti-CEA in der von S.
Hammarström et al. in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 7_2, 1528
(1975) beschriebenen Methode;
(2) dem an Cellulose gebundenen anti-Kaninchen-if-G oder dem an
Cellulose gebundenen anti-HCG in den von B. K. van Weeman et al. in FEBS Letters 1_5, 232 (1971) beschriebenen Verfahren;
(3) dem an Polystyrolröhren gebundenen anti-AFP in dem von L. Belangar et al. in Clin. Chim Acta 48, 15 (1973) beschriebenen
Verfahren;
(4) dem an Polys tyroi-Häinagglutinationspiatten gebundenen anti-HBs
in dem von G. Wolters et al. in J. Clin. Path. 2£, 873 (1976) beschriebenen Verfahren;
(5) dem an Poly~;tyroiröhren gebundenen anti-TgE in der von D. R.
Hoffman in J. Allergy Clin. Immunol. _5_1_, 303 (1973) beschrie-
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benen Methode;
(6) dem an Dextran gebundenen anti-Insulin in dem von K. Kato
et al. in J. Biochem. 78, 235 (1975) beschriebenen Verfahren;
(7) dem an Polystyrolröhren gebundenen spezifischen Antikörper
in dem von S. E. Salmon in J. Immunol. 1_03 , 129 (1969) beschriebenen
Verfahren; und
(8) dem an Poly(tetrafiioroäthylen-g-isothiocyanatostyrol)-Scheiben
gebundenen anti-menschlichem Wachstumshormon in der von
K. Gate in J. Lab. Clin. Med. 70, 820 (1970) beschriebenen
Methode.
DLe erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz
und Mattglas enthalten großen Mengen an den immunologisch aktiven Substanzen, die fest und stabil gebunden sind und bei Verwendung als
insolubilisierte immunologisch aktive Substanzen eine sehr hohe Empfindlichkeit
und Versuchsgenauigkeit sowie ein breites Versuchsberoieh
ergeben und den weiteren Vorteil haben, daß sie sich durch verbesserte Lagerbeständigkeic auszeichnen und bei der Vorsuchsdurchführung
sehr leicht gehnndhabt werden können, v/ob ei als weiterer Vorteil hinzukommt, daß sie kommerziell levicht herstellbar sind. Sie erweisen
sich daher auf dem Gebiete der diagnostischen Medizin als sehr vorteilhaft.
Hinzukommt, daß die erfindungsgemäßen Konjugate aus .immunologisch aktivai
Substanz und Mattglas wenig Neigung zur Adsorption von Best imrnungsreagentien, Farbstoffen oder Pigmenten und den in den Körper flüssigkeiten
vorliegenden Substanzen haben, welche eine nachteilige Beeinflussung
der Hestimmungsmethode bewirken und die Aktivität der Konjugate behindern;
sie führen daher zu einer weitaus besseren Genauigkeit der Best iinn'.ungmethode (insbesondere in ETA) im Vergleich zu den an poröses
Gl-)..-; gebundenen Konjugacen immunologisch aktiver Substanzen, die zu
einer Adsorption größerer Mengen an die Bestimmung beeinflußendeη Substanzen
führen. Ferner können die nr: "iindungsgenvißan Konjugate aus iinmu-
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noloqisch aktiver Substanz und Mattglas aufgrund ihrer vergleichsweise
größeren Abmessung (wobei der maximale Durchmesser in der Regel 1 bis 20 mm und der minimale Durchmesser in der Recjel 1 mm oder
mehr beträgt) während der Versuchsdurchführung leichtqehandhabt werden
(sie können z. B. mit Hilfe von Pinzetten in Teströhrchen leicht eingebracht oder daraus entnommen werden), wo hingegen die bekannten,
an poröses Glas gebundenen Konjugate, die in der Regel sehr winzig sind,
nur laühsam zu handhaben sind.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie
zu beschränken. DLe folgenden mattierten Gläser gelangten dabei zum Einsatz:
(1) Mattgla,s I (nach physikalischen Methoden mattierte Glaskörper).
300 Glaskörper (6 mm Durchmesser) wurden sandgeblasen durch kräftiges
Aufsprühen von körnigem Korund (Sohleifmaterial), der ein
Sieb von 0,2:") um Maschonwsito. passierto, auf die Glaskörper während
15 Minuten unter einem Luftdruck von 5 bar (5 kg/cm2). Der an den
Glaskörpern anhaftende Korund wurde sodann abgewaschen, wobei MatLglaskörper mit gleichförmigmattierten Oberflächen erhalten
wurden, deren nach der folgenden Methode bestimmter Mattierungsgrad
4,5 betrug.
Messung des Mackierunqsgrads d^s mattierten Glases:
50 Stück der mattierten Glaskörper und 50 Stück der nicht-mattierten
Glaskörper (welche die gleich Gestalt und Größe hatten wie die mattierten Glaskörper) wurden eingetaucht in 25 ml einer 10 %
Lösung von )' -Aminopropyl-triäthoxysilan in Aceton. Nach 1 Stunde
langer Inkubation bai 25 0C wurden die erhaltenen Glaskörper abfiltriert
und ausreichend mit de ionisier tem Wasser gewaschen. Dann wurden (insgesamt) 100 Stück dieser Glaskörper eingetaucht in 25 ml
einer wässrigen Lösung von Glutaraldehyd; nach 1 Stunde langer Inkubation
bei 25 °C wurden die auf diese Weise behandelten Glaskörper
gründlich mit do ionisiertem Wasser gewaschen. Pie erhaltenen Glaskörper
wurden sodann eingetaucht in 25 ml einer wässrigen Lösung, d.Lo 12,5 mg G.luconeox idase (GOO) enthielt (Enzymaktivität 3 1,0 E/ml)
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Nach einer Inkubation von zunächst 1 Stunde bei 25 0C und
anschließend 15 Stunden bei 4 0C wurden die Glaskörper mit
deionisiertem Wasser gewaschen unter Erzielung eines GOD/Mattglaskörper-Konjugats
und eines Konjugats aus GOD und nichtmattierten Glaskörpern. In jedes von 10 Teströhrchen wurde ein
Glaskörper aus dem GOD/Mattierglaskörper-Konjugat eingebracht.
In jedes von 10 weiteren Teströhrchen wurde ein Glaskörper aus dem Konjugat aus GOD und nicht-mattiertern Glaskörper eingebracht.
Tn jedes der 20 Testgläser wurden 2 ml deionsisiertes Wasser gegeben,
der Gefäßinhc'ilt wurde unter Verwendung einer Mischvorrichtung
verrrührt und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer Saugvorrichtung abgesaugt. !Hase Y: i:;chpro.-:edur wurde
zweimal wiederholt. Dann wurden 0,3 ml 0,OIM-Matriumacetatpufferlösung
(pH5,1), 2,0 ml M3TH-DEA-Lösung (10 mg Natriumäthylendiamintetraacetat, 1,7 mg S-Methyl-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid,
0,004 ml Ν,Ν-Diäthylanilin in 100 ml 0,1 Π wässriger Essigsäurelösung)
und 0,5 ml Peroxidase(POD)-Lösung (60 E POD in 1 ml 0,1M-wässrlger
Natriumacetatlösung) in jedes Testgefäß gegeben. Nach
5 Minuten langer Vorinkubation bei 37 0C wurden 0,5 ml einer Lösung
vcn 15g ß-D-Glucose in 100 ml 0,1M-Essigsäurelösung jedem
Testgefäß zugesetzt. Nach genau 6 Minuten langer Inkubation unter Schütteln bei 37 0C wurden in jedes Testgefäß 1 ml 0,5N-SaIzsäure
zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. Die /absorption bzw. Extinktion bei 590 nm der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit in
jedem der Gefäße wurde gemessen. Der Mattierungsgrad wurde nach der
angegebenen Gleichung (1) berechnet unter Verwendung des Durchschnittswert der Absorption der 10 überstehenden Flüssigkeiten des
GOD/Mattglas-Konjugats und derjenigen des Konjugats aus GOD und
unmattiertem Glas als die Enzymaktivitäten.
[2) Mattglas II (nach einer chemischen Methode mattierte Glasröhrchen)
.
100 g kleine Glasröhrchen (6 mixi äußerer Durchmesser, 4 mm innerer
Durchmesser und 10 mm Länge) wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
in 200 ml einer Mattierlösung eingetaucht, die 2 % Fluorwasserstoffsäure
und 1 % AHicniumfiuoriä enthielt. Die Glasröhrchen
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v/urden sodann aus der Lösung Gntnoimnen und mit Wasser gewaschen,
wobei mattierte Glasröhrchen mit gleichmäßig mattierten Oberflächen erhalten wurden, die einen Mattierungsgrad von 3,2 hatten,
bestimmt nach einer ähnlichen Methode wie oben unter (1) angegeben
.
Beispiel Ί
Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz
und Mattglas
Die angegebenen 100 Mattglas röhrchen (Mattglas II) v/urden in 100 ml
einer 0,5%igen Lösung von j'-Aminopropyl-triäthoxysilan in Aceton eingetaucht.
Nach 10 Stunden langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden
die Röhrchen abfiltriert und mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Die erhaltenen 100 Mattglasröhrchen,an die das aminohaltige
Silanbindemittel gebunden worden war, v/urden in 40 ml N-Salzlösung eingetaucht.
Eine Lösung von 50 mg menschliches IgG in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung und eine Losung, die 0,2 % N-Äthyl-N'-dimethylaminopropylcarbodiimid
in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung enthielt, wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden langer Behandlung unter Eintauchen
bei 3 7 0C wurden die Röhrchen nacheinander mit Wasser, wässriger
IM-PropionsäurelÖsung und Wasser gewaschen, bis kein Protein in
den Waschwässern festzustellen war. Auf diese Weise wurde ein Konjugat
erhalten mit einem gebundenen Proteingehalt von 63 μg pro g Glas,
der wie folgt bestimmt wurde:
Messung des gebundenen Proteingehalts:
Messung des gebundenen Proteingehalts:
Nach der von S. Moore et al. in Methods in Enzymology _£, 819 (1963),
beschriebenen Methode wurden 10 Stück des Protein/Glas-Konjugats in
eine Lösung von 6N-Salzsäure eingetaucht und das ganze System wurde
unter vermindertem Druck abgeschmolzen und danach bei 110 0C 30 Stunden
lang erhitzt. Der Proteingehalt wurde nach der Ninhydrin-Färbemethode
bestimmt.
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Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz
und Mattylas.
200 der angegebenen Mattglaskörper (Mattglas I) wurden in 100 ml
einer 0,5%igen Lösung von y-Aminopropyl-triäthoxysilan in Toluol
eingetaucht und 7 Stunden laiig zum Sieden erhitzt. Die Körper wurden
sodann abfiltriert und mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen.
Zu den 200 Mattglaskörpern, an die das aminohaltige Silanbindemittel
gebunden war, wurden 100 ml wässrige 2oige Glutaraldehydlösung
zug ^g-? ο en. Mach 2 .'J runden lang-^n '.'<
ί:-?α-·η Lv-: L Λ "C vvuraen dia
Glaskörper mit deionisiertem Wasser 4 bis 6 mal gewaschen, bis sie
nicht mehr den Geruch nach Glutaraldehyd aufwiesen. Die auf diese Waise behänd;:! ten 200 Mat tglaskorper wurden sodann in 40 ml N-SaIzlösung
einget lucht. Hierzu wurde eine Lösung von 50 mg anti-menschliches
Insulin (Kaninchen) in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt.
Nachdem die Reaktion 2 Stunden lang bei 30 0C ablaufen gelassen
worden war, wurden die Glaskörper gründlich mit Wasser gewaschen, bis kein Protein in den Waschwässern mehr nachweisbar war.
Auf diese Weise wur-J/; ein Konjugat erhalten, das einen in ähnlicher
Weise wie in Beispiel 1 gemessenen gebundenen Proteingehalt von 148 μg
pro g Glas aufwies.
Beisp_i.el 3
Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz (menschliches Insulin)
mit dem Konjugat fms immunologisch aktiver Substanz und Mattglas
(Sandwich EIA) .
Die Tnsulir>b'.' - c<
mmung nach der Sandwich-EIA-Methode wurde durchgeführt
unter Verwendung der Konjugate aus anti-menschliches Insulin (Kaninchen)
und Mattglas, die gjmUii Beispiel 2 erhalten worden waren. In jede:;
der Teströhrchen (0,9 χ 10 cm) wurden 0,3 ml einer Lösung von
0 , 0 1 M-Nat riumphosphatpuEf er (pH7,3), die 0,85 'i Natriumchlorid und 0,1 ■.
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Rinderserumalbumin enthielt (im folgenden air. "Pufferlösung A" bezeichnet)
, zugegeben.
In jedes Teströhrchen wurde ein Konjugatkörper aus anti-menschlichem
Insulin/Mattglas, hergestellt nach Beispiel 2, eingebracht. Verschiedene Verdünnungen von menschlichem Insulin wurde hergestallt mit Pufferlösung
A und in die Testgläser (0,1 ml/Glas) gegeben. Nach 1 Stunden langem Schütteln bei Raumtemperatur wurden 0,1 ml mit Phosphatvase
markiertes anti-raenschlichas Insulin zu jedem Testglas zugesetzt. Nach
weiterem Schütteln oder Inkubieren während 1 Stunde wurde etwa 5 ml
N-Salzlösung zu jedem der Glaser zugegeben und der Glasinhalt wurde
gerührt unter Verwendung einer Mischvorrichtung, worauf die überstehende
Flüssigkeit rr.it Hilfe einer Saugvorrichtung abgesaugt wurde. Diese
Waschprozedur wurde viermal wiederholt. Dann wurden 2 ml eines Enzymsubstratreageus
(das enthalten war in einem ΑΤ,Ρ-Bestimmungspack der Chugai Pharmaceutical Cc;., Ltd.) in jedes Testglas gegeben. Die
Inkubeition oder Reaktion bei 37 0C während 30 Minuten unter Schütteln
schloß sich an. Dann wurden 2,0 ml einer Farbbildungsiösung (die enthalten
war in dem angegebenen ALP--Bes tiinmungspack der Chugai Pharmaceutical
Co., Ltd. ) jedem Tostglas zugesetzt. Nach weiterer Inkubation unter Schütteln bei 37 0C während 30 Minuten wurde die Absorption bei
5 70 Uiii gemessen zur Bestimmung der Enzymaktiv ltat. Figur 1 gibt die
Standardbestimmungskurve für menschliches Insulin wieder bei Verwendung
des Konjugats aus Kaninchen-anti-r.'.enschliches Insulin/Mattglaskörper.
Bestimmung der Wirkungsweise des Konjugats 1 aus immunologisch aktiver Substanz uad Mattglas.
ft in Konjugat aus Kaninchen-anti-measchlicheo Insulin/unmattiertem
Glaskörper wurde nach dem in Beispiel k beschriebenen Verfahren hergestellt
,jedoch untor Vorwendung von unmattierten Glaskörpern (6 nm
D lu: el·. :->:--. se r) und mit dem Konjugat aus Kan Lnchen-anti-menschliches Insulin/rlattglaskörper
goinäS Beispiel 2 verglichen in Bezug auf die Men
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- 23 -
ge an gebundenem Prohein. Das gebundene Protein wurde nach der in Bei.spiel 1 beschriebenen Methode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.
Tabelle I
Probe Gebundenes Protein (ug/g Glaskörper)
Probe Gebundenes Protein (ug/g Glaskörper)
Kaninchen-anti-menschliches Insuliii/Mattglaskörper-Konjugat
148
Kaninchen-anti-menschliches Insu-
lin/'-inmactiarte Glaskörper-Kon jugat 32
Die Ergebnisse zeigen, daß eine größere Menge an immunologisch aktiver
Substanz an den mattierten Glaskörper als an den unmattierten Glaskörper
gebunden werden kann.
Bestimmung der Wirkungsweise des Konjugats 2 aus der immunologisch
aktiven Substanz und mattiertem Glas.
Ein Konjugat aus Kaninchen-anti-menschliches Insulin/unmattiertem Glaskörper
wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt mit der Ausnahme, daß unmattierte Glaskörper verwendet wurden. Unter
Verwendung dieses Konjugats und des Konjugats aus Kaninchen-anti-menschliches Insulin/Mattglaskörper, hergestellt gemäß Beispiel 2, wurden Bestimmungen
des menschlischen Insulns nach der in Beispiel 3 beschriebenen Methode durchgeführt und die Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode,
das Versuchsbereich und die Vorsuchsgenauicjkeit wurden zwischen den
beiden Konjugaten verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.
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Bestürmung von menschlichem Insulin mit Konjugat aus Kaninchen-anti-menschlLches
Insulin/mattierten Glaskörpern
Bestimmung von menschlichem Insulin mit Kaninchen-rjnti-menschli
ches Insulin/unmattierten Glaskörpern
Emp Eindlichkeit (μΕ/ml)
Versuchsbereich (μΕ/ml)
Cep.::;iiigkeit (bei f-iestiniüung
von 120 μΕ/ml menschlichem Insulin)
0,2
0,2 - 450
0,2 - 450
113 ·- 5 Ul-VrPl
(Variationskoeffizient
=4,2 %)
(Variationskoeffizient
=4,2 %)
20 20 - 250
110 - 20 μΕ/ml (Variationskoeffizient
= 27,3 %)
Die Ergebnisse zeigen, daß das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und mattiertem Glaskörper weitaus besser ist in Bezug auf
Empfindlichkeit und Versuchsbereich sowie Versuchsgenauigkeit als das
entsprechende, aus unmattierten Glaskörpern hergestellte Konjugat.
Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz
und Mattglas.
(1) Reduktion von anti-menschliches o<
-Fetoprotein (anti-menschliches AFP)
Zu 10 ml einer wässrigen Lösung von 100 mg anti-menschliches AFP
(Kaninchen) (DAKO-Immunoglobulins Ltd., Dänemark) wurde 1 ml einer
0, 1M-wässrigen Lösung von 2-Mercaptoäthylarnin zugegeben und die
Inkubation wurde bei 37 0C 90 Minuten lang durchgeführt. Das auf
diese Weise reduzierte anti-menschliche AFP wurde abgetrennt und gereinigt durch eine Sephadex G-25-Säule ( 1 χ 40 cm),die gepuffert
war mit 0,IM-Natriumacetatpuffer (pH5,0).
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(2) Herstellung eines Konjugats aus immunologisch aktiver Substanz
(anti-menschliches AFP)/Mattglaskörpern
200 Stücke der Mattglaskörper (Mattglas I) wurden eingetaucht in 100 ml einer 0,5 ο igen Lösung von V-Mercaptopropyl-trimethoxysilan
in Toluol und die Reaktion wurde 8 Stunden lang unter Rückfluß vonstatten gehengelassen. Die Glaskörper wurden sodann abfiltriert und
mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Zu den 200 Matt-glaskörpern,
an die das thiolhaltige Silanbindemittel gebunden war, wurden 100 ml einer gesättigten N,N'-o-Phenylendimaleimidlösung in
0,IM-Natiumacetatpuffer (pH5,0) zugegeben. Die Inkubation wurde bei
30 0C 2 Stunden lang durchgeführt. Die Glaskörper wurden viermal
mit: ilaionis L ercam Wasser gewri.;chea. I)Io erhalt-.2r>jn 200 Glaskörper
wurden sodann eingetaucht in 90 ml 0,1M-Natriumacetatpuffer (pH5,0),
und 50 mg des wie oben unter (1) beschrieben reduzierton anti-menschliches
AFP in 10 ml 0,1M-Natriumacetatpuffen (pH5,0) wurden zugesetzt.
Nach der nachfolgenden Reaktion bei 30 0C während 2 Stunden
wurden die erhaltenen Mattglaskörper gründlich mit Wasser gewaschen,
bis in den Waschwässer kein Protein mehr festzustellen war.
Auf diese Weise wurde ein Konjugat aus anti-menschliches AFP/Mattglas
erhalten mit einem nach einer ähnlichen Methode wie in Beispiel
1 beschrieben gemessenen gebunendon Proteingehalt von 103 ng
pro g Glas.
VergleIchsbeispiel· 1
Nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren, jedoch unter Verwendung
von unbehandelten (unmattierten) Gleiskörpern (6 mm Durchmesser) wurde ein Konjugat aus anti-menschliches AFP/unmattierten
Glaskörpern erhalten mit einem nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessenen gebundenen Proteingehalt von 19 μg pro g
Glas .
Be_i_splel 7
Bestimmung einer physiologisch aktiven Substanz (menschliches ;<<-Fetoprotein
menschliches AFP) unter Verwendung des Konjugats aus der
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26 " 2305657
immunologisch aktiven Substanz und Glas nach dem Sandwich-EIA.
Unter Verwendung des Konjugats aus dem anti-menschlichen AFP/Mattglaskörpern
und des Konjugats aus dem anti-menschliches AFP/unmattierte Glaskörper wurde die Bestimmung von menschlichem AFP nach dem
Sandwich-EIA durchgeführt.
Es wurden 0,3 ml der Pufferlösung A gemäß Beispiel 3 und 1 Körper des Konjugats aus anti-menschliches AFP/Mattglaskörper gemäß Beispiel
6 oder des Konjugats aus anti-menschliches AFP/nicht mattierter Glaskörper gemäß Beispiel 1 in jedes der Testgläser (0,9 χ 10 cm) eingebracht.
Verschiedene Verdünnungen von menschlichem AFP wurde hergestellt mit der Pufferlösung A und 0,1 ml-Anteile derselben wurden in
jedes Testglas zugegeben. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 1
Stunde lang durchgeführt. Nach der Reaktion wurden etwa 5 ml physiologische
Kochsalzlösung zugegeben, das Gemisch wurde unter Verwendung einer Mischvorrichtung gerührt und die überstehende Flüssigkeit wurde
unter Verwendung einer Saugvorrichtung abgesaugt, um das Waschen der Glaskörper zu bewirken. Dann wurde 0,1 ml eines mit Peroxidase
markierten anti-menschliches AFP und 0,3 ml der Pufferlösung A in
jedes Testglas zugegeben und die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang durchgeführt. Nach beendeter Reaktion wurden etwa 5 ml
physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt, das Gemisch wurde unter Verwendung eines Mischer gerührt und die überstehende Flüssigkeit wurde
unter Verwendung einer Saugvorrichtung abgesaugt, um das Waschen der Glaskörper zu bewirken. Ein Enzymsubstratreagens (2,5 ml einer frisch
zubereiteten Lösung von 5-Aminosalicylsäure (0,6 mg/ml) und Karnr.toffpurcxid
(0,2 mg/ml) in 0,03M-Natriumphosphatpuffer (pH6,0)) wurden
in jedes Testglas gegeben. Nach 1 Stunde langer Inkubation bei 37 0C
wurden 0,1 ml einer 10%igen wässrigen Lösung von Natriumazid in jedes
Testglas zugesetzt zur Unterbrechung der Reaktion und die Absorption
bei 500 nm wurde gemessen und zu der Enzymaktivität in Beziehung gesetzt.
Die StandardbestLmmungskurve für manschliches AFP bei Verwendung des Konjugats .aus anti-menschliches AFP/Mattglaskörper sowie
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diejenige bei Verwendung des Konjugats aus anti-menschliches AFP/
nicht-mattierte Glaskörper sind in Figur 2 durch die ausgezogene Linie bzw. die unterbrochene Linie wiedergegeben.
Der Einfluß beider Konjugate wurde miteinander verglichen in Bezug
auf Empfindlichkeit, Versuchsbereich und Versuchsgenauigkeit. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.
Empfindlichkeit Versuchsbere ich
Versuchsgenau:gkei t (bei Bestimmung von 80 ng/ml
menschliches AlT)
Bestimmung von menschlichem AFP mit Konjugat aur, antimenschliches
AFP/Mattglaskörper
Bestimmung von menschlichem 7VfP mit Konjugat aus
anti-menschliches AFP/ iiicht-mattierte Glaskörpe
0,5 | 10 | 10 |
0,5 - 500 | - 100 | |
79 - 3 ng/ml (Variat ionskoeff iζ ien t = 3,8 ri) |
76 - 28 ng/ml (Variationskoeffiz ient = 36,8 %) |
|
Aus Figur 2 und Tabelle III ergibt sich eindeutig, daß das Konjugat.
aus immunologisch aktiver Substanz/Mattglas weitaus besser ist in Bezug auf Empfindlichkeit, Bestimmungsbereich und Genauigkeit als das
entsprechende, unter Verwendung der unmattierten Glaskörper hergestellte
Konjugat.
909833/0842 BAD ORIGINAL
Claims (5)
- MiTLLER-BORlS · DlOUFiIL · SCHON · HEBTRL
- ρ at κ ν τα ν W.
- UTB 23 05657
- 4. Feb. 1979DR. WOLFCANG MÜLLER-BOR=; (PATENTANWALT VON 1927-19/5) OR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHEM. DR ALFREO SCHÖN, DIPL.-CHiM. WERNER HERTEL, DiPL-PHVS.ZUGELASSENE VERTRRTEH DEIM EUBOP XISCH ^N F1AIENfAMTD/R/we - S 3183.Sanyo Chemical Industries, Ltd. No. 11-1 Ichinohashinomoto-cho, Higashiyama-ku,Kyo to, JapanKonjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Glas, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselbenPatentansprüche.'', Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Glas, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologisch aktive Substanz physikalisch oder chemisch an ein Mattglas gebunden ist.2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologisch aktive Substanz und das mattierte Glas mit Hilfe eines Silanbindemittels und erforderlichenfalls eines Vernetzungsmittels miteinander verbunden sind.909833/0842s 5t!;.\-(;i(}:> 10 · in eiikutstii. -t ■ ro.sr ν \c;ii SG0720 · kauet.: mlmuioi-at · xi:r,. (OS!»3. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus immunologisch aktiver Substanz und Glas nach Anspruch 1 f dadurch gekennzeichnet, daß man eine immunologisch aktive Substanz und ein Mattglas mit einem Silanbindemittel und erforderlichenfalls einem Vernetzungsmittel umsetzt.4. Verfahren nach Anspruch 3,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reaktionsprodukt aus dem Mattglas mit Silanbindemittel mit der immunologisch aktiven Substanz, erforderlichenfalls mit Hilfe eines Vernetzungsmittels, umsetzt.
- 5. Verwendung des Konjugats aus imraunologisch aktiver Substanz und Glas nacii Anspruch 1 in diagnostischen Reagentien oder zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen.;; 9038 3 37 t) 84 2
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