RU1806198C

RU1806198C - Способ получени авермектина В

Info

Publication number: RU1806198C
Application number: SU884355079A
Authority: RU
Inventors: Вилльям Хэфнер Эдмунд; Скотт Холдом Келвин; Эдвард Ли Шин-Джен
Original assignee: Пфайзер Инк
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1993-03-30
Also published as: KR900004419B1; FI90088B; YU47878B; EP0276131A3; AU1074288A; EP0276103B1; PL270239A1; ATE87927T1; HUT47978A; IL85165A0; AU603416B2; MY103514A; PT86584B; EP0276103A3; DD267512A5; FI90091C; IL85118A0; HU201973B; GR3007586T3; AR241798A1

Abstract

Область использовани : микробиологическа промышленность, производство антибиотиков. Сущность изобретени : авермектииы В получают при культивировании штамма Streptomyus avermltills АТСС № 53692 в питательной среде в присутствии кэрбоновой кислоты. Используемый штамм вл етс двойным мутантом с отсутствием разветвленно-2-оксокислотнб- дегидрогеназной и В-авермектин-0-метилт- рансферазной активностей. Полученные авермектины В обладают противопарази- тарной активностью широкого спектра действи , 1 з.п,ф-лы.

Description

ел

с

либо во врем инокул ции, либо через некоторые промежутки времени во врем ферментации. Продуцирование авермекти- новых продуктов можно контропировать путем отбора проб из ферментационной среды, провод экстрагирование органическим растворителем с последующим определением продукта методом хроматографии, например , использу жидкостную хроматографию высокого давлени . Инкубацию провод т до тех пор, пока выход продукта не будет максимальным , в общем в течение 4-15 дней.

Предпочтительное количество затравочных соединений в каждом случае добавлени (карбонова кислота или соединение, превращающеес в нее) составл ет 0,05- 3,0 г на 1 л. Затравочное соединение можно добавл ть в ферментационную среду непрерывно , через некоторые промежутки времени или однократно. Кислоту (RCOOH) добавл ют как таковую или в виде соли кислоты , такой как соль натриева , литиева или аммониева , или как соединение, превращающеес в кислоту. Кислоту, если она существует в виде твердых частиц, по пред- почтительному варианту раствор ют в подход щем растворителе, таком как вода или (С1-Со)-спирты.

Среды, которые используют дл ферментации , могут представл ть собой, в осо- бенности когда С-25 заместителем вл етс изопропил или (5)-8тор,бутил, общеприн тые среды, содержащие усваиваемые источники углерода, азота и следы элементов. Когда С-25-заместитель-ненатуральна группа, т.е. она не вл етс изопропилом или (5)-втор, бутилом, то ферментационна среда вл етс такой, в которой выбранные ингредиенты не содержат или содержат только минимальные количества затравоч- ных соединений, в которых R-изопропил или (5)-втор. бутил.

После ферментации в течение нескольких дней при температуре предпочтительно в интервале 24-33°С ферментационный бульон центрифугируют или фильтруют, и мицелиевый осадок экстрагируют, предпочтительно ацетоном или метанолом. Экстракт в растворитель концентрируют/в целевой продукт затем экстрагируют в не смешивающийс с водой органический растворитель , такой как хлористый метилен, этилацетат, хлороформ, бутенол или мети- лизобулкетон. Экстракт в растворителе концентрируют , и сырой продукт далее очищают до необходимой степени хрома- тографией, например, использу препара- тивную хроматографию с обращенной фазой, жидкостную хроматографию высокого давлени .

Продукт обычно получают в виде смеси соединений формулы (I), где Р2-4-(альфа-1.- олеандрозил)-альфа-Ьолеандрозилокси, RI- ОН, и двойна св зь отсутствует, или отсутствует RI, а двойна св зь присутствует , и где Ra-H. Соединени , в которых Ra-CHa, no-существу, отсутствуют. Однако пропорции каждого соединени могут соедин тьс в зависимости от использованного конкретного мутанта и затравочного соединени , а также условий проведени .

Источники группы R, т.е. то, происходит ли она непосредственно от R-OOH, или ее получают из одного из упом нутых предшественников , или из любого предшественника , не вл етс существенным дл получени авермёктинов. Существенным требованием дл процесса согласно изобретению дл их получени вл етс то, чтобы нужна группа R была доступна штаммам Str.avermitllis согласно изобретению в процессе ферментации.

Подход щими вл ютс следующие соединени :

2,3 - диметилмасл на кислота;

2 - метилгексанова кислота;

2 - метилпент-4-еноева кислота;

2 - циклопропиллропионова кислота;

литиева соль 4,4 - дифторциклогексан- карбоновой кислоты;

4 -.метиленцикдогексанкарбонова кислота;

3 -метилциклогексанкарбонова кислота (цис/транс);

1 - циклопентенкарбонова кислота;

1 - циклогексенкарбонова кислота;

тетрагидропиран - 4-карбонова кислота;

тиофен - 2-карбонова кислота;

3 - фурокислота;

2 - хлортиофен-4-карбонова кислота;

циклобутанкарбонова кислота;

циклопентанкарбонова кислота;

. циклогексанкарбонова кислота;

циклогептанкарбонова кислота;

2 - метилциклопропанкарбоновап кислота;

3 - цмклогексен-1-карбонова кислота; 2. - метилтиопропионова кислота; 2 - метил-4-метоксимасл на кислота; тиофен - 3- карбонова кислота; гидроксиметилциклопентан; 3-тиофенкарбоксальдегид; 3-циклогексилпропионова кислота; З-циклопентилпропионова кислота; гидроксиметилциклобутан; тетрагидротиофен-3-карбонова кислота; З-циклопентил-1-пропанол; литиева соль 3-метилциклобутанкар- боновой кислоты;

3-фторциклобутанкарбонова кислота;

литиева соль 3-метилленциклобутан- карбоновой кислоты;

2-метил-4-метилтиомасл на кислота;

тетрагидротиопиран-4-карбонова кислота;

циклобутилметиламин;

этилциклобутанкарбоксилат;

4-гидроксиметилциклопентен; этиловый эфир 2-(3-тиофенкарбонил) пропионовой кислоты;

5-2-метилпентанова кислота; R-метил- пентанова кислота..

Изобретение иллюстрируетс следующими примерами.

П р и м е р 1. Получение двойного мутанта Stavermitills 7881 (АТСС 53692) с недостающими разветвлен но-2-оксокислотодегидроге- назой и В-авермектин-0-метилтрансфе- разой.

Стади 1. Исходный штамм Str. avermitllis АТСС 53567 выращивают в виде сливного сло на агаре New Patch. Agar в течение 12 дней при 30°С.

Споры собирают с трех таких чашек и суспендируют в 20 мл 0,05М трис-малеино- кислотном буфере, рН 9.

Среда New Patch.Agar имеет следующий состав:

V - сок 200 мл СаСОз 3 г Агар 15 г Н20 до 1000мл Питательный бульон 1,0 г/л Ацетат натри -ЗНгО 1,4 г/Л Изовалериа нова кислота 50 мг/л Изомасл на кислота 50 мг/л Метилмасл на кислота 50 мг/л Изолейцин 250 мг/л Лейцин 250 мг/л Валин . 250 мг/л Раствор микроэлементов 1 мл/л

Смесь из 8 растительных соков (помидоры , морковь, сельдерей, свекла, петрушка , латук, горчица и шпинат) плюс соль, аскорбинова и лимонна кислота и натуральные вкусовые добавки.

Состав раствора микроэлементов: РеС1з-6Н202,7 г MnSOrHaO 4,2 CuSCU-SHaO 0,5 CaCl2 11,0 Н2РОз 0,62 CaCl2 6H20 0,24 ZnCI2 0,62 Na2Mo04 0,24

Вышеупом нутое раствор ют в 1 л 0,1 HCI.

Стади 2.10 мл споровой суспензии добавл ют в ампулу, содержащую 10 мг N-меTHfl-N -HHTpo-N- нитрозогуанидина (НТГ). Ампулу инкубируют на шейкере при 28°С 60 мин, затем тщательно промывают раствором 1 % NaCI.

Стади 3. Промытые споры суспендируют в 1% растворе NaCI и смешивают с равным объёмом 80% этиленгликол . Суспензию хран т при -20°С и используют в.качестве источника клеток дл скрининга мутантов.

Эту споровую концентрированную массу распредел ют по чашке УРД (дрожжевой пептидно-декстрозный агар) дл получени около 100 колоний на чашку. Колонии

мутагенизйрованой попул ции (обработанной нитрозогуанидином) исходного Str, avermitllls АТСС 535567 собирают и нанос т в виде мазков на агаровую среду, полученную следующим образом (граммы на литр):

разбавленный крахмал 80,К2НРСм 1, MgS04 7H20 1, ардамин рН 5, СаСОз 5, Р- 2000 1 мл, FeS04-7H20 0.01; МпС 2-4Н20 0,001. ZnS04 7H20 0,001; бактоагар 17, дистиллированна вода до 980 мл, рН среды

добавл ют до 7, добавл NaOH перед авто клавированием при 121°С в течение 20 мин. После автоклавировани добавл ют 20 мл 5% концентрированного раствора (±)-2-ме- тилмасл ной кислоты, рН 7.

Агаровые культуры инкубируют в течение 8-12 дней при 28°С. Клетки (мицелий) удал ют с поверхности агара, помещают в 250 млк ацетона. 25 мкл ацетоновых экстрактов затем нанос т точками на хроматографические пластины Analtech Silica Gel GF.

Храмотограмму снимают в течение 30- 40 мин этилацетатом в качестве растворител , затем сушат, затем обрабатывают 5%

ванилином в этаноле. Пластины помещают в печь при 100°С на 1-3 мин, затем обрабатывают 3% серной кислотой в этаноле и вновь помещают в печь при 100°С на 10-15 мин. Мутанты, лишенные В-авермектин-0метилтрансферазы , идентифицируют по изменению на хроматограмме: по присутствию п тна, соответствующего В-авермек- тиновым компонентам (R f %. 0,54; 0,42 дл В1 и 82 соответственно) и отсутствию п тна , соответствующего А-авермектиновым компонентам (Rf - 0,69; 0,58 дл А1 и А2 соответственно).

Общие методики высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Подвижна фаза: 150 мл воды, 70 мл ацетонитрила, добавл ли метанол до получени объема 1л.

Колонка: типа Ultra Sphera ОД5 25 см (Beckman Instrum. Фуллертон, СА 926343100 ).

Поток: 0,75 мл/мин.

Детектирование: УФ на 24, нм.

Ослабление: около 6.

Разбавитель образца (О): 35 мл ацето- нитрила плюс 390 мл метанола.

Стандарты 0,5 мг авермектина А2А в колбу емкостью 10 мл и довести метанолом до нужного объема; навесить 0,5 мг испыту- емого продукта в колбу емкостью 10 мл и довести до полного объема метанол.

Они представл ют собой стандартные концентрированные растворы: дл стзндар- тного раствора:

вз ть 100 мкл и 100 мкл в ампулу и добавить 800 мкл подвижной фазы.

Пробы: отобрать 1 мл хорошо перемешанного бульона; удалить возможно боль- ше надосадочной жидкости, не затрагива осадок; добавить 100 мкл воды после высокоэффективной хроматографии к осажденному слою и провести вихревое смешивание дл диспергировани ; добавить 2 мл разбави- тел и тщательно перемешать; профильтровать и подвергнуть высокоэффективной жидкостной хроматографии,

Натуральные и ненатуральные авермектины по изобретению подвергают высоко- эффективной жидкостной хроматографии и врем удерживани дл пиков отдельных авермектинов дел т на врем удерживани дл наблюдаемого присутствующего олиго- мицина-А, служащего в качестве внутренне- го стандарта дл данного определени методом БЗЖХ. Олигомицин-А почти всегда наблюдают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в виде побочного продукта ферментации Str.avermltilis и он вл етс единственным продуктом, наблюдаемым с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, который продуцируетс описываемыми мутантами, когда их культивируют в среде, свободной от кислот RCOOH, где R имеет определенное значение, Обычно олигомицин-А имеет врем удерживани 12,5-14 мин. Отношение удерживани (НУ) вл етс более значимой основой дл идентификационного сопоставлени и сравнени выходов авер- мектиновых продуктов. Общий пор док по влени авермектиновых продуктов при высокоэффективной тонкослойной хроматографии - В2, А2, В1 и А1.

Натуральный авермектин

В2в В2а А2в А2А В1в В1А А1в А1а

енатуральные авермектины

Врем удерживани / Врем удерживани (олигомицин А)

070

0,84

0,90

1,09

1,40

1,83

Claims

1,83

2,42

циклопентил В20,94 циклопентил А2 1,23 циклопентил В1 .1,99 циклопентил А1 2,62

Врем удерживани колеблетс в пределах 1-2 мин в разные дни, причем врем удерживани олигомицина А, по-видимому, составл ет 12,5-15 мин.

В следующих примерах авермектины определ ют с помощью описанной процедуры высокоэффективной жидкостной хроматографии , за исключением случаев, которые оговорены особо.

Составы использованных сред в следующих примерах представлены ниже.

Среда А7 г/л Разбавленный

крахмал20 Ардамии рН в 05 Фармамедиа с 15 СаСОз 2, а приготовленный гидролизом крахмала аль- фаамилазной из Bacillus fldenlformis (продукт фирмы) Novo Enrym, Уилтон, КТ, поставл етс под товарным знаком Termamy до декстрозного эквивалента 40% ±5%. Вот Yeas + Products, Jnc., Клифтон. Н.Дж 07012

Сот Traders Protein, Мемфис, Теннеси 38108 Добавл ли NaOH, рН доводили до 7,2 Среда АР - 5г/л разбавленный

крахмал80 Ардамин рН 5

К2НР041

MgSO/r7H201

NaCI1

СаСОз7

FeS04-7H200,01

MnCM-7H200.001

СН3СНЭ

СН30 СН3

где R-альфа-разветвленный Сз-Се-алкил, алкенил, алкинил, алкоксиалкил или алкил- тиоалкильна группа, в которой алкильна группа представл ет собой альфа-разветв1 ленную Сз-Св-алкильную группу, Сз-Св-цик- лоалкильную или Сз-Св-циклоалкетильную группу, люба из которых может быть необ зательно замещена метиленовой одной или более С1-С4-алкильными группами или атомами галогена путем культивировани в

0

5

аэробных услови х продуцента вида Streptomyces avermitllis в водной среде, содержащей усваиваемый источник азота, углерода и неорганических солей в присутствии карбоновой кислоты RCOOH, где R имеет указанные значени , и выделени целевого продукта, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Str.avermitllls ATCC 53692. а культивирование провод т при 28-30°С.

2. Способ по п. 1,отличающийс тем, что R 3-6-членное кислород- или серу- содержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным или полностью или частично ненасыщенным.