DE2744835C3 - Immunchemisches Meßverfahren - Google Patents
Immunchemisches MeßverfahrenInfo
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Description
Antigensubstanzen, wie Insulin, Choriumgonadotropin,
Wachstumshormon sowie Immunoglubolin, zeichnen sich durch eine Spezifizität und Empfindlichkeit aus,
mit welcher sie sich mit ihren Antikörpern verbinden. Unter Ausnützung dieser Tatsache wurden viele
Versuche unternommen, derartige Antigensubstanzen oder ihre Antikörper zu messen. Derzeit wird eine
Reihe von derartigen Meßverfahren angewendet. Beispielsweise seien folgende Verfahren erwähnt: Die
Immundiffusionsmethode, bei deren Durchführung das Antigen und der Antikörper miteinander in einem
Agargel umgesetzt werden, die Agglutinierungsreaktions- und Agglutinierungsinhinbierungsreaktionsmethode,
bei deren Durchführung Blutzellen oder feine Teilchen, wie Polystyrollatex, als Träger für Antigen
oder Antikörper verwendet werden sowie dar Radioimmunoassay (RIA), bei deren Durchführung Radioisotope
zur Markierung des Antigens oder des Antikörpers eingesetzt werden.
In neuerer Zeit wurden Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Steroide, Tyroidhormone sowie
aktive Amine, deren Antikörperherstellung schwierig ist, zu messen nach der konkurrierenden Methode unter
Ausnutzung der Bindereaktion des Rezeptorproteins oder des Bindeproteins, das in spezifischer Weise sich
mit diesen Substanzen verbindet, verwendet. In jüngerer Zeit konnten jedoch die Antikörper dieser
Substanzen relativ einfach hergestellt werden, so daß sie nunmehr i;» der gleichen Weise wie die vorstehend
erwähnten Antigensubstanzen gemessen werden können.
Diese Methoden werden in breitem Umfange angewendet Beispielsweise wird der RIA. der bezüglich
der Empfindlichkeit und der quantitativen Genauigkeit der Messung hervorragend ist, in breitem Umfange
eingesetzt. Die Substanzen, die nach dieser Methode meßbar sind, bestehen aus einer Vielzahl hochmolekularer
Substanzen, wie lmmunoglobulin, Viren oder Proteinhormonen sowie Substanzen mit niederem
Molekulargewicht, wie Peptiden oder Steroiden.
Ein RIA unter Einsatz von Radioisotopen erfordert jedoch große Kenntnisse und Geschick des eingesetzten
Personals. Ferner sind kostspielige Instrumente und Vorrichtungen nötig. Darüber hinaus ist diese Methode
im Hinblick auf die Umweltverseuchung vielen Einschränkungen unterzogen. Aus diesen Gründen wird sie
in der klinischen Praxis nur in begrenztem Umfange eingesetzt, ist eine mit einem Radioisotop zu markierende
Substanz beispielsweise eine Verbindung mit einem niederen Molekulargewicht, wie ein Steroid oder eine
instabile Substanz, wie menschliches Placentalactogen, dann ist es schwierig, die Substanz direkt zu markieren.
Auch dann, wenn die Markierung möglich ist, ist die Substanz praktisch infolge einer Verminderung oder
eines Verlustes ihrer immunologischen Aktivität schlecht einsetzbar.
Zur Vermeidung dieser Nachteile wurden in neuerer Zeit neue Verfahren entwickelt, wie beispielsweise der
EIA (Enzymimmunoassay) unter Verwendung eines Enzyms sowie der FIA (Fluoreszenzimmunoassay), der
unter Einsatz eines fluoreszierenden Materials anstelle eines Radioisotops arbeitet. Diese Verfahren zeichnen
sich durch eine hohe Empfindlichkeit und quantitative Meßgenauigkeit aus, wobei diese Eigenschaften ungefähr
denjenigen des RIA entsprechen.
RIA, EIA und FIA arbeiten auf dem gleichen Prinzip, d. h. auf der Grundlage von zwei Methoden, und zwar
der konkurrierenden Methode und der Sandwichmethode. Das Prinzip läßt sich anhand des Falles eines
Antigens, das als zu messende Substanz eingesetzt wird sowie eines Antikörpers, der als Substanz verwendet
wird, die sich in spezifischer Weise mit der zu messenden Substanz verbinden, erläutern.
1. Konkurrierende Methode
Läßt man eine unbekannte Menge eines nichtmarkierten Antigens (nachfolgend als »Ag 1« bezeichnet)
sowie eine gegebene Menge eines markierten Antigens ί (nachfolgend als »markiertes Ag 1« bezeichnet)
miteinander konkurrieren mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers (nachfolgend als »Ab 1« bezeichnet)
reagieren, dann verbinden sich das Ag 1 und das markierte Ag 1 mit dem Ab 1 im Verhältnis ihrer
jeweiligen Mengen. Daher ist die Menge an markiertem
Ag 1, die mit dem Ab 1 verbunden wird, umgekehrt proportional zu der Menge des Ag 1. Durch geeignete
Maßnahmen werden das markierte Ag 1, das sich mit dem Ab 1 verbunden hat, und das markierte Ag 1, das ir>
keine Bindung eingegangen ist, getrennt.
Die Aktivität des Markierungsmittels des markierten Ag 1, das an den Ab 1 gebunden bzw. nicht gebunden ist,
wira gemessen. In der Zwischenzeit wird eine Verdünnungsreihe von Bezugssubstanzen, deren Konzentration
bekannt ist, hergestellt, wobei in der vorstehend beschriebenen Weise die Aktivität des
Markierungsmittels gemessen wird. Eine Standardkurve, die durch Auftragen der gemessenen Aktivitäten
erhalten wird, wird zur Bestimmung der Menge des zu messenden Ag 1 verwendet.
2. Sandwich-Methode
Werden eine unbekannte Menge eines Ag 1 sowie seines Ab 1, der unlöslich gemacht worden ist,
miteinander umgesetzt, dann verbindet sich das Ag 1 mit dem Ab 1 unter Bildung eines Ag 1 —Ab 1-Komplexes.
Dieser Komplex wird von der Reaktionsmischung abgetrennt und mit einer gegebenen Menge eines j5
markierten Ab 1 umgesetzt. Dieser markierte Ab 1 verbindet sich mit dem Komplex unter Bildung eines
sandwichartigen Ab !—Ag 1—Ab 1-Komplexes, wobei
ein Teil des markierten Ab 1, der die Bindefähigkeit des Komplexes übersteigt, in freiem Zustand in der Lösung
verbleibt. Dann werden der »gebundene« markierte Ab 1 und der »freie« markierte Ab 1 voneinander
abgetrennt. Die Aktivitäten entweder des »gebundenen« oder des »freien« Markierungsmittels wird
gemessen. Nach der im Zusammenhang mit der vorstehend beschriebenen konkurrierenden Methode
beschriebenen Weise wird eine Standardkurve hergestellt, die zur Bestimmung der unbekannten Menge des
nichtmarkierten Antigens verwendet werden kr.nn.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein immunchemisches Meßverfahren zur Messung von
physiologischen aktiven Substanzen zu schaffen, bei dessen Durchführung Substanzen mit niederem Molekulargewicht
sowie schwach antigene Substanzen mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden können.
Außerdem soll ein Reagens zur Durchführung eines derartigen Verfahrens zur Verfugung gestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 gekennzeichnete Erfindung gelöst.
Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und Reagenzien zu seiner Durchführung ergeben sich
aus den Ansprüchen 2 bis 6.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt Merkmale der konkurrierenden Methode und der Sandwich-Methode.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf ein Beispiel, bei dessen Ausführung ein Antigen
sowie sein Antikörper eingesetzt werden, näher erläutert.
Eine unbekannte Menge eines zu messenden Ag 1 und eine gegebene Menge eines Ag 1 —Ag 2-Konjugats, in
welchem Ag 2 eine andere stark antigene Substanz ist, läßt man konkurrierend mit einer gegebenen Menge des
Ab 1 zu dem Ag 1 reagieren. Da das Ag 1 und das Ag 1—Ag 2-Konjugat sich mit dem Ab 1 proportional zu
ihren jeweiligen Mengen verbinden, ist die Menge des Ag 1— Ag2-Konjugats,dassichmitdem Ab 1 verbindet,
umgekehrt proportional zu der Menge des Ag 1. Nach der Abtrennung des Ab 1 —Ag 1 —Ag 2-Komplexes, der
bei der vorstehenden Reaktion gebildet worden ist, läßt man den Komplex mit einer gegebenen Menge eines
markierten Antikörpers (nachfolgend als »markierter Ab 2« bezeichnet) zu dem Ag 2 reagieren. Der
markierte Ab 2 verbindet sich mit dem Ab 1 —Ag 1 —Ag 2-Komplex und bildet eine sandwichartige Konfiguration
Ab 1—Ag 1—Ag 2 — markierter Ab 2. Der
markierte Ab 2 in der Reaktionsmischung wird dann zu dem »gebundenen« markierten Ab 2 und dem »freien«
markierten Ab 2 aufgetrennt. Die Aktivität des Markierungsmittels des markierten Ab 2 entweder in
der »gebundenen« Fraktion oder in der »freien« Fraktion wird gemessen. Aus einer Standardkurve, die
aus einer Bezugssubstanz anhand eines parallelen Versuchs aufgetragen worden ist, wird die unbekannte
Menge des zu messenden Ag 1 bestimmt.
In dem folgenden Schema sind die Stufen der konkurrierenden Methode, der Sandwich-Methode
sowie der erfindungsgemäßen Methode zusammengefaßt:
a) Konkurrierende Methode
AbI
AbI
+ Abi—AgI
AgI +
+ (konkurrierende
Reaktion) Ab 1—markiertes Ag 1
markiertes Ag 1 + Ab 2 zu Ab
(insolubilisiert)
b) Sandwich-Methode
Ab 2—Ab 1—markiertes Ag 1
AbI
(insolubilisiert)
(insolubilisiert)
AgI
Abi—AgI
+ markierter Ab 1 (Sandwich)
■ Ab 1—Ag 1—markierter Ab 1
c) Erfindungsgemäßes Verfuhren
AbI
(insolubilisiert)
+ Abi—AgI
Ag I > +
+ (konkurrierende
Reaktion) Ab I-AgI-Ag 2
Ag 1—Ag 2
_ > Ab I—Ag 1—Ag 2- markierter Ab 2
+ markierter Ab 2 (Sandwich)
zu Ag 2
zu Ag 2
Verschiedene Tierserumproteine, wie Albumin oder Globulin sowie stark antigene Substanzen, wie menschliches
Choriongonadotropin (HCG). Hämoglobin (Hb).
Tetanustoxoid, pneumokokkale Polysaccharide oder Giuiaminsäure/Lysin/Tyrosin-Copoiymcre sind als Ag
2, das mit dem Ag 1 verkoppelt werden kann, verfügbar,
es ist jedoch vorteilhaft, wie nachstehend noch näher erläutert werden wird, ein Glycoprotein. wie HCG.
einzusetzen.
Die Methode zur Herstellung eines Ag 2. das an das Ag I gekoppelt ist. schwankt in Abhängigkeil von den
Eigenschaften des Ag 1 und des Ag 2. Beispielsweise kann man das Ag 2 nach verschiedenen Methoden an
das Prolein koppeln, beispielsweise nach Methoden unter Verwendung einer Proteinaminogruppe als
Bindestelle (Diisocyanatmethodc. Malcinsäurcanhy dridmcthode, Glutaraldehydmethode. Chlorearbonaimethode).
ferner kann man auf eine Methode zurückgreifen, die sich einer SH-Gruppe als Bindestelle
bedient (divalente Quecksilben crbindungsmeihodc).
Erwähnt sei ferner eine Methode unter Verwendung einer Tyrosin- oder Histidingruppe als Bindestcllc
(Diazovcrbindung Methode) oder cmc Methode unter
Einsät/ einer Carboxylgruppe als ßindestelle (Curbodiimidmelhode).
Zum Verkoppeln des Ag 2 mn einem Hapten. wie einem Steroid, ist die Hemisucciimtiricthode
oder Oximmethode verfügbar. Wird ein Ghcopro
tem. wie HCG als Ag 2 veru endet, dann ist es möglich
die Kupplung unter Verwendung einer Aldelndgruppe durchzuführen, die durch Oxidation ihrer Zuckerkelte
erhalten worden ist. Diese Methode isi besonders zufrieucnstellend. da sie einen guten Bindungsgrad
ermöglicht und nur eine geringe Beschädigung der Substanz bedingt, die mit dem Ag 2 verkoppelt w ird.
Der Ab 2 kann nach einer Routinemethode durch
Immunisieren eines Kaninchens oder einer Ziege hergestellt werden.
\ls Mittel zur Markierung des Ab 2 stehen folgende Materialien zur Verfügung: Radioisotope (beispielsweise
125|. 131 μ 3h. 14c). Enzyme (beispielsweise Meerrettichneroxidase.
fl-D-Galactosidase. alkalische Phosphatase.
Glucoseoxidase, Glucoamylase) oder fluoreszierende Materialien (beispielsweise Fluoreszeinisothiocyanat.
Rhodamin).
Zum Markieren des Ab 2 mil derartigen Mitteln sind folgende Methoden anwendbar: Die Chloramin-T-Methode
(F. C. Greenwood und W. M. Hunter. Nature. 194. 495 [1962]). die Perjodatmethode (P. Nakane und A.
Kawaoi. J. Histochem. Cytochem.. 22. 1084 [1974]) oder
andere Methoden.
Zur Abtrennung eines Ag 1—Ag 2-Konjugats. das sich mit dem Ab 1 verbunden hat. von einem Ag 1 —Ag
2-Konjugat, das keine derartigen Bindungen eingegangen ist. oder zur Abtrennung eines markierten Ab Z der
sich mit dem Ag 1 —Ag 2-Konjugat verbunden hat. von
einem markierten Ab 2. der keine derartige Bindung eingegangen ist. stehen viele bekannte Methoden zur
Verfügung, beispielsweise Chromatographiemelhoden.
|-> eine Elektrophorese, ein Aussalzen, eine alkoholische
Ausfällung, eine Gelfiltration, eine Festphasenmethode
sowie die Methode des doppelten Antikörpers. Aus Gründen einer einfachen Arbeitsweise ist es vorteilhaft,
die Methode der festen Phase anzuwenden, bei deren
2ii Durchführung ein Antikörper an einen unlöslichen
Trägergebunden wird.
Im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden zeichnet sich die Erfindung durch folgende herausragende
Merkmale aus: Es ist bekannt, daß Substanzen mit
r> relativ niedrigen Molekulargewichten, wie Insulin.
Adrenocorticoiropin. Glucagon oder Gasirin, schwach
antigen sind. Aufgrund einer geringen Aktivität bezüglich des markierten Antikörpers binden diese
Substanzen nur eine geringe Menge desselben. Zur
in Erhöhung der gebundenen Menge an dem markierten Antikörper wird erfindungsgemäß eine stark antigene
Substanz (Ag 2) mit der zu messenden Substanz (Ag 1) verkoppelt. Dabei kann man die zu messende Substanz
veranlassen, eine große Menge des markierten Antikör-
5-, pcrs infolge des hohen Bindevermögens des Ag 2 zu
binden. Erfindungsgemäß kann daher die Messung mn einer höheren Empfindlichkeit .ils bei der Durchführung
der herkömmlichen Methode durchgeführt werden, und zwar auch dann, wenn die Menge des zu messenden Ag
4Ii 1 eurem niedrig ist.
Darüber hinaus hat die Erfindung den Vorteil, daß
dann, wenn d.is mit dem Ag 1 zu verkoppelnde Ag 2 aul
ein einziges Material beschrankt ist. welches die beste
Messung bedingt, nur eine Art eines markierten Ab 2
a; ausreicht, so daß es nicht mehr erforderlich ist.
verschiedene markierte Antikörper entsprechend den verschiedenen zu messenden Substanzen herzustellen.
Die erfindungsgemäß meßbaren Substanzen sind beispielsweise Substanzen mit niederem Molekularge-
-,Ii w icht. z. B. Steroide, w ic Testosteron. Setriol. Progesteron.
Corticosteron oder Aldosteron. Thyroidhormone. wie Thyroxin oder Trijodthyronin, physiologisch aktive
Peptide, wie Bradykinin oder Ansioiensin. Thyroidhormone
freisetzende Hormone, lulcinisierendc Hormone
ίί freisetzende Hormone, physiologisch aktive Amine, wie
Epinephrin. Norepinephrin. Histamin. Serotonin oder Prostglandin. Substanzen mit relativ niedrigem Molekulargewicht,
beispielsweise Insulin. Glucagon. Adrenocorticotropin
oder Gasirin, sowie Substanzen mit
hi hohem Molekulargewicht, beispielsweise menschliches
Choriumgonadotropin. Wachstumshormon, menschliches Placentalactogen. Immunoglobulin Ki-Fötoprotein
oder Hepatitis-B-Antigen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausfüh-
tö rungsbeispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert.
Dabei wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen. Es zeigt
Fig.! eine Standardkurve für die bekannte Insulin-
messung gemäß Vergleichsbeispiel 1,
F i g. 2 eine Standardkurve für eine erfindungsgemäße Insulinmessung gemäß Ausführungsbeispiel I.
Vergleichsbeispiel I
Messung von Insulin (konkurrierende Methode)
a) Herstellung einer Standard-Insulin-Lösung
a) Herstellung einer Standard-Insulin-Lösung
Kristallines Rinderinsulin (Sigma Chemical, 25 IU/mg) wird bis zu Konzentrationen von 104, 103, 320,
80, 20 und Ομΐυ/ml in einer phosphatgepufferten
Salzlösung (PBS, pH 6,4) die 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) enthält, aufgelöst.
b) Herstellung des Antiinsulinantikörpers
In einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiertes
kristallines Rinderinsulin wird durch Zugabe von 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure, Tropfen für Tropfen, aufgelöst.
Es wird eine Konzentration von 2 mg/ml eingestellt. Die Insulinlösung wird mit Aktivkohlepulver
(Wako Pure Chemical) in einer Menge von 10 mg pro 1 ml der Insulinlösung vermischt. Auf diese Weise wird
das Insulin an der Aktivkohle adsorbiert. Die Aktivkoh- 2~> Ie mit adsorbiertem Insulin wird durch Zentrifugieren
abgetrennt. Durch Zugabe von 0,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung zu 10 mg dieser Aktivkohle
erhält man eine Suspension aus Aktivkohle mit adsorbiertem Insulin. Ein Meerschweinchen wird jede
Woche mit einer Mischung aus 0.25 ml dieser Suspension und 0,25 ml eines vollständigen Freundschcn
Adjuvanses (Freunds complete adjuvant) gespritzt. Die Injektion wirrl zehnmal wiederholt. Eine Woche nach
der letzten injektion wird das Blut aus dem Karotid des
Tieres gesammelt, wobei ein Meerschweinchenantiinsulinserum erhalten wird. Das auf diese Weise erhaltene
Antiserum wird zweimal mit Natriumsulfat ausgesalzen, wobei der Antiinsulinantikörper erhalten wird.
40
c) Herstellung eines Insulin-Meerrettich-
peroxidasekonjugats
Nach der Perjodat-Methode von P. Nakane und A. Kawaoi wird kristallines Rinderinsulin mit Meerrettichperoxidase
verbunden. 5 g Meerrettichperoxidase (HRP) werden in 1 ml einer 0,3 m-Natriumbicarbonatlösung
aufgelöst, worauf sich die Zugabe von 0,1 ml eines l%igen 2.4-DinitrofIuorbenzols anschließt. Die erhaltene
Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird 1 ml
einer 0,08 m-Natriumperjodatlösung zugesetzt und während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei
Zimmertemperatur eingemischt, worauf sich die Zugabe von 1 ml eines 0,16 m-Äthylenglykols und ein Mischen
während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur anschließen. Die erhaltene Lösung wird
über Nacht gegen einen 0.01 m-Natriumcarbonatpuffer mit einem pH von 93 dialysiert. Dann wird 1,0 ml einer
Insulinlösung zugesetzt cie durch Auflösung von kristallinem Rinderinsulin zur Erzielung einer Konzentration
von 5 mg/ml in einer 0,01 m-Natriumcarbonatpufferlösung mit einem pH von 9,5 erhalten worden ist
Nach einer dreistündigen Reaktion bei Zimmertemperatur werden 5 mg Natriun'borhydrid der Reaktionsmischung
zugesetzt worauf man die Mischung weitere 3 Stunden bei 4° C stehenläßt Nach der Reaktion wird
über Nacht eine Dialyse gegen PBS mit einem pH von 7,2 durchgeführt, worauf sich eine Fraktionierung und
Reinigung mit Sephadex G-200 und ein Gefriertrocknen anschließt. Dabei erhält man ein Insulin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat(INS-HRP).
d) Herstellung einer Kaninchen-Antimeerschweincheny-globulinantikörper-gekuppeltcn
Cellulose
Ein gesundes Meerschweinchenserum wird durch Aussalzen und DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie
gereinigt, wobei eine y-Globulinfraktion erhalten
wird. Die erhaltene Meerschweinchen-y-globulinfraktion
wird zur Einstellung einer Konzentration von 2 mg/ml in einer physiologischen Kochsalzlösung
aufgelöst. 0,5 ml der erhaltenen Lösung werden mit 0,5 ml eines vollständigen Freundschen Adjuvanses
vermischt. Die Mischung wird fünfmal in ein Kaninchen einmal pro Woche eingespritzt. Eine Woche nach der
letzten Injektion wird das Blut aus dem Kaninchen gesammelt. Auf diese Weise wird das Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinserum
erhalten. Das erhaltene Antiserum wird durch Aussalzen gereinigt, wobei der Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinantikörper
erhalten wird.
i- ρ Cellulosepulver (Merk Chemical) werden zu
320 ml eines 2,5%igen Bromcyans gegeben. Die Suspension wird auf einen pH von 10 bis 11 durch eine 1
n-Natriumhydroxidlösung eingestellt, worauf sich eine Umsetzung während einer Zeitspanne von 2 Minuten
unter Rühren anschließt Dann wird die Suspension durch ein Glasfilter geschickt und mit einer 0,1
n-Natriumbicarbonatlösung gewaschen, wobei eine aktivierte Cellulose erhalten wird. Die aktivierte
Cellulose wird in 32 ml einer 0,1 m-Natriumbicarbonatlösung
suspendiert. Dieser Suspension werden 8 mg des Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinantikörpers
zugesetzt, worauf sich ein Stehenlassen während einer Zeitspanne von 22 Stunden bei 4CC unter Rühren
anschließt. Nach der Umsetzung wird die Suspension mit PBS mit einem pH von 6,4 und einer Mischung eines
8molaren Harnstoffs und eines 0.2molaren Glycins mit einem pH von 7,0 gewaschen und zur Erzielung einer
Konzentration von 10% in PBS mit einem pH von 6,4, enthaltend 1% BSA. suspendiert.
e) Insulinmessung
0.1 ml einer Standardinsulinlösung mit der jeweils gemäß a) erhaltenen Konzentration werden in ein
Reagensglas eingefüllt. Dann werden 0,1 ml des Antiinsulinantikörpers gemäß b) als Lösung, die auf das
16 OOOfache mit PBS verdünnt ist, zugesetzt. Dann wird während einer Zeitspanne von 50 Minuten bei
Zimmertemperatur bebrütet. Die Lösung wird dann mit 0.1 ml INS-HRP gemäß c) in Form einer 30fach
verdünnten Lösung mit PBS versetzt, worauf während einer Zeitspanne von 40 Minuten bei Zimmertemperatur
bebrütet wird. Dann werden 0,1 ml einer 10%igen Suspension der Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinantikörper-gekuppelten
Cellulose gemäß d) zugesetzt. Die Suspension wird während einer Zeitspanne
von 90 Minuten bebrütet Die feste Phase wird nach einem Abtrennen der flüssigen Phase zweimal mit einer
physiologischen Kochsalzlösung, die Tween 20 enthält gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substratlösung, die
5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) sowie 3%iges Wasser-Stoffperoxid
(ΙΟΟμΐ/dl) enthält zugesetzt worauf
während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Nach einer Zugabe von 2
Tropfen einer l,6%igen Natriumazidlösung wird das
Absorptionsvermögen bei 465 nm gemessen. Die dabei erzeugte Standardkurve geht aus der F i g. 1 hervor. Aus
Fi g. 1 können 50 μΐυ/ml Insulin gemessen werden.
Vergleichsbeispiel Il
Insulinmessung (Sandwich-Methode)
a) Herstellung eines Antikörper-sensibilisierten
Polystyrolreagensglases
Der gemäß Ib) erhaltene Antiinsulinantikörper wird zur Erzielung einer Konzentration von 10C^g/ml in
einem Glycinpuffer mit einem pH von 8,2 aufgelöst. 1 ml der Lösung wird in ein Polystyrolreagensglas mit einem
inneren Durchmesser von 1,5 cm und einer Länge von 10 cm eingefüllt. Das Reagensglas wird während einer
Zeitspanne von 3 Stunden bei 37°C bebrütet. Das Reagensglas wird in einer physiologischen Kochsalzlösung
gewaschen, worauf ein 1%iges normales Meerschweinchenserum-PBS zugesetzt wird. Man läßt die
Mischung bei 4°C über Nacht stehen. Dabei wird ein Antiinsulinantikörper-sensibilisiertes Polystyrolreagensglas
erhalten.
b) Herstellung eines Antiinsulinantikörper-HRP-Konjugats
Nach der unter Ic) beschriebenen Methode wird eine Reaktion zwischen 5 mg des Antiinsulinantikörpers
gemäß Ia) und 5 mg HRP durchgeführt, wobei ein Antiinsulinantikörper-HRP-Konjugat erhalten wird.
c) Insulinmessung
Das Antiinsulinantikörper-sensibilisierte Polystyrolreagensglas, das gemäß a) hergestellt worden ist, wird
mit 0,1 ml der Standardinsulinlösung mit der jeweils gemäß Ia) erzielten Konzentration gefüllt und dann
während einer Zeitspanne von 1 Stunde bebrütet. Nach dem Verwerfen der Lösung wird das Reagensglas mit
einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Nachdem 0,1 ml des gemäß b) hergestellten Antiinsulinantikörper-HRP-Konjugats
in das Reagensglas eingefüllt worden sind, wird dieses während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Nach der Reaktion wird das Reagensglas mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dann
werden 3 ml einer Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure
(60 mg/dl) und O,3°/oiges Wasserstoffperoxid (1 ml/dl) enthält, zugesetzt, worauf man die Mischung
während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt. Anschließend wird das Absorptionsvermögen
bei 465 nm gemessen. Aus der dabei erzeugten Standardkurve lassen sich 20 bis 30 μΐυ/ml
Insulin messen.
Ausiührungsbeispiel 1
Insulinmessung
Insulinmessung
a) Herstellung des Insulin-HCG-Konjugats
5 mg HCG werden in 1 ml einer 0,3 m-Natriumbicarbonatlösung
aufgelöst und mit 0,1 ml eines 1 %igen 2,4-Dinitrofluorbenzols vernetzt, worauf man die
Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt Anschließend wird nach
der Methode Ic) ein Insulin-HCG-Konjugat (INS-HCG)
erhalten.
b) Herstellung von Anti-HCG-Antikörper
HCG wird in ein Kaninchen in üblicher Weise zur
HCG wird in ein Kaninchen in üblicher Weise zur
Gewinnung des Kaninchen-Anti-HCG-Serums injiziert
Das Antiserum wird durch Natriumsulfat ausgesalzen, wobei man einen Anti-HCG-Antikörper erhält.
c) Herstellung von Anti-HCG-Antikörper-
HRP-Konjugat
Nach der Methode gemäß Ic) wird eine Reaktion zwischen 5 mg Anti-HCG-Antikörper, erhalten gemäß
b), und 5 mg HRP durchgeführt, wobei ein Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugat
erhalten wird.
d) Herstellung von Antiinsulinantikörpersensibilisiertem
PolystyrolreagensgJ.as
Der gemäß Ib) hergestellte Antiinsulinantikörper wird zur Erzielung einer Konzentration von 20 μg/ml in
Glycinpuffer (pH 8,2) aufgelöst. In ein Polystyrolreagensglas wird 1 ml der Lösung eingefüllt, worauf eine
Bebrütung während einer Zeitspanne von 30 Minuten in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 56°C
durchgeführt wird. Auf diese Weise wird ein Antiinsulinantikörper-sensibilisiertes
Polystyrolreagensglas hergestellt.
e) Insulinmessung
In das gemäß d) hergestellte Antiinsulinantikörpersensibilisierte Polystyrolreagensglas werden 0,4 ml
jeweils der in Ia) angegebenen Standardinsulinlösung eingefüllt, worauf 0,3 ml BSA (0,5%ig) zugesetzt
werden. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 18 Stunden bei 4" C bebrütet Dann werden 0,1 ml
der gemäß a) erhaltenen INS-HCG-Lösung zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne
von 1 Stunde bei 37°C anschließt. Nach der Bebrütung wird die Lösung in dem Reagensglas entfernt, worauf
das Reagensglas mit Phosphatpuffer gewaschen wird. Dann werden 0,1 ml des gemäß c) erhaltenen Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugats
und 0,7 ml BSA (0,5°/oig) zugesetzt, worauf die Mischung während einer
Zeitspanne von 1 Stunde bei 370C bebrütet wird. Nach einem Waschen des Reagensglases werden 3 ml einer
Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) enthält sowie 3%iges Wasserstoffperoxid (ΙΟΟμΙ/dl)
enthält, zugesetzt, worauf eine Reaktion während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur
ausgeführt wird. Dann wird das Absorptionsvermögen bei 465 nm gemessen. Die dabei hergestellte Standardkurve
geht aus Fig. 2 hervor. Man sieht, daß eine Insulinmessung zur Ermittlung eines Wertes von
10 μΐυ/ml aus Fi g. 2 möglich ist Diese Messung ist um
das 3- bis 5fache empfindlicher als diejenige der herkömmlichen Methode.
Ausfährur.gsbeispie! 2
Insulinmessung
a) Herstellung eines Insulin-BSA-Konjugats
a) Herstellung eines Insulin-BSA-Konjugats
10 mg kristallines Rinderinsulin und 12,8 mg BSA
werden jeweils in 10 ml eines 0,4 m-Boratpuffers mit einem pH von 9,0 aufgelöst Diese zwei Lösungen
werden vermischt Die erhaltene Mischung wird mit 037 ml eines 0,01 m-Bisdiazobenzidins vermischt
worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur unter Rühren
stehenläßt Nach der Reaktion wird die Lösung unter Anwendung einer Ultrafiltrationsmethode konzentriert
worauf sich eine Reinigung mit Sephadex G-150 anschließt Dabei wird ein Insulin-BSA-Konjugat
erhalten.
b) Herstellung eines mit readioaktivem Jod
markierten Anti-BSA-Antikörpers
markierten Anti-BSA-Antikörpers
In ein kleines Reagensglas werden 0,025 ml einer 0,5
m-Phosphatpufferlösung eingefüllt. Dann werden 2 m-Ci radioaktives Natriumiodid (NA131J) eingefüllt.
Anschließend werden 0,025 ml einer 400 μg/ml Anti-BSA-Antikörperlösung
hergestellt und auf herkömmliche Weise gereinigt. 0,02 ml 4 mg/ml Chloramin T werden zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne
von 1 Minute vermischt wird. Dann werden 0,1 ml 24 mg/ml Natriummetabisulfit und 0,4 ml 10 mg/ml
Kaliumiodid zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird mit Sephadex G-50 gereinigt, wobei ein 1JI J-Anti-BSA-Antikörper
erzeugt wird.
c) Insulinmessung
In ein gemäß Ha) hergestelltes Antiinsulinantikörpersensibilisiertes
Polystyrolreagensglas werden jeweils 0,1 ml einer gemäß la) erhaltenen Standardinsulinlösung
und 0,1 ml einer gemäß Ia) erhaltenen Standardinsulinlösung und 0,6 ml PBS-Lösung von 0,1% Kaninchen-yglobulin
(RGG) gegeben, worauf während einer Zeitspanne von 18 Stunden bei 4°C bebrütet wird. Dann
werden 0,1 ml des gemäß a) erhaltenen Insulin-BSA-Konjugats
zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37° C
anschließt. Nach der Bebrütung wird die Lösung entfernt, worauf das Reagensglas mit Phosphatpuffer
dreimal gewaschen wird. Dann werden 0,1 ml einer mit radioaktivem Jod markierten Anti-BSA-Antikörperlösung,
erhalten gemäß b) sowie 0,7 ml PBS, enthaltend 0,1% RGG, zugesetzt. Die Mischung wird während
einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37°C bebrütet. Nach der Entfernung der Reaktionsmischung wird das
Reagensglas gewaschen, worauf unter Verwendung eines Szintillationszählers die Restradioaktivität in dem
Reagensglas gemessen wird. Nach dieser Methode können 1 μΐυ/ml Insulin gemessen werden.
Ausführungsbeispiei 3
Messung von menschlichem Placentalactogen (HPL) a) Herstellung von einer Standard-HPL-Lösung
Nach der Methode von H.Morikawa et al. (Jap. J. EndocrinoU 49, 882 [1973]), wird HPL aus der Placenta
einer normalen schwangeren Frau extrahiert und gereinigt und zur Erzielung von Konzentrationen von
100, 10, 2,5, 0,6, 0,15 und 0 ng/ml in PBS mit einem pH von 6,4, enthaltend 0,1% BSA, aufgelöst.
b) Herstellung von HPL-HCG-Konjugat
Nach der Methode gemäß Ic) werden 5 mg HCG und 5 mg HPL miteinander umgesetzt wobei ein HPL-HCG-Konjugat
erhalten wird.
c) Herstellung einer Anti-HPL-Antikörpergekuppelten Cellulose
Ein Kaninchenanti-HPL-Serum, das aus einem Kaninchen erhalten wird, das gegen HPL immunisiert
ist, wird durch Aussalzen zur Erzeugung eines Änti-HPL-Antikörpers gereinigt Nach der Methode
gemäß Id) wird der auf diese Weise erhaltene Antikörper mit Cellulose umgesetzt wobei eine
45
50
55
60 Anti-HPL-Antikörper-gekuppelte Cellulose erhallen
wird, die dann gefriergetrocknet wird.
d) HPL-Messung
0,5 ml einer l%igen Suspension der gemäß c) erhaltenen Anti-HPL-Antikörper-gekuppelten Cellulose
und 0,1 ml jeweils der gemäß a) erhaltenen Standard-HPL-Lösung werden zusammen in ein Reagensglas
eingefüllt. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 370C bebrütet. Dann wird
die Mischung mit 0,1 ml HPL-HCG-Konjugat, erhalten gemäß b) versetzt, worauf während einer Zeitspanne
von 1 Stunde bei 37°C bebrütet wird. Nach der Bebrütung wird die Anti-HPL-Antikörper-gekuppelte
Cellulose abgetrennt und mit Phosphatpuffer gewaschen. Dann werden 0,1 ml des Anti-HCG-Antikörper-HRP-Kunjugais,
erhalten gemäß Beispiel Ic), und 0,6 rnl BSA, 0,5%ig, zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung
während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 370C anschließt. Anschließend erfolgt ein Waschen mit einem
Phosphatpuffer, worauf 3 ml einer Substratlösung zugesetzt werden, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl)
und 0,3%iges Wasserstoffperoxid (1 ml/dl) enthält. Die Mischung läßt man während einer Zeitspanne von 1
Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird das Absorptionsvermögen bei 465 nrn gemessen. Nach
dieser Methode können 0,5 bis 1 ng/ml HPL gemessen werden.
Ausführungsbeispiei 4
östriolmessung
a) Herstellung einer Standardöstriollösung
a) Herstellung einer Standardöstriollösung
östriol (Sigma Chemical) wird zur Erzielung von
Konzentrationen von 640,160,40,10, 2,5 und 0 ng/m! in
PBS mit einem pH von 6,4, enthaltend 0,1% BSA, aufgelöst.
b) Herstellung von östriol-ie^-dihemisuccinat-
BSA-Konjugat
600 mg Östriol-16,17-dihemisuccinat (Am. J. Obstet.
Gynecol., 109, 897 [1971]), werden in 12 ml Dioxan aufgelöst worauf 0,3 ml Tri-n-butyiamin der Lösung
zugesetzt werden. Nach einer Abkühlung auf 12° C wird
die Lösung mit 0,17 ml Isobutylchlorcarbonat versetzt, worauf durch Rühren gut vermischt wird Die auf diese
Weise erhaltene Mischung wird mit einer Lösung vermischt die durch Auflösen von 1,70 g BSA in 40 ml
destilliertem Wasser erhalten worden ist Der pH der Lösung wird unter Verwendung von 1 n-Natriumhydroxid
auf 12,0 eingestellt worauf 40 ml Dioxan zugesetzt werden. Die Mischung läßt man dann bei 12° C stehen.
Nach der Umsetzung während einer Zeitspanne von 4
Stunden unter Rühren werden nichtumgesetzte Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht wie Östriol-16,17-dihemisuccinat
und Tri-n-butylamin, unter Verwendung von Sephadex G-25 abgetrennt Die Fraktion
mit hohem Molekulargewicht wird gefriergetrocknet wobei ein Östriol-ie.^-dihemisuccinat-BSA-KonJTigat
erhalten wird.
c) Herstellung von östron-17-oxim-hämoglobin-
Konjugat
In 20 ml Dioxan werden 687 mg Östron-17-oxim (Erlanger, B. F, J. BioL Chem, 234, 1090 [1959]),
aufgelöst Die erhaltene Lösung wird mit QS ml Tri-n-butylamin versetzt Nach einem Abkühlen auf
11°C werden der Lösung 0,27 ml Isobutylchlorcarbonat
10
15
zugesetzt, worauf gerührt wird. Dieser Mischung wird eine Lösung zugesetzt, die durch Auflösen von 2,42 g
Hämoglobin (Hb) in 70 ml destilliertem Wasser erhalten worden ist. Der pH wird auf 9,5 eingestellt, worauf 70 ml
Dioxan zugegeben werden. Dann hält man die Mischung bei ITC Nach einer Umsetzung während
einer Zeitspanne von 4 Stunden unter Rühren werden nichtumgesetzte Substanzen mit niederem Molekulargewicht
unter Verwendung von Sephadex G-25 abgetrennt Die Fraktion mit hohem Molekulargewicht
wird gefriergetrocknet, wobei ein Östron- 17-oxim- Hb-Konjugat
erhalten wird.
d) Herstellung von
Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugat
Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugat
Eine Ziege wird mit jeweils 20 mg Hb zusammen mit vollständigem Freundschem Adjuvans drei- bis viermal
pro Woche gespritzt. Nach der Methode gemäß Ib) wird ein Anti-Hb-Antikörperglobulin erhalten. Die Umsetzung
zwischen 5 mg dieses Anti-Hb-Antikörperglobulins und 5 mg HRP erfolgt nach der Methode Ic), wobei
ein Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugat erhalten wird.
e) Herstellung von Anliöstriolantikörper
Das gemäß b) erhaltene Östriol-ie^-dihemisuccinat-BSA-Konjugat
wird in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst. Die Lösung wird zusammen mit
vollständigem Freundschen Adjuvans wiederholt subkutan in das Hinterteil eines erwachsenen Kaninchens
injiziert, wobei jeweils 2 mg des Konjugats eingespritzt werden. Nachdem ein Anstieg des Antikörpertiters
festgestellt worden ist, wird das Blut gesammelt, wobei nach der Methode gemäß Ib) ein Antiöstriol-16,17-dihemisuccinat-BSA-Antikörper
erhalten wird. Unter Verwendung von BSA, gekuppelt mit Sepharose durch Bromcyan, wird der Anli-BSA-Antikörper aus diesem
Antikörper entfernt. Nach Zugabe von BSA-gekuppelter Sepharose in einer Menge von 25 ml bis 50 ml der
Antikörperlösung läßt man die Suspension während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 37°C stehen,
worauf sich eine Bebrütung über Nacht bei 4°C anschließt. Dann wird die Suspension während einer
Zeitspanne von 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, wobei ein spezifischer Antikörper zu Östriol erzeugt wird.
f) Öslriolmessung
In ein nach der Methode Ha) hergestelltes Antiöstriol-Antikörper-sensibilisiertes
Polystyrolreagensglas werden 0,6 ml BSA (0,1 %ig) und 0,1ml der
Standardöstriollösung gemäß a) zusammen eingefülk und während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei
Zimmertemperatur bebrütet. Dann werden 0,1 ml des gemäß c) hergestellten Östron-17-oxim-Hb-Konjugats
25
30 der Lösung zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird.
Nach der Reaktion erfolgt ein Waschen mit Phosphatpuffer. Anschließend werden 0,1 ml des gemäß d)
erhaltenen Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugats und 0,5 ml BSA (0,1 %ig) zugesetzt, worauf während einer
Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Anschließend wird gewaschen. Dann
werden 3 ml einer Substratlösung gemäß Beispiel 1 zugesetzt, worauf man die Mischung während einer
Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt. Dann wird das Absorptionsvermögen bei
465 nm gemessen. Nach dieser Methode kann 1 mg/ml Östriol gemessen werden.
Ausführungsbeispiel 5
Insulinmessung
a) Herstellung von Rattenleberinsulinrezeptor
Rattenleberinsulinrezeptor wird nach der Methode von K. Suzuki et al. (Saishin Igaku, 30, 591 [1975]) hergestellt.
Rattenleberinsulinrezeptor wird nach der Methode von K. Suzuki et al. (Saishin Igaku, 30, 591 [1975]) hergestellt.
b) Herstellung von Insulin-HCG-Konjugat
Nach der Methode gemäß Beispiel Ia) wird ein Insulin-HCG-Konjugat erhalten.
c) Herstellung von mit 125J markiertem
Anti-HCG-Antikörper
Anti-HCG-Antikörper
Der gemäß Beispiel Ib) erhaltene Anti-HCG-Antikörper wird mit 125J nach der Chloramin-T-Methode
markiert. Der markierte Antikörper wird mit Sephadex G-50 gereinigt, wobei ein 125]-Anti-HCG-Antikörper
erhalten wird.
d) Insulinmessung
In ein Reagensglas werden 0,1 ml der Standardinsulinlösung gemäß Ia), 0,5 ml BSA (0,5%ig) und 0,1 ml der
Rezeptorsuspension gemäß a) eingefüllt, worauf sich eine Bebrülung während einer Zeitspanne von 1 Stunde
bei 4°C anschließt. Dann werden 0,1 ml des Insulin-HCG-Konjugats gemäß b) zugesetzt, worauf man die
Mischung über Nacht bei 4°C stehenläßt. Dann wird die Reaktionsmischung zentrifugiert, worauf der ausgefallene
Rezeptor mit einem kalten Phosphatpuffer gewaschen wird. Dann werden in das Reagensglas 0,5 ml BSA
(0,5%ig) und 0.1 ml der '"J-Anti-HCG-Antikörperlösung
eingefüllt, worauf die Mischung über Nacht bei 4°C stehengelassen wird. Nach einem Zentrifugieren und
einem Waschen mit Phosphatpuffer wird die Radioaktivität des ausgefällten Rezeptors gemessen. Nach dieser
Methode können mehr als 5 ng/ml Insulin gemessen werden.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (6)
- Patentansprüche:L Immunchemisches Meßverfahren, gekennzeichnet durch folgende Stufen:a) Umsetzung eines Antikörpers zu einem zu messenden Antigen (Ab 1) mit dem zu messenden Antigen (Ag 1) und einem Konjugat, das durch Kupplung des zu messenden Antigens an ein zweites Antigen mit einer starken Antigenizität gebildet worden ist (Ag 1 —Ag 2),b) Abtrennen des durch die vorstehende Reaktion gebildeten Komplexes Ab 1—Ag 1—Ag 2 aus der Reaktionsmischung,c) Umsetzung des abgetrennten Komplexes Ab 1 —Ag 1 —Ag 2 mit einem markierten Antikörper zu dem zweiten Antigen (Ab 2),d) Abtrennen des Komplexes Ab 1—Ag 1 —Ag 2 — markiertes Ab 2, der bei der Reaktion gemäßc) erzeugt wird, von der Reaktionsmischung, unde) Messen entweder der Aktivität des Markierungsmittels, das an die vorstehenden Reaktionsprodukte gebunden ist, oder des Markierungsmittels, das in der Reaktionsmischung zurückbleibt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete zweite Antigen ausRinderserumalbumin,menschlichem Serumalbumin, Kaninchen-y-Globulin,menschlichem Choriumgonadotropin,Hämoglobin, Tetanustoxoid,einem pneumokokkaien Polysaccharid oder aus einem GIutaminsäure/Lysin/Tyrosin-Copolymeren
besteht. - 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Markierungsmittel ein Radioisotop, Enzym oder ein fluoreszie- rendes Material ist.
- 4. Reagens zur Durchführung einer immunchemischen Messung, gekennzeichnet durch ein Konjugat, das durch Kupplung des zu messenden Antigens an ein zweites Antigen mit einer starken Antigenizität gebildet worden ist.
- 5. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Antigen ausAlbumin, menschlichem Serumalbumin,y-Globulin, somenschlichem Choriumgronadotropin,Hämoglobin, Tetanustoxoid,einem pneumokokkalem Polysaccharid oder auseinem GIutaminsäure/Lysin/Tyrosin-Copolymeren
besteht. - 6. Reagens nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es gefriergetrocknet ist.60
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