DE2448411A1

DE2448411A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von substanzen mit einer gegenseitigen spezifischen bindungsaffinitaet

Info

Publication number: DE2448411A1
Application number: DE19742448411
Authority: DE
Inventors: Ernest Clarence Adams; Joe William Davis; John Menley Yoder
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1973-10-11
Filing date: 1974-10-10
Publication date: 1975-05-22
Also published as: ES430056A1; CS200471B2; BR7408412A; IL45646A0; IL45646A; NO147198C; NO147198B; DD114148A5; AU7325174A; CH607025A5; NL7413284A; JPS5067191A; FR2247728B1; HU171139B; NO743632L; DK526174A; FR2247728A1; AR203574A1; ZA745776B; IT1032099B

Description

Beschreibung zu der Patentanmeldung

Miles Laboratories, Inc. 1127 Myrtle Street, Elkhart, Indiana 46514

U.S.A.

betreffend:

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Substanzen mit einer gegenseitigen spezifischen Bindungsaffinität

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Substanzen in einer Flüssigkeit, die eine gegenseitige spezifische· Bindungsaffinität besitzen, wie Antigene und Antikörper. Zur Durchführung dieses Verfahrens wird eine Vorrichtung angewandt umfassend eine Säule, die eine unlösliche poröse Matrix enthält, an oder in der spezifische bindende Partner zu der zu bestimmenden Substanz unbeweglich gemacht worden sind, vorzugsweise durch chemische Kupplung mit dem Matrixmaterial. Das Verfahren besteht darin, daß man eine Flüssigskeitsprobe, enthaltend die zu bestimmende Substanz, eine Vergleichsprobe_f enthaltend eine markierte Form entweder der zu bestimmenden Substanz oder eines spezifischen Bindungspartners, und eine Eluierflüssigkeit durch die Vorrichtung fließen läßt und anschließend die relative Menge der markierten Komponente, die in der Säule zurückgehalten o<ter aus ihr eluiert worden ist* bestimmt. Ein Vergleich -mit Standardwerten ergibt den Wert

die

für die Konzentration oder absolute Menge der in der flüssigen Probe zu bestimmenden Substanz.

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Spezifische bindende Substanzen sind solche Substürfeerr, * die mit npeziflachen bindenden Partnern unter Ausschluß andoror Substanzen eine Bindung eingehen. Diese Bindung i.f.;t im allgemeinen eine physikalische Bindung, kann jedoch in einigen Fällen alt; physiochemische Bindung oder sogar als chemische Bindung bezeichnet werden. Man kann r.agen, daß eine spezifische bindende Substanz und ihr spezifischer Bindungspartner eine Bindungsaffinität oder Neigung miteinander zu reagieren besitzen. Spezifisch bindende Substanzen sind im allgemeinen Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Glycoproteine oder Steroide. Einige Beispiele für spezifisch bindende Paare umfassend eine spezifinch bindende Substanz und deren spezifischen Bindungspar' tner, sind Antigene und ihre Antikörper, Haptene und ihre Antikörper, Enzyme und ihre. Substrate, Hormone und ihre Rezeptoren \md Vitamine und deren Rezeptoren.

Der Ausdruck "spezifisch bindende Substanz"·; wie er hier verwendet wird, kann sich entweder auf die zu bestimmende Substanz oder deren spezifischen Bindungspartner beziehen. Der Ausdruck "spezifisch bindendes Paar" bezeichnet eine spezifisch bindende Substanz und deren spezifischen Bindungspartner. Der Ausdruck "unbekannte Substanz" bezeichnet die zu bestimmende Substanz und der Ausdruck "markierte Komponente" bezeichnet entweder eine markierte Form der zu bestimmenden Substanz oder eines spezifischen Bindungspartners.

Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von spezifisch bindenden Substanzen beruhen auf der Fähigkeit derartiger Substanzen gleichannaßen mit ihren spezifischen Bindungspartnern zu reagieren unabhängig davon, ob diese in markierter oder nicht markierter Form vorliegen.

Bestimmungsverfahren für spezifisch bindende Substanzen können alsiflinunologische Bestimmungsverfahren bezeichnet werden, wenn Antigene, Haptene oder Antikörper beteiligt

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sind und als radioimmunologische Bestimmungsverfahren bei den gleichen Substanzen, wenn die markierte Substanz radioaktiv markiert ist.

Die Anwendung eines Zweiphasensystems, bestehend aus einer flüssigen Phase und einer festen Phase, bei Bestimmungsverfahren für spezifisch bindende Substanzen hat diese Verfahren wesentlich vereinfacht. In derartigen Zweiphasensystemen umfaßt die feste Phase die bindenden Partner in unlöslich gemachter Form. Die Anwendung von Techniken wie Adsorption, chemische Kupplung und physikalischer Einschluß ermöglicht die Unlöslichmachung der bindenden Partner. Der Vorteil des Zweiphasensystemn liegt in erster Linie in der leichten Trennung der gebundenen markierten Komponente von der nicht gebundenen markierten Komponente.

Die Trennung der markierten Komponente, die an ihren Bindungspartner gebunden ist, von dem nicht gebundenen Anteil ist für die Bestimmung spezifischer bindender Substanzen kritisch. Im allgemeinen bestimmt die Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit, mit der diese Trennung durchgeführt werden kann_fdirekt die Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit der gesamten Bestimmung. Die zur Unlöslichmachung der bindenden Partner für die spezifischen Bindungsbestimmungen angewandten Techniken umfassen eine Vorfällung des bindenden Partners, die manchmal als Doppelantikörper-Verfahren bezeichnet wird, wenn der bindende Partner ein Antikörper ist,den Einschluß des bindenden Partners in einem Acrylamidgel und eine Polymerisation des bindenden Partners. Die Verfahren der chemischen Bindung oder Kupplung des bindenden Partners an ein unlösliches Polymer oder Absorption an der inneren Oberfläche eines Reagenzglases für die Bestimmung werden häufiger angewandt.

Zur Zeit wird bei den bekannten ,Bestimmungen spezifisch bindender Substanzen, bei denen unlöslich gemachte .Bindungspartner angewandt werden, ein geschlossenes oder Nicht-Durchlaufsystem wie Reagenzgläser enthaltend die unlöslich gemach-

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ten Bindungspartner in loser Teilchenform oder Reagenzgläser, bei denen die Bindungspartner an der inneren Oberfläche adsorbiert sind, angewandt. Da die Proben der unbekannten Substanz im allgemeinen stark verdünnt sind und da bei einem abgeschlossenen System die Größe der Probe begrenzt ist, muß die Inkubationszeit lang sein, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Empfohlene Inkubationszeiten liegen im Bereich von 6 Stunden bis zu 2 Tagen oder darüber. Die Trennung der gebundenen von der ungebundenen markierten Komponente erfordert auch wenn unlöslich gemachte Bindungspartner angewandt werden, noch mühsame Schritte, wie ein Filtrieren, Zentrifugieren und ausgiebiges Waschen.

Der Ausdruck "Bestimmung einer Substanz" in einer Flüssigkeit bedeutet sowohl die Bestimmung der Konzentration als auch der absoluten Menge der Substanz in der flüssigen Probe.

Es hat sich nun gezeigt, daß durch Anwendung eines Zweiphasendurchlauf-Bestimmungssystems bei einer Gleichgewichts-, direkten oder Sättigungsbestimmung sich ein sehr vorteilhaftes schnelles und zuverlässiges Verfahren ergibt und eine geeignete Verrichtung zur quantitativen Bestimmung einer der Substanzen eines spezifisch bindenden Paares mit einer gegenseitigen Bindungsaffinität. Substanzen, die auf diese Weise bestimmt werden können, umfassen Antigene und ihre Antikörper, Haptene und ihre Antikörper, Enzyme und ihre Substrate, Hormone und ihre Rezeptoren und Vitamine und ihre Rezeptoren. Ein Antigen kann irgend eine chemische Verbindung oder Substanz sein, die mit einem Antikörper reagiert und an ihn gebunden wird. So kann ein Antigen ein einfaches antigenes Protein oder Polypeptid sein oder ein antigenisch wirksamer Antigen-Antikörper-Komplex. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt grundsätzlich eine Säule, enthaltend eine Matrix, die porös und in der,die zu bestimmende Substanz enthaltendenflüssigkeit unlöslich ist und die einen spezifischen Bindungspartner zu der zu bestimmenden Substanz in unlöslicher⁺Form enthält.

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Die Matrix besteht vorzugsweise aus einem Material umfassend eine polymere Substanz. Ein spezifischer Bindungspartner zu der zu bestimmenden Substanz ist an oder in der Matrix immobilisierte vorzugsweise durch chemische Bindung an die Matrix, wobei die Matrix vorzugsweise eine Polymersubstanz ist, die eine Hydroxyl-, primäre Amino-oder sekundäre Aminogruppe enthält. Der immobilisierte spezifische Bindungspartner ist chemisch an die Matrix gebunden, vorzugsweise über ein Kupplungsmittel besonders ein Cyanogenhalogenid, ein anorganisches oder organisches Cyanat oder ein Epihalogenhydrin.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt grundsätzlich die folgenden Stufen (a) Zusammenbringen der Matrix mit der zu bestimmenden Substanz und einer markierten Komponente, umfassend eine markierte Form --iner der Substanzen, die ein spezifisches bindendes Paar bilden, zu dem die zu bestimmende Substanz gehört; (b) Zusammenbringen der Matrix mit einer Eluierflüssigkeit, die im wesentlichen die gesamte nicht gebundene markierte Komponente eluieren kann, die eine vorher bestimmte Zeit nach Stufe (a) verbleibt und (c) Bestimmung der relativen Menge der markierten Komponente, die in der Säule zurückbleibt und die abhängt von der Menge der zu bestimmenden Substanz, die mit der Matrix in Berührung gekommen ist.

Die relative Menge der markierten Substanz, die in der Säule verbleibt, indem sie spezifisch an die immobilisierte · Bindungspartner gebunden wird, wird vorzugsweise mit Standardwerten verglichen, die die relativen Mengen der markierten Komponente angeben, die in der gleichen oder einer ähnlichen Säule nach dem gleichen Verfahren zurückbleibt, bei der Bestimmung von Standardflüssigkeiten, enthaltend verschiedene bekannte Standardmengen der zu bestimmenden Substanz.

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Es gibt grundsätzlich drei Arten der quantitativen Bestimmung spezifisch bindender Substanzen mit Hilfe der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode. Die Gleichgewichtsmethode beruht auf der Konkurrenz zwischen der unbekannten Substanz und deren markierter Eorm um eine begrenzte Menge der spezifischen Bindungspartner. Die Sättigungsmethode beruht auf der Sättigung eines Teils der bindenden Partner mit der unbekannten Substanz und anschließenden Umsetzung der restlichen nicht gebundenen Partner mit einer Menge der markierten Form der zu bestimmenden Substanz. Die direkte Methode beruht auf der Zugabe der unbekannten Substanz zu einer Menge der spezifisch bindenden Partner und anschließenden Zugabe überschüssiger bindender Partner in markierter Form, die mit der unbekannten Substanz eine Bindung eingehen. Alle diese Methoden ergeben quantitative Bestimmungen durch Berechnungen des Ausmaßes der Bindung der markierten Komponente. Bei keiner der erwähnten Bestimmungsmethoden oder in keiner Stufe ist es erforderlich, daß die Reaktion vollständig abläuft oder das Gleichgewicht erreicht wird. Eine genaue Regelung der Mengen an unlöslich gemachten Bindungspartnern und markierter Komponente,der Größe der Probe und der Inkubationszeiten führt zu einer Bindung der markierten Komponente an die Matrix, die eine Funktion der Menge oder Konzentration der unbekannten Substanz ist.

Bei einem Sättigungsverfahren ist die markierte Komponente eine markierte Form der zu bestimmenden Substanz und die Stufe(a)wird durchgeführt, indem man (a)(1) die Matrix mit der zu bestimmenden Substanz zusammenbringt, vorzugsweise unter Anwendung einer vorher bestimmten Menge der Flüssigkeit, wobei die in der Matrix unbeweglich gemachten spezifisch bindenden Partner im Überschuß gegenüber der Menge vorliegen, die mit der zu bestimmenden Substanz innerhalb der Zeit, die die zu bestimmende Substanz und die Matrix in Kontakt
miteinander stehen, eine. Bindung.eingehen können, wobei

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mindestens einige nicht gebundene Stellen an der Matrix verbleiben und (a)(2) anschließend die Matrix mit einer vorher bestimmten Menge der markierten Komponente zusammenbringt, die mit einem Teil oder allen restlichen nicht gebundenen Stellen der unbeweglich gemachten spezifisch bindenden Partner eine'Bindung eingeht. Vorzugsweise werden die Zeiten, in denen die Matrix und die zu bestimmende Substanz bzw. die Matrix und .die markierte Komponente in Berührung sind, auf vorher bestimmte Inkubationszeiten verlängert, die gleich oder unterschiedlich sein können und die vorzugsweise zwischen 15 Minuten und 12 Stunden betragen.

Bei der Sättigungsmethode kann zwischen den Stufen (a)(1) und (a)(2) die Säule mit der Eluierflüssigkeit, die imstande ist, im wesentlichen die gesamte verbleibende nicht gebundene unbekannte Substanz aus der Flüssigkeitsprobe zu entfernen in Berührung gebracht werden, obwohl sich das als nicht erforderlich erwiesen hat. Diese Eluierflüssigkeit ist im allgemeinen die gleiche wie die in Stufe (b) angewandte. Es hat sich gezeigt, daß diese Stufe im allgemeinen nicht erforderlich ist, da die Vergleichsprobe selbst als Eluierflüssigkeit dient, indem sie im wesentlichen die gesamte restliche nicht gebundene unbekannte Substanz, die aus der,Flüssigkeitsprobe stammt, physikalisch aus der Säule entfernt.

Nach dem Gleichgewichtsverfahren ist die markierte Komponente eine markierte Form der zu bestimmenden Substanz und Stufe (a) wird durchgeführt, indem^mIStweder die Matrix mit einem Gemisch, umfassend die zu bestimmende Substanz und die markierte Komponente, in Berührung bringt, wobei die Menge der spezifischen bindenden Partner die in der Matrix unbeweglich gemacht sind, gegenüber derjenigen Menge, die mit den beiden Substanzen, nämlich der zu bestimmenden und der markierten Substanz innerhalb der Zeit die das Gemisch und die Matrix miteinander in Berührung stehen, reagieren kann, im Überschuß vorliegt, oder indem man (a)(1) die Matrix mit einer vorher bestimmten Menge der markierten

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Komponente in Berührung bringt, wobei die markierte Komponente im Überschuß gegenüber der Menge vorliegt, die mit den spezifisch bindenden, in der Matrix unbeweglich gemachten Partnern, in der Zeit, in der die markierte Komponente und die Matrix in Berührung stehen, eine Bindung eingehen

kann, und (a)(2) anschließend die Matrix mit der zu bestimmenden Substanz in Berührung bringt, vorzugsweise indem man eine vorher bestimmte Menge der Flüssigkeitsprobe verwendet, wobei die zu bestimmende Substanz einen Teil der gebundenen markierten Komponente, von den in der Matrix unbeweglich gemachten spezifisch bindenden Partnern verdrängt. Daher muß die Menge der markierten Komponente, die in Stufe (a)(1) an die Matrix gebunden wird, größer sein als die Menge, die vollständig durch die zu bestimmende Substanz," die in Stufe (a)(2) zugegeben wird, innerhalb der Zeit, die die zu bestimmende Substanz mit der Matrix in Berührung steht, verdrängt werden kann. In beiden Fällen werden die Berührungszeiten zwischen der Matrix und der zu bestimmenden Substanz bzw. der markierten Komponente auf vorher bestimmte Inkubationszeiten verlängert, die gleich oder verschieden sein können und vorzugsweise zwischen 15 Minuten und 12 Stunden betragen.

Bei der. direkten Bestimmungsmethode ist die markierte Komponente eine markierte Form eines spezifisch bindenden Partners zu der zu bestimmenden Substanz und Stufe (a) wird durchgeführt, indem man (a)(1) die Matrix mit der zu bestimmenden Substanz zusammenbringt, wobei vorzugsweise eine vorher bestimmte Menge einer Flüssigkeitsprobe angewandt wird und die Menge der in der Matrix unbeweglich gemachten spezifisch bindenden Partner größer ist als die Menge, die imstande ist, mit der zu bestimmenden Substanz in der Zeit, die die zu bestimmende Substanz und die Matrix in Berührung sind, eine Bindung einzugehen und (a)(2) anschließend die Matrix mit einer vorher bestimmten Menge der markierten Substanz- in Berührung bringt, um mit einem

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Teil öder der gesamten zu bestimmenden Substanz, die an die.unbeweglich gemachten spezifisch bindenden Partner· gebunden ist, eine Bindung einzugehen.

Bei einem speziellen Verfahren hängt das Ausmaß der Bindung der markierten Komponente ab von den Matrix-Parametern, nämlich der Menge der bindenden Partner, die in der Matrix immobilisiert sind, dem Ausmaß der Hemmung durch die Immobilisierung und der Größe der flüssigen Probe sowie von der Konzentration oder Menge der unbekannten Substanz In der Probe. Mit Ausnahme der Konzentration oder Menge der unbekannten Substanz können die anderen oben erwähnten Faktoren so geregelt und eingestellt werden, daß man Meßbereiche erhält, die über den erwarteten Konzentrationsbereich der unbekannten Substanz zuverlässig sind. Üblicherweise werden die Paramter für die Matrix so gewählt, daß 30 bis 50 % der markierten Verbindung gebunden und in der Säule festgehalten werden, bei einem speziellen Verfahren, bei dem die flüssige Probe die zu bestimmende Komponente nicht enthält. Das gleiche Verfahren wird dann bei der späteren Bestimmung der unbekannten Substanz angewandt.

Bei der erfindungsgemäßen Anwendung eines Zweiphasenbestimmungsverfahrens für spezifisch bindende Substanzen, ist eine fest Phase erforderlich, die die unlöslich gemachten Bindungspartner umfaßt. Durch das Unbeweglichmachen bzw. Immobilisieren der Bindungspartner in der unlöslichen Matrix werden die Bindungspartner unlöslich gemacht. Die Matrix kann irgendeine Substanz enthalten, die in Beziehung auf die flüssige Phase unlöslich und porös ist und die Fließeigenschaften besitzt, um eine wirksame Berührung mit der flüssigen Phase zu ermöglichen und die imstande ist, die spezifischen Bindungspartner zu immobilisieren. Derartige Substanzen umfassen verschiedene Polymere, Gele, Kolloide, faserförmige Produkte usw. Die Porosität sollte so sein,, daß eine ausreichende Wechselwirkung zwischen den

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flüssigen Phasen und den Bindungspartnem in einer möglichst geringen Zeit eintritt, so daß die unbekannte Substanz und die markierte Komponente in schnellen und wirksamen Kontakt kommen mit den spezifisch bindenden Stellen der Bindungspartner.

Es gibt eine Vielzahl von Verfahren zur Immobilisierung der Bindungspartner mit einer unlöslichen Matrix. Dazu gehört der physikalische Einschluß der Bindungspartner. Die Bindungspartner können auch polymerisiert oder an eine Substanz gekuppelt werden, wobei zunächst ein Konjugat entsteht^ und dann physikalisch als Polymer oder Konjugat in die Matrix eingeschlossen werden. Solche Substanzen, die mit den Bindungspartnern Konjugate bilden, sind unter anderen Latex, Methacrylat und Bakterien. Ein anderes Mittel, um die Bindungspartner unbeweglich zu machen, ist die Adsorption an einer Matrix. Exne solche Adsorption muß stark genug sein, um die Bindungspartner gegenüber der Flüssigkeitsprobe unbeweglich bzw. unlöslich zu machen. Beispiele für Matrices, die geeignet sind, um die Bindungspartner durch einen physikalischen Einschluß entweder der Bindungspartner selbst oder eines Polymers oder Konjugats der Bindungspartner zu immobilisieren₍umfassen verschiedene komplexe Polymere, Kolloide und Gele wie Acrylamidgel. Substanzen, die die Bindungspartner durch Adsorption immobilisieren, sind unter anderem Aktivkohle, Glas und verschiedene Kunststoffe.

Bei der Immobilisierung der spezifischen Bindungspartner in der Matrix sollten die bindenden Stellen der Bindungspartner so wenig wie möglich gehemmt werden in Beziehung auf ihre spezifische Bindungsfähigkeit gegenüber der unbekannten Substanz und den markierten Komponenten. Änderungen des pH-Wertes, der Temperatur und anderer Bedingungen können das Ausmaß einer derartigen Hemmung beeinflussen, so daß optimale Bedingungen gewählt werden können. Alle Reaktionen,

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bei denen Proteinstrukturen beteiligt sind, wie sie sich in Antigenen, Haptenen, Enzymen, Hormonen, Rezeptoren und Antikörpern finden, sollten bei einer möglichst niedrigen Temperatur und einem pH-Wert, der möglichst nahe an dem neutralen Bereich liegt, durchgeführt werden, um eine irreversible Denaturierung oder Aggregation zu vermeiden. Optimale Bedingungen variieren mit den einzelnen Bindungspartnern auf Grund der strukturellen Unterschiede bei derartigen Substanzen.

Ein bevorzugtes Mittel zur Immobilisierung der Bindungspartner mit der Matrix besteht darin, diese chemisch an die Matrix zu binden oder mit ihr zu kuppeln. Die chemische Bindung öder Kupplung der Bindungspartner mit der Matrix stellt sicher, daß sie unbeweglich sind und ermöglicht es, ein geeignetes Verfahren aus vielen auszuwählen. Für einen vorgegebenen Bindungspartner ergibt die große Anzahl chemisch reaktionsfähiger Gruppen, die darin enthalten sind , leicht ein Mittel, die Substanzen chemisch an eine entsprechend gewählte Matrix zu binden oder zu kuppeln.

Substanzen, die sich eignen , um die 'Bindungspartner über die Bildung chemischer Bindungen oder Kupplungsprodukte zu immobilisieren, wie es bevorzugt ist, umfassen verschiedene Polymere, Gele, Kolloide und faserförmige Substanzen. Die Bindungspartner können an das Matrixmaterial entweder direkt oder über ein chemisches Kupplungsmittel gebunden werden. Matrixmaterialien, die mit einem Kupplungsmittel umgesetzt worden sind, können als aktiviert, bezogen auf die chemisch reaktionsfähigen Stellen der Bindungspartner bezeichnet werden. Die grundsätzlichen reaktionsfähigen Stellen in den Bindungspartnern sind freie Carboxylgruppen, Iminogruppen, freie Thiolgruppen, Guanidinostrukturen, aliphatische Hydroxylgruppen, Methylmercaptogruppen, Phenylgruppen, Amidgruppen, Disulfidbindungen und Peptidbindungen.

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Substanzen, die für die Kupplung aktiviert werden können, umfassen faserförmige Materialien wie Cellulosederivate, natürlich vorkommende Polymere, wie bestimmte Polysaccharide und synthetische Polymers.

Die Gruppe der synthetischen Polymere ergibt eine große Auswahl an Substanzen, die für die Matrix verwendet werden können. Besonders bevorzugte polymere Substanzen sind solche, die mindestens eine Hydroxyl-, primäre Amino-oder sekundäre Aminogruppe enthalten. Bevorzugte Kupplungsmittel, die in Kombination mit den oben angegebenen Polymeren angewandt werden, sind Cyanogenhalogenide, wie Cyanogenbromid, die anorganischen und organischen Cyanate wie die Alkalicyanate und die Epihalogenhydrine wie Epichlorhydrin. Mit Cj^anogenbromid aktivierte Agarose ist besonders geeignet. Andere Kupplungsmittel, die angewandt werden können, umfassen Diazo- und Hydrazinverbindungen wie sie angewandt werden zur Aktivierung von Polystyrolen, Acrylamiden und deren Derivaten; Glutaraldeliyd zur Aktivierung von teilweise hydrolisiertem Nylon usw. Die Polymere, die angewandt werden können, können in disperser Form,als einheitliche Struktur oder in irgendeinem Zwischenzustand angewandt werden. Derartige Formen umfassen Pulver, Harze, Membranen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung umfassend eine Säule, die grundsätzlich als länglicher Hohlkörper beschrieben werden kann, der an beiden Enden offen ist. Die Säule ist vorzugsweise an mindestens einem Ende beliebig verschließbar. Die Säule kann irgendeine Form besitzen, in der die feste Phase festgehalten werden kann und die flüssige Phase auf die feste Phase aufgebracht und durch diese hindurchfließen kann. Derartige Formen umfassen gerade Rohre, Spritzen, Büretten, Pipetten und ähnliches sowie übliche Säulen, wie sie zum Beispiel zur Chromatographie angewandt werden. Die Säule sollte aus einem Material bestehen, das gegenüber den flüssigen Phasen in "dem Sinne inert ist, daß weder störende Substanzen, noch die unbekannte Substanz oder die markierte Komponente von dem Säulenmaterial selbst adsorbiert oder auf andere Weise festgehalten werden können.

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Wenn die markierte Substanz radioaktiv markiert ist, besitzt die Säule vorzugsweise eine feste Geometrie, um eine Vorrichtung zu erhalten, an der direkt die Radioaktivitätsmessungen durchgeführt werden können. Die feste Phase wird zum Beispiel durch poröse Scheiben, saugfähige bzw. durchlässige Stopfen permeable Membranen und ähnliches sowie durch die Form der Säule selbst festgehalten. Die zum Festhalten der festen Phase dienenden Substanzen sollten porös und gegenüber den flüssigen Phasen inert sein, so daß sie weder störende Substanzen noch die nichtgebundene unbekannte Verbindung oder die nichtgebundene markierte Komponente festhalten.

Die Zeichnung ist eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht einer Form der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Vorrichtung besteht aus einem zylinderförmigen Rohrkörper 11 mit einer festen Geometrie, der an einem Ende in ein 3pitzes Mundstück 13 ausläuft. Der Körper 11 besteht aus Polypropylen oder einem geeigneten Material und ist nach Belieben an dem Mundstück 13 mit Hilfe einer durch Reibung festsitzenden Kappe 12 verschließbar, die über das Mundstück 13 paßt und davon entfernt werden kann. Eine bestimmte Menge der Matrix 15, in der spezifische Bindungspartner immobilisiert sind, wird mit Hilfe einer porösen Polyäthylenscheibe 14 im unteren Bereich des Körpers 11 in diesem festgehalten. Ein Konservierungs- bzw. Schutzgemisch 16 für den Transport und die Lagerung wie eine Salzlösungj der ein Baktericid zugesetzt ist,oder ein Anteil einer der flüssigen Phasen, die während der Anwendung der Vorrichtung angewandt werden, kann in dem oberen Teil des Körpers enthalten sein, wie in der Figur angegeben. Der obere Teil des Körpers 11 kann einen nach außen ragenden Flansch 17 besitzen, der dazu dient, den Körper 11 in einem geeigneten Gestell senkrecht zu halten. Ferner ist eine abnehmbare Kappe bzw. " Stopfen 18 vorgesehen, um das obere Ende des Körpers 11 während des Transports und der Lagerung zu verschließen.

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Die in Stufe (b)angewandte Eluierflüsaigkeit muß im Stande aeir^auo der Säule im wesentlichen die gesamte nichtgebundene murkier te Komponente aus der Vergleichsprobe zu eluieren. Im allgemeinen■trennt die Eluierflüssigkeit nur physikalisch die in der Säule enthaltene Flüssigkeit von der Säule. Diese Eluierflüssigkeit; ist vorzugsweise ein Puffer, der im Stande ist, einen für die spezifische Bindungsreaktion geeigneten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Der optimale pH-Wert wird im allgemeinen so bestimmt, daß die Jiindungsaffinität zwischen der spezifisch bindenden Substanz und ihrem Bindungspartner möglichst heraufgesetzt und die Affinität störender Substanzen zu dem Matrixmaterial möglichst herabgesetzt wird. Es können sowohl organische als auch anorganische Puffer angewandt werden und die Auswahl eines speziellen Puffers hängt von der speziellen Bindungsreaktion ab. Es kann auch günstig sein_;der Eluierflüssigkeit ein Detergens zuzusetzen, um die Eluierung störender Substanzen aus der Flüssigkeitsprobe zu erleichtern.

Die Säule wird vorzugsweise vor Stufe (a) äquilibriert, indom man sie mit einer Äquilibrierflüssigkeit zusammenbringt. I)iöse Flüssigkeit ist vorzugsweise ein Puffer und stellt die optimalen Bedingungen für die spezifische Bindungsreaktion ein. Es ist im allgemeinen die gleiche Flüssigkeit, die in Stufe (b) angewandt wird.

Der Kontakt zwischen der festen Phase und der flüssigen Phase wird erreicht, indem man die flüssigen Phasen durch die erfindungsgemäße Vorrichtung leitet. Beim Durchgang der beiden flüssigen Phasen, nämlich der flüssigen Probe,die die unbekannte Substanz enthält, und der Vergleichsprobe werden die flüssigen Phasen an dem offenen Ende des Körpers in die Vorrichtung eingebracht und. kommen mit der festen Phase in Kontakt. Die Zeit,die die feste Phase und die flüssige Phase in Berührung stehen, wird bestimmt durch die Stärke der Kraft, die auf die flüssige Phase einwirkt, und die Fließeigenöchaften der

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festen Phase. Die auf die flüssigen Phasen ausgeübte Kraft, um den Durchgang durch die Vorrichtung zu ermöglichen, kann die Anwendung von mechanischen und pneumatischen Pumpen ein Ansaugen mit Hilfe von Vakuum usw. umfassen. Vorzugsweise wird der Durchgang der Probe nur durch die Schwerkraft erreicht.

Es ist bevorzugt, daß die feste. Phase solche Fließeigenschaften besitzt, daß sie die Flüssigkeit unter dem Einfluß der Schwerkraft wie ein Adsorptionsmittel zurückhält. Die Dichte der Matrix kann üblicherweise so gewählt werden, daß derartige Eigenschaften auftreten. Die in der Matrix festgehaltene Flüssigkeit kann dann verdrängt werden durch Zugabe weiterer Flüssigkeit in die Vorrichtung. So sind, wenn eine flüssige Phase zu der festen Phase zugegeben und von ihr festgehalten worden ist, die Phasen in einem wirksamen Inkubationszustand, bis eine andere Flüssigkeit wie ein Puffer zugegeben wird, um die festgehaltene Flüssigkeit zu verdrängen.

Wenn die feste Phase die gewünschten flüssigkeitsfesthaltenden Eigenschaften nicht besitzt, wenn größere Kräfte als die Schwerkraft auf die flüssige Phase ausgeübt werden oder wenn die Proben zu groß sind, ist die Auslaßöffnung des Körpers vorzugsweise beliebig verschließbar, z.B. mit Hilfe eines Ventils oder einer Kappe. Das beliebig verschließbare offene Ende des Körpers kann so gehändhabt werden, daß es offen, teilweise verschlossen oder vollständig verschlossen ist. Der teilweise geschlossene Zustand kann angewandt werden, um die Fließgeschwindigkeit herabzusetzen und eine längere Kontaktzeit zwischen der festen Phase und der flüssigen Phase zu erreichen, während der Körper ganz geschlossen werden kann, um die feste Phase und die flüssige Phase zu inkubieren.

Die Dauer der Inkubation kann in allen Fällen zwischen einigen Minuten bis zu einigen !Tagen variieren, wobei die bevorzugte Zeit 15 min bis über Wacht oder 12 h beträgt. Eine'solche In-

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kubationszeit ist günstig, um eine soweitgehend quantitative Reaktion mit der unbekannten Substanz und der markierten Komponente sicherzustellen, wie sie bei dem aufeinanderfolgenden Durchfluß der flüssigen Phasen durch die Vorrichtung möglich ist.

Irgendeine Substanz,die eine spezifische Bindungsaffinität besitzt, kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung quantitativ bestimmt werden. Die Anwendung ihrer Bindungspartner bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ergibt ein Mittel zur spezifischen Bestimmung irgendeiner Substanz, die mit einem spezifischen Bindungspartner reagieren kann. Derartige Substanzen umfassen insbesondere Insulin, Proinsulin, Wachstumshormone, Angiotensin I und II, Humanpiacentalactogen, Homanchoriongonadotropin, luteinisierendes Hormon, schilddrüsenstimulierendes Hormon, Parathormon, Progesteron, Aldosteron, Cholesterin, follikslstimulierendes Hormon, Testosteron, Vitamin D-G-ruppe, Erythropoetin,<k -1-Anti-trypsin, Renin und Morphin. Andere Substanzen, die bestimmt werden können, umfassen Corticoide, Lysotropin, Vasopressin, Oxytocin, Relaxin, Gastrin, Bradykinin,Calcitonin, Plasmin, G-lukagon, Vitamin-B-Gruppe, Östrogene, Digoxin, Digitoxin, Australian Antigen, Tetanustoxin usw.

Die markierte Komponente, die in der Vergleichsprobe enthalten ist, kann markiert sein, z.B. radioaktiv,durch Enzym-Substrat-Markierungen usw. Bei dem Enzym-Substrat-markierten System, ist die zu markierende Substanz chemisch entweder an ein Enzym oder dessen Substrat gebunden oder gekuppelt unter Anwendung üblicher Verfahren, die eine wesentliche Hemmung der enzymatisch aktiven Stellen vermeiden. Einige Substanzen können direkt entweder mit einem Enzym oder dessen Substrat umgesetzt werden unter Bildung der markierten Komponente, während bei anderen chemische Kupplungsmittel wie Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd, Bis-diazobenzidin und

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ähnliche angewandt werden müssen. Die in der Säule festgehaltene Menge der markierten Komponente kann bestimmt werden durch ein enzymatisches Bestimmungsverfahren an dem Eluat oder an der Säule selbst. Das enzymatisch^ Bestimmungsverfahren kann entweder ein colorimetrisch.es, spektrophotometrisches oder fluorometrisches sein. Die radioaktive Markierung kann durch irgendein Standardverfahren erreicht werden.

Markierende Isotope, die zur radioaktiven Markierung geeignet sind, umfassen ¹²⁵J (Jod 125), ¹³¹J (Jod 131),¹⁴C (Kohlenstoff 14),/% (Tritium) usw., wobei J bevorzugt

angewandt wird, da die Jodierung ein allgemein übliches

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Markierungsverfahren darstellt und da J eine verhältnismäßig kürzere Halbwertszeit besitzt. Die radioaktive

zu

Markierung kann erreicht werden, indem man direkt die markierende Substanz markiert oder indem man eine zweite Substanz markiert, die mit· der zu markierenden Substanz ein Konjugat bildet, ohne daß die spezifische Bindungsfähigk'eit wesentlich herabgesetzt wird. Wenn die Säule eine feste Geometrie besitzt, kann die Menge der markierten Komponente, die in der Säule festgehalten wird, bestimmt werden durch Messung der von der Säule ausgestrahlten Radioaktivität und einen Vergleich der Messung mit Standardwerten. Wahlweise" kann die Radioaktivität des Eluats gemessen und mit Standardwerten verglichen werden. Im allgemeinen wird die markierte Komponente mit der Matrix zusammengebracht, indem sie in einer Flüssigkeit enthalten ist, wie einem Puffer, die gegenüber der unbekannten Substanz, die an die feste Phase gebunden ist, inert ist.

Flüssige Proben.die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können, umfassen anorganische und organische Lösungen spezifisch bindender Substanzen. Die Größe der ITüssigkeitsprobe ist theoretisch unbegrenzt, da die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Durchlaufsystem darstellt-. Bei einem speziellen Verfahren und einer Vorrichtung

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können verdünntere Proben, die spezifisch, bindende Substanzen enthalten, bestimmt werden, indem man größere Volumina durch die Vorrichtung leitet, da sie die Konzentrierung sowie die Trennung ermöglicht. Es ist besonders bemerkenswert, daß, da die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen der spezifisch bindenden Substanz und ihren· Bindungspartner in der Wechselwirkung zwischen fester Phase und flüssiger Phase konzentrationsabhängig ist, eine erhöhte wirksame Konzentration erreicht werden kann, wodurch die Inkubationszeit herabgesetzt und die Genauigkeit erhöht wird. Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung sind besonders geeignet zur Bestimmung von spezifisch bindenden Substanzen in Körperflüssigkeiten und Gewebeauszügen. Solche Körperflüssigkeiten umfassen amniotische, cerebrale und spinale Flüssigkeiten, Serum, Plasma und Urin.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Dieses Beispiel betrifft die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung zur Bildung einer Dosis-Reaktions-Kurve für die Bestimmung von Insulin unter Anwendung des Sättigungsverfahrens.

a) Bildung von Insulin-Antikörpern

WasserSchweinen (Capybaras) wurde ein ersterImpfstoff,bestehend aus einem homogenisierten 50/50 Gemisch von 8 mg/ml Zink-kristallines Schweininsulin (gelöst in 0,01 η HCl und neutralisiert mit,0,01 η ITaOH) und vollständiger Freund ¹S Zusatz injiziert. In jeden Fußbällen wurden 0,25 ml des Homogenisats injiziert. An den Tagen 21, 23» 5.6vund 58 wurden 0,25 ml zusätzlicher Impfstoff subcutan Viertel des Tieres injiziert. Der zusätzliche Impfstoff bestand aus 8 ml/ml Zinkkristallines Schweininsulin im Gemisch mit einem gleichen Volumen unvollständigem Freund's Zusatz· Am Tag 68 wurde den Tieren eine Blutprobe entnoiumeii.aiid eine letsste Menge zusätzlicher Impfstoff verabreicht, \ietm der Eiter 0 erreichte» ungefähr -70 Tage später. 10 Tage naek der letzten Verabreichung <les Impf-

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- 19 Stoffs wurde das Blut der Tiere abgezogen.

b) Herstellung der Testvorrichtung

Mit CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) wurden 15 min in 0,001 τη HCl gequollen und auf einem gesinterten Glastrichter mit 0,001 m HOl gewaschen. Das ganze, nicht-fraktionierte Antiserum wurde dann an die mit ClTBr-aktivierte Sepharose -4B gekuppelt, indem man das ganze nicht-fraktionierte Antiserum der Stufe (a) mit einer Menge 0,2 m Citratpuffer (pH 6,5) entsprechend der Menge der gepackten Sepharose vermischte und dann das Gemisch zu der gequollenen Sepharose zugab. Das entstehende Gemisch wurde über Nacht bei 4⁰C gerührt. Die Suspension von Sepharose mit daran gekuppelten Antikörpern wurde mit 0,2 m Citratpuffer (pH 6,5) gewaschen "bis die optische Dichte der

weniger als Waschflüssigkeit bei 280 nm 0,05 betrug und dann mit 0,9%iger Salzlösung bis die optische Dichte der Waschlösung

wpniifpi¹ εΓ-L s

bei 215 nm 0,u5 betrug. Die Sepharose, an die die Antikörper gekuppelt waren, wurde mit reiner nichtgekuppelter Sepharose verdünnt bis zu einem Punkt, an dem 30 bis 50 $ der Menge des radioaktiv markierten Insulins in der Säule festgehalten wurden, nach dem-unten unter (c) beschriebenen Verfahren, wenn die untersuchte Flüssigkeitsprobe kein Insulin enthielt. Die Sepharose wurde dann mit 0,9 $iger Salzlösung, enthaltend 0,1 % Half*, aufgeschlämmt und in 3 ml Stylex-Spritzen (Pharmaseal Laboratories,Glendale, California) gegeben·, die mit Polyäthylen-Trägerscheiben versehen waren, ähnlich in Form und Struktur der in der Zeichnung angegebenen Säule, so daß man Säulen erhielt, die mit 1 ml Sepharose gepackt waren.

c) Durchführung der Bestimmung

Die gepackten Säulen wurden durch Zugabe von 20 ml Anteilen eines Boratpuffers (pH 9,0), den man in die Säulen eindringen ließ, äquilibriert. Der Boratpuffer war hergestellt worden durch Vermischen von 50 ml 0,1 m KCl/H^BO,, 20,8 ml 0,1 m NaOH, 1,7 ml 30?öiges Humanserum-albumin und 27,5 ml HpO. Schweineinsulin-Standards wurden für die folgenden Insulinkonzentration-

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en hergestellt: 50 η Einheiten/ml, 100 ai Einheiten/ml und 2[3O /U Einheiten/ml. Ein Vergleich, enthaltend kein Insulin und die drei Insulin-Standards wurden zu Säulen, die entsprechend 00 hergestellt worden waren, in Mengen von 0,5 gegeben und 25 min inkubiert. Eine markierte Probe, enthal-

1 ° h
tend mit '"J markiertes Insulin, wurde dann in einerMenge von 0,5 ml zu jeder Säule gegeben und 25 min inkubiert. Während dieser Zeit wurde die Gammastrahlung der Säulen mit eine; Gammaοord (Miles Laboratories, Inc., Elkhart,Indiana) gemessen. Die Säulen wurden mit 10 ml des Boratpuffers gewaschen und erneut die Strahlung gemessen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse ($ gebunden wurde berechnet unter der Annahme, daß 100 % gebunden, die prozentuale Bindung des Vergleichs war):

Insulin-Konzentration	Ja gebunden
/U Einheiten/ml
0	100
25	66
50	43
100	28
250	17

Diese Daten konnten dann graphisch aufgetragen werden, wobei man eine Standard-Kurve erhielt und unbekannte Proben konnten durch einen Vergleich des Prozentsatzes an gebundenem markierten Insulin mit dieser Standard-Kurve bestimmt werden.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung zur Bildung einer Dosis-Reaktions-Kurvo zur Bestimmung von Vitamin ILp nach dem Gleichgewicht α verfahren.

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a) Herstellung der Testvorrichtung

Intrinsic-i^laktor(.17l, ein Vitamin IL ₂~ Binder (Nutritional Biochemicals Corp.,Cleveland,Ohio) wurde Covalent an mit CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia AB, Uppsala,Schweden) gekuppelt, nach dem in Scand. J. Clin. Lab. Invest. 27.151 (1971) beschriebenen Verfahren. Die mit Intrinsic-]?aktor(_17) gekuppelte Sepharose 4B wurde mit reiner nichtgekuppelter Sepharose 4B bis zu einem Punkt verdünnt, an dem 40 bis 60 i> des radioaktiv-markierten Vitamins B^₂ nach dem Verfahren (b) in der Säule festgehalten wurden, wenn die flüssige Probe kein Vitamin B^p enthielt. Es wurde radioaktives Vitamin' B^p (Co Cyanocobalanin) (Amersham/Searl©,Arlington Heights, Illinois) verwendet. Das verdünnte Gemisch wurde mit 0,9 % Salzlösung aufgeschlämmt und in 3 ml Kunststoffspritzen gegeben, wobei man wie in Beispiel 1b Säulen mit 1 ml Sepharose erhielt.

b) Durchführung der Bestimmung

Es wurden Standard Vitamin B^₂ Lösungen der folgenden Konzentrationen hergestellt: 2000 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 63 pg/ml und 31 pg/ml. Eine Vergleichsprobe » enthaltend kein Vitamin B^₂ und die sieben Vitamin B^ Standards wurden jeweils mit 0,5 ml der radioaktiv-markierten Vitamin B^₂-Lösung vermischt, so daß man Endvolumina von 1 ml erhielt. Diese Gemische wurden zu den entsprechend a) hergestellten Säulen gegeben und 90 min inkubiert. Die Säulen wurden dann mit 6 ml Puffer (hergestellt nach Scand.J.Clin· Lab. Invest.27:151 /T971_7 ) gewaschen und die Gammastrahlung mit einem Gammacora® gemessen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse ($ gebunden wurde berechnet in der Annahme, daß 100 $ gebunden die prozentuale Bindung der Vergleichslösung angibt):

-22=

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Vitamin B^p	% gebunden
Konzentration
pg/ml
O	100,0
31	94,9
63	87,8
125	79,8
250	65,6
500	44,7 .
1000	24,2
2000	13,6

Unbekannte Proben konnten mit Hilfe der so erhaltenen Kurve, wie in Beispiel 1c beschrieben, bestimmt werden.

Beispiel 3

Dieses Beispiel betrifft die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung zur Bildung von Dosis-Reaktions-Kurven für die Bestimmung von Human-placenta-lactogen (HPL), wobei das markierte HPL in mit einem Enzym markierter Form vorliegt.

a) Herstellung von Enzym-markiertem HPL

HPL wurde mit Peroxidase nach dem in Immunochemistry 6: 43 (1969) beschriebenen Verfahren mit den folgenden Modifikationen markiert: 10 mg HPL und 10 mg Meerrettich-Peroxidase wurden in 1,4 ml 0,05 m Carbonatpuffer (pH 9) gelöst und 0,05 ml 3$iger Glutaraldehydlösung wurden zu dem Gemisch zugegeben. Man ließ das Gemisch dann 90 min bei Raumtemperatur rotieren und es wurde anschließend gegen 128 ml 0,1 m Boratpuffer (pH 8) mit mehrmaligen Wechsel des Puffers dialysiert.

b) Herstellung der Testvorrichtung

Es wurde entsprechend Beispiel 1b gearbeitet.

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c) Durchführung der Bestimmung

Die gepackten Säulen wurden durch Zugabe von je 20 ml eines Boratpuffers (pH 9) zu den Säulen und Eindringenlassen des Puffers äquili"briert. Der Boratpuffer war entsprechend Beispiel 1c hergestellt worden. HPL-Standards wurden für HPL-Konzentrationen von 1000 ng/ml und 62 ng/ml hergestellt. Eine Vergleichsprobe, enthaltend kein HPL und die "beiden HPL-Standards wurden zu Säulen gegeben, die entsprechend dem Verfahren b) hergestellt worden waren₅in 0,5 ml Volumina und 25 min inkubiert. Eine, markierte Probe, enthaltend mit Peroxidase markiertes HPL₅ die entsprechend a) hergestellt worden war, wurde dann in Mengen von 0,5 ml zu jeder Säule gegeben und 25 min inkubiert. Die Säulen wurden mit 10 ml 0,1 ra Boratpuffer (pH 8) und anschließend 3 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH6) gewaschen. Eine Substrat-Indikator-Lösung, die hergestellt worden war, durch Vermischen von 0,28 ml 0,03 ⁰A HpOp in Wasser, 0,1 ml 0,25 i° 3,3^f-Dimethylbenzidin und 0,12 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 6) wurde zu jeder Säule gegeben und 10 rain inkubiert. Die Säulen wurden jeweils mit 3 ml 0,1 η HCl gewaschen und die optische Dichte (OD) der Waschlösungen wurde bei 460 nm abgelesen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

HPL-Konzentration OD₇₁^_n $ gebundene Farbe ng/ml ⁴⁶°

0 1,2 100

02 0,96 63

1000 0,78 35

Unbekannte Proben konnten unter Anwendung der au3 diesen Daten erhaltenen Standardkurven, wie in Beispiel 1c bestimmt werden.

Beispiel 4

Dieses Bei Dpi el betrifft die Anwendung det; erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung zur Bestimmung von Hepatitis-B-Antigen durch oin direktes radioimmunologirjches Bentiramuugsverfahren.

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a) Bildung von Hepatitis-B--Antikörpern

Antiserum, enthaltend Hepatitis-B-Antikörper, wurde nach dem in The Journal of Immunology, Bd. 109, Nr. 4»S.835 "beschriebenen Terfahren hergestellt.

b) Herstellung der Testvorrichtung

Mit CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia AB,Uppsala, Schweden) wurde in 0,001 ro HCl gequollen. Die in dem entsprechend a) hergestellten Antiserum enthaltenen Antikörper wurden mit der gequollenen und mit CNBr-aktivierten Sepharose 4B gekuppelt durch Vermischen des Antiserums mit der Sepharose-Gel-Aufschlämmung in Mengen von 5 bis 20 ml Protein/g aktivierte Sepharose 4B und zwar 1 h bei 25⁰G. lias entstehende Gemisch wurde 17h bei 4⁰O gerührt. Die an Antikörper gekuppelte Sepharose-Suspension wurde abwechselnd mit einem Puffer, enthaltend 0,1 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan~0,5 m NaCl mit HCl auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt und einen Puffer, enthaltend 0,1 m Natriumaeetat-0,5 NaCl mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, gewaschen. Die gewaschene, mit Antikörper gekuppelte Sepharose wurde in Tris(hydroxymethyl)aminomethan aufgeschlämmt, um eine 50$ige Sepharose-Suspension zu erhalten und 1 bis 2 ml dieser Aufschlämmung wurden in 3 ml Kunststoff-Stylex-Spritzen (Pharmaseal Laboratories, Glendale, Californien) gegeben, die mit-Polyäthylen-Trägerscheiben versehen waren.

c) Durchführung der Bestimmung

Sera, die in Beziehung auf das Vorhandensein von Hepatitis-B-Antigen entweder positiv oder negativ waren, wurden zu den entsprechend b) hergestellten Säulen in Mengen von 0,1 ml gegeben und 30 min inkubiert. Eine markierte Probe, enthaltend

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mit ^J markierte Hepatitis-B-Antikörper nach dem in The Journal of Immunology, Bd. 109, Nr. 4, Seite 835 beschriebenen Verfahren₍wurden in Mengen von 0,1 ml zu. jeder Säule gegeben und 1 1/2 h inkubiort. Die Säulen wurden mit 25 ml Puffer, enthaltend 0,1 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan-O,5 NaCl-0,€1 $> eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels

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(!ween 20 der Atlas Powder Co., Wilmington, Delaware) ge-

CS) waschen und dann die Gammastrahlung mit einem Gammacora⁰^ gemessen. Es zeigte sich, daß ungefähr 12 mal mehr markierte Antikörper in den Säulen zurückgehalten wurden, die mit
positiven Sera zusammengebracht worden waren, als in denjenigen, die mit negativen Sera zusammengebracht worden waren.

Pa tentanspruche

/0647

Claims

2U8411

h M KX(Ml KN !)() Κ'· I' WJ-¹U< IWTHASS K a TRLHK(JV (08l)> (M) UO öl TICLKX 3 a+070

TKI.H(II(AMM R : IMIOTHCTI'ATrcN'r M i^l .Vt-'II K N

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Patentansprüche

ί 1J Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Komponente eines spezifisch bindenden Paars von Substanzen mit einer gegenseitigen spezifischen Bindungsaffinität, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine in einer Säule enthaltene Matrix mit der zu bestimmenden Substanz und einer markierten Komponente, umfassend eine markierte Form einer der das spezifisch bindende Paar bildenden Substanzen in Berührung bringt,wobei die Matrix den spezifisch bindenden Partner zu der zu bestimmenden Substanz in immobilisierter Form enthält;

b) die Matrix mit einer Eluierflussigkeit zusammenbringt,die aus der Säule im wesentlichen die gesamte nicht-gebundene markierte Komponente, die nach einer vorher bestimmten Zeit nach der Stufe a) noch vorhanden ist, elu'iert und

c) die relative Menge der markierten Komponente, die in der Säule zurückgehalten worden ist und die Funktion der Menge der zu bestimmenden mit der Matrix in Stufe a) in Berührung gekommenen Substanz ist, bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe a) durchführt, indem man die Matrix mit einer vorher bestimmten Menge einer flüssigen Probe, enthaltend die zu bestimmende Substanz und mit einer vorbestimmten Menge einer Vergleichsprobe enthaltend die markierte Substanz, in Berührung bringt, wobei die Matrix in Beziehung auf die flüssige Probe und die Vergleichsprobe unlöslich und porös ist.

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man Stufe a) so durchführt, daß man die Matrix mit einem Gemisch, umfassend eine vorher "bestimmte Menge einer flüssigen Probe, enthaltend die zu bestimmende Substanz und enthaltend die markierte Substanzen Berührung bringt, wobei die Menge der spezifisch bindenden Partner die in der Matrix immobilisiert ist, größer ist als die Menge, die mit der zu bestimmenden Substanz und der markierten Substanz.in der Zeit eine Bindung eingehen kann, die das Gemisch und die Matrix in Kontakt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e k e η η zeichnet* daß die markierte Komponente eine markierte-Form der zu bestimmenden Substanz umfaßt und man die Stufe a) durchführt, indem man a 1) die Matrix mit der zu bestimmenden Substanz in Berührung bringt', wobei die Menge der spezifisch bindenden Partner, die in der Matrix immobilisiert ist, größer ist als die Menge, die mit der zu bestimmenden Substanz eine Bindung eingehen kann in der Zeit die die Matrix mit der zu bestimmenden Substanz in Kontakt ist, wobei mindestens ein Teil der bindenden Stellen der Matrix frei bleibt und a 2) die Matrix mit der markierten Komponente in Berührung bringt, wobei zumindest ein Teil der bindenden Stellen der Matrix die nach Stufe a) noch frei sind mit der markierten Komponente Bindungen eingeht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man zwischen den Stufen a 1) und a 2) die Matrix mit einer Eluierflüssigkeit in Kontakt bringt, die aus der Säule im wesentlichen die gesamte zu bestimmende Substanz eluiert, die mit der Matrix keine Bindungen eingegangen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als markierte Komponente eine markierte I'orm der zu bestimmenden Substanz verwendet und die Stufe a) durchführt, indem man

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a 1) die Matrix mit der markierten Komponente in Berührung ■bringt, wobei die Menge der markierten Komponente größer ist als diejenige, die mit allen spezifisch, "bindenden Partner^ die in der Matrix immobilisiert sind«, in der Zeit die markierte Komponente mit der Matrix in Berührung ist, eine Bindung eingehen kann und

a 2) die Matrix mit der zu feestimmenden Substanz in Berührung bringt» wobei die Menge der markierten Komponente, die mit der Matrix in Stufe a 1) eine Bindung eingegangen ist, größer ist als diejenige j die vollständig durch die su bestimmende Substanz in der ZeIt₅ die die zu bestimmende Substanz und die Matrix In Kontakt sind, Bindungen eingehen kann, wobei ein Teil der gebundenen markierten Komponente von der Matrix verdrängt wird. '

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die markierte Komponente eine markierte Form eines spezifisch bindenden Partners zu der zu bestimmenden Substanz umfaßt und man die Stufe a) durchführt, indem man

a 1) die Matrix mit der zu bestimmenden Substanz in Berührung bringt, wobei die Menge der spezifisch bindenden Partner,die in der Matrix immobilisiert ist^ größer ist als die Menge, die mit der zu bestimmenden Substanz in der Zeit, die die zu bestimmende Substanz mit der Matrix in Kontakt ist, Bindungen eingehen kann und

a 2) die Matrix mit der markierten Komponente in Berührung bringt, wobei zumindest ein Teil der zu bestimmenden Substanz der Stufe a 1) an die Matrix gebunden worden ist, auch mit der markierten Komponente Bindungen eingeht.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man die Matrix vor der Stufe a) mit einer äquilibrierenden Flüssigkeit in Berührung bringt.

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ZB

9r Verfahren nach Anspruch 1 "bis 8, dadurch g e Ic e η η - '. zeichnet , daß man als Eluierflüssigkeit einen Puffer verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1 Ms 9, dadurch gekennzeichnet , daß man als markierte Komponente eine radioaktiv markierte Komponente verwendet und in Stufe c) die entweder von der Säule oder dem Eluat aus Stufe b) ausgestrahlte Radioaktivität mißt, wobei die gemessene Radkoaktivität eine Punktion der Menge der zu bestimmenden Substanz ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß man als markierte Komponente eine solche verwendet, die durch Kupplung . einer der Komponenten die ein Enzym-markierendes Paar der zu markierenden Substanz bilden, wobei ein Enzym-markierendes Paar ein Enzym und ein Substrat dafür umfaßt, markiert und man in Stufe c) die.enzymatische Aktivität oder die Menge des Substrats entweder in der Säule oder in dem Eluat aus Stufe b) mißt, wobei die enzymatische Aktivität oder die Substratmenge eine Punktion der Menge dei? zu bestimmenden Substanz sind.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch' g e k e η η zeichnet, daß man ein spezifisch bindendes Paar der folgenden Art verwendet: Antigene und ihre Antikörper, Haptene und ihre Antikörper, Enzyme und ihre Substrate, Hormone und ihre Rezeptoren und Vitamine und ihre Rezeptoren.

13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch · 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Säule umfaßt, enthaltend eine Matrix, die in Beziehung auf die flüssige Probe unlöslich und porös ist und in der ein spezifisch bindender Partner zu der zu bestimmenden' Substanz immobilisiert ist.

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14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß die Matrix ein polymeres Material umfaßt.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet , daß die polymere Matrix unter dem Einfluß der Schwerkraft absorbierende und Flüssigkeit-zurückhaltende Eigenschaften besitzt.

16. Vorrichtung nach Anspruch 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß der spezifisch bindende Partner chemisch an die Matrix gebunden ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Auslaß der Säule beliebig verschließbar ist.

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