JPH0817693B2 - アベルメクチンｂ化合物の産生方法およびそのための培養物 - Google Patents

アベルメクチンｂ化合物の産生方法およびそのための培養物

Info

Publication number
JPH0817693B2
JPH0817693B2 JP63011881A JP1188188A JPH0817693B2 JP H0817693 B2 JPH0817693 B2 JP H0817693B2 JP 63011881 A JP63011881 A JP 63011881A JP 1188188 A JP1188188 A JP 1188188A JP H0817693 B2 JPH0817693 B2 JP H0817693B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
acid
avermectin
cooh
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP63011881A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS63291576A (ja
Inventor
エドマンド・ウィリアム・ハフナー
カルヴィン・スコット・ホルダム
シーージェン・エドワード・リー
Original Assignee
ファイザー・インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ファイザー・インコーポレーテッド filed Critical ファイザー・インコーポレーテッド
Publication of JPS63291576A publication Critical patent/JPS63291576A/ja
Publication of JPH0817693B2 publication Critical patent/JPH0817693B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/22—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアベルメクチンBO−メチルトランスフェラー
ゼ活性および分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
を有さないストロプトマイセス アベルミチリス（Stre
ptomyces avermitilis）、前記ストロプトマイセス
アベルミチリスの産生方法ならびにストロプトマイセス
アベルミチリスを使用して天然および非天然アベルメ
クチンを産生することに関する。
（従来の技術） 米国特許第4,310,319号および第4,429,042号はアベル
メクチン、強力な抗寄生虫活性を有する関連作用剤の複
合体、およびストロプトマイセス アベルミチリス菌株
すなわちストロプトマイセス アベルミチリスATCC第31
267号，第31271号および第31272号の好気性発酵による
それらの産生について述べている。上記の最後の２菌株
はそれぞれ、ストロプトマイセス アベルミチリスATCC
第31267号の紫外線照射によって得られた培養物を含む
凍結バイアルと凍結乾燥管を表す。
1986年７月16日出願の米国特許出願第886,867号に対
応する、1987年３月18日発行のヨーロッパ特許第214,73
1号は天然または公知のアベルメクチンに関連するが、2
5位置に新規な置換基を有する多くの化合物（ここでは
非天然アベルメクチンと呼ぶ）、およびある特定のカル
ボン酸またはその誘導体もしくはその前駆体の存在下で
のアベルメクチン産生微生物の発酵によるその製造方法
に関する。前記の新規なＣ−25置換アベルメクチンの製
造に用いられるストロプトマイセス アベルミチリス菌
はストロプトマイセス アベルミチリスATCC31267,3127
1,31272およびNCIB12121である。ヨーロッパ特許第214,
731号に記載されている後者の菌はストロプトマイセス
アベルミチリスATCC31271から誘導されたものであ
る。これを半規定培地中で培養すると、新規なＣ−25置
換アベルメクチンの収率が改善される。ATCC31267,3127
1,31272およびNCIB12121のそれぞれは、新規なＣ−25置
換誘導体の他に、Ｃ−25置換基がイソプロピルまたは
（Ｓ）−sec−ブチル（１−メチルプロピル）である公
知または天然のアベルメクチンをも種々な量で産生す
る。
アベルメクチンの炭素骨格（下記の式（１）に示す）
は酢酸塩とプロピオン酸塩から誘導され、天然アベルメ
クチンのＣ−25置換基はＬ−イソロイシン（Ｒ＝（Ｓ）
−sec−ブチル）またはＬ−バリン（Ｒ＝イソプロピ
ル）から誘導される〔フイッシャー（Fisher）とモロジ
ク（Mrozik）の「マクロライド抗生物質（Macrolide An
tibiotics）」アカデミックプレス（Academic Press）
（1984）第14章〕。
「公知」または「天然」とは、25位置の置換基がイソ
プロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル（１−メチルプロ
ピル）のいずれかである、ストロプトマイセス アベル
ミチリスATCC31267,ATCC31271およびATCC31272によって
産生されるアベルメクチンを意味する。25位置置換基が
イソプロピルまたはsec−ブチル（Ｓ形）以外の基であ
るアベルメクチンをここでは新規または非天然アベルメ
クチンと呼ぶことにする。
上記米国特許に記載されたストロプトマイセス アベル
ミチリス菌株は、この特許に一般にＣ−076として記載
されている種類の物質を産生する。この種類はＣ−076A
1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2aおよびB2として表される、
密接に関連した８種類の化合物を含む。「ａ」シリーズ
の化合物は25位置置換基が（Ｓ）−sec−ブチルである
天然アベルメクチンを意味し、「ｂ」シリーズは25位置
置換基がイソプロピルである天然アベルメクチンであ
る。「Ａ」と「Ｂ」の名称は５−置換基がそれぞれメト
キシまたはヒドロキシであるアベルメクチンを意味す
る。最後に数字「１」は22-23位置に二重結合が存在す
ることを意味し、数字「２」は22位置に水素を有し、23
位置にヒドロキシを有するアベルメクチンを意味する。
本出願では、非天然アベルメクチンの25置換基に関す
るこのような同類体を用いない。同類体A1,A2,B1および
B2は上記天然アベルメクチンの構造特徴に相当する構造
特徴を有する非天然アベルメクチンを意味するように意
図する。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない
突然変異体の発生が枯草菌（Bacillus sulbtiles）〔ヴ
ィレッチ（Willecke）とパルディ−（Pardes）による、
ジェイ．バイオル．ケム．（J.Biol.Chem.）246巻,5264
-72頁（1971）〕とシュードモナス プチダ（Pseudomna
s putida）〔マーチン（Martin）等によるジェイ．バク
テリオロジー（Ｊ．Becteriology）115巻,198-204頁（1
973）〕については報告されているが、ストレプトマイ
セスについては報告されていない。
突然にアベルメクチン アグリコーンズA1aとA2aのみ
を産生する突然変異体である、ストレプトマイセス ア
ベルミチリスAgly−１がシュルマン（Schulman）等のジ
ェイ．アンチバイオト（J.Antibiot）38（11）,1494-14
98頁（1985）によって報告されている。アベルメクチン
アグリコーンＢ成分の産生を増加させるシネフンギン
存在下でのストレプトマイセス アベルミチリスAgly−
１の発酵も報告されている。同様に、Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼの阻害剤としてのシネフンギン存在下で発
酵させた場合に、アベルメクチン高産生菌であるストレ
プトマイセス アベルミチリス08はアグリコーンのＣ−
５位置とオレアンドロース二糖成分とにＯ−メチル基を
有さないアベルメクチンを産生する。
米国特許第4,378,353号はＣ−076関連化合物とMA-521
8の培養によるその産生について述べている、MA-5218は
ストレプトマイセス アベルミチリスATCC31272の紫外
線照射によって得られた突然変異株である。この突然変
異株はATCC31780として確認される。前記突然変異株が
産生するＣ−076関連化合物はＣ−076フラン環を有さな
い。さらに、報告された化合物のあるものでは、オレア
ンドロース糖成分の一方または両方が開裂するが、他の
化合物では５位置基がケト基に酸化される。
Ｏ−メチル基を有さないアベルメクチンを産生するス
トレプトマイセス アベルミチリスの３種類のＯ−メチ
ルトランスフェラーゼ突然変異株が、ルビー（Ruby）等
による「アクチノマイセテスのバイオロジー（Biology
of Actinomycetes）」に関する第６回国際シンポジウム
（ハンガリーのデブレセンにおいて1985年８月26〜30日
間開催）によって、およびシュルマン等によるアンチマ
イクロビアル エイジェントス アンド ケモセラピー
（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）31巻,7
44−７頁（1987）によって報告されている。最初の種類
はマクロ環式ラクトン環のＣ−５ヒドロキシルをメチル
化することができないために主としてアベルメクチンＢ
を産生する。第２の種類は３′−O,3″−Ｏ−ビス−デ
メチルアベルメクチン（両オレアンドロース単糖残基の
３位置にＯ−メチル置換基を有さないアベルメクチン）
を産生する、このアベルメクチンはデメチルアベルメク
チンと呼ばれる。第３の種類は如何なる位置をもメチル
化することができない。
シュルマン等のフェド．プロク．（Fed.Proc.）44巻,
931頁（1985）は、アベルメクチンBO−メチルトランス
フェラーゼ酵素によるアグリコーン成分のＣ−５ヒドロ
キシ基のメチル化を阻害する例えばシネフンギン,S−ア
デノシルエチオニンおよびＳ−アデノシルホモシスティ
ンのような物質の存在下でストレプトマイセス アベル
ミチリスを発酵させることによる、アベルメクチンＢ産
生の増強を開示している。Ｏ−メチルトランスフェラー
ゼ活性を有さず、アベルメクチンＢ成分の産生量を増強
するストレプトマイセス アベルミチリス変異株はシュ
ルマン等によってアンチマイクロビアル エイジェント
ス アンド ケモセラピー 29巻,620-624頁（1986）に
も言及されている。
（課題を解決するための手段） ストレプトマイセス アベルミチリスの突然変異生成
によって、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を
有さない突然変異株が生ずる。この突然変異株は、化合
物RCOOH（Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチ
ル）の存在下で、または発酵過程中にRCOOHに転化しう
る化合物の不在下で、天然アベルメクチンの有意な量を
産生する能力をもはや有さない。しかし、この変異株
が、添加化合物RCOOH（Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）
−sec−ブチルまたはここに開示した他の基である）の
存在下または前記RCOOHの前駆体の存在下で発酵させる
と、天然および非天然のアベルメクチンを産生すること
が全く意外にも発見された。ここに開示した、分枝鎖２
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さずかつＬ−イソ
ロイシン,L−ロイシンまたはＬ−バリンを分解すること
のできない変異株が広範囲な化合物をアベルメクチン生
合成経路に同化させて、天然アベルメクチンの存在しな
い非天然アベルメクチンを産生することは、さらに意外
である。
このようにして産生した単独阻害変異株の突然変異生
成によって、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
とアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活
性の両方が欠損した変異株が生ずる。前記二重阻害株は
添加化合物RCOOH（Ｒは上記で定義した通りである）の
存在下で培養した場合に、実質的に天然および非天然ア
ベルメクチンＢのみを全く意外にも産生する。
上記の天然アベルメクチンは密接に関連した８種類の
化合物〔式（１）において、Ｒ＝イソプロピルまたは
（Ｓ）−sec−ブチル〕の複合混合物として産生され
る。これらは実質的に純粋な形で回収されるが（米国特
許第4,429,042号参照）、この方法は結局は困難であ
る。アベルメクチンＢは対応するアベルメクチンＡより
も大きい駆虫活性を一般に示す。ヨーロッパ特許第214,
731号に述べられた方法による非天然アベルメクチン
（Ａ成分とＢ成分）の産生によっても、ストレプトマイ
セス アベルミチリス菌の細胞中およびその産生に用い
た培地中に分枝類２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび
アミノ酸Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンが存在する
ために、天然アベルメクチンの幾つかが種々な量で産生
される。
天然または非天然アベルメクチンの生物学的により有
効なＢ成分のみを産生しうることは、生成物の数と複雑
さを最小にし、これによって特定アベルメクチンの純度
を高め、分離方法を簡単化するために望ましい目的であ
る。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない
ストレプトマイセス アベルミチリス菌株、はストレプ
トマイセス アベルミチリスのアベルメクチン産生菌株
の突然変異、特にストレプトマイセス アベルミチリス
ATCC31267,ATCC31271,ATCC31272またはNCIB12121の突然
変異によって生ずる。この突然変異株は、イソプロピル
基またはsec−ブチル基（Ｓ形）含有脂肪酸またはその
前駆体を前記突然変異体の発酵培地に加える場合以外
は、天然アベルメクチンを合成することができない。こ
の突然変異株は、適当なプライマー酸または発酵過程中
にこれに転化しうる化合物を含む栄養培地中での水性好
気性条件下で発酵させると、天然および非天然アベルメ
クチンを産生することができる。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない
ことを特徴とする突然変異株は、14CO2分析に基づいて
突然変異生成コロニーから単離される。この方法では、
〔14Ｃ−１〕−２−オキソイソカプロン酸または〔14Ｃ
−１〕−２−オキソ−３−メチル吉草酸または〔14Ｃ−
１〕−２−オキソ−３−メチル酪酸の基質から透過性化
細胞による14CO2発生のないことが、分枝鎖２−オキソ
酸デヒドロゲナーゼ活性の存在しないことを示唆する。
ここに述べた分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
性を有さない突然変異株がアベルメクチン、特に非天然
アベルメクチンおよびシネフンギン存在下ではデメチル
アベルメクチンを産生する能力を保有することは、意外
で予想しえないことであった。これらの突然変異株が、
慣習的な培地上で増殖させた場合に、天然の脂肪アシル
補酵素Ａ誘導体を産生できないことは、膜の完全性が前
記誘導体に依存するならばまたは前記突然変異体による
２−オキソ酸蓄積が細胞毒性をもたらすならば、致命的
な突然変異になったであろうと考えられる。さらに、こ
の突然変異体がＬ−イソロイシンおよびＬ−バリンの分
解代謝からアセチルCoAおよびプロピオニルCoAを合成し
うることは予想されなかった、これらの合成にはこの突
然変異株に欠けている酵素活性が必要であるからであ
る。上記のアベルメクチン生合成にはこれらのアシルCo
A誘導体が必要であるので、この突然変異株が非天然ア
ベルメクチン産生でひどく損傷することが予想された
が、これは生じなかった。
ここに述べる突然変異株に分枝鎖２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性の存在しないことは、分枝鎖脂肪アシル
CoA合成をＬ−イソロイシン,L−ロイシンおよびＬ−バ
リンの分解から保護することになり、そのために、酸Ｒ
−COOH（Ｒは（Ｓ）sec−ブチルまたはイソプロピルで
ある）またはこれの前駆体を発酵培地に加える場合以外
は、天然アベルメクチンの合成を特に保護することにな
る。さらに、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
欠損変異株が突然変異を起こすと、付加的にアベルメク
チンBO−メチルトランスフェラーゼ活性が欠損した変異
株が形成される。アベルメクチンBO−メチルトランスフ
ェラーゼ活性を有さない変異株はアベルメクチンのアグ
リコーン成分のＣ−５酸素をメチル化することができな
い。このような活性が欠損した変異株はＡアベルメクチ
ン産生を阻害して、本質的にアベルメクチンＢのみを産
生する。
本発明は、形質転換、形質導入、遺伝的組換えまたは
他の何らかの遺伝的方法によって、ここに述べた細菌種
からの核酸もしくは同等な物質を用いて発生させ、それ
によってここに述べた変異株の特徴を獲得させた微生物
をも包含する。
ここで用いる「アベルメクチン」または「アベルメク
チン類」なる用語は、25置換基（Ｒ）が本発明のトレプ
トマイセス アベルミチリスによって前記位置に同化し
うる基である。下記の式（１）で示される化合物を意味
する。
ここに述べる突然変異株はここに開示し、ここに例示
する方法によって非天然デメチルアベルメクチンを製造
するために非常に貴重である。これらの突然変異株は好
ましいデメチルアベルメクチン、すなわちＣ−25置換基
がＣ1‐Ｃ4アルキル基によって任意に置換されたＣ4‐
Ｃ6シクロアルキルもしくはシクロアルケニル基、１−
メチルチオエチルまたは５員もしくは６員の酸素もしく
は硫黄含有複素環基、特に３−チエニルまたは３−フリ
ルである化合物の製造にとって特に貴重である。
ストレプトマイセス アベルミチリス種のアベルメク
チン産生菌の突然変異は、紫外線照射,X線照射,N−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン，エチルメ
タンスルホネート，亜硝酸およびナイトロジェンマスタ
ード、例えばＮ−メチルビス（２−クロロエチル）アミ
ン、または同様な処置を含む、様々な突然変異誘発剤を
用いる公知の方法によって実施される。突然変異誘発
は、例えばストレプトマイセス アベルミチリスATCC31
272のような、天然アベルメクチンを産生しうるストレ
プトマイセス アベルミチリスの胞子または増殖性培養
物に対して行われる。
当業者に周知の方法に従って、特定の〔14Ｃ−１〕−
２−オキソ分枝鎖酸から14CO2を放出する、無作為に突
然変異を誘発した多数の細菌コロニーを検出しうる生化
学的分析方法に基づいて、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼの欠損に関して突然変異誘発コロニーを選択す
る〔タボール（Tabor）等、ジェイ．バクト．（J.Bac
t．）128巻,485-486頁（1976）〕。
この方法は、マイクロタイタープレートの孔中の適当
な栄養培地上で突然変異株コロニーを増殖させる；細胞
にトルエンを透過させる；次に各孔に〔14Ｃ−１〕−２
−オキソ酸（例えば２−オキソイソカプロン酸）を加
え、発酵上の雰囲気を14CO2に関して検査することから
成る。また、〔14Ｃ−１〕−２−オキソ−イソカプロン
酸の代りに、〔14Ｃ−１〕−２−オキソ−メチル吉草酸
または〔14Ｃ−１〕−２−オキソ−３−メチル酪酸を用
いることができる。湿ったBa（OH）2飽和紙を各孔の
上において放出14CO2を捕捉して、Ba14CO3（存在する場
合には）をオートラジオグラフィによって検出すること
によって、14CO2の発生が簡単に調べられる。分枝鎖２
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない突然変異株
はブランク対照に大体等しいオートラジオグラムを示
す；すなわち、Ba14CO3はこの突然変異株によって産生
されない。
このようにして得られた突然変異株に上記の突然変異
誘発剤を用いて、さらに突然変異を誘発する。突然変異
誘発コロニーを添加前駆体（例えば、２−メチル酪酸）
の存在下での発酵後に、クロマトグラフィ（薄層クロマ
トグラフィまたは高速液体クロマトグラフィ）によっ
て、アベルメクチンBO−メチルトランスフェラーゼ活性
の欠損に関して検査する。このような突然変異株の発酵
ブイヨンには、アベルメクチンＡ化合物が本質的に存在
しない。
特定菌株の好ましい対立遺伝子の突然変異誘発による
生地の他に、１つの菌株中に生成し固定された対立遺伝
子の他の菌株の染色体中への導入が、原形質体融合によ
って可能になる。例えば、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼとアベルメクチンBO−メチルトランスフェラー
ゼとが欠損したストレプトマイセン アベルミチリス菌
株は前記活性を有するストレプトマイセス アベルミチ
リス菌株との原形質体融合によって、アベルメクチンBO
−メチルトランスフェラーゼ活性のみが欠損したストレ
プトマイセス アベルミチリス菌株を生成することがで
きる。当業者に自明であるように、原形質体融合法によ
って、特定の分岐ラインからの好ましい対立遺伝子を単
菌株に結合させることができる。
ここに述べる突然変異株の方法論的および培養上の特
徴は、一般に米国特許第4,429,042号に述べられている
通りである。この突然変異株の明確な特徴は分枝鎖２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないことであり、
この特徴は上述のようにして検出される。この活性が存
在しないと、突然変異体は脂肪酸RCOOH（Ｒはイソプロ
ピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである）または発酵中
に前記RCOOHに転化しうる化合物を実質的に含まない規
定（defined）培地上で増殖させたときに、天然アベル
メクチンを産生することができない。アメリカン タイ
プ カルチャー コレクション（American Type Cultur
e Collection）によって実施した分類学的研究（taxono
mic investigation）は、上記14CO2分析によって選択し
た、２種類の突然変異株Ｉ−３とHL-026の特徴が米国特
許第4,429,042号に述べられているATCC31272親菌株の特
徴に密接に関係する（若干の例外にあるが）ことを実証
した。従って、突然変異株Ｉ−３（ATCC53567）はATCC3
1272よりも有意に少ない胞子を形成する。出願人による
実験では、ラフィノースは１−３の増殖を支持するよう
に見えなかった。米国特許第4,429,042号では、単独元
素源としてスクロースを用いてATCC31272の突然変異株
の増殖を検出することができなかった。突然変異株Ｉ−
３は分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さな
い。本発明の二重欠損変異株すなわち突然変異株Ｉ−３
（ATCC53567）のさらに突然変異生成によって生じた、
分枝鎖２−オキソ酸デヒトラゲナーゼ活性とアベルメク
チンBO−メチルトランスフェラーゼ活性とを有さないス
トレプトマイセス アベルミチリス7881は、突然変異株
Ｉ−３と同様な、ATCC31272に対する分類学的関係を有
する。
ストレプトマイセス アベルミチリスＩ−３と7881は
ブタベスト条約の条件下で、アメリカンタイプ カルチ
ャー コレクション（メリーランド州，ロックビル）に
寄託された、この機関は永久的な寄託を可能にする公認
の受託所であり、この出願に特許権が付与された場合に
は公衆に容易に入手可能になる。これらの菌株はそれぞ
れストレプトマイセス アベルミチリスATCC53567と535
68なる名称を与えられている。この寄託は、この出願の
審査中はアメリカ合衆国特許庁の特許局長が37CFR1.14
および35USC122の下に、およびこの出願の対応物または
その後継物を出願した国の特許法に従って、資格がある
と判定した人に利用可能である。寄託した微生物の公衆
への利用可能性に対する全ての制限は、特許の付与時に
変更不能に除去される。
ストレプトマイセス アベルミチリスATCC31267,ATCC
31271,ATCC31272およびNCIB12121はそれぞれ、式
（１）： 〔式中、22-23位置の破線は任意の二重結合を表す； Ｒ1はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
のみに存在する； Ｒ2は式： で示される４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−
Ｌ−オレアンドロシロキシであり、 Ｒ3は水素またはメチルであり、 Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである〕 によって示される化合物を産生する。米国特許第4,285,
963号は25位置がメチル基またはエチル基によって置換
され、Ｒ1がヒドロキシであり、Ｒ3がメチルである式
（１）のアベルメクチンを述べている。
上記の非天然アベルメクチンでは、Ｒはイソプロピル
または（Ｓ）−sec−ブチル以外の置換基であり、下記
のように定義される。
式（１）化合物の生合成に用いる重要な化合物はスト
レプトマイセス アベルミチリスの細胞中および培地中
に生成する。これらの化合物はＬ−バリンとＬ−イソロ
イシンの分解から、または分枝鎖２−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼによる２−オキソ酸の脱炭酸により対応２−オ
キソ酸から、同時に生成物を補酵素Ａと結合させること
によって得られる。これらの存在は式（１）のイソプロ
ピル化合物と（Ｓ）−sec−ブチル化合物の両方が同時
に生成する原因となる。これは当然、（Ｓ）−sec−ブ
チル誘導体からイソプロピル誘導体を分離するという問
題を招く。
本発明の変異株は、適当なプライマー化合物を含む栄
養培地中で発酵させると、式（１）の化合物または、よ
り通常の場合には、式（１）の２種類の化合物（Ｒは使
用プライマー化合物に相当する）の混合物を産生する。
米国特許第4,429,042号に用いられている名称によると
Ｒ−アベルメクチンB1とB2と便宜的かつ慣用的に呼ばれ
る、２種類までの化合物が産生される。Ｒ基は当然、Ｃ
−25置換基を意味する。例えば、Ｒがシクロペンチルで
ある場合には、２種類の可能なアベルメクチンが存在す
る： 非天然アベルメクチンでは、式（１）のＣ−25置換基
「Ｒ」はイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル以外
の基である。
二重結合が存在し、OHが存在しない式（１）の化合物
は、この代りに、Ｒ1がOHであり、二重結合が存在しな
い式（１）の対応化合物から脱水反応によって製造され
る。この反応は例えばｔ−ブチルジメチルシリルオキン
アセチル誘導体として、５および４″位置のヒドロキシ
基を最初に選択的に保護し、次に例えば（４−メチルフ
ェノキシ）チオカルボニルクロリドのような、置換チオ
カルボニルハライドと反応させ、次に例えばトリクロロ
ベンゼンのような高沸点溶媒中で加熱することによって
脱水させることによって行われる。最後に、生成物を脱
保護して、不飽和化合物を得る。これらの工程は適当な
試薬と反応条件とともに、米国特許第4,328,335号に述
べられている。
Ｒ1がＨであり、二重結合が存在しない式（１）化合
物は二重結合が存在し、Ｒ1が存在しない対応化合物か
ら適当な触媒を用いる選択的接触水素化によって製造す
ることができる。例えば、ヨーロッパ特許出願公報第00
01689号およびそれに対応する米国特許第4,199,569号
（1980年４月22日発行）に述べられているように、トリ
ス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）クロリド
を用いて還元が行われる。
Ｒ2がＨである式（１）の化合物は、Ｒ2が４′−（α
−Ｌ−オレアンドロシル）−α−Ｌ−オレアンドロシロ
キシである対応化合物から、水性有機溶媒中での酸によ
る緩和な加水分解によって４′−（α−Ｌ−オレアンド
ロシル）−α−Ｌ−オレアンドロース基を除去して13位
置にヒドロキシ基を有するアグリコーンを得ることによ
って製造される。次にこのアグリコーンを例えばベンゼ
ンスルホニルハライドとの反応によってハロゲン化し
て、13−デオキシ−13−ハロ誘導体を形成し、最後にこ
れを例えば水素化トリブチルスズを用いて選択的に還元
する。好ましくない副反応を避けるために、存在する他
のヒドロキシ基を例えばtert−ブチルジメチルシリル基
によって保護することが望ましい。この保護基は次に微
量の酸を含むメタノールによる処理によって、ハロゲン
化または還元後に容易に除去される。これらの工程は全
て、その実施のために適当な試薬および反応条件ととも
に、ヨーロッパ特許出願公報第0002615号に述べられて
いる。
本発明のストレプトマイセス アベルミチリスによっ
て式（１）のデメチルアベルメクチンの生合成に用いる
ことのできる化合物は式（II−Ａ）： RCOOH （II−Ａ） で示される化合物および発酵過程中に（II−Ａ）に転化
できる化合物である。前記化合物をここでは「プライマ
ー化合物」と呼ぶ。式（II−Ａ）では、Ｒはα−分枝鎖
基であり、−COOHが付着した、この基の炭素原子は水素
以外の少なくとも２個の他の原子または基にも結合す
る。この定義は当然、非環式鎖または環の要素としての
硫黄もしくは酸素のヘテロ原子を任意に含む飽和および
不飽和の非環式基および環式基を含む。
さらに詳しくは、Ｃ−25位置基になるＲはα−分枝鎖
Ｃ3‐Ｃ8アルキル，アルケニル，アルキニル，アルコキ
シアルキルまたはアルキルチオアルキル基；アルキル基
がα−分枝鎖Ｃ2‐Ｃ5アルキル基であるＣ5‐Ｃ8シクロ
アルキルアルキル基；メチレンまたは１個以上のＣ1‐
Ｃ4アルキルもしくはハロゲン原子（フルオロ，クロ
ロ，ヨードもしくはブロム）によって任意に置換するこ
とのできるＣ3‐Ｃ8シクロアルキルまたはＣ5‐Ｃ8シク
ロアルケニル基;1個以上のＣ1‐Ｃ4アルキル基もしくは
ハロゲン原子によって任意に置換することのできる、飽
和なまたは完全にもしくは部分的に不飽和な、３員〜６
員の酸素もしくは硫黄含有複素環式基である。
発酵過程中にRCOOHに転化可能な化合物；すなわち前
駆体は式（II−Ｂ）： Ｒ−（CH2）n−Ｚ （II−Ｂ） 〔式中、Ｒは上記で定義した通りであり;nは0,2,4ま
たは６であり； Ｚは−CH2OH,−CHO,−CH2Ｎ2，−COOR4または−CONHR
5であり； Ｒ4はＨまたは（Ｃ1‐Ｃ6）アルキルであり； Ｒ5は水素，（Ｃ1‐Ｃ4）アルキル，またはアミノ酸
残基，特にアスパラギン酸，グルタミン酸およびメチオ
ニンの残基、例えば−CH（COOH）CH2COOH,−CH（COOH）
（CH2）2COOH,および−CH（COOH）（CH2）2SCH3であ
る〕 で示される化合物である。
本発明には、式（II−Ａ）化合物の異性体形、発酵過
程中にそれに転化可能な化合物およびここに述べる方法
への使用から生ずるＣ−25における異性体アベルメクチ
ンをも含む。
本発明の方法は、窒素，炭素，無機塩および式RCOOH
で示される化合物または発酵過程中に前記化合物に転化
可能な化合物（すなわち前駆体）の同化可能なソースを
含む水性栄養培地中で、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性とアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフ
ェラーゼ活性とを有さないストレプトマイセス アベル
ミチリス菌株による好気性発酵によって実施する。接種
時にまたは発酵中に時々、酸または酸に転化可能な化合
物を発酵に加える。これは一度に全部、または発酵中に
間隔をおいて加える。発酵からサンプルを採取し、有機
溶媒で抽出し、例えば高速液体クロマトグラフィを用い
たクロマトグラフィによる生成物の表示に従って、アベ
ルメクチン生成物の産生を監視することができる。生成
物の収量が最大になるまで、一般には４〜15日間インキ
ュベーションを続ける。
プライマー化合物（カルボン酸またはカルボン酸に転
化可能な化合物）の各添加の好ましいレベルは0.05〜3.
0g/lの範囲である。プライマー化合物は連続的、間欠的
にまたは一度に全部を発酵に加えることができる。酸は
そのものとして、または例えばナトリウム，リチウムも
しくはアンモニウム塩のような塩として、または上記で
定義したような酸に転化可能な化合物として加える。酸
が固体である場合には、酸を水または（Ｃ1‐Ｃ4）アル
コールのような適当な溶媒に溶解するのが好ましい。
発酵に用いる培地は、特にＣ−25置換基がイソプロピ
ルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである場合には、同化可
能な炭素，窒素および微量元素源を含む慣習的培地であ
る。Ｃ−25置換基が非天然基である場合、すなわちイソ
プロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル以外の基である場
合には、発酵培地は特定成分が欠損しているまたはＲ基
がイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルであるプラ
イマー化合物の少量のみを含む培地である。
好ましくは24℃〜33℃の範囲内の温度において数日間
発酵させた後に、発酵ブイヨンを遠心分離または過
し、菌糸体ケーキを好ましくはアセトンまたはメタノー
ルによって抽出する。溶媒抽出物を濃縮し、次に目的生
成物を例えば塩化メチレン，酢酸エチル，クロロホル
ム，ブタノールまたはメチルイソブチルケトンのよう
な、水に混和しない有機溶媒中に抽出する。溶媒抽出物
を濃縮し、粗生成物を必要に応じて、例えば調製用逆相
高速液体クロマトグラフィを用いて、クロマトグラフィ
によってさらに精製する。
生成物は一般に、Ｒ2が４′−（α−Ｌ−オレアンド
ロシル）−α−Ｌ−オレアンドロシルオキシであり、Ｒ
1がOHで二重結合が存在しない。またはＲ1が存在せず二
重結合が存在し、Ｒ3がＨである式（１）化合物の混合
物である。Ｒ3がCH3である化合物は本質的に存在しな
い。しかし、各化合物の割合は特定の変異株、使用する
プライマー化合物および使用条件に依存して変動しう
る。
Ｒ基の源は、すなわちＲ基が直接Ｒ−COOHから生じた
かまたは上記の前駆体からもしくは何らかの前駆体から
生成したかはデメチルアベルメクチンの産生にとって重
要ではない。本発明の方法のデメチルアベルメクチンの
産生にとって重要な必要な条件は、Ｒ基が発酵過程で本
発明のストレプトマイセス アベルミチリス菌株にとっ
て同化可能であるということである。
適当な化合物を次に挙げる： 2,3−ジメチル酪酸 ２−メチルヘキサン酸 ２−メチルペント−４−エン酸 ２−シクロプロピルプロピオン酸 4,4−ジフルオロシクロヘキサンカルボン酸リチウム塩 ４−メチレンシクロヘキサンカルボン酸 ３−メチルシクロヘキサンカルボン酸（シス／トラン
ス） １−シクロペンテンカルボン酸 １−シクロヘキセンカルボン酸 テトラヒドロピラン−４−カルボン酸 チオフェン−２−カルボン酸 ３−クロン酸 ２−クロロチオフェン−４−カルボン酸 シクロブタンカルボン酸 シクロペンタンカルボン酸 シクロヘキサンカルボン酸 シクロヘプタンカルボン酸 ２−メチルシクロプロパンカルボン酸 ３−シクロヘキセン−１−カルボン酸 ２−メチルチオプロピオン酸 ２−メチル−４−メトキシ酪酸 チオフェン−３−カルボン酸 ヒドロキシメチルシクロペンタン ３−チオフェンカルボキシアルデヒド ３−シクロヘキシルプロピオン酸 ３−シクロペンチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒドロチオフェン−３−カルボン酸 ３−シクロペンチル−１−プロパノール ３−メチルシクロブタンカルボン酸リチウム塩 ３−フルオロシクロブタンカルボン酸 ３−メチレンシクロブタンカルボン酸リチウム塩 ２−メチル−４−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオプラン−４−カルボン酸 シクロブチルメチルアミン エチルシクロブタンシクロペンテン ４−ヒドロキシメチルシクロペンテン ２−（３−チオフェンカルボニル）プロピオン酸エチル
エステル （Ｓ）−２−メチルペンタン酸 （Ｒ）−２−メチルペンタン酸 ３種類のＯ−メチルトランスフェラーゼ変異株がここ
に述べた分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰性変異
株から得られる。有効な分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性の突然変異が１個以上のＯ−メチルトランス
フェラーゼ突然変異と結合した変異株は、RCOOH化合物
または発酵過程中にRCOOHに転化可能な化合物を供給す
ると、主としてアベルメクチンB,デメチルアベルメクチ
ンまたは全くメチル化されていないアベルメクチンを産
生するストレプトマイセス アベルミチリス菌株を生産
する。前記突然変異株は分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性を有さない、ここに述べた突然変異株の紫外
線および／または例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトロウレタ
ン，ニトロソグアニジン，エチルメタンスルホネートも
しくは上記に挙げたような他の作用剤のような化学的突
然変異誘発物質による突然変異誘発によって得られる。
この代りに、Ｏ−メチルトランスフェラーズ活性の一方
または両方を有さない分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ陽性突然変異株は紫外線または突然変異誘発剤によ
る処理によって突然変異を起して、分枝鎖２−オキソ酸
デヒドロゲナーゼ陰性突然変異株および／または分枝鎖
アミノ酸トランスアミナーゼ陰性変異株を生ずる。
このような突然変異株によって生ずる非天然アベルメ
クチンはアグリコーン成分のC5位置および／またはオレ
アンドロース成分のC3′および／またはC3″位置におけ
るヒドロキシ基の存在を特徴とする。
上記突然変異株はシュルマン等が述べている方法によ
って同定する〔アンチマイクロビアル エイジェント
アンド ケモセラピー,29巻,620-624頁（1986）〕。こ
れらの突然変異株は公知のアベルメクチンと同じ目的
に、同じように有用である。
この代りに、オレアンドロース二糖成分にメチル基を
有さないアベルメクチンを含めたアベルメクチンＢが、
Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を阻害するシネフン
ギン,S−アデノシルエチオニンまたはＳ−アデノシルホ
モシステインのような物質の存在下で、活性な分枝鎖２
−オキソ酸デヒドロゲナーゼを有さない本発明の変異株
を発酵させることによって多量に産生される。
本発明の化合物は駆虫薬，外部寄生虫撲滅剤，殺虫剤
およびダニ駆除剤として特定の用途を有する非常に活性
な駆虫薬である。
このように、これらの化合物は特に、線虫と呼ばれる
寄生虫群によって非常に頻繁に誘発され、ブタ，ヒツ
ジ，ウマおよびウシの重度な経済的損失を招き、家畜お
よび家きんに影響を与える蠕虫病を含めた、内部寄生虫
によって生ずる種々な症状の治療に有効である。この化
合物は例えばイヌのイヌ糸状虫および例えば鉤虫属（An
cylostoma），鉤虫（Necator），回虫（Ascaris），円
虫（Strongyloides），旋毛虫（Trichinella），毛頭虫
（Capiliaria），鞭虫（Trichuris），蟯虫（Enterobiu
s）のような胃腸寄生虫，ならびに例えばフィラリァ虫
および円虫と旋毛虫の腸外期のような、血液またはその
他の組織および器官に検出される寄生虫を含めた、ヒト
に感染しうる種々な寄生虫を含めて、種々な動物種に影
響を与える線虫に対して有効である。
この化合物はまた、例えばウシおよびウマに影響を与
えるマダニ，ダニ，シラミ，ノミ，クロバエ，刺虫（bi
ting insect）および移住性双翅目幼虫のような、特に
動物および鳥の昆虫網外部寄生虫を含めた外部寄生虫感
染症の治療にも有効である。
この化合物はまた、ゴキブリ，イガ，ヒメマルカツオ
ブシムシおよびイエバエのような家庭害虫に対して有効
かつ貯蔵穀粒の害虫およびハダニ，アブラムシ，イモ虫
のような農作物の害虫ならびにダイミョウバッタのよう
な移住性直翅目に対して有効である殺虫剤である。
式（１）の化合物は予定の特定の用途ならびに治療す
べき特定の宿主動物種および関係する寄生虫または害虫
に適した製剤として投与する。駆虫薬として用いるため
には、化合物をカプセル剤，巨丸剤，錠剤または水薬と
して経口投与する、またはこの代りに、注射によってま
たはインプラントとして投与する。このような製剤は標
準的な獣医学的方法に従って、慣習的な方法で製造され
る。従って、有効成分を例えば殿粉，ラクトース，タル
ク，ステアリン酸マグネシウム等のような、崩壊剤およ
び／または結合剤を補助的に含む、適当な微粉状希釈剤
またはキャリィーと混合することによって、カプセル
剤，巨丸剤または錠剤を製造することができる。水薬製
剤は有効成分を分散剤または湿潤剤等とともに水溶液中
に分散させることによって製造し、注射可能な製剤は例
えば、溶液を血液と等張性にするために充分な塩または
グルコースのような、他の物質を含む無菌溶液として製
造することができる。これらの製剤では被治療宿主動物
種、感染症の重症度と種類および宿主の体重に依存し
て、有効成分量が変化する。一般に経口投与用には、１
回量または分割量として動物体重1kgにつき約0.001〜10
mg量１日〜５日間投与が充分であるが、これより高いま
たは低い用量範囲が指示される場合も当然あり、このよ
うな用量範囲も本発明の範囲内に含まれる。
代替手段として、化合物を動物の飼料とともに投与す
ることもでき、この目的には濃厚な飼料添加剤またはプ
レミックスを通常の動物飼料との混合用に製造すること
ができる。
殺虫剤としておよび農業の害虫駆除のために使用する
には、化合物をスプレー，ダスト，エマルジョン等とし
て標準の農業的方法に従って用いる。
ストレプトマイセスＩ−３（ATCC53567）の産生 工程1.ストレプトマイセス アベルミチリスATCC31272
をニューパッチ寒天培地（New Patch Agar Medum）上に
集密的ローンとして、30℃において12日間増殖させた。
Ｖ−８ジュース※ 200ml CaCO3 3g 寒天 15g Ｈ2Ｏ 100mlになるまで 栄養ブイヨン 1.0g/l 酢酸ナトリウム三水和物 1.4g/l イソ吉草酸 50mg/l イソ酪酸 50mg/l メチル酪酸 50mg/l イソロイシン 250mg/l ロイシン 250mg/l バリン 250mg/l 微量元素溶液※※ 1ml/l ※ ８種類の野菜ジュース（トマト，ニンジン，セロ
リ，ビート，パセリ，レタス，オランダガラシ，ホウレ
ン草）に塩，アスコルビン酸，クエン酸および天然フレ
ーバーを加えた混合物，キャンベル スープ カンパニ
ー（Campbell Soup Campany）（ニュージャージー州，
キャムデン）から入手可能。
※※ 微量元素溶液の組成： FeCl3・6H2Ｏ 2.7g MnSO4・Ｈ2Ｏ 4.2 CuSO4・5H2Ｏ 0.5 CaCl2 11.0 Ｈ3BO3 0.62 CoCl2・6H2Ｏ 0.24 ZnCl2 0.68 Na2MoO4 0.24 上記成分を0.1NHCl1に溶解・ このような３プレートから胞子を回収して0.05Mトリ
スマレイン酸緩衝液（pH9.0）20ml中に懸濁させる。
工程2.胞子懸濁液10mlをＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）10ml含有バイアルに加え
た。このバイアルを28℃において60分間振とうインキュ
ベートし、次に１％NaCl溶液で充分に洗浄した。
工程3.洗浄した胞子を１％NaCl中に懸濁し、等量の80％
エチレングリコールと混合した。この懸濁液を−20℃で
保存し、突然変異株を検出するための細胞源として用い
た。これは発芽時に約104コロニー/mlを生じた。
この胞子ストックをYPDプレート上に展げて、約100コ
ロニー／プレートを形成した〔YPD培地は酵母抽出物、
バクトペプトン※（Bacto peptone）およびデキストロ
ース各10g/lと、バクト寒天※（Bacto agar）15g/lを含
み、加圧滅菌前にpH6.9に調節する〕。星印を付けた成
分はディフコ ラホラトリーズ（Difco Labolatories）
（ミシガン48238,デトロイト）から入手可能。
工程4.28℃において２〜３週間増殖させた後に、独立コ
ロニーをプレートから採取して、標準96孔マイクロタイ
タープレートの孔に入れた。コロニーの少量は新しい寒
天培地にパッチして、変異株を確認する場合の生育可能
細胞としても用いた。
工程5.各孔に、グルコース１％，カザミノ酸0.1％，お
よびイソ吉草酸，イソ酪酸および２−メチル酪酸各0.01
％を含む液体M9塩培地約75μｌを加えた。28℃において
数日間インキュベートした後、分枝鎖２−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼの存在に関して細胞を検査した。（M9塩培
地１はNa2HPO46g,KH2PO33g,NaCl0.5gおよびNH4Ｃ1g
を含有する。この培地を加圧滅菌し、殺菌した1M MgSO4
と0.1M CaCl2各1ml無菌添加する） 工程6.混和不能な混合物を短時間超音波処理することに
よって、M9塩培地中５％トルエンのミクロ懸濁液を調製
した。この懸濁液25mlに、〔14Ｃ−１〕−２−オキソ−
イソカプロン酸2.5マイクロキューリー/ml,10.0マイク
ロキューリー／μmoleを含む溶液1.2mlを加えた。この
総混合物50μｌを被検コロニー含有マイクロタイタープ
レートの各孔（ウェル）に加えた。
工程7.タボール（Tabor）等がジェイ．バクテリオル
（J.Bacteriol.）128巻,485-486頁（1976） 「多重サンプル中の14CO2検出の簡便方法：突然変異体
の迅速検出への適用（Convenient Method for Detectin
g 14CO2 in Multiple Sample:Application to Rapid Sc
reening for Mutants）」 に述べている方法に従って、各孔から発生する14CO2を
捕捉し、可視化した。活性な分枝鎖２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼを有さない変異株は対照で観察された以上の
Ba14CO3を産生しない。
Ba14CO3形成の結果としてのオートラジオグラム上の
暗色スポットとして示される14CO2陽性分析と、スポッ
トなしまたは非常に淡色のスポットとして示される陰性
分析との対比を改良した、より正確な方法は次の改良検
査方法から成る。
独立コロニー（上記工程４参照）を７〜14日間増殖後
に寒天培地から採取する（２〜３週間ではなく、工程６
と７によって直接検査）。上記方法の工程５は省略す
る。
14CO2放出に関して定量的な性質であるさらに正確な
分析方法は、M9塩培地とグルコース１％および「シンカ
サ（Syncasa）−bcaa」（Ｌ−アミノ酸と適当な組成の
市販のカザミノ酸との合成混合物,L−バリン,L−イソロ
イシンおよびＬ−ロイシンは存在せず、下記参照）0.1
％とから成る適当な培地上での上記検査方法によって検
出された変異株を増殖させることから成る。
高細胞密度に増殖した後に、M9塩培地内で細胞を洗浄
し、超音波処理によってトルエンの乳白色分散系を生じ
た１％トルエン含有冷M9塩培地中に再懸濁させた。細胞
を透過性化するために、細胞／緩衝液／トルエン懸濁液
を30℃において40分間インキュベートした。透過性化細
胞をM9塩培地中で洗浄し、M9培地緩衝液の最初の量の1/
5中に最終的に懸濁させた。この懸濁液180μｌを分析に
用いた。
反応量300μｌはトルエン化細胞、チアミンピロホス
フェート（TPP）0.4mM,補酵素Ａ（CoA）0.11mM,ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレチオド（NAD）0.68mM,ジチオ
スレイトール（DTT）2.6mM,MgCl24.1mM,トリスHCl 60m
M,トリスHCl 60mM（pH7.5），および〔14Ｃ−１〕−２
−オキソイソカプロエート6,000cpm（マイクロキューリ
ー／μmol）を含有した。計数率は73％であった。反応
はバイアルのねじ込みキャップ２×2cmホワットマン（W
ha tman）♯４方形紙を押込んだ、15mlシンチレーシ
ョンバイアル内で実施した。紙は1Mヒアミンヒドロキ
シド（Hyamine Hydroxide）〔メタノール中メチルベン
ズエトニムヒドロキシドの1M溶液、シグマケミカル社
（Sigme Chemical Co.）（ミズーリ63178,セントルイ
ス）から入手可能〕30μｌを含み、反応から発生する14
CO2を捕捉する。２時間インキュベートした後に、紙
をベックマンアクアゾルII〔ユニバーサル（Univeras
l）LSC（液体シンチレーション計数管）、ニューイング
ランドニュークレアーリサーチプロダクツ（New Englan
d Nuclear Research Products），マサチュセッツ0211
8,ボストンから入手可能〕10ml中に浸せきし、この溶液
中で４時間以上平衡させた後に液体シンチレーション計
数管で放射能を測定した。ブランクの対照反応（細胞を
含まず）は約50-300cpmを示した。変異株Ｉ−３および
これと同様な他の変異株はブランク対照反応以下のカウ
ントを示したが、親菌株はブランク対照値よりも数倍高
いカウントを示した。
「シンカサ−bcaa」の組成,100倍濃縮物g/l Ｌ−アラニン 3 Ｌ−アルギニン 4 Ｌ−アスパラギン酸 6 Ｌ−システィン 1 Ｌ−グルタミン酸 20 グリシン 1 Ｌ−ヒスチジン 2 Ｌ−リシン 7 Ｌ−メチオニン 3 Ｌ−フェニルアラニン 6 Ｌ−プロリン 10 Ｌ−セリン 6 Ｌ−スレオニン 4 Ｌ−チロシン 4 Ｌ−トリプトファン 1 混合物をpH7に調節し、フィルター殺菌する。濃縮部
１容量部を培地99容量部に加えて、標準的な使用濃度に
する。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼとアベルメクチ
ンBO−メチルトランスフェラーゼとが欠損したストレプ
トマイセス アベルミチリス7881 （ATCC53567）の二重阻害変異株の調製 工程1.ストレプトマイセス アベルミチリスATCC53567
をニューパッチ寒天培地上の集密的ローンとして、30℃
において12日間増殖させた。このような３プレートから
胞子を回収して、0.05Mトリスマレイン酸緩衝液（pH9.
0）20ml中に懸濁させた。
工程2.胞子懸濁液10mlをＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）10ml含有バイアルに加え
た。このバイアルを28℃において60分間振とうインキュ
ベートし、次に胞子を１％NaCl溶液で充分に洗浄した。
工程3.洗浄した胞子を１％NaCl中に懸濁させ、等量の80
％エチレングリコールを加えた。この懸濁液を−20℃に
おいて保存し、変異株を検出するための細胞ソースとし
て用いた。
この胞子ストックをYPDプレート上に展げて約100コロ
ニー／プレートを得た。ストレプトマイセス アベルミ
チリス菌株Ｉ−３（ATCC53567）の突然変異生成集団
（ニトロソグアニジン処理）コロニーを採取し、次のよ
うに調製した寒天培地上にパッチとして展げた。寒天培
地の調製（g/l）：希薄化殿粉80;K2HPO41;MgSO4・7H2O
1;アルダミンpH5;CaCO35;P−2000 1ml;FeSO4・7H2O0.0
1;MnCl2・4H2O0.001;ZnSO4・7H2O0.001;バクト寒天17;
蒸留水980mlになるまで加える。NaOHによってpHを7.0に
調節してから、121℃において20分間加圧滅菌する。加
圧滅菌後、（±）−２−メチル酪酸の無菌５％ストック
溶液20ml（pH7.0）を加える。
寒天培養物を28℃において８−12日間インキュベート
する。細胞（菌糸体）を寒天表面から採取し、アセトン
250μｌ中に入れる。次にアセトン抽出物25μｌをアナ
ルテクシリカゲル（Analtech Silica Gel）GFプレコー
ト薄層クロマトグラフィープレートにスポットする。溶
媒として酢酸エチルを用いて、クロマトグラムを30〜40
分間展開させ、乾燥し、エタノール中３％バニリンをス
プレーした。このプレートを100℃の乾燥器に１〜３分
間入れ、次にエタノール中３％硫酸をスプレーし、再び
100℃の乾燥器に10-15分間入れた。アベルメクチンBO−
メチルトランスフェラーゼ欠損突然変異株はクロマトグ
ラフィーパターンの変化によって確認する；すなわちア
ベルメクチンＢ成分に相当するスポット（B1とB2のRfは
それぞれ、約0.54と0.42）がまだ存在するが、アベルメ
クチンＡ成分に相当するスポット（A1とA2のRfはそれぞ
れ約0.69と0.58）は存在しない。
一般的高速液体クロマトグラフィ（HPLC）処置 移動相： 水 150ml アセトニトリル 70ml メタノールを加えて、１にする。
カラム： ウルトラスフェア（Ultrasphere）ODS 25cm〔ベック
マンインストル−メンツ（Beckman Instruments）（カ
リフォルニア 92634-3100,フラートン）〕 流量:0.75ml/分 検出：紫外線240nm 減衰：約６ サンプル希釈剤： アセトニトリル35ml＋メタノール390ml 標準： 1.アベルメクチンA2A 0.5mgを10mlフラスコに秤り入
れ、メタノールを10mlまで加える。
2.試験生成物0.5mgを10mlフラスコに秤り入れ、メタノ
ールを10mlまで加える。
１と２は標準ストック溶液である；標準溶液の操作： （１） 100μｌと（２）100μｌをバイアルに入れ、移
動相800μｌを加える サンプル： 1.充分に振とうしたブイヨン1mlを採取し、遠心分離す
る 2.ペレットを損傷しないように、できるだけ多くの上清
を除去する 3.HPLC水100μｌをペレットに加え、混合物を攪拌して
分散させる 4.希釈剤（Ｄ）2mlを加え、充分に混合する 5.混合物を過し、HPLC分析する 前記天然アベルメクチンと非天然アベルメクチンに対
して、このHPLCクロマトグラフィ処置を行い、各アベル
メクチンのピークの保持時間を存在するオリゴマイシン
Ａに観察された保持時間で除した、オリゴマイシンＡは
特定HPLC測定の内部標準として役立つ。オリゴマイシン
Ａはストレプトマイセス アベルミチリス発酵の副生成
物として、HPLCによって殆んど常に観察され、酸RCOOH
（Ｒは前記で定義した通りである）を含まない培地また
は酸RCOOH（Ｒは前記で定義した通りである）に転化可
能な化合物を含まない培地中で培養した場合に前記変異
株が産生する、HPLCで観察される唯一の生成物でわる。
オリゴマイシンＡの保持時間は典型的に12.5-1.4分間で
ある。保持時間（RT）の比はアベルメクチン生成物の同
一性および収率を比較するための重要な根拠を与える。
HPLC上のアベルメクチン生成物の一般的な出現順序はB
2,A2,B1およびA1である。天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） B2b 0.70 B2a 0.84 A2b 0.90 A2a 1.09 B1b 1.40 B1a 1.83 A1b 1.83 A1a 2.42 B1aとA1aが不溶であることに注意する。非天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） シクロペンチルB2 0.94 シクロペンチルA2 1.23 シクロペンチルB1 1.99 シクロペンチルA1 2.62 保持時間は日によって１〜２分間変動し、オリゴマイ
シンＡは一般に約12.5-14分間に変動する。
次の例では、アベルメクチンを特に指示した場合以外
は上記HPLC方法によって測定する。
次の例に用いる培地の組成は下記の通りである：AS-7培地 g/l 希薄化殿粉a 20 アルダミン（Ardamine）pHb ５ アァルマメディア（Pharme media）c 15 CaCO3 ２ a.バチリス リチュニホルミス（Bacillus lichenifor
mis）からのα−アミラーゼ〔ノボエンザイム（Novo En
zymes）（コネティカット州，ウィルトン）から商品名
「ターマル（Termamyl）」として入手可能〕によっ殿粉
から40％±５％に等しいデキストロースへの加水分解に
よって調製。
ｂ イーストプロダクツ社（Yeast Products.Inc.）
（ニュージャーシー07012クリフトン）から ｃ トレーダー プロティン（Trader Protein）（テネ
シー38108,エムフィス）から NaOHによって、pHを7.2に調節する。AP-5培地 g/l 希薄化殿粉 80 アルダミンpH ５ Ｋ2HPO4 １ MgSO4・7H2Ｏ １ NaCl １ CaCO3 ７ FeSO4・7H2Ｏ 0.01 MnCl2・7H2Ｏ 0.001 ZnSO4・7H2Ｏ 0.001 Ｐ−2000（消泡剤）a 1ml/l ａ ダウケミカル社（Dow Chemical Co.）（ミシガン48
640ミッドランド）から 25％NaOHによってpHを6.9に調節する。
（実施例） 例１−４ ストレプトマイセス アベルミチリスＩ−３（ATCC53
567）からのアベルメクチン 胞子形成Ｖ−８プレートからのストレプトマイセス
アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）を500ml−トリプル
バッフルフラスコ（Triple baffled flask）中のAS−７
培地80mlに接種した。このフラスコを回転シェーカー上
で20〜30℃において200rpmで攪拌しながら、インキュベ
ートした。24時間インキュベートした後に、全ブイヨン
の1mlをAP−５培地40ml含有300ml−フラスコに接種し
た。下記の各プライマー化合物（24時間後に添加）400p
pmの存在下、28-30℃において２通りの発酵を実施し
た。
312時間後に、全ブイヨンのサンプル2mlにメタノー
ル：アセトニトリル（390:35）8mlを混合した。過後
に、サンプル50μｌをベックマンウルトラスフェアーOD
Sカラム（30×250mm）に注入した。カラムをメタノー
ル：アセトニトリル：水（89:14:7）によって0.8ml/分
において溶出し、溶出物を240nmにおける紫外線検出法
によって監視した。新規なアベルメクチンの保持時間を
下記に示す： 例５ ストレプトマイセス アベルミチリス7881（ATCC5369
2）からのシクロヘキシルアベルメクチン 培養物ストレプトマイセス アベルミチリス7881（AT
CC53692）の凍結バイアルを500ml−トリプルバッフルフ
ラスコ中にAS−７培地100mlに接種した。このフラスコ
を回転シェーカー上で28〜30℃において200rpmで攪拌し
ながらインキュベートした。28時間インキュベートした
後に、全ブイヨン5mlを500ml−トリプルバッフルフラス
コの新たなAS−７培地100mlに接種した。このフラスコ
を回転シェーカー上で28-30℃において200rpmで攪拌し
ながらインキュベートした。24時間インキュベートした
後に、全ブイヨン1mlをAP−５培地40ml含有300ml−フラ
スコに接種した。このフラスコを28-30℃において200rp
mで攪拌しながらインキュベートした。24時間後にシク
ロヘキサンカルボン酸40ppmを加えた、312時間後にサン
プル2mlを採取し、例１に述べたように、このサンプル
に対して高速度液体クロマトグラフィを行った。このよ
うな条件下で、発酵中に検出されたアベルメクチン成分
のみがシクロヘキシルB2とB1にそれぞれ相当する14.84
（54.9mg/l）および31.46（32.1mg/l）分間に溶出し
た。
例６ ストレプトマイセス アベルミチリス7881（ATCC5369
2）からのsec−ブチルアベルメクチン 例５の方法をくり返したが、この場合にはシクロヘキ
サンカルボン酸の代りに±２−メチル酪酸400ppmを用
い、他の条件は全て例２に述べた条件と同じであった。
sec−ブチルアベルメクチンB2（11.60,12.40分間,63.5,
42.4mg/l）およびsec−ブチルアベルメクチンB1（23.1
分間,105.5mg/l）のみが発酵中に検出された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シーージェン・エドワード・リー アメリカ合衆国コネチカット州ウォーター フォード，ウォータービュー・ドライブ 12 (56)参考文献 米国特許4310519（ＵＳ，Ａ) 米国特許4429042（ＵＳ，Ａ)

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
    およびアベルメクチンBO−メチルトランスフェラーゼ活
    性を有さないが、適当なプライマー酸あるいは発酵の過
    程で該プライマー酸に転化し得る化合物の存在下にアベ
    ルメクチンを産生する能力を有するストロプトマイセス
    アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）。
  2. 【請求項２】その透過性細胞が添加［14Ｃ−１］−２−
    オキソイソカプロン酸から14CO2を発生させることがで
    きないことを特徴とする、特許請求の範囲第１項の、ス
    トロプトマイセス アベルミチリス。
  3. 【請求項３】ストロプトマイセス アベルミチリスATCC
    53692である特許請求の範囲第２項のストロプトマイセ
    ス アベルミチリス。
  4. 【請求項４】分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
    とアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活
    性とを有さないが、適当なプライマー酸あるいは発酵の
    過程で該プライマー酸に転化し得る化合物の存在下にア
    ベルメクチンを産生する能力を有するストロプトマイセ
    ス アベルミチリス菌株、同化可能な、窒素、炭素およ
    び無機塩源を含む水性栄養培地、およびアベルメクチン
    の生合成に利用可能な化合物による好気性発酵からな
    る、Ｒ3が水素である式（Ｉ）のアベルメクチンＢ化合
    物の産生方法。 ［式中、22-23位の破線は任意の二重結合を表す； Ｒ1はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
    のみに存在する； Ｒ2は式： で示される４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−
    Ｌ−オレアンドロシロキシであり、 Ｒは−COOH基が付着した炭素原子に水素以外の少なくと
    も２個の他の原子または基が付着しているα−分枝鎖基
    である。］
  5. 【請求項５】ストロプトマイセス アベルミチリス菌株
    がストロプトマイセス アベルミチリスATCC53692であ
    る特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】化合物が式 Ｒ−COOH ［式中、Ｒは−COOH基が付着した炭素原子に水素以外の
    少なくとも２個の他の原子または基が付着しているα−
    分枝鎖基である］ で示される化合物、または発酵過程中に前記化合物に転
    化可能な化合物である特許請求の範囲第４項記載の方
    法。
  7. 【請求項７】Ｒがα−分枝鎖Ｃ3‐Ｃ8アルキル、アルケ
    ニル、アルキニル、アルコキシアルキルまたはアルキル
    チアオルキル基；アルキル基がα−分枝鎖Ｃ2‐Ｃ5アル
    キル基であるＣ5‐Ｃ8シクロアルキル基；任意にメチレ
    ンまたは１個以上のＣ1‐Ｃ4アルキル基またはハロゲン
    原子によって任意に置換されているＣ3‐Ｃ8シクロアル
    キルまたはＣ5‐Ｃ8シクロアルケニル基；または飽和ま
    たは完全にもしくは部分的に不飽和で、１個以上のＣ1
    ‐Ｃ4アルキル基またはハロゲン原子によって任意に置
    換される、３員〜６員の酸素もしくは硫黄含有複素環で
    ある化合物、または発酵過程中に前記化合物に転化可能
    な化合物である特許請求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】基質RCOOHに転化可能な化合物が式： Ｒ−（CH2）ｎ−Ｚ ［式中、Ｒは前記に定義した通りであり； ｎは0,2,4または６であり； Ｚは−CH2OH、−CHO、−COOR4、−CH2NH2または−CONHR
    5であり； Ｒ4はＨまたは（Ｃ1‐Ｃ6）アルキルであり； Ｒ5はＨ、（Ｃ1‐Ｃ4）アルキル、−CH（COOH）CH2COO
    H、−CH（COOH）（CH2）2COOHまたは−CH（COOH）（C
    H2）2SCH3である］で示される化合物である特許請求の
    範囲第６項記載の方法。
  9. 【請求項９】Ｒがシクロブチル、シクロペンチル、シク
    ロヘキシル、シクロヘプチル、２−メチルシクロプロピ
    ル、３−シクロヘキセニル、１−シクロペンテニル、１
    −シクロヘキセニル、３−メチルシクロヘキシル（シス
    ／トランス）、４−メチレンシクロヘキシル、３−メチ
    ルシクロブチル、３−メチレンシクロブチル、３−シク
    ロペンテニル、１−シクロプロピルエチル、３−フルオ
    ロシクロブチル、4,4−ジフルオロシクロヘキシル、イ
    ソプロピル、sec−ブチル、２−ペンチル、2,3−ジメチ
    ルプロピル、２−ヘキシル、２−ペント−４−エニル、
    ２−メチルチオエチル、Ｓ−２−ペンチル、Ｒ−２−ペ
    ンチル、２−チエニル、３−チエニル、４−テトラヒド
    ロピラニル、３−フリル、２−クロロチエニル、３−テ
    トラヒドロチエニル、４−メチルチオ−２−ブチル、４
    −テトラヒドロチオピラニル、４−メトキシ−２−ブチ
    ルまたは４−メチルチオ−２−ブチルである特許請求の
    範囲第７項記載の方法。
  10. 【請求項１０】Ｒが式： Ｒ−COOH で示されるカルボン酸から誘導される特許請求の範囲第
    ９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】Ｒがシクロペンチル、シクロヘキシルま
    たはチエニルである特許請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】Ｒが発酵過程中にRCOOHに転化し得る化
    合物から誘導される基であり、前記化合物が式： Ｒ−（CH2）ｎ−Ｚ ［式中、Ｒは前記に定義した通りであり； ｎは0,2,4または６であり； Ｚは−CH2OH、−CHO、−COOR4、−CH2NH2または−CONHR
    5であり； Ｒ4は（Ｃ1‐Ｃ6）アルキルであり； Ｒ5は水素、（Ｃ1‐Ｃ4）アルキル、CH（COOH）CH2COO
    H、−CH（COOH）（CH2）2COOHまたは−CH（COOH）（C
    H2）2SCH3である］ で示される化合物である特許請求の範囲第９項記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】Ｒがα−分枝鎖Ｃ3‐Ｃ8アルキル基であ
    るときに、イソプロピルおよび（Ｓ）−sec−ブチル以
    外の基である特許請求の範囲第７項記載の方法。
  14. 【請求項１４】ストロプトマイセス アベルミチリスの
    菌株がストロプトマイセス アベルミチリスATCC53692
    である特許請求の範囲第７項記載の方法。
  15. 【請求項１５】同化可能な、炭素、窒素および無機塩源
    を含む水性栄養培地中好気性条件下発酵させた場合に、
    前記培地が式RCOOH（Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−s
    ec−ブチルである）で示される酸またはストロプトマイ
    セス アベルミチリスによって前記酸に転化可能な化合
    物を含む場合にのみ、前記培地中での発酵時に実質的に
    Ｒ3がＨである下記式（Ｉ）の化合物を産生することが
    できるストロプトマイセス アベルミチリス種に属する
    新規な菌株であって、ストロプトマイセス アベルミチ
    リスATCC53567の突然変異である菌株： ［式中、22-23位の破線は任意の二重結合を表す； Ｒ1はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
    のみに存在する； Ｒ2は式： で示される４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−
    Ｌ−オレアンドロシロキシであり、 Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルであ
    る。］
  16. 【請求項１６】Ｒがシクロヘキシルである請求項11の方
    法。
  17. 【請求項１７】Ｒがシクロヘキシルである請求項12の方
    法。
JP63011881A 1987-01-23 1988-01-23 アベルメクチンｂ化合物の産生方法およびそのための培養物 Expired - Lifetime JPH0817693B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US651287A 1987-01-23 1987-01-23
US6512 1987-01-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS63291576A JPS63291576A (ja) 1988-11-29
JPH0817693B2 true JPH0817693B2 (ja) 1996-02-28

Family

ID=21721247

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63012462A Expired - Lifetime JPH0681757B2 (ja) 1987-01-23 1988-01-22 非天然デメチルアベルメクチン
JP63011881A Expired - Lifetime JPH0817693B2 (ja) 1987-01-23 1988-01-23 アベルメクチンｂ化合物の産生方法およびそのための培養物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63012462A Expired - Lifetime JPH0681757B2 (ja) 1987-01-23 1988-01-22 非天然デメチルアベルメクチン

Country Status (30)

Country Link
EP (2) EP0276103B1 (ja)
JP (2) JPH0681757B2 (ja)
KR (2) KR900004419B1 (ja)
CN (1) CN1056883C (ja)
AR (1) AR241798A1 (ja)
AT (2) ATE96174T1 (ja)
AU (2) AU595673B2 (ja)
BG (1) BG51051A3 (ja)
BR (1) BR8800271A (ja)
CZ (1) CZ279782B6 (ja)
DD (2) DD267512A5 (ja)
DE (2) DE3884973T2 (ja)
DK (2) DK175720B1 (ja)
EG (1) EG18797A (ja)
ES (2) ES2059498T3 (ja)
FI (2) FI90091C (ja)
GR (1) GR3007586T3 (ja)
HU (2) HU201973B (ja)
IE (2) IE61483B1 (ja)
IL (2) IL85118A (ja)
IN (1) IN167980B (ja)
MA (1) MA21160A1 (ja)
MY (1) MY103514A (ja)
NZ (2) NZ223272A (ja)
PL (2) PL156763B1 (ja)
PT (2) PT86583B (ja)
RU (1) RU1806198C (ja)
SK (1) SK279351B6 (ja)
YU (1) YU47878B (ja)
ZA (3) ZA88447B (ja)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806527A (en) * 1987-03-16 1989-02-21 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US4874749A (en) * 1987-07-31 1989-10-17 Merck & Co., Inc. 4"-Deoxy-4-N-methylamino avermectin Bla/Blb
DE3881147T2 (de) * 1987-10-23 1993-09-02 Pfizer Verfahren zur herstellung von aglykonen von avermectin und sie enthaltende kulturen.
GB8807280D0 (en) * 1988-03-26 1988-04-27 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
GB8811036D0 (en) * 1988-05-10 1988-06-15 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB8813760D0 (en) * 1988-06-10 1988-07-13 American Cyanamid Co Chemical process
GB8815967D0 (en) * 1988-07-05 1988-08-10 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
NZ231773A (en) * 1988-12-23 1992-09-25 Merck & Co Inc Avermectin derivatives, preparation and parasiticidal pharmaceutical compositions thereof
NZ231772A (en) * 1988-12-23 1992-11-25 Merck & Co Inc Avermectin derivatives, preparation and parasiticidal compositions thereof
US5015630A (en) * 1989-01-19 1991-05-14 Merck & Co., Inc. 5-oxime avermectin derivatives
US4897383A (en) * 1989-02-13 1990-01-30 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US5252474A (en) * 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
US5057499A (en) * 1989-06-02 1991-10-15 Merck & Co. Inc. Avermectin derivatives
US5030622A (en) * 1989-06-02 1991-07-09 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US5023241A (en) * 1989-07-31 1991-06-11 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US5830875A (en) * 1989-10-30 1998-11-03 Merck & Co., Inc. 24-and 25-substituted avermectin and milbemycin derivatives
JP2888586B2 (ja) * 1990-03-05 1999-05-10 社団法人北里研究所 エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法
US5169839A (en) * 1990-05-11 1992-12-08 Merck & Co., Inc. Derivatives of 3'- and 3"-o-desmethyl avermectin compounds, compositions and methods of treating melmintic and parasitic infections
US5208222A (en) * 1991-03-28 1993-05-04 Merck & Co., Inc. 4"-and 4'-alkylthio avermectin derivatives
US5240915A (en) * 1991-10-15 1993-08-31 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US6103504A (en) * 1992-03-25 2000-08-15 Pfizer Inc. Process for production of avermectins and cultures therefor
US5292647A (en) * 1992-11-30 1994-03-08 Eli Lilly And Company Strain of streptomyces for producing avermectins and processes therewith
CN1038330C (zh) * 1993-07-05 1998-05-13 塞泰克斯公司 阿弗麦菌素的生产与分离
ES2204914T3 (es) * 1993-07-30 2004-05-01 Pfizer Inc. Genes que codifican el complejo alfa cetoacido deshidrogenasa de cadena ramificada de streptomyces avermitilis.
KR100186946B1 (ko) * 1993-10-05 1999-04-01 알렌 제이.스피겔 도라멕틴의 구충활성 중간체 및 도라멕틴의 제조방법
FI942725A (fi) * 1993-12-16 1995-06-17 Pfizer Haaraketjuista alfaketohappodenydrogenaasikompleksia koodaavia geenejä Streptomyces avermitiliksesta
US5701591A (en) * 1995-04-07 1997-12-23 Telecommunications Equipment Corporation Multi-function interactive communications system with circularly/elliptically polarized signal transmission and reception
KR20040099389A (ko) * 1998-02-13 2004-11-26 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 유전자
DE60031126T2 (de) * 1999-08-12 2007-02-08 Pfizer Products Inc., Groton Streptomyces avermitilis gen zum regulieren des verhältnisses der b2:b1 avermectinen
KR100415395B1 (ko) * 2000-08-02 2004-01-16 한국생명공학연구원 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법
EP1476539B1 (en) 2002-02-12 2009-03-25 Pfizer Products Inc. Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins
WO2023203038A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4310519A (en) 1976-04-19 1982-01-12 Merck & Co., Inc. Novel substances and process for their production
US4429042A (en) 1978-09-08 1984-01-31 Merck & Co., Inc. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ188459A (en) * 1977-10-03 1982-09-07 Merck & Co Inc Derivatives of c-076 compounds and pesticidal compositions
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina
GB8606120D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Process

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4310519A (en) 1976-04-19 1982-01-12 Merck & Co., Inc. Novel substances and process for their production
US4429042A (en) 1978-09-08 1984-01-31 Merck & Co., Inc. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
KR900004419B1 (ko) 1990-06-25
FI90088B (fi) 1993-09-15
YU47878B (sh) 1996-05-20
EP0276131A3 (en) 1989-10-25
AU1074288A (en) 1988-07-28
EP0276103B1 (en) 1993-10-20
PL270239A1 (en) 1989-06-26
ATE87927T1 (de) 1993-04-15
HUT47978A (en) 1989-04-28
IL85165A0 (en) 1988-07-31
AU603416B2 (en) 1990-11-15
MY103514A (en) 1993-07-31
PT86584B (pt) 1991-12-31
EP0276103A3 (en) 1989-11-08
DD267512A5 (de) 1989-05-03
FI90091C (fi) 1993-12-27
IL85118A0 (en) 1988-06-30
HU201973B (en) 1991-01-28
GR3007586T3 (ja) 1993-08-31
AR241798A1 (es) 1992-12-30
EP0276131A2 (en) 1988-07-27
PL156764B1 (pl) 1992-04-30
JPS63291576A (ja) 1988-11-29
JPH0681757B2 (ja) 1994-10-19
PL270238A1 (en) 1989-06-26
DK29088A (da) 1988-07-24
ZA88448B (en) 1989-08-30
PT86583B (pt) 1991-12-31
SK40788A3 (en) 1998-10-07
AU1069688A (en) 1988-07-28
FI880281A (fi) 1988-07-24
DK29088D0 (da) 1988-01-22
BR8800271A (pt) 1988-09-06
AU631298B2 (en) 1992-11-19
SK279351B6 (sk) 1998-10-07
EP0276131B1 (en) 1993-04-07
HUT47644A (en) 1989-03-28
EG18797A (en) 1994-06-30
NZ223271A (en) 1991-12-23
IN167980B (ja) 1991-01-19
IE61483B1 (en) 1994-11-02
FI880281A0 (fi) 1988-01-22
DE3884973D1 (de) 1993-11-25
KR880009122A (ko) 1988-09-14
CN88100649A (zh) 1988-10-26
RU1806198C (ru) 1993-03-30
ZA88449B (en) 1989-08-30
FI880280A0 (fi) 1988-01-22
IE880160L (en) 1988-07-23
FI90088C (fi) 1993-12-27
DK28988D0 (da) 1988-01-22
IL85118A (en) 1993-01-31
DE3879975T2 (de) 1993-07-15
IE61066B1 (en) 1994-09-21
DE3879975D1 (de) 1993-05-13
CZ279782B6 (cs) 1995-06-14
ZA88447B (en) 1989-08-30
FI90091B (fi) 1993-09-15
AU595673B2 (en) 1990-04-05
CN1056883C (zh) 2000-09-27
DK175720B1 (da) 2005-02-07
CZ40788A3 (en) 1994-12-15
PT86584A (en) 1988-02-01
PL156763B1 (pl) 1992-04-30
PT86583A (en) 1988-02-01
KR910002225B1 (ko) 1991-04-08
BG51051A3 (en) 1993-01-15
MA21160A1 (fr) 1988-10-01
ATE96174T1 (de) 1993-11-15
IE880161L (en) 1988-07-23
FI880280A (fi) 1988-07-24
KR880009027A (ko) 1988-09-13
EP0276103A2 (en) 1988-07-27
DE3884973T2 (de) 1994-02-17
DK28988A (da) 1988-07-24
AU7111091A (en) 1991-08-08
IL85165A (en) 1992-07-15
JPS63270684A (ja) 1988-11-08
ES2059498T3 (es) 1994-11-16
NZ223272A (en) 1989-12-21
HU200487B (en) 1990-06-28
DD290214A5 (de) 1991-05-23
ES2053719T3 (es) 1994-08-01
YU11988A (en) 1989-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0817693B2 (ja) アベルメクチンｂ化合物の産生方法およびそのための培養物
US5077278A (en) Non-natural demethylavermectins compositions and method of use
AU636709B2 (en) Process for production of avermectins and cultures therefor
US5565359A (en) Cultures for production of B avermectins
US5238848A (en) Cultures for production of avermectins
EP0313297B1 (en) Process for production of avermectin aglycones and cultures therefor
US5583029A (en) Cultures for production of avermectin aglycones
US5387509A (en) Ethylated avermectins
US5525506A (en) Process for production of avermectins and cultures therefor
JP2858951B2 (ja) アベルメクチン類の産生プロセスとそのための培養法
AP64A (en) "Process for production of B avermectins and cultures therefor".

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term