DE2164768A1

DE2164768A1 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von spezifischen Bindeproteinen

Info

Publication number: DE2164768A1
Application number: DE19712164768
Authority: DE
Inventors: Antonius Hermanus Wilhelmus Maria Dr. Oss Schuurs (Niederlande). GOIn 21-34
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1970-12-28
Filing date: 1971-12-27
Publication date: 1972-07-20
Also published as: ES398372A1; FI54034C; SE398557B; DK150690C; IT965020B; IL38371A; CH557030A; GB1348938A; FI54034B; FR2120835A5; JPS5834783B1; ZA718332B; NL154599B; AT320145B; EG11604A; DK150690B; DE2164768B2; IL38371A0; NL7018838A; JPS58117455A

Description

"Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von spezifischen Bindeproteinen"

Eine Komponente der Reaktion zwischen einem spezifischen Bindeprotein und der entsprechenden bindefähigen Substanz kann bekanntlich nachgewiesen und bestimmt werden, indem ·, man die eine der genannten Komponenten, nachdem sie radioaktiv markiert wurde, in einem Reaktionsgemisch, das mindestens die andere Komponente enthält, bebrütet und daraufhin eine Trennung bewirkt zwischen dem an den Bindungspartner gebundenen und dem nicht gebundenen Teil der markierten K ο/αχ) on ent e, worauf man zum Schluß in mindestens einer der beiden erhaltenen Fraktionen die Markierungssubstanz bestimmt. Me Verteilung der markierten Komponente über die beiden Fraktionen gibt ein Naß für die in der Probe anwesende, zu bestimmende Substanz. Eg lassen sich drei verschiedene

209830/0634

Systeme beschreiben, bei welchen die obige Methode angewendet wird:

a) Antikörper als spezifische Bindeproteine und die entsprechenden Antigene als bindfähige Substanzen. Substanzen,

. die mit diesem System bestimmt werden können, sind u.a. Proteinhormone und ihre Antikörper sowie Virusantigene und deren Antikörper;

b) Antikörper als spezifische Bindeproteine und Haptene (Halbantigene) als bindefähige Substanz. Hier sind die Haptene definiert als p'roteinfreie Substanzen, die mit Antikörpern reagieren können, ohne daß sie fähig sind, diese zu beeinflussen. Substanzen, die in einem derartigen System bestimmt werden können, sind u.a. Steroidhormone und Vitamine;

c) Proteine, die im Körper als Rezeptor- oder Transportmoleküle wirken als spezifische Bindeproteine und Substanzen, die als bindefähige Substanzen von ihnen gebunden sind. Dieses System ist z.B. geeignet zur Bestimmung von Steroidhormonen, jedoch auch von Thyrosin, Trijodthyronin, und Vitamin B^₂ sowie des Intrinsicfaktors und von adrenocortiocotropischem Hormon.

Am wichtigsten bei den beschriebenen Methoden ist die Verwendung einer Markierungssubstanz und die Trennung der markierten Komponente in eine Fraktion, die an die korrespondierende Komponente gebunden ist und eine andere Fraktion, die nicht daran gebunden ist.

Bei den bisher in der Praxis angewandten Methoden werden

209830/0634

zum Markieren nur radioaktive Atome, z.B. I3iji 125j, 3tt, 57_Go verwendet. Diese Methode zeichnet sich gewöhnlich durch eine hohe Empfindlichkeit aus. Ihre Anwendung ist allerdings beschränkt auf Institute, bei denen die notwendigen Spezialeinrichtungen verfügbar sind.

Die Trennungsmethoden können wie folgt unterteilt werden:

a) Methoden, die auf dem Unterschied in den physikalischen Eigenschaften zwischen der nicht gebundenen markierten Komponente und ihrem Komplex mit dem Bindepartner beruhen, z.B. auf Gelfiltration, Elektrophorese, Salzausfällung und Adsorption an mit Dextran überzogene Holzkohle:

b) die sog. Peststoffphasen-Methoden, bei Vielehen die

eine Komponente vorher bereits durch Vernetzung oder durch .' Kovalenzbindung oder physikalische Adsorption an einen festen Träger in unlösliche Form gebracht wurde 5

c) die sog. doppelte Antikörpermethode, bei welcher der gebildete Komplex, Antigen (oder Hapten)-Antikörper mit Hilfe von Antikörpern gegen den im Komplex enthaltenen Antikörper ausgefällt wird; diese Methode ist nur bekannt für Systeme mit AntiM5 rpern.

Während die unter a) und c) erwähnten Methoden in der Durchführung verhältnismäßig kompliziert sind, haben die unter b) erwähnten Methoden den Nachteil, daß bei der in unlösliche Form gebrachten Reaktionskomponente die Affinität zum Reaktionspartner gewöhnlich nachläßt.'Für ein empfindliches Testsystem ist jedoch eine hohe Affinität Grundbedingung.

209830/0634

Es wurde nun ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmungeiner Komponente der Reaktion zwischen einem spezifischen Bindeprotein und der entsprechenden bindefähigen Substanz gefunden, bei welchem die bekannte Bindeaffinität derartiger Komponenten für einander ausgenützt wird; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Gebrauch macht von einer gegebenen Menge eines Kupplungsproduktes der kombinierbaren Substanz mit einem Enzym und von Antikörpern gegen das spezifische, in unlösliche !Form gebrachte, die Kombination eingehende Protein, und ferner dadurch, daß man nach der Reaktion in der flüssigen oder festen Phase des Reaktionsgemisches die Enzymaktivität bestimmt, die ein Maß gibt für die Menge der zu bestimmenden Komponente.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird häufig und mit besonderem Vorteil angewandt, wenn Antikörper als spezifisches Bindeprotein und ein Antigen oder Hapten als korrespondierende bindefähige Substanz dienen sollen.

Die Ausdrücke "Conjugat" und "Enzymeonjugat" bezeichnen beide im folgenden das Kupplungsprodukt von bindefähiger Substanz und Enzym.

Die bindefähige Substanz kann dadurch nachgewiesen und bestimmt werden, daß man die unbekannte Probe oder eine Verdünnungsserie davon zusammenbringt mit einer bekannten Menge eines Conjugates der zu bestimmenden Substanz und eines Enzyms und mit einer bestimmten Menge an spezifischem Bindeprotein, die abhängt von der zugefügten Menge an Enzymconjugat. Dann fügt man eine gewisse'Menge, vorzugsweise einen Überschuß, an unlöslich gemachten Antikörpern gegen das spezifische Bindeprotein zu, so daß das gesamte Enzymeonjugat, das mit dem Bindeprotein reagiert hat,

209830/OS34

über dieses Protein mit den unlöslichen Antikörpern gekuppelt wird. Je mehr bindefähige Substanz in der Probe vorhanden ist, um so weniger Enzymeonjugat reagiert mit dem spezifischen Bindeprotein und geht dann schließlich in die unlösliche Phase über; es ergibt sich daraus, daß in der flüssigen Phase mehr nicht gebundenes Enzymconjugat übrig bleibt, das dort auf einfache Art bestimmt werden kann.

Das spezifische Bindeprotein kann dadurch bestimmt v/erden, daß man die Probe selbst oder eine Verdünnungsserie davon mit einer bekannten Menge Enzymconjugat und einer gewissen Menge der unlöslich gemachten Antikörper gegen das spezifische Bindeprotein bebrütet. Die Enzymaktivität kann nur dann in die unlösliche Phase übergehen, wenn das Conjugat mit dem spezifischen Bindeprotein reagiert 'hat: In der Probe ist dann um so mehr spezifisches Bindeprotein vorhanden, je weniger gebundenes Enzymeonjugat in der flüssigen Phase zurückbleibt.

Die Empfindlichkeit des beschriebenen Testsysteme kann dadurch variiert werden, daß man die Menge der Eeagentien (entweder im gleichen "Verhältnis oder nicht) ändert. -. Die Menge an Enzymeonjugat, die angewendet werden kann, ist jedoch nach unten begrenzt durch die Forderung, daß seine Enzymaktivität noch gut gemessen werden kann, so daß die Empfindlichkeit des Testsystems eine Grenze hat. Die geringste noch meßbare Enzymaktivität hängt u.a. ab von der Art des zum Kuppeln verwendeten Enzyms und .von der Art des Substrates sowie von der Inkubationsperiode der Enzymreaktion. Außerdem beeinflußt die Äffindt ät der spezifischen Bindeproteine stark die Empfindlichkeit der Bestimmung. Έην ein hochempfindliches Testsystera

209830/0334

müssen spezifische Bindeproteine mit höherer Affinität verwendet werden.

Die Mengen an je Bestimmung notwendigem Reagens werden empirisch festgelegt. · ·

Zur Bestimmung der bindefähigen Substanz wird die Menge an Enzymconjugat mit Hilfe der Enzymaktivität bestimmt; dann erfolgt die Inkubation dieser Menge mit einer Ver- ! düimungsserie des spezifischen Bindeproteins, um die notwendige Menge dieses Proteins zu bestimmen. Vorzugsweise wählt man das spezifische Bindeprotein in einer Menge, die 50 bis 90 % des Enzymeonjugates bindet. Zum Schluß stellt man fest, ob die gewünschte Empfindlichkeit tatsächlich erreicht worden ist, indem man eine Verdünnungsserie der in dem System zu bestimmenden Substanz testet. i"ür die Bestimmung des spezifischen Bindeproteins kommt hinsichtlich der Dosierung des Enzymkonjugates weiterhin dessen Aktivität in'Betracht, die im vernünftigen Umfang bestimmbar sein sollte.

Die unlöslich gemachten Antikörper gegen das spezifische " Bindeprotein werden bei beiden Bestimmungsarten vorzugsweise im Überschuß zugegeben; ihre Dosierung wird durch Vorversuche bestimmt.

Die Vorteile dieser Methode gegenüber den bekannten sind die folgenden:

a) Anstatt mit Radioisotropen kann man mit Enzymen arbeiten. Hierzu wird eine beträchtlich einfachere Laboratoriumseinrichtung benötigt, wobei die Mitarbeiter nicht so hoch qualifiziert sein müssen. Zu bedenken ist ferner» daß das Arbeiten mit radioaktiven Isotropen durch gesetz-

209830/0634

liche Bestimmungen stark eingeschränkt ist. Außerdem halten sich die erfindungsgemäß notwendigen Eeagentien . über längere Zeit und die Unfallgefahr ist wesentlich geringer; ' ■

b) Die kombinierte Methode, die sich zusammensetzt aus der "Doppel-Antikörper-" und der "Feststoffphasen-"Methode ("Double Antibody" and "Solid Phase"-Methods) und hier der Einfachheit halber als."DASP-Methode" "bezeichnet wird, hat gegenüber den bekannten Methoden verschiedene Vorteile. So ist die" Durchführung der erfindungsgemäßen Methode sehr einfach, denn sie besteht einfach in der Zugabe ■ der unlöslich gemachten Antikörper gegen das spezifische Bindeprotein, einer Inkubation und dem Zentrifugieren und Messen. Die Dosierung ist oft leichter als bei den Feststoffphasen-Methoden, da es genügt, wenn man das unlösliche Material im Überschuß zugibt, während bei den Feststoffphasen-Methoden das Material in genau abgemessener Menge verwendet werden muß. Außerdem ist die Affinität des Bindeproteins gegenüber der bindefähigen Substanz nicht dadurch beeinträchtigt, daß das Protein an ein Trägermaterial gebunden ist, wie dies bei der Feststoffphasenmethode der Fall sein kann. Ein weiterer. Vorteil gegenüber der letzteren Methode ist die rasche Einstellung des Gleichgewichtes der Reaktion zwischen dem spezifischen Bindeprotein und der bindefähigen Substanz (beide in Lösung). Noch ein weiterer Vorteil besteht darin, daß bei der DASP-Methode der unlöslich gemachte Antikörper, der im folgenden "Immunoadsorbens" genannt wird, in jedem beliebigen System verwendet werden kann, irjdem Antikörper als spezifisches Bindeprotein verwendet werden, vorausgesetzt daß diese Antikörper in der gleichen Tierart erzeugt worden sind. In Gegensatz dazu müssen die Antikörper für jedes mit der Feststoffmethode zu bestimmende Antigen oder Hapten

209830/0634

unlöslich gemacht werden. Die Doppelantikörper-Methode ist sehr empfindlich gegenüber verhältnismäßig geringen Schwankungen in der«Salzkonzentration, dem pH-Wert und dergl., wodurch eine scharfe Kontrolle der Bedingungen notwendig wird. Außerdem muß bei dieser Methode ein "Träger "-Gamma· globulin und daher viel zweiter Antikörper zugefügt werden, um einen immunen Niederschlag zu erhalten. Abgesehen von der einfacheren Durchführung läßt sich bei der DASP-Methode die kein "Träger"-Gammaglobulin benötigt, eine Materialeinsparung erreichen. Schließlich sei noch erwähnt, daß eine auf Transport- oder Rezeptorproteine angewandte doppelantikörperähnliche Trennung nicht möglich ist, da kein geeignetes "Träger-"Protein für diesen Zweck verfügbar ist. Das erfindungsgemäße Verfahren hat daher in dieser Hinsicht einmalige Vorteile.

c) Das erfindungsgemäße Verfahren kann leicht automatisiert werden.

Prinzipiell können die Reaktionskomponenten gemeinsam zusammen oder in beliebiger Reihenfolge dem System zugefügt werden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Bestimmung empfindlicher wird, wenn das Immunoadsorbens erst nach der Inkubation der anderen Komponenten zugegeben wird.

Das'erfindungsgemäß notwendige Reagens, d.h. das Kupplungsprodukt aus Antigen, Hapten oder bindefähiger Substanz mit einem Enzym, kann auf bekannte Weise hergestellt werden. Diese Methoden können auch verwendet werden, um. ein Hapten oder eine niedrig-molekulare bindefähige Substanz an ein Enzym zu binden, vorausgesetzt, daß die eine Substanz eine oder mehrere Aminogruppen und die andere eine oder mehrere Carboxylgruppen aufweist. Ist das letztere nicht der JTeJLl, so können di«

209830/0634

gewünschten Gruppen in das zu kuppelnde Molekül mit Hilfe von bekannten organochemischen Verfahren eingeführt werden. Auch Verfahren zur Verbindung von Amino- oder Carboxylgruppen, gegebenenfalls unter Einführung einer Brücke, sind bekannt. Schließlich können auch oft Verbindungen, wie Glutarsäurealdehyd, Difluordinitrodiphenylsulfon und Di- und Trichlor-s-triazin für das in Präge kommende Kuppeln verwendet werden. Gegebenenfalls müssen die hergestellten Enzymkonjugate von den nicht umgesetzten Substanzen oder von solchen, die inaktiv geworden sind, abgetrennt werden. Dies kann mit Hilfe der bekannten biochemischen Methoden geschehen, z.B. durch Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln, Gelfiltration oder Zentrifugieren, falls ein Dichte/falle besteht.

Die Wahl des Enzyms,/'das in das Kupplungsprodukt aufgenommen werden soll, wird bestimmt durch eine Anzahl von Eigenschaften des betreffenden Enzyms. Wesentlich ist selbstverständlich, daß das Enzym beständig ist gegenüber dem Kuppeln mit einem anderen Molekül, d.h. gegenüber einer Modifikation einer oder mehrerer Aminosäureseitenketten. Von großer Wichtigkeit ist auch die spezifische Aktivität des Enzyms. Da zur Erreichung eines meß- . ■■> baren Enzymeffektes weniger Enzymkonjugat zugegeben werden muß, wird das Testsystem empfindlicher. Außerdem sind diejenigen Enzyme bevorzugt, bei denen die Bestimmung der Aktivität auf einfache Weise durchgeführt werden kann. In Betracht kommen in erster Linie diejenigen Enzyme, die kolorimetrisch, spektrophotometrisch oder fluoriinetrisch bestimmt werden können. Diese Art der Bestimmung eignet sich auch für die automatische Durchführung des Verfahrens, die einen zusätzlichen Vorteil darstellt.

Kolorimetrisch können diejenigen Enzyme bestimmt werden,

209830/0634

die eine Reaktion katalysieren, bei der entweder in der primären oder in der sekundären Reaktion eine gefärbte Substanz auftritt bzw. verschwindet.

Als enzymatisch aktive Komponente in.Conjugaten kommen u.a. folgende Enzyme in Frage: Katalase, Peroxidase, ß-Glucoronidase, ß-D-Glucosidase, ß-D-Galactosidase, Urease, Glucose-Qxidase, Galactose-Oxidase und alkalische Phosphatase.

der Reaktion

Nach Beendigung/zwischen den Komponenten und den erfindungsgemäßen Reagentien kann die Enzymaktivität der flüssigen oder der festen Phase des Reaktionsgemisches oder auch der beiden Phasen bestimmt werden. Am einfachsten ist es jedoch, die Enzymaktivität der flüssigen Phase zu bestimmen.

Die unlöslich gemachten Antikörper gegen die spezifischen Bindeproteine, die im erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls ein wesentliches Reagens darstellen, können ebenfalls auf bekannte Art hergestellt werden. Die Herstellung der Antikörper kann so erfolgen, daß man ein gereinigtes Präparat des spezifischen Bindeproteins oder eines Proteins, das mindestens teilweise die gleichen Antigeneigenschaften wie das spezifische Bindeprotein hat, herstellt und dieses auf bekannte Weise einer anderen Tierart als der, von der es erhalten wurde, injiziert. Das Serum des behandelten Tieres bzw. dessen Gammaglobulinfraktion kann dadurch unlöslich gemacht werden, daß man es mit Verbindungen, wie Glutarsäurealdehyd oder Chloroformsäure-.äthylester vernetzt oder daß man es an feste Trägerteilchen bindet, entweder auf physikalische V/eise durch Adsorption oder chemisch durch Bildung von Kovalentbindungen. Als feste Träger kommen Stoffe, wie Cellulose (die gegebenenfalls modi-

209830/0634

-In fiziert sein kann), Agarose, vernetztes Dextran, Polystyrol u.dgl. in Betracht. Eine Kovalenzbindung der Antikörper 'an diese Stoffe kann "bewirkt werden mit Hilfe von Substanzen, wie Carbodiimiden, Di- und Trichlor-s-triazinen, Glutarsäurealdehyd, Cyanogenbromid und z.B. durch Diazotierung.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens kommen voll zur Auswirkung, wenn die Antikörper im Überschuß angewendet werden, so daß das spezifische Bindeprotein vollständig in die feste Phase übergeht.

Die Form, in der die Eeagentien verwendet werden, kann sehr verschieden sein; das Enzymeonjugat als Bestandteil des Eeaktionssystems kann durch Gefriertrocknung erhalten oder in einem Puffer gelöst sein. Es kann auch ein fester Träger verwendet werden, z.B. ein mit dem Conjugat getränkter Papierstreifen. Dies trifft ebenso zu für die notwendigen spezifischen Bindeproteine.

Die unlösliche Komponente kann in Form von Teilchen verschiedener Dimension vorliegen, z.B. als Körner, Flocken, Stäbchen oder in Form eines Streifens aus Trägermaterial. g

Vorzugsweise verwendet man zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Testpäckchen. Dieses besteht hauptsächlich aus:

1) einer bekannten Menge eines Conjugates eines Antigens, Haptens oder einer niedrig molekularen bindefähigen Substanz mit einem Enzym;

2) einer entsprechenden Menge eines spezifischen Bindeproteins (Antikörper oder Transport- oder Eezeptorproteine);

209830/0634

3) einer bekannten Menge an unlöslich gemachten Antikörpern gegen das verwendete spezifische Bindeprotein.

Das Testpäckchen kann weiterhin die für die Enzymbestimmungen notwendigen Reagentien und dazu noch Hilfsmittel zur Durchführung des Testes, wie Teströhrchen, Pipetten und Gefäße mit Verdünnungsflüssigkeit enthalten. Ein derartiges Testpäckchen eignet sich zur Bestimmung einer bindefähigen Substanz,_aber auch zur Bestimmung eines spezifischen Bindeproteins, wobei im letzteren Fall das im Testpäckchen enthaltene spezifische Bindeprotein nicht verwendet werden muß.

Die Testpäckchen lassen sich insbesondere mit Vorteil benutzen zum Nachweis und zur Bestimmung eines Antigens oder Haptens und enthalten·"zu diesem Zweck hauptsächlich:

a) eine bekannte Menge eines Conjugates aus dem Antigen bzw. Hapten und einem Enzym;

b) eine entsprechende Menge an korrespondierenden Antikörpern;

c) eine bekannte Menge an unlöslich gemachten Antikörpern gegen die verwendeten Antikörper.

Sollen solche Testpäckchen zum Nachweis und zur Bestimmung von Antikörpern verwendet werden, so können die unter

d) erwähnten Antikörper weggelassen werden.

Eine wichtige Ausführungsform der erfindungsgemäßen Testpäckchen ist ein Testpäckchen, das zur Bestimmung von gonadotropischen Hormonen und insbesondere zur Bestimmung von

209830/0634

HCG- (Human Chorionic Gonadotropin) zur Schwangerschaft sdiagnose schon in einem sehr frühen Stadium verwendet werden soll. Ein solches Testpäckchen besteht aus einer Ampulle-j einem Röhrchen, einem Fläschchen oder einem anderen Behälter mit den notwendigen Ingrecöentien in getrennten lyophilisieren Schichten³/ vorbestimmten Mengen an: ■

a) einem Conjugat von HCG mit einem Enzym, z.B. HCG-Peroxida

b) Anti-HCG;

c) unlöslich, gemachten Antikörpern gegen Anti-HCG;

d) gegebenenfalls anderen Ingredientien, wie einem Puffer.

Gibt man zu der Testpackung eine gewisse Menge an Urin einer vermutlich schwangeren Frau zu und inkubiert den Urin mit den Bestandteilen des Päckchens, so bildet sich ein Gemisch aus unlöslichen Stoffen und die überstehende Flüssigkeit enthält das übrig bleibende lösliche HCG-Enzymeonjugat. Die Menge des letzteren hängt von der Menge an HCG in dem zu testenden Urin ab. Durch Bestimmung der Enzymaktivität dieses zurückbleibenden > HCG-Enzymconjugates kann festgestellt v/erden, ob der Urin von einer schwangeren Frau stammt oder nicht.

Ein bevorzugtes Verfahren für die Bestimmung der Enzymaktivität besteht darin, daß man die Probe in Berührung bringt mit einem Indikatorpapier, das imprägniert ist inib Enzymreagentien, z.B.jfalls eine Peroxidase verwendet wurde, einer 11^0 ^ abgebenden Substanz, wie Harnstoff-HpOp, und einem Farbreagens, wie o-Tolidin.

209830/0634

Wählt man die Reagentien jeweils in richtiger Menge, so läßt sich Schwangerschaft auch durch ungeschultes Personal schon in einem sehr frühen Stadium und auf einfache, rasche und sehr zuverlässige Weise feststellen.

Beispiel 1

Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HCG)

a) Herstellung von HCG-HRP "

5 mg HCG und 20 mg Meerrettieh-Peroxidase (HRP) wurden gelöst in 2 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,2. Nach Zugabe von 40/Ul 25 ^iger Glutarsäurealdehydlösung wurde das Gemisch 2 Std. bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 5 min langem Zentrifugieren bei 25°C wurde die Flüssigkeit über Sephadex G-200 in 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,2 fraktioniert» Die Fraktionen, von denen der höchste Prozentsatz an Enzymaktivität durch Antikörper gegen HCG gebunden war, wurden in dem Testsystem verwendet.

b) Herstellung von Antikörpern gegen HCG

^ Antikörper gegen HCG wurden, wie beschrieben von Schuurs ' et al in Acta Endocr. (Kbh.) 59, 120 (1968), in Kaninchen induziert.

c) Herstellung von Antikörpern gegen Kaninchen- ^-Globulin

Kaninchen- ^"^Globulin wurde aus normalem Kaninchenserum isoliert durch Ausfällen mit 18 Gew./Vol.-% festem Natriumsulfat. Antikörper gegen dieses Globulin wurden hergestellt durch Immunisieren eines Schafes gemäß dem folgenden Plan:

209830/0634

0	ο,	5	mg
14	0,	5	mg
28	1		mg
42	1		mg
56	1		mg

Tag Menge Freund's Adjuvans Injektionsweise

+ intramuskulär

intravenös
intravenös

Am Tag 70 wurde dem Schaf Blut entnommen.

d) Herstellung des Immunoadsorbens ^~Schaf-anti-(Kanin-Gammaglobulin)^7-CeIIuIo se.

Die Gammaglobulinfraktion des unter 1c) beschriebenen Schafserums wurde hergestellt durch Ausfällen mit 16 Gew./Vol.-% festem Natriumsulfat. Nach dem Waschen wurde der Niederschlag in so viel 0,05 M Boratpuffer vom pH 8,6 aufgenommen, daß die resultierende Proteinkonzentration auf 10 mg/ml anstieg.

350 mg m-Aminobenzyloxymethylcellulose wurden suspendiert in 50 ml destilliertem Wasser und diazotiert durch Zugabe von 10 ml 36 %iger Salzsäure und trofpenweise Zugabe von 10 ml 10 %iger NaN0₂-Lösung bei O⁰C. Die Suspension wurde zentrifugiert und gewaschen und der Niederschlag in 43 ml 0,05 M Natriumborat vom pH 8,6 resuspendiert. Dann wurden 7 ml der wie oben hergestellten Gammaglobulinlösung zugegeben. Das Gemisch wurde 26 Stunden bei 4°C gerührt, dann zentrifugiert und mit 0,02 M Phosphatpuffer vom pH 6,0 gewaschen.

e) Bestimmung von HCG

Es wurde eine Verdünnungsserie (32-16-8-4-2-1-0,5-0 IU/ml) von HCG in 0,02 M Phosphatpuffer, pH 6,0, hergestellt, die 2 Vol.-?o normales Schafserum enthüLt.

209830/0634

Von jeder der HCG enthaltenden Proben wurden 0,5 al inkubiert mit 0,1 ml Kanin-(anti-HCG)-Serum und 0,1 ml HCG-HRP-Konjugat, beide in entsprechender Verdünnung. ." Nach halbstündiger Inkubation wurden 0,3 ml des gemäß d) hergestellten Immunadsorbens (10 mg/ml) zugefügt und die resultierende Mischung bei Raumtemperatur eine Stunde in Rotation gehalten. Nach Zentrifugieren wurde in der überstehenden Flüssigkeit die Enzymaktivität gemessen durch Vermischen von 0,5 ml der Flüssigkeit mit 1,5 ml Substrat (10/Ul 30 Soiges H₂O₂ und 20 mg 5-Aminosalicylsäure in 150 ml 0,02 M Phosphatpuffer, pH 6,0); nach 30 Minuten bei 25°C wurde die Extinktion bei 460 mn gemessen.

Auf diese Weise war es möglich, in der Probe eine HCG-Konzentration von 0,5 bis 1 IU/ml festzustellen. Mit dieser Methode konnten auch Urinproben getestet werden; der Test eignet sich also zum Schwangerschaftsnachweis. Die Übereinstimmung mit einer bekannten Testmethode, einem Haemagglutinations-Inhibitionstest, war gut. Es erwies sich als möglich,durch Anwendung einer Vorinkubation die Empfindlichkeit des Systems zu steigern. Hierbei wurde zuerst die Probe nur mit dem Antiserum inkubiert und daraufhin das HCG-HRP-Konjugat zugefügt.

Beispiel 2

Bestimmung von Insulin und Antiinsulin.

a) Herstellung von Insulin-(glucoseoxidase). 5 mg Schweineinsulin und 25 mg Glucoseoxidase wurden gelöst in 2 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,5. Zu der Lösung wurden 5/Ul 25 Soige Glutarsäurealdehydlösung zugegeben, worauf das Gemisch 90 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und dann über Sephadex G-200 in 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6.,5 fraktioniert wurde. Die Fraktionen, von welchen der höchste Prozentsatz an Enzymaktivität durch Antikörper gegen Insulin gebunden worden konnte,

209830/0634

wurden in dem Testsystem verwendet.

b) Herstellung von Antikörpern gegen Insulin

10 Guinea-Schweinen wurde wöchentlich eine intramuskuläre Injektion mit 1 mg Schweineinsulin in vollständigem Freunds-Adjuvans über eine Periode von 4 bis 8 Wochen verabreicht. Nach 2 Wochen Ruhe wurde den Tieren zusätzlich 1 mg Insulin durch intravenöse Injektion ohne Adjuvans verabreicht. 2 Wochen später wurde den Tieren Blut entnommen. Zeitweise auftretende Hypoglycaemie wurde durch intraperitoneale Verabreichung von Glucose bekämpft.

c) Herstellung von Antikörpern gegen Guinea-Schweine-Gammaglobulin.

Durch Zugabe von 1 Vol. gesättigte Ammoniumsulfatlösung zu 2 Vol. Guinea-Schweineserum wurde Guinea-Schweine-Gammaglobulin hergestellt. Der gebildete Niederschlag wurde zweimal gewaschen mit 33 %iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung und dann in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dann wurde ein Schaf mit Hilfe von ansteigenden Dosen des hergestellten Gammglobulins (0,5, 1 und 2 mg) immunisiert. Die Injektionen wurden im Abstand von 2 Wochen verabreicht, wobei das Immunogen vermischt war mit vollständigem Freunds Adjuvans. 2 Wochen nach der letzten Injektion wurden zusätzlich noch 2 mg Gammaglobulin in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht und 1 Woche später wurde dem Tier Blut entnommen.

d) Herstellung von unlöslichen Antikörpern gegen Guinea-JSchweine-Gammaglobulin.

10 g mikrokristalline Cellulose wurde aktiviert durch Zugabe von 400 ml 2,5 Gew./Vol.-# CNBr-Lösung unter Rühren, worauf der pH-Wert mit 1 η NaOH-Losung auf 10,5

"ΐ C, <"* O fS /

gebracht und dabei 2 Minuten gehalten wurde. Dann wurde die Cellulose mit Eiswasser und mit 0,1 M NaHCO, gewaschen. Zu 10 ml Schaf-Anti(Guinea-Schweine-Gammaglobulin)-Serum wurden 1,6 g Na₂SO^ zugegeben. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag abzentrifugiert,' zweimal mit je 20 ml 16 Gev./Vol.-% NapSO^-Lösung gewaschen und dann in 10 ml 0,1 M NaHCO^ aufgenommen. Die aktivierte Cellulose wurde vermischt mit 40 ml 0,1 M NaHCO,-Lösung und den 10 ml Gammaglobulinlösung. Diese Suspension wurde 40 Stunden bei 4°C in Rotation gehalten und daraufhin zweimal mit je 500 ml 0,5 M NaHCO,, zweimal mit je 500 ml 0,05 M Citrat vom pH 1,1 und zweimal mit je 500 ml 0,05 M Phosphat vom pH 6,2 gewaschen.

e) Bestimmung von Antikörpern gegen Insulin

0,1 ml Insulin-(glucoseoxidase) in geeigneter Verdünnung wurde 4 Stunden inkubiert mit 0,4 ml einer Verdünnungsserie eines Guinea-Schweine-Antiinsulinserums. Die Verdünnungsserie war hergestellt worden mit 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,0. Dann wurden 0,3 ml Immunoadsorbens (15 mg/ml) und 0,2 ml Puffer zugefügt und das Gemisch über Nacht bei 4⁰C in Rotation gehalten. Nach Zentrifugieren wurde die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, indem man 0,5 ml davon 30 Minuten mit-2,5 ml Substrat inkubierte und dann die Extinktion bei 460 nm maß. Das Substrat enthielt 50 mg Glucose, 10/Ug Peroxidase und 1 mg 5-Aminosalicylsäure je 2,5 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,0.

Mittels dieses Systems konnte der Antikörpergehalt der verschiedenen Sera verglichen werden. Als Bezugspunkt wurde diejenige Serumverdünnung gev/ählt, bei welcher 50 % der gesamten kombinierbaren Enzymaktivität ge«

blinden ist.

f) Bestimmung von Insulin.

Je 0,2 ml aus einer Verdünnungsserie von Insulin wurden 2 Stunden mit 0,4 ml Antiinsulinserum inkubiert, wobei das Serum soweit verdünnt war, daß es 60 % des zuzugebenden Enzymkon jugates binden konnte. Dann wurde 0,1 ml Insulin-(glucoseoxidase) in entsprechender Verdünnung zugegeben und 4 Stunden inkubiert. Zum Schluß wurden noch 0,3 ml Immunoadsorbens (15 mg/ml) zugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C in Rotation gehalten. Nach Zentrifugieren wurde in der überstehenden Flüssigkeit die Enzymaktivität auf die unter e) beschriebene Weise gemessen.

Die Empfindlichkeit der Bestimmung, die von dem verwendeten Antiserum abhängt, liegt im Nanogramm-Bereich von 20 bis 100 ng/ml, d.h. 0,5 bis 2,5 mU/ml.

■* f

Beispiel 5
Bestimmung von Oestradiol.

a) Herstellung von Oestradiol-17-succinyl-HRP.

50 mg Oestradiol-17-hemisuccinat und 0,08 ml Tri-nbutylamin wurden gelöst in 2,5 ml Dioxan. Zu der kalten (2⁰C) Lösung wurden 15/ul Isobutylchlorcarbonat zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Lösung vermischt mit 100 mg Meerrettichperoxidase (HRP) in 7,5 ml eines Gemisches aus Dioxan und Wasser (2:3), das mit Natronlauge auf ein pH von 9,5 eingestellt worden war. Die Lösung wurde 4 Stunden bei 2°C gerührt und dann 18 Stunden dialysiert. Der Niederschlag, der sich abschied, nachdem der pH-Wert des Dialysats auf 4,6 gebracht worden war, wurde abzentrifugiert, gewaschen und in 5 ml destilliertem Wasser, das auf ein pH von 8 eingestellt

209830/0634

worden war, aufgenommen. Zur weiteren Reinigung wurde zweimal mit 10 ml Aceton umgefällt· Das gereinigte Produkt wurde in 10 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 7,8 aufgenommen.

b) Herstellung von Oestradiol-iy-succinyl-BSA.

Das Präparat wurde hergestellt mit Hilfe der in Beispiel 3a) beschriebenen Misch-Anhydrid-Methode, ausgehend von 100 mg Oestradiol-17-hemisuccinat und 150 mg Rinderserumalbumin (BSA).

c) Herstellung von Antikörpern gegen Oestradiol.

Einem Schaf wurden in Abständen von 4 Wochen je 4 mg Oestradiol-17-succinyl-BSA in vollständigem Freunds-Adjuvans injiziert. In regelmäßigen Intervallen wurde dem Schaf Blut entnommen. Das Serum war absorbiert von BSA, das vorher unlöslich gemacht worden war.

d) Herstellung von Antikörpern gegen Schaf-Gammaglobulin.

Gammaglobulin vom Schaf wurde gemäß Beispiel 1, jedoch in diesem Fall mit 16 Gew./Vol.-% Natriumsulfat, hergestellt. Mit dem so gewonnen Schafglobulin wurden Kaninchen nach folgendem Plan immunisiert:

Tag Menge Freunds Adjuvans Injektionsweise

0 200/Ug + intramuskulär

14 400/Ug + intramuskulär

28 800/Ug + intramuskulär

42 800/Ug - intravenös

Die Blutentnahme erfolgte 2 Wochen nach der letzten Injektion.

0.9830/0634

e) Herstellung des Immunoadsorbens /"Kanin—anti- (Schaf-Gammaglobulin)^-Cellulose.

Die Gammaglobulinfraktion des unter d) beschriebenen Antiserums wurde hergestellt durch Ausfällen mit 18 Gew./Vol.-% Na₂SO₂,. Das erhaltene Produkt wurde gemäß der Gurvich-Methode ("beschrieben in Beispiel 1) mit Cellulose gekuppelt.

f) Bestimmung von Oestradiol

Die Immunreaktion wurde·durchgeführt in 0,02 M Phosphatpuffer, pH 6,0, der 2 % BSA enthielt: Eine Probe von 0,5 ml wurde vermischt mit 0,1 ml des Schafantioestradiol-Serums in der gewünschten Verdünnung. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde 0,1 ml Oestradiol-17-succinyl-HBP in geeigneter Verdünnung zugegeben, worauf eine weitere Inkubation von 30 min bei Kaumtemperatur folgte.^ADann wurden 0,3 ml Immunoadsorbenssuspension (30 mg/ml) zugefügt und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur in Rotation gehalten. Die flüssige und die feste Phase wurdet dann durch Zentrifugieren getrennt. Die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit wurde gemäß Beispiel 1 gemessen. Das Schafantioestradiol-Serum konnte verwendet werden in Verdünnungen von 1:1 600 bis 1:12 je nach der Qualität des verwendeten Oestradiol-17-succinyl-HRP. Bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:12 konnte in der Probe eine Oestradiolkonzentration von 10 mg/ml nachgewiesen v/erden. Oestriol und Oestron zeigten in diesem System eine kreuzweise Reaktion.

Beispiel 4-

Bestimmung von Cortisol- und Corticoid-Bindeglobulin a) Herstellung von Cortisol-21-(galacboseoxidase).

209830/0634

50 mg Cortisol-21-hemisucciiiat und Ί00 mg Galactoseoxidase wurden mit Hilfe der Mischanhydridtechnik (s. Beispiel 3a) gekuppelt.

t>) Corticoid-Bindeglobulin (GBG) wurde aus menschlichem Serum mit Hilfe von aufeinanderfolgender Chromatographie über DEAE-Cellulose und Hydroxylapatit isoliert.

Antikörper gegen dieses Globulin wurden hergestellt, indem Kaninchen in Intervallen von 14 Tagen mit 500yug GBG in vollständigem Freunds Adjuvans injiziert wurden. Nach 3 Monaten wurde den Tieren 1 mg CBG injiziert und 2 Wochen später wurde ihnen Blut entnommen.

c) Die Gammaglobulinfraktion von Anti-CBG-Serum wurde gemäß Beispiel 3 mit m-Aminabenzyloxymethylcellulose gekuppelt.

d) Bestimmung von Cortisol

0,5 ml einer Cortisol enthaltenden Probe (Standardlösung) wurde extrahiert mit 2 χ 3 ml Methylenchlorid. Die vereinigten Extrakte wurden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,5 ml 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 6,2 auf ge- ., nommen, mit 0,1 ml einer Lösung von CBG im gleichen Puffer in der entsprechenden Konzentration vermischt und 30 Minuten bei 4⁰C inkubiert. Dann wurden 0,1 ml Cortisol-2i-(galactoseoxidase), ebenfalls in geeigneter Verdünnung, und 0,3 ml des unter c) hergestellten Immunuadsorbens mit einer Konzentration von 5 mg/ml zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden bei 4⁰C in Rotation gehalten und dann zentrifugiert, worauf in der überstehenden !Flüssigkeit die Enzymaktivität gemessen wurde.

Zu diesem Zweck wurden zu 1,5 ml Substrat, bestehend aus 100 mg

209830/0634

D-Galactose, 20 mg 5-Aminosalicylsäure und 10/Ug Peroxidase in 150 ml 0,02 M Phospliatpuffer vom pH 6,0 0,5 Liter der Flüssigkeit zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Extinktion bei 4-60 nm gemessen,. Bei Anwendung einer CBG-Konz ent ration von 0,4yUg/ml und soviel Gortisol-21-(galactoseoxidase), daß ohne Zugabe von Steroiden.80 % des Enzymkonjugates an das Immunoadsorbens gebunden waren, erwies es sich als möglich, Mengen von 3 bis 30 ng Cortisol zu bestimmen.

e) Mit den oben beschriebenen Reagentien war auch eine Bestimmung von GBG möglich.

Aus einer Verdünnungsserie von Transcortin, die von O bis 1 280 ng/ml reichte, wurden je 0,5 ml 15 Minuten mit 0,5 ml Cortisol-21-(galactoseoxidase) in geeigneter Verdünnung inkubiert. Dann wurden 0,3 ml Immunoadsorbensßuspension (5 mg/ml) zugefügt und das Gemisch 15 Minuten in Rotation gehalten. In beiden Fällen wurde die Inkubation bei 4-°C durchgeführt. In der überstehenden Flüssigkeit wurde nun die Enzymaktivität wie oben unter d) gemessen. Es erwies sich, daß die Empfindlichkeit des Testsystems bei 50 ng/ml lag.

Beispiel 5

In einem Fläschchen wurden die folgenden Reagentien nacheinander in getrennten Schichten lyophilisiert:

1) 0,3 ml der in Beispiel 1a beschriebenen Immunoadsorbens-Suspension (10 mg/ml);

2) 0,1 ml einer 1%igen Mannit ο !lösung;

209830/0634

•3) 0,1 ml HCG-HEP, wie beschrieben in Beispiel 1a);

4) Eine zweite Schicht von 0,1 ml einer 1%igen Mannitollösung;

5) 0,1 ml Kanin-(Anti-HCG)-serum wie beschrieben in Beispiel 1b).

Zu diesem lyophilsierten Gemisch wurden 0,5 ml einer Urinprobe und daraufhin 0,5 ml destilliertes Wasser zugegeben. Nach 10 Minuten wurde in der überstehenden Flüssigkeit die Enzymaktivtät mit Hilfe eines mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid und o-Tolidin imprägnierten Papierstreifens gemessen·.

Stammte die Urinprobe von einer schwangeren Frau (> 2 IU HCG/ml), so trat innerhalb 5 Minuten eine Blaufärbung auf, während im Urin von nicht schwangeren Frauen innerhalb der gleichen Zeit !seine Färbung zu beobachten war.

PATENTANSPRÜCHE:

209830/0634

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1j Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente der Reaktion zwischen einem spezifischen Bindeprotein und der entsprechenden bindefähigen Substanz unterAnwendung der bekannten Bindeaffinität derartiger Komponenten füreinander, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung Gebrauch macht von einer bekannten Menge eines Kupplungsproduktes der bindefähigen Substanz mit einem Enzym und von in unlösliche Form gebrachten Antikörpern gegen das spezifische Bindeprotein_?und daß man nach der Reaktion die Enzymaktivität in der flüssigen oder festen Phase des Reaktionsgemisches bestimmt, die ein Maß gibt für die Menge der zu bestimmenden Komponente.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadureh gekennzeichnet, daß als spezifisches Bindeprotein Antikörper gegen die bindefähige Substanz und als entsprechende bindefähige Substanz Antigen oder Hapten wirken.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadureh gekennzeichnet, daß man die unlöslichen Antikörper gegen das spezifische Bindeprotein dem Reaktionsgemisch als letztes Reagens zufügt.
4) Verfahren nach Anspruch 3, dadureh gekennzeichnet, daß man die bindefähige Substanz dadureh bestimmt, daß man zuerst der Probe das spezifische Bindeprotein, dann das Enzymkonjugat und zum Schluß die unlöslichen Antikörper gegen das spezifische Bindeprotein zufügt.

209830/0634
5) Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die unlöslichen Antikörper im Überschuß gegenüber der Menge an spezifischem Bindeprotein zufügt.
6) Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymaktivität der flüssigen Phase des Reaktionsgemisches bestimmt.

s ,■

209830/0634