DE2905657A1 - Konjugate aus immunologisch aktiver substanz und glas, verfahren zu deren herstellung und verwendung derselben - Google Patents

Konjugate aus immunologisch aktiver substanz und glas, verfahren zu deren herstellung und verwendung derselben

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Description

O _
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen näher gekennzeichneten Gegenstand. Bei den erfindungsgemäßen Konjugaten handelt es sich um solche aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas, die die Bestimmung aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten, z. B. von Hormonen und Proteinen, mit sehr hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit ermöglichen und in vorteilhafter Weise in diagnostischen Reagentien verwendbar sind.
Die Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen, z. B. Hormonen und Proteinen, die in Körperflüssigkeiten, z. B. Urin und Serum, enthalten sind, ist vom diagnostischen Standpunkt aus sehr wichtig und entweder durch die auch im deutschen Sprachgebrauch als Radio-Immunoassay (im folgenden abgekürzt RIA) bezeichnete Bestimmungsmethode oder durch Enzym-Immunoassay (im folgenden abgekürzt als EIA) durchführbar. Sowohl RIA als auch EIA basieren auf dem gleichen Prinzip, nämlich auf der Spezifität von Antigen-Antikörperreaktionen.
Geeignete, für RIA und EIA üblicherweise verwendete Bestimmungssysteme sind Festphasensysteme, in denen immunologisch aktive Substanzen zur Anwendung gelangen, die mit Hilfe von wasserunlöslichen Trägerstoffen insolubisiert sind. Bei den bisher verwendeten wasserunlöslichen Trägerstoffen handelt es sich um (1) Kunststoffe, wie Polystyrol und Polyäthylen, (2) natürliche Polymere, wie Sepharose und Cellulose, (3) Gläser usw. Die Verwendung von Kunststoffen (z. B. Polystyrol und Polyäthylen) als wasserlösliche Trägerstoffe erweist sich als nachteilig wegen deren unbefriedigender Lagerungsstabilität und Versuchsgenauigkeit. Immunologisch aktive Substanzen, die an natürliche Polymere, wie Sepharose oder Cellulose, gebunden sind, sind flockig oder flaumig und schwierig zu handhaben und erfordern überdurchschnittliches Geschick, um damit die Bestimmungen erfolgreich durchführen zu können. Andererseits unterscheiden sich Gläser von den angegebenen wasserunlöslichen Trägerstoffen dadurch, daß immunologisch aktive Substanzen daran durch covalente Bindungen gebunden werden können und daß die an Gläser gebundenen immunologischen aktiven Substanzen stabil und sehr leicht zu handhaben sind. Die bishar verwendeten Gläser haben jedoch den Nachteil, daß die Menge em immunologisch aktiver Substanz, die daran gebunden werden
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kann, nur gering ist und daß deshalb die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung nicht voll befriedigt und das Versuchsbereich ziemlich eng ist.
Aufgabe der Erfindung isL es die aufgezeigten Nachteile auszuschalten und Mittel und Wege anzugeben, mit deren Hilfe die Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit in einem viel breiteren Versuchsbereich gelingt.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt in der in den Patentansprüchen gek ·:■: η η ■-: <-t 1 c h r»^ u e n. Vi e i s r> i :i i ζ Hilfe ν ο η K ο η j u g a t a η , i p. d e r\ a η i mmu η ο 1 ο g 1 s c h aktive Substanzen physikalisch oder chemisch an die Oberfläche eines mattierten Glases gebunden sind.
Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher veranschaulicht, in der darstellen
Figur 1 eine Standardkurve zur Bestimmung von menschlichem Insulin nach der Sandwich-EIA-Methode (vgl. das unten angegebene Beispiel 3), und
Figur 2 eine Standardkurve zur Bestimmung von menschlichem c.-Fetoprotein mich der Sandwich-EIA-Methode {vgl. das unten angegebene Beispiel 7).
Der Typ der erfindungsgemäß verwendeten immunologisch aktiven Substanz ist nicht sonderlich kritisch. Geeignete derartige Substanzen sind z. B. Antigene und Antikörper. Beispiele für Antigene sind Hormone, z. B. Insulin, Gonadotropin, 17-Ketosteroide, Wuchshormone, Thyroxin, Trijodthyronin und Thyroid-stimmuliorende Hormone; Proteine, z. B. IgG, IgA, IgM, IgE,κ -Fetoprotein, CEA (Carcinoembryonales Antigen) und Protamine; und antigene Komponenten von Pathogenen, z. B. pathogenen Bakterien (z. B. Streptococcen) , Viren (?;. B. Hepatitis-Virus und Rubella-Virus), Protozoen (z. B. Toxoplasma gondii und Malaria-Parasiten) und dergleichen. Geeignete Antikörper sind z. B. Antisera, die in üblicher bekannter Weise durch Immunisierung von Säugetieren (ζ. B,
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Kaninchen und Ziegen) mit Hilfe der angegebenen Antigene erhalten werden können. Vorzugsweise handelt es sich bei den Antikörpern um solche, die aus den Antiseren nach üblichen bekannten Reinigungsmethoden, z. B. Franktionierung unter Verwendung von gesättigem Ammoniumsulfat, DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie und Affinitätschromatographie, erhalten werden.
Der Typ des erfindungsgemäß verwendeten Mattglases ist ebenfalls nicht sonderlich kritisch. So sind z. B. physikalisch (mechanisch) mattierte Gläser sowie chemisch wattierte Gläser verwendbar, wie sie z. B. in Encyclopedia Chimica, Band 5, Seite 999, Kyoritsu Publishing Co., 1963, beschrieben werden. In dfr Regel wer<lan solche Gläser verwendet, die eine unregelmäßige und in winzigen Dimensionen unebene Oberfläche, die durch eine physikalische oder chemische Behandlung verursacht ist, aufweisen. Geeignete physikalische Methoden sind z. B. das Abschleifen der Glasoberflache unter Verwendung eines Schleifrnaterials (z. B. Schleifmittel, Schleifpapier oder mit Schleifmittel beschichtete Textilien) , das Aufsprühen eines Schleifmaterials (z. B. Schmirgel oder körniger Korund) mit Hilfe von Druckluft auf die Glasoberflache (Sandblasen) oder das Abschleifen der Glasoberfläche mit einem Schleifmaterial in einer geeigneten Vorrichtung z. B. einer Kugelmühle. Eine geeignete chemische Behandlung iot z. B. das Ätzen mit Fluorwasserstoffsäure, Ammoniumfliorid oder einem Alkali. Im Hinblick auf die Verarbeitbarkeit und Effizienz der Mattierungs-operation werden das Sandblasverfahren und die unter Verwendung einer Mattierungslösung, die Fluorwasserstoffsäure oder Ammoniumfluorid enthält, durchgeführte Methode bevorzugt als physikalische bzw. chemische Behandlungsmethode. Die Gestalt der Glaskörper ist nicht kritisch und geeignete Formen sind z. B. zylindrische, kugelförmige, röhrenförmige und kubische Ausgestaltungen. Die Größe der Glaskörper ist nicht sonderlich kritisch, doch beträgt dar maximale Durchmesser in der Regel 1 bis 20 mm und der minimale Durchmesser moistens 1 mm oder mehr.
Geeignete mattierte Gläser sind z. B. solche mit einem Mattierungsgrad von in der Regel 1,5 bis 10,0, vorzugsweise 2,0 bis 9,0. Hier und im
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folgenden v/ird der Mattierungsgrad definiert als das Verhältnis von Enzymaktivität eines an mattiertes Glas gebundenen Enzyms zu derjenigen eines an unmattiertes Glas (mit der gleichen Gestalt und Größe) gebundenen Enzyms. Dabei werden die Enzymaktivitäten nach der folgenden Methode bestimmt:
(a) Herstellung von Enzym/Glas-Konjugaten:
Gleiche Mengen des mattierten Glases und des unmattierten Glases, das die gleiche Gestalt und Größe wie das mattierte Glas hat, v/erden in eine 10%ige Lösung von > -x\minopropyl-triäthoxysilan in Aceton eingetaucht. Nach 1 Stunden langer Inkubation bei 25 0C werden die Glaser abfiltiert und mit entionisiertem Wasser gewaschen. Zu den behandelten Gläsern wird eine 20%ige wässrige Lösung von Glutaraldehyd zugegeben. Nach 1 Stunde langem Stehen bei 25 0C v/erden die Gläser mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die so behandelten Gläser werden sodann in 0,5 mg/ml einer wässrigen Lösung von Glucoseoxidase (GOD) eingetaucht (Enzymaktivität von 34,0 E/mg, Toyo Boseki K.K.). Nach 1 Stunden langer Inkubation bei 25 0C und anschließender 15 stündiger Inkubation ei 4 0C werden die Gläser abfiltriert und mit deionisiertem Wasser gewaschen unter Erzielung eines GOU/Hattglas-Konjugats und eines Konjugats aus GOD und unmattiertem Glas, die sodann zur Messung der Absorption bzw. Extinktion herangezogen werden.
(b) Messung der Absorption:
Eine bestimmte Anzahl (in der Regel 1 Stück) des GOD/Mattglas-Konjugats wird in jedes von insgesamt 10 Reagenzgläsern eingebracht. Eine Enzymsubstratlösung mit einem Gehalt an ß-D-Glucose wird zu jedem Reagenzglas zugegeben, worauf eine Farbbildungslösung zugesetzt wird, die 3-Methyl-2-benzo-thiazolinonhydrazon-hydrochlorid (MBT[I), N,N-Üiäthylanilin (DEA) und Peroxidase (POD) enthält. Nach Inkubation wird die Absorption bei 590 mn der Überstände in jedem Reagenzglas gemessen. Die angegebene Verfahrensweise wird wiederholt mit der Ausnahme, daß anstelle des GOD/Mattglas-Korijugats das Konjugat aus GOD und unmattiertem Glas verwendet wird.
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Der Durchschnittswert der Adsorption bei 590 nm der Überstände in jedem Reagenzglas wird als die Enzymaktivität der Konjugate aus Enzym und mattiertem Glas bzw. aus Enzym und unmattiertem Glas angenommen.
Der Mattierungsgrad des mattierten Glases (X) wird nach der folgenden Gleichung (1) berechnet:
Enzymaktivität des an das mattierte Glas gebundenen Enzvms
Enzymaktivität des art das unmattierte Glas gebundenen Enzyms
Das angewandte Gewichtsverhäitnis von immunologisch aktiver Substanz zu Mattglas ist nicht sonderlich kritisch, sondern kann in weiten Grenzen ja nach Erfordernis variieren. So werden z. B. 10 bis 1 000 Teile, vorzugsweise 50 bis 300 Teile,einer Lösung der immunologisch aktiven Substanz pro 100 Teile des mattierten Glases verwendet, wobei die Konzentration der Lösung in der Regel 0,001 bis 40 g/100ml, vorzugsweise 0,01 bis 0,1 g/100ml, beträgt.
Etrfindungsgemäß ist es wichtig, einen speziellen Trägerstoff, nämlich ein mattiertes Glas, zu Insolubilisierung der immunologisch aktiven Substanz zu verwenden. Die angewandten Methoden zum Binden der immunologisch aktiven Substanz an das Mattglas sind nicht sonderlich kritisch, Die immunologisch aktive Substanz kann an die Mattglasoberfläche nach physikalischen oder chemischen Methoden gebunden werden. Letztgenannte Methoden werden bevorzugt im Hinblick auf die Tatsache, daß damit eine große Menge an der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte Glas fest und dauerhaft gebunden wird.
Das Binden durch eine physikalische Methode kann hauptsächlich durch physikalische Adsorption (van der Waals-AdsorptLon) erzielt werden. So kann z. B. das mattierte Glas in eine Lösung der immunologisch aktiven Substanz eingetaucht und inkubiert oder stehengelassen werden während einer zur Bildung der physikalischen Bindung geeigneten Zeitspanne.
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Die verwendete Losung hat eine Konzentration von in der Regel 0,001 bis 40 g/100ml, vorzugsweise 0,01 bis 0,1 g/100ml. Die Eintauchoder Untertauchbehandlung kann z. B. bei einer Temperatur von 0 bis 45 0C 1 bis 48 Stunden lang durchgeführt werden.
Eine geeignete chemische Methode ist z. B. eine solche, bei der die immunologisch aktive Substanz an die Mattglasoberfläche gebunden wird mit Hilfe eines Silanbindemittels und erforderlichenfalls eines Vernetzungsmittels .
Verwendbar ist jedes beliebige Silanbindemittel, das in seinem Molekül sowohl >:iiie funke lonelle Gruppe, di.e mit den mattierten Glas zu reagieren vermag, als auch eine funktioneile Gruppe, die mit der immunologisch aktiven Substanz und/oder dem Vernetzungsmittel zu reagieren vermag, aufweist. Beispiele für geeignete, mit dem Mattglas reaktive funktioneilt: Gruppen sind z. B. solche, die mit einer Silanolgruppe des mattierten Glases reagieren; hierzu gehören z. B. Alkoxysilylgruppen (z. B. Methoxy- oder Äthoxy-substituierte Silylgrupper), Halogensily!gruppen (ζ. B. Chlor-substituierte Silylgruppen) und dergleichen. Beispiele für geeignete funktioneile Gruppen, die mit der immunologisch aktiven Substanz und/oder dem Vernetzungsmittel zu reagieren vermögen, sind solche, die mit Amino-Carboxyl·- und/oder Thiolgruppen reaktiv sind; hierzu gehören z. B. Carboxyl- Epoxy-, Halogenalkyl-(ζ. B. Chloräthyl- und Chlorpropy!gruppen), Aldehyd^Amino- (primäre und sekundäre Aminogruppen) , Thiol-, Isocyanat-, Carboxylat-, Imino- und Nitril- (oder Cyano-)Gruppen. Spezielle Beispiele für geeignete funktioneile Gruppen, die mit der Aminogruppe reagieren,sind z. B. Carboxyl-, Epoxy-, Halogenalkyl- und Aldehydgruppen; geeignete funktionelle Gruppen, die mit der Carboxylgruppe reagieren,sind z. B. Aminogruppen (primäre und sekundäre Aminogruppen) und Epoxygruppen; geeignete funktionelle Gruppen, die mit dar Thiolgruppe reagieren, sind z. B. Thiol-, Epoxy- Halogenalkyl- und Aldehydgruppen.
Typische erfindungsgemäß geeignete Silanbindemittel sind z. B.: (1) Silanbindemittel·, die Amino- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
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Aminoalkyl-trialkoxysilane (z. B. χ -Aminopropyl-trimethoxysilan, y-Aminoprpyl-triäthoxysilan), N-(ß-Aminoäthyl)-y-aminopropyl-methyl-dimethoxysilan, N-(ß-Aminoäthyl)-yaminopropyl-trimethoxysilan und dergleichen;
(2) Silanbindemittel, die Thiol- und Alkoxysilylgruppen enthalten :
Mercaptoalkyl-trialkoxysilane (z. B. ^'-Mercaotopropyl-trimethoxysilan) und dergleichen;
(3) Silanbindemittel, die Epoxy- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
>-Glycidoxypropyl-trimethoxysilan, Triäthoxysilylmethyl-■üthylenoxid, B- (3 , 4 -Epoxycyclohexyl) äthy"L-1rimethoxysilan und dergleichen;
(4) Silanbindemittel, die Carboxyl- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
2- (Tr i.methoxysilyl) propionsäure und dergleichen; und
(5) Silanbindemittel, die Halogenalkyl-und Alkoxysilylgruppen enthalten:
>-Chloropropyl-trimethoxysilan und dergleichen.
Beim Binden der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte Glas kann das Silanbindemirtel mit oder ohne einen. Vernetzungsmittel angewandt werden«.
Bei Verwendung eines Vernetzungsmittels wird dieses je nach Typ des Silanbindemittels und je nach Typ der zu bindenden immunologisch aktiven Substanz ausgewählt. Verwendbar sind praktisch alle Vernetzungsmittel, die das Silanbindemittel reit der immunologisch aktiven Substanz zu vernetzen mögen. Geeignete Venetzungsmittel sind z. B. Verbindungen, die die Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe des Silanbindemittels mit der Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz zu vernetzen vermögen, z. B. solche, die zur Erzeugung einer Vernetzungsbindung zwischen Thiolgruppe und Thiolgruppe oder zwischen Ami-nogruppe und Thiolgruppe befähigt sind. Geeignete Ver-
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bindungen, die Aminogruppe und Aminogruppe zu vernetzen vermögen, sind ζ. B. aliphatische Dialdehyde (ζ. B. Glyoxal, Malonaldehyd, Succinaldehyd und Glutaraldehyd) und Dichlorotriazine (2-Amino-4,6-dichloro-s-triazin) und dergleichen. Geeignete Vernetzungsmittel zur Herstellung von Bindungen zwischen Thiolgruppe und Thiolgruppe sind z. B. Dimaleimidverbindung (z. B. N,N'-o-Phenylendimalaimid und N ,N ' -ni-Phenylendimaleimid) . Geeignete Vernetzungsmittel zwischen Amiongruppe und Thiolgruppe sind z. B. Maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidester (z. B. m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester und 4-(Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyl-N-hydroxysuccinimidester).
Zur Herstellung dar erfindungsgemäßen Konjugate nach chemischen Methoden bieten sich die beiden folgenden Verfahrensweisen an:
(1) Binden der immunologisch aktiven Substanz an die Mattglasoberfläche durch das Silankupplungs- oder -Bindemittel, und
(2) Binden der immunologisch aktiven Substanz an die Mattglasoberfläche durch das Silanbindemittel und das Vernetzungsmittel.
Nach der ersten Verfahrenaweire ist das Konjugat z. B. nach folgender Methode herstellbair: Das Silanbindemittel wird zuerst an das mattierte Glas gebunden durch Behandlung des Glases mit dem Silanbindemittel unter Umsetzung des Bindemittels mit den Silanolgruppen dor Mattglasoberfläche, worauf das erhaltene Zwischenprodukt mit der immunologisch aktiven Substanz umgesetzt wird unter Ausbildung einer Bindung zwischen der immunologisch aktiven Substanz und dem mattierten Glas über das Silanbindemittel. Wird ein aminohaltiges Silanbindemittel verwendet, so bildet dieses eine Peptidbindung mit der Carboxylgruppe der immunologisch aktiven Substanz. Die Verwendung eines carboxylhaltigen Silanbindemittels führt zur Bildung einer Peptidbindung mit der Aminogruppe der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines epoxyhaltigen Sileuibindemittels bewirkt eine Additionsreaktion
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mit der Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines thiolhaltigen Silanbindemittels führt zur Bildung einer S-S-Bindung mit der Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines halogenalkylhaltigen Silanbindemittels hat eine elektrophile Subs hituionsreaktion an der Amino- oder Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz zur Folge, und die Verwendung eines aldehydhaltigen Siliinbindemittel führt zur Bildung eines Thioacetals oder Heinithioacetals mit der Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz.
Vom Standpunkt einer festen und dauerhaften Bindung der immunologisch aktiven Substanz an das ma cciac te Glas i^rden Üilanbindemittel bevorzugt, die sowohl eine Aminogruppe als auch eine Alkoxysilylgruppe oder sowohl eine Carboxylgruppe als auch eine Alkoxysilylgruppe enthalten. Die Reaktion, die in der Regel abläuft zwischen dem Silanbindemittel und der immunologisch aktiven Substanz, ist eine Peptidbildungsreaktion und es erweist sich als besonders vorteilhaft, dabei ein wasserlösliches Carbo-diimid, das als Dehydratationskondensationsmittel wirkt, z. B. N-A" chyl--N ' -demethylaminocarbodiimid , 1 -Äthyl-S-diisopropylaminocarbodiimid oder 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid, zu verwenden .
Nach der zweiten Verfahrensweise kann das Konjugat z. B. nach folgender Methode hergestellt werden: zuerst wird das Silanbindemittel an das mattierte Glas gebunden, dann wird das Silan-Glas-Reaktionsprodukt mit dem Vernetzungsmittel umgesetzt, und schließlich wird das erhaltene Zwischenprodukt mit der immunologisch aktiven Substanz umgesetzt. Vom Standpunkt einer festen und dauerhaften Bindung der immunologisch aktiven Substanz mit dem Mattglas her betrachtet,sind bevorzugte Silanbindemittel amino- und alkoxysilylhaltige Silanbindemittel, insbesondere Aminoalkyl-trialkoxysilane, und bevorzugte Vernetzungsmittel aliphatische Dialdo.hyda, insbesondere Glutaraldehyd.
Die Menge des in den chemischen Methoden verwendeten Silanbindemittels ist nicht kritisch und kann im Rahmen der Erfindung in weiten Grenzen variieren. Das Gewichtsverhältnis einer Lösung des Silanbindemittels zum Mattglas kann z. B. 30/100 bis 1000/100 betragen, wobei die Lösung eine Konzentration von in der Regel 0,01 bis 50 Vol-%, Vorzugs-
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weise 0,1 bis 10 Vol-%, aufweist.
Die Menge des nach der zweiten Verfahrensweise verwendeten Vernetzungsmittels ist ebenfalls nicht kritisch und kann in weiten Grenzen variieren. Das Gewichtsverhältnis einer Lösung des Vernetzungsmittels zum Mattglas kann z. B. 30/100 bis 1000/100 betragen, wobei die Lösung eine Konzentration von in der Regel 0,0001 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise von 0,1 bis 20 Gew.-%, hat.
Die Verfahren zum Binden der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte Glas mit Hilfe des Silankupplungsmittels und erforderlichenfctlLo des Vernetzunysrnittels können ähnlich den bekannten, bisher verwendeten Verfahren sein, mit der Ausnahme, daß als Trägerglas das mattierte Glas verwendet wird.
Kin Beispiel für derartige Verfahren, hai dem die immunologisch aktive Substanz an die Mattglasoberfläche mit Hilfe des Silanbindemittels nach der ersten Verfahrensweise gebunden wird, ist das folgende: Das mattierte Glas wird gut eingetaucht in nine Lösung des Silanbindemittels, die eine Lösung mit einer Konzentration von 0,01 bis 50 V/V % (vorzugsweise 0,1 bis 10 V/V o) in einem organischen Lösungsmittel (z. B. aceton oder Toluol) darstellt, bei einer Temperatur von 0 bis 80 0C während einer Zeitdauer von 10 Minuten bis 24 Stunden, um das SilanbLndemittel mit dem Mattglas reagieren zu lassen. Das auf diese Weise behandelte Mattglas wird vom Reaktionsgemisch abgetrennt und nacheinander mit Methanol und deionisertem Wasser gründlich gewaschen. Zu dem erhaltenen Mattglas werden 10 bis 1000 Teile (vorzugsweise 50 bis 300 Teile) einer Lösung der immunologisch aktiven Substanz mit einer Konzentration von 0,001 bis 40 g/100ml (verzugsweise 0,01 bis 0,1 g/100ml) pro 100 Teile Mattglas zugegeben und die Reaktion wird bei etwa 0 bis 40 0C 10 Minuten bis 24 Stunden lang (vorzugsweise 1 bis 3 Stunden lang) ablaufen gelassen, so daß das Mattglas und die immunologisch aktive Substanz aneinander gebunden werden durch das Silanbindemittel. Es erweist sich als besonders vorteilhaft, eine Lö-
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.sung eines wasserlöslichen Carbodiimids bei einer Konzentration von 0,1 bis 10 y/100ml bei der Umsetzung der immunologisch aktiven Substanz mit dem Mattglas,an das ein amino- oder carboxylhaltiges Silanbindemittel gebunden worden ist, zu verwenden.
Kin Beispiel für Verfahren des angegebenen Typs bei dem die immunologisch aktive Substanz an die Mattglasoberflache mit Hilfe des Silanbindemittels und des Vernetzungsruittels gemäß der zweiten Verfahrensweise gebunden wird, ist wie folgt: Das Mattglas wird gut eingetaucht in eine Lösung dos Silanbindemittels, bei der es sich um eine Lösung mit einer Konzentration von 0,01 bis 50 V/V % (vorzugsweise 0,1 bis !0 V/V i) in einem organischen Lösung j lii i ttel (z. E. Aceton ode; Toluol) handelt, bei einer Temperatur von 0 bis 80 0C während einer Zeitdauer von 10 Minuten bis 24 Stunden, so daß das Silanbindemittel 'nit dem Mattglas reagieren und daran gebunden v/erden kann. Dann wird das auf diese Ueise behandelte Mattglas vom Reaktionsgemisch abgetrennt und nacheinander mit Methanol und deionisiertem V/asser gründlich gewaschen. Das erhaltene Mattglas wird sodann gut eingetaucht in eins wässrige Lösung des Vernetzungsmittels mit einer Konzentration von 0,0001 bis 50 G/G % (vorzugsweise 0,1 bis 20 G/G %) bei etwa 0 bis 4 0 0C während einer Zeitspanne von 3 0 Minuten bis 10 Stunden, wobei das Vernetzungsmittel an das zuvor an das Mattglas gebundene Silanbindemittel gebunden wird. Das auf diese Weise behandelte Mattglas wird sodann vom Reaktionsgemisch abgetrennt und gründlich mit deionisiertem Wasser gewaschen. Das erhaltene Mattglas wird mit 10 bis 1000 Teilen (vorzugsweise mit 50 bis 300 Teilern) einer Lösung der immunologisch aktiven Substanz mit einer Konzentration vom 0,001 bis 40 g/100ml (vorzugsweise vom 0,01 bis 0,1 g/100ml) pro 100 Teile Mattglas versetzt und die Reaktion wird bei etwa 0 bis 40 0C 10 Minuten bis 24 Stunden lang (vorzugswei.se 1 bis 3 Stunden lang) ablaufen gelassen, wobei die immunologisch aktive Substanz an das Mattglas durch das .Silanbindemittel und das Vernetzungsmittel gebunden wird.
Die erfJndungsgemäßen Konjugato aus immunologisch aktiver Substanz und Glas enthalten in der Regel 0,1 bis 100t! μg, vorzugsweise 50 bis 500 (ig (pro g Mattglas) immunologisch aktive Substanz an das Glas ge-
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blinden. Die Menge an Silanbindemittel, die an öas Mattglas nach der chemischen Methode gebunden wird, kann z. B. 10 bis 1 μΐηοΐ (vor-
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zugsweise 10 bis 10 μΐηοΐ) pro g Glas betragen. Die Menge an Vernetzungsmittel, das an das Konjugat nach der zweiten Verfahrensweise
die
gebunden wird, macht vorzugsweise/stöchiometrische Menge aus zum Vernetzen der funktioneilen Gruppe des Silanbindemittels mit der funktioneilen Gruppe der immunologisch aktiven Substanz, sie kann jedoch variieren, beispielsweise von 20 bis 100 o, bezogen auf die stöc'niometrischa Menge.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas sind stabil und können länger als 1 Jahr gelagert werden, z.B. in einer mit 0,01M-Phosphat gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH7,2), die 1 % Natriumnitrit und 1 % Rinderserumalbumin enthält, bei 4 0C.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas sind als diagnostische Reagenzien zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten, z. B. Urin und Serum, verwendbar. Beispiele für dereirtige physiologisch aktive Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen Konjugaten bestimmt werden können, sind Hormone, z. B. Insulin, Gonadotropin, 17-Kotosceroide, Wachstumshormone, Thyroxin, Trijodthyronin und Thyroid-stimmulierende Hormone; Px"oteina, z. B. IgA, IgG, IgE, IgM, iX-Fetoprotein, CEA und Protamine; antigene Elemente oder Fraktionen von pathogenen Bacterien, Viren und Protozoan, ζ. B. Streptococcen, Hepatitis-Virus, Rubella-Virus, Toxoplasma gondii und Malariaparasiten; und Antikörper gegen Bacterien, Viren, Protozoen, Medikamente und so weiter.
Die erfLndungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas sind zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen in Körper! Hiss igke L t-jn nach üblichen bekannten Methoden des RiA oder ΕΙΛ untor Verwendung von Feststof^systemen verwendbar. Typische derartige Methoden sind z. tt. :
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(1) Die konkurrierende Reaktionsmethode, bei der die zu bestimmende Substanz und eine bestimmte Menge an enyzm- oder isotopenmarkierter immunologisch aktiver Substanz (bei der es sich um die gleiche Substanz handelt, wie die, welche bestimmt werden soll) konkurrierend umgesetzt werden mit einem Konjugeit aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas, wobei ein Antigen oder ein Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz an das Mattglas gebunden wird, worauf die Enzymaktivität oder Radioaktivität derjenigen Substanz, die an das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas entweder gebunden wurde oder daran nicht gebunden wurde, bestimmt wird; durch Vergleich des Bestimmungsergebnissos mit den Ergebnissen, die nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung bekannter Mengen der gleichen Substanz wie derjenigen, die zu bestimmen war, erhalten wurden, wird das Testergebnis erzielt;
(2) die Sandwich-Methode, bei der die zu bestimmende Substanz mit einem Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas reagieren gelassen wird, wobei ein Antigen oder Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz an das Mattglas gebunden wird, worauf die gebundene Substanz mit einer immunologisch aktiven Substanz (Antigen oder Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz), welche mit einem Enzym oder einem Isotop markiert ist, umgesetzt wird, und worauf schließlich die Enzymaktivität oder Radioaktivität der Substanz, die an das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas gebunden wurde, bestimmt wird; durch Vergleich des Be--. Stimmungsergebnisses mit den Ergebnissen, die nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung bekannter Mengen der gleichen Substanz wie derjenigen, die zu bestimmen war, erhalten wurden, wird das Testergebnis erzielt; und
(3) eine Methode, bei der die zu bestimmende Substanz und eine bestimmte Menge an mit einem Enzym oder Isotop markierter immunologisch aktiver Substanz (welche ursprünglich die gleiche ist, wie die zu bestimmende Substanz) konkurrierend umgesetzt werden mit einem Antigen oder Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz,
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worauf das gebundene Antigen oder der gebundene Antikörper mit einem Konjugat itus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas reagieren gelassen werden, wobei ein Antikörper gegen das Antigen oder der Antikörper an das Mattglas gebunden wird, .worauf schließlich die Enzymaktivität oder Radioaktivität der Substanz, die an das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas entweder gebunden wurde oder daran nicht gebunden wurde, bestimmt wird; durch Vergleich des Bestimmungsergebnisses mit den Ergebnissen, die nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung bekannter Mengen der gleichen Substanz wie derjenigen, die zu bestimmen war, erhalten wurden, wird das Testergebnis erzielt.
Selbstverständlich sind die angegebenen Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Konjugate auf die angegebenen Methoden nicht beschränkt.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas können anstelle verschiedener bekannter, insolubilisierher, immunologisch aktiver Substanzen in EIA und RIA verwendet werden. So sind z. D. die erfinduncjsgemäßen Konjugate anstelle folgender Substanzen verwendbar:
(1) dem an Polystyroiröhren gebundenen anti-CEA in der von S. Hammarström et al. in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 7_2, 1528 (1975) beschriebenen Methode;
(2) dem an Cellulose gebundenen anti-Kaninchen-if-G oder dem an Cellulose gebundenen anti-HCG in den von B. K. van Weeman et al. in FEBS Letters 1_5, 232 (1971) beschriebenen Verfahren;
(3) dem an Polystyrolröhren gebundenen anti-AFP in dem von L. Belangar et al. in Clin. Chim Acta 48, 15 (1973) beschriebenen Verfahren;
(4) dem an Polys tyroi-Häinagglutinationspiatten gebundenen anti-HBs in dem von G. Wolters et al. in J. Clin. Path. 2£, 873 (1976) beschriebenen Verfahren;
(5) dem an Poly~;tyroiröhren gebundenen anti-TgE in der von D. R. Hoffman in J. Allergy Clin. Immunol. _5_1_, 303 (1973) beschrie-
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benen Methode;
(6) dem an Dextran gebundenen anti-Insulin in dem von K. Kato et al. in J. Biochem. 78, 235 (1975) beschriebenen Verfahren;
(7) dem an Polystyrolröhren gebundenen spezifischen Antikörper in dem von S. E. Salmon in J. Immunol. 1_03 , 129 (1969) beschriebenen Verfahren; und
(8) dem an Poly(tetrafiioroäthylen-g-isothiocyanatostyrol)-Scheiben gebundenen anti-menschlichem Wachstumshormon in der von K. Gate in J. Lab. Clin. Med. 70, 820 (1970) beschriebenen Methode.
DLe erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas enthalten großen Mengen an den immunologisch aktiven Substanzen, die fest und stabil gebunden sind und bei Verwendung als insolubilisierte immunologisch aktive Substanzen eine sehr hohe Empfindlichkeit und Versuchsgenauigkeit sowie ein breites Versuchsberoieh ergeben und den weiteren Vorteil haben, daß sie sich durch verbesserte Lagerbeständigkeic auszeichnen und bei der Vorsuchsdurchführung sehr leicht gehnndhabt werden können, v/ob ei als weiterer Vorteil hinzukommt, daß sie kommerziell levicht herstellbar sind. Sie erweisen sich daher auf dem Gebiete der diagnostischen Medizin als sehr vorteilhaft.
Hinzukommt, daß die erfindungsgemäßen Konjugate aus .immunologisch aktivai Substanz und Mattglas wenig Neigung zur Adsorption von Best imrnungsreagentien, Farbstoffen oder Pigmenten und den in den Körper flüssigkeiten vorliegenden Substanzen haben, welche eine nachteilige Beeinflussung der Hestimmungsmethode bewirken und die Aktivität der Konjugate behindern; sie führen daher zu einer weitaus besseren Genauigkeit der Best iinn'.ungmethode (insbesondere in ETA) im Vergleich zu den an poröses Gl-)..-; gebundenen Konjugacen immunologisch aktiver Substanzen, die zu einer Adsorption größerer Mengen an die Bestimmung beeinflußendeη Substanzen führen. Ferner können die nr: "iindungsgenvißan Konjugate aus iinmu-
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noloqisch aktiver Substanz und Mattglas aufgrund ihrer vergleichsweise größeren Abmessung (wobei der maximale Durchmesser in der Regel 1 bis 20 mm und der minimale Durchmesser in der Recjel 1 mm oder mehr beträgt) während der Versuchsdurchführung leichtqehandhabt werden (sie können z. B. mit Hilfe von Pinzetten in Teströhrchen leicht eingebracht oder daraus entnommen werden), wo hingegen die bekannten, an poröses Glas gebundenen Konjugate, die in der Regel sehr winzig sind, nur laühsam zu handhaben sind.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie zu beschränken. DLe folgenden mattierten Gläser gelangten dabei zum Einsatz:
(1) Mattgla,s I (nach physikalischen Methoden mattierte Glaskörper).
300 Glaskörper (6 mm Durchmesser) wurden sandgeblasen durch kräftiges Aufsprühen von körnigem Korund (Sohleifmaterial), der ein Sieb von 0,2:") um Maschonwsito. passierto, auf die Glaskörper während 15 Minuten unter einem Luftdruck von 5 bar (5 kg/cm2). Der an den Glaskörpern anhaftende Korund wurde sodann abgewaschen, wobei MatLglaskörper mit gleichförmigmattierten Oberflächen erhalten wurden, deren nach der folgenden Methode bestimmter Mattierungsgrad 4,5 betrug.
Messung des Mackierunqsgrads d^s mattierten Glases:
50 Stück der mattierten Glaskörper und 50 Stück der nicht-mattierten Glaskörper (welche die gleich Gestalt und Größe hatten wie die mattierten Glaskörper) wurden eingetaucht in 25 ml einer 10 % Lösung von )' -Aminopropyl-triäthoxysilan in Aceton. Nach 1 Stunde langer Inkubation bai 25 0C wurden die erhaltenen Glaskörper abfiltriert und ausreichend mit de ionisier tem Wasser gewaschen. Dann wurden (insgesamt) 100 Stück dieser Glaskörper eingetaucht in 25 ml einer wässrigen Lösung von Glutaraldehyd; nach 1 Stunde langer Inkubation bei 25 °C wurden die auf diese Weise behandelten Glaskörper gründlich mit do ionisiertem Wasser gewaschen. Pie erhaltenen Glaskörper wurden sodann eingetaucht in 25 ml einer wässrigen Lösung, d.Lo 12,5 mg G.luconeox idase (GOO) enthielt (Enzymaktivität 3 1,0 E/ml)
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Nach einer Inkubation von zunächst 1 Stunde bei 25 0C und anschließend 15 Stunden bei 4 0C wurden die Glaskörper mit deionisiertem Wasser gewaschen unter Erzielung eines GOD/Mattglaskörper-Konjugats und eines Konjugats aus GOD und nichtmattierten Glaskörpern. In jedes von 10 Teströhrchen wurde ein Glaskörper aus dem GOD/Mattierglaskörper-Konjugat eingebracht. In jedes von 10 weiteren Teströhrchen wurde ein Glaskörper aus dem Konjugat aus GOD und nicht-mattiertern Glaskörper eingebracht. Tn jedes der 20 Testgläser wurden 2 ml deionsisiertes Wasser gegeben, der Gefäßinhc'ilt wurde unter Verwendung einer Mischvorrichtung verrrührt und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer Saugvorrichtung abgesaugt. !Hase Y: i:;chpro.-:edur wurde zweimal wiederholt. Dann wurden 0,3 ml 0,OIM-Matriumacetatpufferlösung (pH5,1), 2,0 ml M3TH-DEA-Lösung (10 mg Natriumäthylendiamintetraacetat, 1,7 mg S-Methyl-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid, 0,004 ml Ν,Ν-Diäthylanilin in 100 ml 0,1 Π wässriger Essigsäurelösung) und 0,5 ml Peroxidase(POD)-Lösung (60 E POD in 1 ml 0,1M-wässrlger Natriumacetatlösung) in jedes Testgefäß gegeben. Nach 5 Minuten langer Vorinkubation bei 37 0C wurden 0,5 ml einer Lösung vcn 15g ß-D-Glucose in 100 ml 0,1M-Essigsäurelösung jedem Testgefäß zugesetzt. Nach genau 6 Minuten langer Inkubation unter Schütteln bei 37 0C wurden in jedes Testgefäß 1 ml 0,5N-SaIzsäure zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. Die /absorption bzw. Extinktion bei 590 nm der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit in jedem der Gefäße wurde gemessen. Der Mattierungsgrad wurde nach der angegebenen Gleichung (1) berechnet unter Verwendung des Durchschnittswert der Absorption der 10 überstehenden Flüssigkeiten des GOD/Mattglas-Konjugats und derjenigen des Konjugats aus GOD und unmattiertem Glas als die Enzymaktivitäten.
[2) Mattglas II (nach einer chemischen Methode mattierte Glasröhrchen) .
100 g kleine Glasröhrchen (6 mixi äußerer Durchmesser, 4 mm innerer Durchmesser und 10 mm Länge) wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 200 ml einer Mattierlösung eingetaucht, die 2 % Fluorwasserstoffsäure und 1 % AHicniumfiuoriä enthielt. Die Glasröhrchen
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v/urden sodann aus der Lösung Gntnoimnen und mit Wasser gewaschen, wobei mattierte Glasröhrchen mit gleichmäßig mattierten Oberflächen erhalten wurden, die einen Mattierungsgrad von 3,2 hatten, bestimmt nach einer ähnlichen Methode wie oben unter (1) angegeben .
Beispiel Ί
Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz und Mattglas
Die angegebenen 100 Mattglas röhrchen (Mattglas II) v/urden in 100 ml einer 0,5%igen Lösung von j'-Aminopropyl-triäthoxysilan in Aceton eingetaucht. Nach 10 Stunden langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen abfiltriert und mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Die erhaltenen 100 Mattglasröhrchen,an die das aminohaltige Silanbindemittel gebunden worden war, v/urden in 40 ml N-Salzlösung eingetaucht. Eine Lösung von 50 mg menschliches IgG in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung und eine Losung, die 0,2 % N-Äthyl-N'-dimethylaminopropylcarbodiimid in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung enthielt, wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden langer Behandlung unter Eintauchen bei 3 7 0C wurden die Röhrchen nacheinander mit Wasser, wässriger IM-PropionsäurelÖsung und Wasser gewaschen, bis kein Protein in den Waschwässern festzustellen war. Auf diese Weise wurde ein Konjugat erhalten mit einem gebundenen Proteingehalt von 63 μg pro g Glas, der wie folgt bestimmt wurde:
Messung des gebundenen Proteingehalts:
Nach der von S. Moore et al. in Methods in Enzymology _£, 819 (1963), beschriebenen Methode wurden 10 Stück des Protein/Glas-Konjugats in eine Lösung von 6N-Salzsäure eingetaucht und das ganze System wurde unter vermindertem Druck abgeschmolzen und danach bei 110 0C 30 Stunden lang erhitzt. Der Proteingehalt wurde nach der Ninhydrin-Färbemethode bestimmt.
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Beispiel 2
Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz und Mattylas.
200 der angegebenen Mattglaskörper (Mattglas I) wurden in 100 ml einer 0,5%igen Lösung von y-Aminopropyl-triäthoxysilan in Toluol eingetaucht und 7 Stunden laiig zum Sieden erhitzt. Die Körper wurden sodann abfiltriert und mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Zu den 200 Mattglaskörpern, an die das aminohaltige Silanbindemittel gebunden war, wurden 100 ml wässrige 2oige Glutaraldehydlösung zug ^g-? ο en. Mach 2 .'J runden lang-^n '.'< ί:-?α-·η Lv-: L Λ "C vvuraen dia Glaskörper mit deionisiertem Wasser 4 bis 6 mal gewaschen, bis sie nicht mehr den Geruch nach Glutaraldehyd aufwiesen. Die auf diese Waise behänd;:! ten 200 Mat tglaskorper wurden sodann in 40 ml N-SaIzlösung einget lucht. Hierzu wurde eine Lösung von 50 mg anti-menschliches Insulin (Kaninchen) in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt. Nachdem die Reaktion 2 Stunden lang bei 30 0C ablaufen gelassen worden war, wurden die Glaskörper gründlich mit Wasser gewaschen, bis kein Protein in den Waschwässern mehr nachweisbar war.
Auf diese Weise wur-J/; ein Konjugat erhalten, das einen in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gemessenen gebundenen Proteingehalt von 148 μg pro g Glas aufwies.
Beisp_i.el 3
Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz (menschliches Insulin) mit dem Konjugat fms immunologisch aktiver Substanz und Mattglas (Sandwich EIA) .
Die Tnsulir>b'.' - c< mmung nach der Sandwich-EIA-Methode wurde durchgeführt unter Verwendung der Konjugate aus anti-menschliches Insulin (Kaninchen) und Mattglas, die gjmUii Beispiel 2 erhalten worden waren. In jede:; der Teströhrchen (0,9 χ 10 cm) wurden 0,3 ml einer Lösung von 0 , 0 1 M-Nat riumphosphatpuEf er (pH7,3), die 0,85 'i Natriumchlorid und 0,1 ■.
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Rinderserumalbumin enthielt (im folgenden air. "Pufferlösung A" bezeichnet) , zugegeben.
In jedes Teströhrchen wurde ein Konjugatkörper aus anti-menschlichem Insulin/Mattglas, hergestellt nach Beispiel 2, eingebracht. Verschiedene Verdünnungen von menschlichem Insulin wurde hergestallt mit Pufferlösung A und in die Testgläser (0,1 ml/Glas) gegeben. Nach 1 Stunden langem Schütteln bei Raumtemperatur wurden 0,1 ml mit Phosphatvase markiertes anti-raenschlichas Insulin zu jedem Testglas zugesetzt. Nach weiterem Schütteln oder Inkubieren während 1 Stunde wurde etwa 5 ml N-Salzlösung zu jedem der Glaser zugegeben und der Glasinhalt wurde gerührt unter Verwendung einer Mischvorrichtung, worauf die überstehende Flüssigkeit rr.it Hilfe einer Saugvorrichtung abgesaugt wurde. Diese Waschprozedur wurde viermal wiederholt. Dann wurden 2 ml eines Enzymsubstratreageus (das enthalten war in einem ΑΤ,Ρ-Bestimmungspack der Chugai Pharmaceutical Cc;., Ltd.) in jedes Testglas gegeben. Die Inkubeition oder Reaktion bei 37 0C während 30 Minuten unter Schütteln schloß sich an. Dann wurden 2,0 ml einer Farbbildungsiösung (die enthalten war in dem angegebenen ALP--Bes tiinmungspack der Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. ) jedem Tostglas zugesetzt. Nach weiterer Inkubation unter Schütteln bei 37 0C während 30 Minuten wurde die Absorption bei 5 70 Uiii gemessen zur Bestimmung der Enzymaktiv ltat. Figur 1 gibt die Standardbestimmungskurve für menschliches Insulin wieder bei Verwendung des Konjugats aus Kaninchen-anti-r.'.enschliches Insulin/Mattglaskörper.
Bestimmung der Wirkungsweise des Konjugats 1 aus immunologisch aktiver Substanz uad Mattglas.
ft in Konjugat aus Kaninchen-anti-measchlicheo Insulin/unmattiertem Glaskörper wurde nach dem in Beispiel k beschriebenen Verfahren hergestellt ,jedoch untor Vorwendung von unmattierten Glaskörpern (6 nm D lu: el·. :->:--. se r) und mit dem Konjugat aus Kan Lnchen-anti-menschliches Insulin/rlattglaskörper goinäS Beispiel 2 verglichen in Bezug auf die Men
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ge an gebundenem Prohein. Das gebundene Protein wurde nach der in Bei.spiel 1 beschriebenen Methode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.
Tabelle I
Probe Gebundenes Protein (ug/g Glaskörper)
Kaninchen-anti-menschliches Insuliii/Mattglaskörper-Konjugat 148
Kaninchen-anti-menschliches Insu-
lin/'-inmactiarte Glaskörper-Kon jugat 32
Die Ergebnisse zeigen, daß eine größere Menge an immunologisch aktiver Substanz an den mattierten Glaskörper als an den unmattierten Glaskörper gebunden werden kann.
Beispiel 5
Bestimmung der Wirkungsweise des Konjugats 2 aus der immunologisch aktiven Substanz und mattiertem Glas.
Ein Konjugat aus Kaninchen-anti-menschliches Insulin/unmattiertem Glaskörper wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt mit der Ausnahme, daß unmattierte Glaskörper verwendet wurden. Unter Verwendung dieses Konjugats und des Konjugats aus Kaninchen-anti-menschliches Insulin/Mattglaskörper, hergestellt gemäß Beispiel 2, wurden Bestimmungen des menschlischen Insulns nach der in Beispiel 3 beschriebenen Methode durchgeführt und die Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode, das Versuchsbereich und die Vorsuchsgenauicjkeit wurden zwischen den beiden Konjugaten verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.
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Tabelle II
Bestürmung von menschlichem Insulin mit Konjugat aus Kaninchen-anti-menschlLches Insulin/mattierten Glaskörpern
Bestimmung von menschlichem Insulin mit Kaninchen-rjnti-menschli ches Insulin/unmattierten Glaskörpern
Emp Eindlichkeit (μΕ/ml) Versuchsbereich (μΕ/ml)
Cep.::;iiigkeit (bei f-iestiniüung von 120 μΕ/ml menschlichem Insulin)
0,2
0,2 - 450
113 ·- 5 Ul-VrPl
(Variationskoeffizient
=4,2 %)
20 20 - 250
110 - 20 μΕ/ml (Variationskoeffizient = 27,3 %)
Die Ergebnisse zeigen, daß das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und mattiertem Glaskörper weitaus besser ist in Bezug auf Empfindlichkeit und Versuchsbereich sowie Versuchsgenauigkeit als das entsprechende, aus unmattierten Glaskörpern hergestellte Konjugat.
Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz und Mattglas.
(1) Reduktion von anti-menschliches o< -Fetoprotein (anti-menschliches AFP)
Zu 10 ml einer wässrigen Lösung von 100 mg anti-menschliches AFP (Kaninchen) (DAKO-Immunoglobulins Ltd., Dänemark) wurde 1 ml einer 0, 1M-wässrigen Lösung von 2-Mercaptoäthylarnin zugegeben und die Inkubation wurde bei 37 0C 90 Minuten lang durchgeführt. Das auf diese Weise reduzierte anti-menschliche AFP wurde abgetrennt und gereinigt durch eine Sephadex G-25-Säule ( 1 χ 40 cm),die gepuffert war mit 0,IM-Natriumacetatpuffer (pH5,0).
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(2) Herstellung eines Konjugats aus immunologisch aktiver Substanz (anti-menschliches AFP)/Mattglaskörpern
200 Stücke der Mattglaskörper (Mattglas I) wurden eingetaucht in 100 ml einer 0,5 ο igen Lösung von V-Mercaptopropyl-trimethoxysilan in Toluol und die Reaktion wurde 8 Stunden lang unter Rückfluß vonstatten gehengelassen. Die Glaskörper wurden sodann abfiltriert und mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Zu den 200 Matt-glaskörpern, an die das thiolhaltige Silanbindemittel gebunden war, wurden 100 ml einer gesättigten N,N'-o-Phenylendimaleimidlösung in 0,IM-Natiumacetatpuffer (pH5,0) zugegeben. Die Inkubation wurde bei 30 0C 2 Stunden lang durchgeführt. Die Glaskörper wurden viermal mit: ilaionis L ercam Wasser gewri.;chea. I)Io erhalt-.2r>jn 200 Glaskörper wurden sodann eingetaucht in 90 ml 0,1M-Natriumacetatpuffer (pH5,0), und 50 mg des wie oben unter (1) beschrieben reduzierton anti-menschliches AFP in 10 ml 0,1M-Natriumacetatpuffen (pH5,0) wurden zugesetzt. Nach der nachfolgenden Reaktion bei 30 0C während 2 Stunden wurden die erhaltenen Mattglaskörper gründlich mit Wasser gewaschen, bis in den Waschwässer kein Protein mehr festzustellen war.
Auf diese Weise wurde ein Konjugat aus anti-menschliches AFP/Mattglas erhalten mit einem nach einer ähnlichen Methode wie in Beispiel 1 beschrieben gemessenen gebunendon Proteingehalt von 103 ng pro g Glas.
VergleIchsbeispiel· 1
Nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren, jedoch unter Verwendung von unbehandelten (unmattierten) Gleiskörpern (6 mm Durchmesser) wurde ein Konjugat aus anti-menschliches AFP/unmattierten Glaskörpern erhalten mit einem nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessenen gebundenen Proteingehalt von 19 μg pro g Glas .
Be_i_splel 7
Bestimmung einer physiologisch aktiven Substanz (menschliches ;<<-Fetoprotein menschliches AFP) unter Verwendung des Konjugats aus der
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immunologisch aktiven Substanz und Glas nach dem Sandwich-EIA.
Unter Verwendung des Konjugats aus dem anti-menschlichen AFP/Mattglaskörpern und des Konjugats aus dem anti-menschliches AFP/unmattierte Glaskörper wurde die Bestimmung von menschlichem AFP nach dem Sandwich-EIA durchgeführt.
Es wurden 0,3 ml der Pufferlösung A gemäß Beispiel 3 und 1 Körper des Konjugats aus anti-menschliches AFP/Mattglaskörper gemäß Beispiel 6 oder des Konjugats aus anti-menschliches AFP/nicht mattierter Glaskörper gemäß Beispiel 1 in jedes der Testgläser (0,9 χ 10 cm) eingebracht. Verschiedene Verdünnungen von menschlichem AFP wurde hergestellt mit der Pufferlösung A und 0,1 ml-Anteile derselben wurden in jedes Testglas zugegeben. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang durchgeführt. Nach der Reaktion wurden etwa 5 ml physiologische Kochsalzlösung zugegeben, das Gemisch wurde unter Verwendung einer Mischvorrichtung gerührt und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer Saugvorrichtung abgesaugt, um das Waschen der Glaskörper zu bewirken. Dann wurde 0,1 ml eines mit Peroxidase markierten anti-menschliches AFP und 0,3 ml der Pufferlösung A in jedes Testglas zugegeben und die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang durchgeführt. Nach beendeter Reaktion wurden etwa 5 ml physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt, das Gemisch wurde unter Verwendung eines Mischer gerührt und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer Saugvorrichtung abgesaugt, um das Waschen der Glaskörper zu bewirken. Ein Enzymsubstratreagens (2,5 ml einer frisch zubereiteten Lösung von 5-Aminosalicylsäure (0,6 mg/ml) und Karnr.toffpurcxid (0,2 mg/ml) in 0,03M-Natriumphosphatpuffer (pH6,0)) wurden in jedes Testglas gegeben. Nach 1 Stunde langer Inkubation bei 37 0C wurden 0,1 ml einer 10%igen wässrigen Lösung von Natriumazid in jedes Testglas zugesetzt zur Unterbrechung der Reaktion und die Absorption bei 500 nm wurde gemessen und zu der Enzymaktivität in Beziehung gesetzt. Die StandardbestLmmungskurve für manschliches AFP bei Verwendung des Konjugats .aus anti-menschliches AFP/Mattglaskörper sowie
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diejenige bei Verwendung des Konjugats aus anti-menschliches AFP/ nicht-mattierte Glaskörper sind in Figur 2 durch die ausgezogene Linie bzw. die unterbrochene Linie wiedergegeben.
Der Einfluß beider Konjugate wurde miteinander verglichen in Bezug auf Empfindlichkeit, Versuchsbereich und Versuchsgenauigkeit. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.
Tabelle III
Empfindlichkeit Versuchsbere ich
Versuchsgenau:gkei t (bei Bestimmung von 80 ng/ml menschliches AlT)
Bestimmung von menschlichem AFP mit Konjugat aur, antimenschliches AFP/Mattglaskörper
Bestimmung von menschlichem 7VfP mit Konjugat aus anti-menschliches AFP/ iiicht-mattierte Glaskörpe
0,5 10 10
0,5 - 500 - 100
79 - 3 ng/ml
(Variat ionskoeff iζ ien t
= 3,8 ri) 		76 - 28 ng/ml
(Variationskoeffiz ient
= 36,8 %)
Aus Figur 2 und Tabelle III ergibt sich eindeutig, daß das Konjugat. aus immunologisch aktiver Substanz/Mattglas weitaus besser ist in Bezug auf Empfindlichkeit, Bestimmungsbereich und Genauigkeit als das entsprechende, unter Verwendung der unmattierten Glaskörper hergestellte Konjugat.
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Claims (5)

  1. MiTLLER-BORlS · DlOUFiIL · SCHON · HEBTRL
  2. ρ at κ ν τα ν W.
  3. UTB 23 05657
  4. 4. Feb. 1979
    DR. WOLFCANG MÜLLER-BOR=; (PATENTANWALT VON 1927-19/5) OR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHEM. DR ALFREO SCHÖN, DIPL.-CHiM. WERNER HERTEL, DiPL-PHVS.
    ZUGELASSENE VERTRRTEH DEIM EUBOP XISCH ^N F1AIENfAMT
    D/R/we - S 3183
    .Sanyo Chemical Industries, Ltd. No. 11-1 Ichinohashinomoto-cho, Higashiyama-ku,
    Kyo to, Japan
    Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Glas, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselben
    Patentansprüche
    .'', Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und Glas, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologisch aktive Substanz physikalisch oder chemisch an ein Mattglas gebunden ist.
    2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologisch aktive Substanz und das mattierte Glas mit Hilfe eines Silanbindemittels und erforderlichenfalls eines Vernetzungsmittels miteinander verbunden sind.
    909833/0842
    s 5t!;.\-(;i(}:> 10 · in eiikutstii. -t ■ ro.sr ν \c;ii SG0720 · kauet.: mlmuioi-at · xi:r,. (OS!»
    3. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus immunologisch aktiver Substanz und Glas nach Anspruch 1 f dadurch gekennzeichnet, daß man eine immunologisch aktive Substanz und ein Mattglas mit einem Silanbindemittel und erforderlichenfalls einem Vernetzungsmittel umsetzt.
    4. Verfahren nach Anspruch 3,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reaktionsprodukt aus dem Mattglas mit Silanbindemittel mit der immunologisch aktiven Substanz, erforderlichenfalls mit Hilfe eines Vernetzungsmittels, umsetzt.
  5. 5. Verwendung des Konjugats aus imraunologisch aktiver Substanz und Glas nacii Anspruch 1 in diagnostischen Reagentien oder zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen.
    ;; 9038 3 37 t) 84 2
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