JPH0817693B2 - アベルメクチンb化合物の産生方法およびそのための培養物 - Google Patents
アベルメクチンb化合物の産生方法およびそのための培養物Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
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- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P33/00—Antiparasitic agents
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- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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Description
【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明はアベルメクチンBO−メチルトランスフェラー
ゼ活性および分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
を有さないストロプトマイセス アベルミチリス(Stre
ptomyces avermitilis)、前記ストロプトマイセス
アベルミチリスの産生方法ならびにストロプトマイセス
アベルミチリスを使用して天然および非天然アベルメ
クチンを産生することに関する。
ゼ活性および分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
を有さないストロプトマイセス アベルミチリス(Stre
ptomyces avermitilis)、前記ストロプトマイセス
アベルミチリスの産生方法ならびにストロプトマイセス
アベルミチリスを使用して天然および非天然アベルメ
クチンを産生することに関する。
(従来の技術) 米国特許第4,310,319号および第4,429,042号はアベル
メクチン、強力な抗寄生虫活性を有する関連作用剤の複
合体、およびストロプトマイセス アベルミチリス菌株
すなわちストロプトマイセス アベルミチリスATCC第31
267号,第31271号および第31272号の好気性発酵による
それらの産生について述べている。上記の最後の2菌株
はそれぞれ、ストロプトマイセス アベルミチリスATCC
第31267号の紫外線照射によって得られた培養物を含む
凍結バイアルと凍結乾燥管を表す。
メクチン、強力な抗寄生虫活性を有する関連作用剤の複
合体、およびストロプトマイセス アベルミチリス菌株
すなわちストロプトマイセス アベルミチリスATCC第31
267号,第31271号および第31272号の好気性発酵による
それらの産生について述べている。上記の最後の2菌株
はそれぞれ、ストロプトマイセス アベルミチリスATCC
第31267号の紫外線照射によって得られた培養物を含む
凍結バイアルと凍結乾燥管を表す。
1986年7月16日出願の米国特許出願第886,867号に対
応する、1987年3月18日発行のヨーロッパ特許第214,73
1号は天然または公知のアベルメクチンに関連するが、2
5位置に新規な置換基を有する多くの化合物(ここでは
非天然アベルメクチンと呼ぶ)、およびある特定のカル
ボン酸またはその誘導体もしくはその前駆体の存在下で
のアベルメクチン産生微生物の発酵によるその製造方法
に関する。前記の新規なC−25置換アベルメクチンの製
造に用いられるストロプトマイセス アベルミチリス菌
はストロプトマイセス アベルミチリスATCC31267,3127
1,31272およびNCIB12121である。ヨーロッパ特許第214,
731号に記載されている後者の菌はストロプトマイセス
アベルミチリスATCC31271から誘導されたものであ
る。これを半規定培地中で培養すると、新規なC−25置
換アベルメクチンの収率が改善される。ATCC31267,3127
1,31272およびNCIB12121のそれぞれは、新規なC−25置
換誘導体の他に、C−25置換基がイソプロピルまたは
(S)−sec−ブチル(1−メチルプロピル)である公
知または天然のアベルメクチンをも種々な量で産生す
る。
応する、1987年3月18日発行のヨーロッパ特許第214,73
1号は天然または公知のアベルメクチンに関連するが、2
5位置に新規な置換基を有する多くの化合物(ここでは
非天然アベルメクチンと呼ぶ)、およびある特定のカル
ボン酸またはその誘導体もしくはその前駆体の存在下で
のアベルメクチン産生微生物の発酵によるその製造方法
に関する。前記の新規なC−25置換アベルメクチンの製
造に用いられるストロプトマイセス アベルミチリス菌
はストロプトマイセス アベルミチリスATCC31267,3127
1,31272およびNCIB12121である。ヨーロッパ特許第214,
731号に記載されている後者の菌はストロプトマイセス
アベルミチリスATCC31271から誘導されたものであ
る。これを半規定培地中で培養すると、新規なC−25置
換アベルメクチンの収率が改善される。ATCC31267,3127
1,31272およびNCIB12121のそれぞれは、新規なC−25置
換誘導体の他に、C−25置換基がイソプロピルまたは
(S)−sec−ブチル(1−メチルプロピル)である公
知または天然のアベルメクチンをも種々な量で産生す
る。
アベルメクチンの炭素骨格(下記の式(1)に示す)
は酢酸塩とプロピオン酸塩から誘導され、天然アベルメ
クチンのC−25置換基はL−イソロイシン(R=(S)
−sec−ブチル)またはL−バリン(R=イソプロピ
ル)から誘導される〔フイッシャー(Fisher)とモロジ
ク(Mrozik)の「マクロライド抗生物質(Macrolide An
tibiotics)」アカデミックプレス(Academic Press)
(1984)第14章〕。
は酢酸塩とプロピオン酸塩から誘導され、天然アベルメ
クチンのC−25置換基はL−イソロイシン(R=(S)
−sec−ブチル)またはL−バリン(R=イソプロピ
ル)から誘導される〔フイッシャー(Fisher)とモロジ
ク(Mrozik)の「マクロライド抗生物質(Macrolide An
tibiotics)」アカデミックプレス(Academic Press)
(1984)第14章〕。
「公知」または「天然」とは、25位置の置換基がイソ
プロピルまたは(S)−sec−ブチル(1−メチルプロ
ピル)のいずれかである、ストロプトマイセス アベル
ミチリスATCC31267,ATCC31271およびATCC31272によって
産生されるアベルメクチンを意味する。25位置置換基が
イソプロピルまたはsec−ブチル(S形)以外の基であ
るアベルメクチンをここでは新規または非天然アベルメ
クチンと呼ぶことにする。
プロピルまたは(S)−sec−ブチル(1−メチルプロ
ピル)のいずれかである、ストロプトマイセス アベル
ミチリスATCC31267,ATCC31271およびATCC31272によって
産生されるアベルメクチンを意味する。25位置置換基が
イソプロピルまたはsec−ブチル(S形)以外の基であ
るアベルメクチンをここでは新規または非天然アベルメ
クチンと呼ぶことにする。
上記米国特許に記載されたストロプトマイセス アベル
ミチリス菌株は、この特許に一般にC−076として記載
されている種類の物質を産生する。この種類はC−076A
1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2aおよびB2として表される、
密接に関連した8種類の化合物を含む。「a」シリーズ
の化合物は25位置置換基が(S)−sec−ブチルである
天然アベルメクチンを意味し、「b」シリーズは25位置
置換基がイソプロピルである天然アベルメクチンであ
る。「A」と「B」の名称は5−置換基がそれぞれメト
キシまたはヒドロキシであるアベルメクチンを意味す
る。最後に数字「1」は22-23位置に二重結合が存在す
ることを意味し、数字「2」は22位置に水素を有し、23
位置にヒドロキシを有するアベルメクチンを意味する。
ミチリス菌株は、この特許に一般にC−076として記載
されている種類の物質を産生する。この種類はC−076A
1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2aおよびB2として表される、
密接に関連した8種類の化合物を含む。「a」シリーズ
の化合物は25位置置換基が(S)−sec−ブチルである
天然アベルメクチンを意味し、「b」シリーズは25位置
置換基がイソプロピルである天然アベルメクチンであ
る。「A」と「B」の名称は5−置換基がそれぞれメト
キシまたはヒドロキシであるアベルメクチンを意味す
る。最後に数字「1」は22-23位置に二重結合が存在す
ることを意味し、数字「2」は22位置に水素を有し、23
位置にヒドロキシを有するアベルメクチンを意味する。
本出願では、非天然アベルメクチンの25置換基に関す
るこのような同類体を用いない。同類体A1,A2,B1および
B2は上記天然アベルメクチンの構造特徴に相当する構造
特徴を有する非天然アベルメクチンを意味するように意
図する。
るこのような同類体を用いない。同類体A1,A2,B1および
B2は上記天然アベルメクチンの構造特徴に相当する構造
特徴を有する非天然アベルメクチンを意味するように意
図する。
分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない
突然変異体の発生が枯草菌(Bacillus sulbtiles)〔ヴ
ィレッチ(Willecke)とパルディ−(Pardes)による、
ジェイ.バイオル.ケム.(J.Biol.Chem.)246巻,5264
-72頁(1971)〕とシュードモナス プチダ(Pseudomna
s putida)〔マーチン(Martin)等によるジェイ.バク
テリオロジー(J.Becteriology)115巻,198-204頁(1
973)〕については報告されているが、ストレプトマイ
セスについては報告されていない。
突然変異体の発生が枯草菌(Bacillus sulbtiles)〔ヴ
ィレッチ(Willecke)とパルディ−(Pardes)による、
ジェイ.バイオル.ケム.(J.Biol.Chem.)246巻,5264
-72頁(1971)〕とシュードモナス プチダ(Pseudomna
s putida)〔マーチン(Martin)等によるジェイ.バク
テリオロジー(J.Becteriology)115巻,198-204頁(1
973)〕については報告されているが、ストレプトマイ
セスについては報告されていない。
突然にアベルメクチン アグリコーンズA1aとA2aのみ
を産生する突然変異体である、ストレプトマイセス ア
ベルミチリスAgly−1がシュルマン(Schulman)等のジ
ェイ.アンチバイオト(J.Antibiot)38(11),1494-14
98頁(1985)によって報告されている。アベルメクチン
アグリコーンB成分の産生を増加させるシネフンギン
存在下でのストレプトマイセス アベルミチリスAgly−
1の発酵も報告されている。同様に、O−メチルトラン
スフェラーゼの阻害剤としてのシネフンギン存在下で発
酵させた場合に、アベルメクチン高産生菌であるストレ
プトマイセス アベルミチリス08はアグリコーンのC−
5位置とオレアンドロース二糖成分とにO−メチル基を
有さないアベルメクチンを産生する。
を産生する突然変異体である、ストレプトマイセス ア
ベルミチリスAgly−1がシュルマン(Schulman)等のジ
ェイ.アンチバイオト(J.Antibiot)38(11),1494-14
98頁(1985)によって報告されている。アベルメクチン
アグリコーンB成分の産生を増加させるシネフンギン
存在下でのストレプトマイセス アベルミチリスAgly−
1の発酵も報告されている。同様に、O−メチルトラン
スフェラーゼの阻害剤としてのシネフンギン存在下で発
酵させた場合に、アベルメクチン高産生菌であるストレ
プトマイセス アベルミチリス08はアグリコーンのC−
5位置とオレアンドロース二糖成分とにO−メチル基を
有さないアベルメクチンを産生する。
米国特許第4,378,353号はC−076関連化合物とMA-521
8の培養によるその産生について述べている、MA-5218は
ストレプトマイセス アベルミチリスATCC31272の紫外
線照射によって得られた突然変異株である。この突然変
異株はATCC31780として確認される。前記突然変異株が
産生するC−076関連化合物はC−076フラン環を有さな
い。さらに、報告された化合物のあるものでは、オレア
ンドロース糖成分の一方または両方が開裂するが、他の
化合物では5位置基がケト基に酸化される。
8の培養によるその産生について述べている、MA-5218は
ストレプトマイセス アベルミチリスATCC31272の紫外
線照射によって得られた突然変異株である。この突然変
異株はATCC31780として確認される。前記突然変異株が
産生するC−076関連化合物はC−076フラン環を有さな
い。さらに、報告された化合物のあるものでは、オレア
ンドロース糖成分の一方または両方が開裂するが、他の
化合物では5位置基がケト基に酸化される。
O−メチル基を有さないアベルメクチンを産生するス
トレプトマイセス アベルミチリスの3種類のO−メチ
ルトランスフェラーゼ突然変異株が、ルビー(Ruby)等
による「アクチノマイセテスのバイオロジー(Biology
of Actinomycetes)」に関する第6回国際シンポジウム
(ハンガリーのデブレセンにおいて1985年8月26〜30日
間開催)によって、およびシュルマン等によるアンチマ
イクロビアル エイジェントス アンド ケモセラピー
(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)31巻,7
44−7頁(1987)によって報告されている。最初の種類
はマクロ環式ラクトン環のC−5ヒドロキシルをメチル
化することができないために主としてアベルメクチンB
を産生する。第2の種類は3′−O,3″−O−ビス−デ
メチルアベルメクチン(両オレアンドロース単糖残基の
3位置にO−メチル置換基を有さないアベルメクチン)
を産生する、このアベルメクチンはデメチルアベルメク
チンと呼ばれる。第3の種類は如何なる位置をもメチル
化することができない。
トレプトマイセス アベルミチリスの3種類のO−メチ
ルトランスフェラーゼ突然変異株が、ルビー(Ruby)等
による「アクチノマイセテスのバイオロジー(Biology
of Actinomycetes)」に関する第6回国際シンポジウム
(ハンガリーのデブレセンにおいて1985年8月26〜30日
間開催)によって、およびシュルマン等によるアンチマ
イクロビアル エイジェントス アンド ケモセラピー
(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)31巻,7
44−7頁(1987)によって報告されている。最初の種類
はマクロ環式ラクトン環のC−5ヒドロキシルをメチル
化することができないために主としてアベルメクチンB
を産生する。第2の種類は3′−O,3″−O−ビス−デ
メチルアベルメクチン(両オレアンドロース単糖残基の
3位置にO−メチル置換基を有さないアベルメクチン)
を産生する、このアベルメクチンはデメチルアベルメク
チンと呼ばれる。第3の種類は如何なる位置をもメチル
化することができない。
シュルマン等のフェド.プロク.(Fed.Proc.)44巻,
931頁(1985)は、アベルメクチンBO−メチルトランス
フェラーゼ酵素によるアグリコーン成分のC−5ヒドロ
キシ基のメチル化を阻害する例えばシネフンギン,S−ア
デノシルエチオニンおよびS−アデノシルホモシスティ
ンのような物質の存在下でストレプトマイセス アベル
ミチリスを発酵させることによる、アベルメクチンB産
生の増強を開示している。O−メチルトランスフェラー
ゼ活性を有さず、アベルメクチンB成分の産生量を増強
するストレプトマイセス アベルミチリス変異株はシュ
ルマン等によってアンチマイクロビアル エイジェント
ス アンド ケモセラピー 29巻,620-624頁(1986)に
も言及されている。
931頁(1985)は、アベルメクチンBO−メチルトランス
フェラーゼ酵素によるアグリコーン成分のC−5ヒドロ
キシ基のメチル化を阻害する例えばシネフンギン,S−ア
デノシルエチオニンおよびS−アデノシルホモシスティ
ンのような物質の存在下でストレプトマイセス アベル
ミチリスを発酵させることによる、アベルメクチンB産
生の増強を開示している。O−メチルトランスフェラー
ゼ活性を有さず、アベルメクチンB成分の産生量を増強
するストレプトマイセス アベルミチリス変異株はシュ
ルマン等によってアンチマイクロビアル エイジェント
ス アンド ケモセラピー 29巻,620-624頁(1986)に
も言及されている。
(課題を解決するための手段) ストレプトマイセス アベルミチリスの突然変異生成
によって、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を
有さない突然変異株が生ずる。この突然変異株は、化合
物RCOOH(Rはイソプロピルまたは(S)−sec−ブチ
ル)の存在下で、または発酵過程中にRCOOHに転化しう
る化合物の不在下で、天然アベルメクチンの有意な量を
産生する能力をもはや有さない。しかし、この変異株
が、添加化合物RCOOH(Rはイソプロピルまたは(S)
−sec−ブチルまたはここに開示した他の基である)の
存在下または前記RCOOHの前駆体の存在下で発酵させる
と、天然および非天然のアベルメクチンを産生すること
が全く意外にも発見された。ここに開示した、分枝鎖2
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さずかつL−イソ
ロイシン,L−ロイシンまたはL−バリンを分解すること
のできない変異株が広範囲な化合物をアベルメクチン生
合成経路に同化させて、天然アベルメクチンの存在しな
い非天然アベルメクチンを産生することは、さらに意外
である。
によって、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を
有さない突然変異株が生ずる。この突然変異株は、化合
物RCOOH(Rはイソプロピルまたは(S)−sec−ブチ
ル)の存在下で、または発酵過程中にRCOOHに転化しう
る化合物の不在下で、天然アベルメクチンの有意な量を
産生する能力をもはや有さない。しかし、この変異株
が、添加化合物RCOOH(Rはイソプロピルまたは(S)
−sec−ブチルまたはここに開示した他の基である)の
存在下または前記RCOOHの前駆体の存在下で発酵させる
と、天然および非天然のアベルメクチンを産生すること
が全く意外にも発見された。ここに開示した、分枝鎖2
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さずかつL−イソ
ロイシン,L−ロイシンまたはL−バリンを分解すること
のできない変異株が広範囲な化合物をアベルメクチン生
合成経路に同化させて、天然アベルメクチンの存在しな
い非天然アベルメクチンを産生することは、さらに意外
である。
このようにして産生した単独阻害変異株の突然変異生
成によって、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
とアベルメクチンB−O−メチルトランスフェラーゼ活
性の両方が欠損した変異株が生ずる。前記二重阻害株は
添加化合物RCOOH(Rは上記で定義した通りである)の
存在下で培養した場合に、実質的に天然および非天然ア
ベルメクチンBのみを全く意外にも産生する。
成によって、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
とアベルメクチンB−O−メチルトランスフェラーゼ活
性の両方が欠損した変異株が生ずる。前記二重阻害株は
添加化合物RCOOH(Rは上記で定義した通りである)の
存在下で培養した場合に、実質的に天然および非天然ア
ベルメクチンBのみを全く意外にも産生する。
上記の天然アベルメクチンは密接に関連した8種類の
化合物〔式(1)において、R=イソプロピルまたは
(S)−sec−ブチル〕の複合混合物として産生され
る。これらは実質的に純粋な形で回収されるが(米国特
許第4,429,042号参照)、この方法は結局は困難であ
る。アベルメクチンBは対応するアベルメクチンAより
も大きい駆虫活性を一般に示す。ヨーロッパ特許第214,
731号に述べられた方法による非天然アベルメクチン
(A成分とB成分)の産生によっても、ストレプトマイ
セス アベルミチリス菌の細胞中およびその産生に用い
た培地中に分枝類2−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび
アミノ酸L−バリンおよびL−イソロイシンが存在する
ために、天然アベルメクチンの幾つかが種々な量で産生
される。
化合物〔式(1)において、R=イソプロピルまたは
(S)−sec−ブチル〕の複合混合物として産生され
る。これらは実質的に純粋な形で回収されるが(米国特
許第4,429,042号参照)、この方法は結局は困難であ
る。アベルメクチンBは対応するアベルメクチンAより
も大きい駆虫活性を一般に示す。ヨーロッパ特許第214,
731号に述べられた方法による非天然アベルメクチン
(A成分とB成分)の産生によっても、ストレプトマイ
セス アベルミチリス菌の細胞中およびその産生に用い
た培地中に分枝類2−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび
アミノ酸L−バリンおよびL−イソロイシンが存在する
ために、天然アベルメクチンの幾つかが種々な量で産生
される。
天然または非天然アベルメクチンの生物学的により有
効なB成分のみを産生しうることは、生成物の数と複雑
さを最小にし、これによって特定アベルメクチンの純度
を高め、分離方法を簡単化するために望ましい目的であ
る。
効なB成分のみを産生しうることは、生成物の数と複雑
さを最小にし、これによって特定アベルメクチンの純度
を高め、分離方法を簡単化するために望ましい目的であ
る。
分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない
ストレプトマイセス アベルミチリス菌株、はストレプ
トマイセス アベルミチリスのアベルメクチン産生菌株
の突然変異、特にストレプトマイセス アベルミチリス
ATCC31267,ATCC31271,ATCC31272またはNCIB12121の突然
変異によって生ずる。この突然変異株は、イソプロピル
基またはsec−ブチル基(S形)含有脂肪酸またはその
前駆体を前記突然変異体の発酵培地に加える場合以外
は、天然アベルメクチンを合成することができない。こ
の突然変異株は、適当なプライマー酸または発酵過程中
にこれに転化しうる化合物を含む栄養培地中での水性好
気性条件下で発酵させると、天然および非天然アベルメ
クチンを産生することができる。
ストレプトマイセス アベルミチリス菌株、はストレプ
トマイセス アベルミチリスのアベルメクチン産生菌株
の突然変異、特にストレプトマイセス アベルミチリス
ATCC31267,ATCC31271,ATCC31272またはNCIB12121の突然
変異によって生ずる。この突然変異株は、イソプロピル
基またはsec−ブチル基(S形)含有脂肪酸またはその
前駆体を前記突然変異体の発酵培地に加える場合以外
は、天然アベルメクチンを合成することができない。こ
の突然変異株は、適当なプライマー酸または発酵過程中
にこれに転化しうる化合物を含む栄養培地中での水性好
気性条件下で発酵させると、天然および非天然アベルメ
クチンを産生することができる。
分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない
ことを特徴とする突然変異株は、14CO2分析に基づいて
突然変異生成コロニーから単離される。この方法では、
〔14C−1〕−2−オキソイソカプロン酸または〔14C
−1〕−2−オキソ−3−メチル吉草酸または〔14C−
1〕−2−オキソ−3−メチル酪酸の基質から透過性化
細胞による14CO2発生のないことが、分枝鎖2−オキソ
酸デヒドロゲナーゼ活性の存在しないことを示唆する。
ことを特徴とする突然変異株は、14CO2分析に基づいて
突然変異生成コロニーから単離される。この方法では、
〔14C−1〕−2−オキソイソカプロン酸または〔14C
−1〕−2−オキソ−3−メチル吉草酸または〔14C−
1〕−2−オキソ−3−メチル酪酸の基質から透過性化
細胞による14CO2発生のないことが、分枝鎖2−オキソ
酸デヒドロゲナーゼ活性の存在しないことを示唆する。
ここに述べた分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
性を有さない突然変異株がアベルメクチン、特に非天然
アベルメクチンおよびシネフンギン存在下ではデメチル
アベルメクチンを産生する能力を保有することは、意外
で予想しえないことであった。これらの突然変異株が、
慣習的な培地上で増殖させた場合に、天然の脂肪アシル
補酵素A誘導体を産生できないことは、膜の完全性が前
記誘導体に依存するならばまたは前記突然変異体による
2−オキソ酸蓄積が細胞毒性をもたらすならば、致命的
な突然変異になったであろうと考えられる。さらに、こ
の突然変異体がL−イソロイシンおよびL−バリンの分
解代謝からアセチルCoAおよびプロピオニルCoAを合成し
うることは予想されなかった、これらの合成にはこの突
然変異株に欠けている酵素活性が必要であるからであ
る。上記のアベルメクチン生合成にはこれらのアシルCo
A誘導体が必要であるので、この突然変異株が非天然ア
ベルメクチン産生でひどく損傷することが予想された
が、これは生じなかった。
性を有さない突然変異株がアベルメクチン、特に非天然
アベルメクチンおよびシネフンギン存在下ではデメチル
アベルメクチンを産生する能力を保有することは、意外
で予想しえないことであった。これらの突然変異株が、
慣習的な培地上で増殖させた場合に、天然の脂肪アシル
補酵素A誘導体を産生できないことは、膜の完全性が前
記誘導体に依存するならばまたは前記突然変異体による
2−オキソ酸蓄積が細胞毒性をもたらすならば、致命的
な突然変異になったであろうと考えられる。さらに、こ
の突然変異体がL−イソロイシンおよびL−バリンの分
解代謝からアセチルCoAおよびプロピオニルCoAを合成し
うることは予想されなかった、これらの合成にはこの突
然変異株に欠けている酵素活性が必要であるからであ
る。上記のアベルメクチン生合成にはこれらのアシルCo
A誘導体が必要であるので、この突然変異株が非天然ア
ベルメクチン産生でひどく損傷することが予想された
が、これは生じなかった。
ここに述べる突然変異株に分枝鎖2−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性の存在しないことは、分枝鎖脂肪アシル
CoA合成をL−イソロイシン,L−ロイシンおよびL−バ
リンの分解から保護することになり、そのために、酸R
−COOH(Rは(S)sec−ブチルまたはイソプロピルで
ある)またはこれの前駆体を発酵培地に加える場合以外
は、天然アベルメクチンの合成を特に保護することにな
る。さらに、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
欠損変異株が突然変異を起こすと、付加的にアベルメク
チンBO−メチルトランスフェラーゼ活性が欠損した変異
株が形成される。アベルメクチンBO−メチルトランスフ
ェラーゼ活性を有さない変異株はアベルメクチンのアグ
リコーン成分のC−5酸素をメチル化することができな
い。このような活性が欠損した変異株はAアベルメクチ
ン産生を阻害して、本質的にアベルメクチンBのみを産
生する。
ロゲナーゼ活性の存在しないことは、分枝鎖脂肪アシル
CoA合成をL−イソロイシン,L−ロイシンおよびL−バ
リンの分解から保護することになり、そのために、酸R
−COOH(Rは(S)sec−ブチルまたはイソプロピルで
ある)またはこれの前駆体を発酵培地に加える場合以外
は、天然アベルメクチンの合成を特に保護することにな
る。さらに、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
欠損変異株が突然変異を起こすと、付加的にアベルメク
チンBO−メチルトランスフェラーゼ活性が欠損した変異
株が形成される。アベルメクチンBO−メチルトランスフ
ェラーゼ活性を有さない変異株はアベルメクチンのアグ
リコーン成分のC−5酸素をメチル化することができな
い。このような活性が欠損した変異株はAアベルメクチ
ン産生を阻害して、本質的にアベルメクチンBのみを産
生する。
本発明は、形質転換、形質導入、遺伝的組換えまたは
他の何らかの遺伝的方法によって、ここに述べた細菌種
からの核酸もしくは同等な物質を用いて発生させ、それ
によってここに述べた変異株の特徴を獲得させた微生物
をも包含する。
他の何らかの遺伝的方法によって、ここに述べた細菌種
からの核酸もしくは同等な物質を用いて発生させ、それ
によってここに述べた変異株の特徴を獲得させた微生物
をも包含する。
ここで用いる「アベルメクチン」または「アベルメク
チン類」なる用語は、25置換基(R)が本発明のトレプ
トマイセス アベルミチリスによって前記位置に同化し
うる基である。下記の式(1)で示される化合物を意味
する。
チン類」なる用語は、25置換基(R)が本発明のトレプ
トマイセス アベルミチリスによって前記位置に同化し
うる基である。下記の式(1)で示される化合物を意味
する。
ここに述べる突然変異株はここに開示し、ここに例示
する方法によって非天然デメチルアベルメクチンを製造
するために非常に貴重である。これらの突然変異株は好
ましいデメチルアベルメクチン、すなわちC−25置換基
がC1‐C4アルキル基によって任意に置換されたC4‐
C6シクロアルキルもしくはシクロアルケニル基、1−
メチルチオエチルまたは5員もしくは6員の酸素もしく
は硫黄含有複素環基、特に3−チエニルまたは3−フリ
ルである化合物の製造にとって特に貴重である。
する方法によって非天然デメチルアベルメクチンを製造
するために非常に貴重である。これらの突然変異株は好
ましいデメチルアベルメクチン、すなわちC−25置換基
がC1‐C4アルキル基によって任意に置換されたC4‐
C6シクロアルキルもしくはシクロアルケニル基、1−
メチルチオエチルまたは5員もしくは6員の酸素もしく
は硫黄含有複素環基、特に3−チエニルまたは3−フリ
ルである化合物の製造にとって特に貴重である。
ストレプトマイセス アベルミチリス種のアベルメク
チン産生菌の突然変異は、紫外線照射,X線照射,N−メチ
ル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン,エチルメ
タンスルホネート,亜硝酸およびナイトロジェンマスタ
ード、例えばN−メチルビス(2−クロロエチル)アミ
ン、または同様な処置を含む、様々な突然変異誘発剤を
用いる公知の方法によって実施される。突然変異誘発
は、例えばストレプトマイセス アベルミチリスATCC31
272のような、天然アベルメクチンを産生しうるストレ
プトマイセス アベルミチリスの胞子または増殖性培養
物に対して行われる。
チン産生菌の突然変異は、紫外線照射,X線照射,N−メチ
ル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン,エチルメ
タンスルホネート,亜硝酸およびナイトロジェンマスタ
ード、例えばN−メチルビス(2−クロロエチル)アミ
ン、または同様な処置を含む、様々な突然変異誘発剤を
用いる公知の方法によって実施される。突然変異誘発
は、例えばストレプトマイセス アベルミチリスATCC31
272のような、天然アベルメクチンを産生しうるストレ
プトマイセス アベルミチリスの胞子または増殖性培養
物に対して行われる。
当業者に周知の方法に従って、特定の〔14C−1〕−
2−オキソ分枝鎖酸から14CO2を放出する、無作為に突
然変異を誘発した多数の細菌コロニーを検出しうる生化
学的分析方法に基づいて、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼの欠損に関して突然変異誘発コロニーを選択す
る〔タボール(Tabor)等、ジェイ.バクト.(J.Bac
t.)128巻,485-486頁(1976)〕。
2−オキソ分枝鎖酸から14CO2を放出する、無作為に突
然変異を誘発した多数の細菌コロニーを検出しうる生化
学的分析方法に基づいて、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼの欠損に関して突然変異誘発コロニーを選択す
る〔タボール(Tabor)等、ジェイ.バクト.(J.Bac
t.)128巻,485-486頁(1976)〕。
この方法は、マイクロタイタープレートの孔中の適当
な栄養培地上で突然変異株コロニーを増殖させる;細胞
にトルエンを透過させる;次に各孔に〔14C−1〕−2
−オキソ酸(例えば2−オキソイソカプロン酸)を加
え、発酵上の雰囲気を14CO2に関して検査することから
成る。また、〔14C−1〕−2−オキソ−イソカプロン
酸の代りに、〔14C−1〕−2−オキソ−メチル吉草酸
または〔14C−1〕−2−オキソ−3−メチル酪酸を用
いることができる。湿ったBa(OH)2飽和紙を各孔の
上において放出14CO2を捕捉して、Ba14CO3(存在する場
合には)をオートラジオグラフィによって検出すること
によって、14CO2の発生が簡単に調べられる。分枝鎖2
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない突然変異株
はブランク対照に大体等しいオートラジオグラムを示
す;すなわち、Ba14CO3はこの突然変異株によって産生
されない。
な栄養培地上で突然変異株コロニーを増殖させる;細胞
にトルエンを透過させる;次に各孔に〔14C−1〕−2
−オキソ酸(例えば2−オキソイソカプロン酸)を加
え、発酵上の雰囲気を14CO2に関して検査することから
成る。また、〔14C−1〕−2−オキソ−イソカプロン
酸の代りに、〔14C−1〕−2−オキソ−メチル吉草酸
または〔14C−1〕−2−オキソ−3−メチル酪酸を用
いることができる。湿ったBa(OH)2飽和紙を各孔の
上において放出14CO2を捕捉して、Ba14CO3(存在する場
合には)をオートラジオグラフィによって検出すること
によって、14CO2の発生が簡単に調べられる。分枝鎖2
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない突然変異株
はブランク対照に大体等しいオートラジオグラムを示
す;すなわち、Ba14CO3はこの突然変異株によって産生
されない。
このようにして得られた突然変異株に上記の突然変異
誘発剤を用いて、さらに突然変異を誘発する。突然変異
誘発コロニーを添加前駆体(例えば、2−メチル酪酸)
の存在下での発酵後に、クロマトグラフィ(薄層クロマ
トグラフィまたは高速液体クロマトグラフィ)によっ
て、アベルメクチンBO−メチルトランスフェラーゼ活性
の欠損に関して検査する。このような突然変異株の発酵
ブイヨンには、アベルメクチンA化合物が本質的に存在
しない。
誘発剤を用いて、さらに突然変異を誘発する。突然変異
誘発コロニーを添加前駆体(例えば、2−メチル酪酸)
の存在下での発酵後に、クロマトグラフィ(薄層クロマ
トグラフィまたは高速液体クロマトグラフィ)によっ
て、アベルメクチンBO−メチルトランスフェラーゼ活性
の欠損に関して検査する。このような突然変異株の発酵
ブイヨンには、アベルメクチンA化合物が本質的に存在
しない。
特定菌株の好ましい対立遺伝子の突然変異誘発による
生地の他に、1つの菌株中に生成し固定された対立遺伝
子の他の菌株の染色体中への導入が、原形質体融合によ
って可能になる。例えば、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼとアベルメクチンBO−メチルトランスフェラー
ゼとが欠損したストレプトマイセン アベルミチリス菌
株は前記活性を有するストレプトマイセス アベルミチ
リス菌株との原形質体融合によって、アベルメクチンBO
−メチルトランスフェラーゼ活性のみが欠損したストレ
プトマイセス アベルミチリス菌株を生成することがで
きる。当業者に自明であるように、原形質体融合法によ
って、特定の分岐ラインからの好ましい対立遺伝子を単
菌株に結合させることができる。
生地の他に、1つの菌株中に生成し固定された対立遺伝
子の他の菌株の染色体中への導入が、原形質体融合によ
って可能になる。例えば、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼとアベルメクチンBO−メチルトランスフェラー
ゼとが欠損したストレプトマイセン アベルミチリス菌
株は前記活性を有するストレプトマイセス アベルミチ
リス菌株との原形質体融合によって、アベルメクチンBO
−メチルトランスフェラーゼ活性のみが欠損したストレ
プトマイセス アベルミチリス菌株を生成することがで
きる。当業者に自明であるように、原形質体融合法によ
って、特定の分岐ラインからの好ましい対立遺伝子を単
菌株に結合させることができる。
ここに述べる突然変異株の方法論的および培養上の特
徴は、一般に米国特許第4,429,042号に述べられている
通りである。この突然変異株の明確な特徴は分枝鎖2−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないことであり、
この特徴は上述のようにして検出される。この活性が存
在しないと、突然変異体は脂肪酸RCOOH(Rはイソプロ
ピルまたは(S)−sec−ブチルである)または発酵中
に前記RCOOHに転化しうる化合物を実質的に含まない規
定(defined)培地上で増殖させたときに、天然アベル
メクチンを産生することができない。アメリカン タイ
プ カルチャー コレクション(American Type Cultur
e Collection)によって実施した分類学的研究(taxono
mic investigation)は、上記14CO2分析によって選択し
た、2種類の突然変異株I−3とHL-026の特徴が米国特
許第4,429,042号に述べられているATCC31272親菌株の特
徴に密接に関係する(若干の例外にあるが)ことを実証
した。従って、突然変異株I−3(ATCC53567)はATCC3
1272よりも有意に少ない胞子を形成する。出願人による
実験では、ラフィノースは1−3の増殖を支持するよう
に見えなかった。米国特許第4,429,042号では、単独元
素源としてスクロースを用いてATCC31272の突然変異株
の増殖を検出することができなかった。突然変異株I−
3は分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さな
い。本発明の二重欠損変異株すなわち突然変異株I−3
(ATCC53567)のさらに突然変異生成によって生じた、
分枝鎖2−オキソ酸デヒトラゲナーゼ活性とアベルメク
チンBO−メチルトランスフェラーゼ活性とを有さないス
トレプトマイセス アベルミチリス7881は、突然変異株
I−3と同様な、ATCC31272に対する分類学的関係を有
する。
徴は、一般に米国特許第4,429,042号に述べられている
通りである。この突然変異株の明確な特徴は分枝鎖2−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないことであり、
この特徴は上述のようにして検出される。この活性が存
在しないと、突然変異体は脂肪酸RCOOH(Rはイソプロ
ピルまたは(S)−sec−ブチルである)または発酵中
に前記RCOOHに転化しうる化合物を実質的に含まない規
定(defined)培地上で増殖させたときに、天然アベル
メクチンを産生することができない。アメリカン タイ
プ カルチャー コレクション(American Type Cultur
e Collection)によって実施した分類学的研究(taxono
mic investigation)は、上記14CO2分析によって選択し
た、2種類の突然変異株I−3とHL-026の特徴が米国特
許第4,429,042号に述べられているATCC31272親菌株の特
徴に密接に関係する(若干の例外にあるが)ことを実証
した。従って、突然変異株I−3(ATCC53567)はATCC3
1272よりも有意に少ない胞子を形成する。出願人による
実験では、ラフィノースは1−3の増殖を支持するよう
に見えなかった。米国特許第4,429,042号では、単独元
素源としてスクロースを用いてATCC31272の突然変異株
の増殖を検出することができなかった。突然変異株I−
3は分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さな
い。本発明の二重欠損変異株すなわち突然変異株I−3
(ATCC53567)のさらに突然変異生成によって生じた、
分枝鎖2−オキソ酸デヒトラゲナーゼ活性とアベルメク
チンBO−メチルトランスフェラーゼ活性とを有さないス
トレプトマイセス アベルミチリス7881は、突然変異株
I−3と同様な、ATCC31272に対する分類学的関係を有
する。
ストレプトマイセス アベルミチリスI−3と7881は
ブタベスト条約の条件下で、アメリカンタイプ カルチ
ャー コレクション(メリーランド州,ロックビル)に
寄託された、この機関は永久的な寄託を可能にする公認
の受託所であり、この出願に特許権が付与された場合に
は公衆に容易に入手可能になる。これらの菌株はそれぞ
れストレプトマイセス アベルミチリスATCC53567と535
68なる名称を与えられている。この寄託は、この出願の
審査中はアメリカ合衆国特許庁の特許局長が37CFR1.14
および35USC122の下に、およびこの出願の対応物または
その後継物を出願した国の特許法に従って、資格がある
と判定した人に利用可能である。寄託した微生物の公衆
への利用可能性に対する全ての制限は、特許の付与時に
変更不能に除去される。
ブタベスト条約の条件下で、アメリカンタイプ カルチ
ャー コレクション(メリーランド州,ロックビル)に
寄託された、この機関は永久的な寄託を可能にする公認
の受託所であり、この出願に特許権が付与された場合に
は公衆に容易に入手可能になる。これらの菌株はそれぞ
れストレプトマイセス アベルミチリスATCC53567と535
68なる名称を与えられている。この寄託は、この出願の
審査中はアメリカ合衆国特許庁の特許局長が37CFR1.14
および35USC122の下に、およびこの出願の対応物または
その後継物を出願した国の特許法に従って、資格がある
と判定した人に利用可能である。寄託した微生物の公衆
への利用可能性に対する全ての制限は、特許の付与時に
変更不能に除去される。
ストレプトマイセス アベルミチリスATCC31267,ATCC
31271,ATCC31272およびNCIB12121はそれぞれ、式
(1): 〔式中、22-23位置の破線は任意の二重結合を表す; R1はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
のみに存在する; R2は式: で示される4′−(α−L−オレアンドロシル)−α−
L−オレアンドロシロキシであり、 R3は水素またはメチルであり、 Rはイソプロピルまたは(S)−sec−ブチルである〕 によって示される化合物を産生する。米国特許第4,285,
963号は25位置がメチル基またはエチル基によって置換
され、R1がヒドロキシであり、R3がメチルである式
(1)のアベルメクチンを述べている。
31271,ATCC31272およびNCIB12121はそれぞれ、式
(1): 〔式中、22-23位置の破線は任意の二重結合を表す; R1はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
のみに存在する; R2は式: で示される4′−(α−L−オレアンドロシル)−α−
L−オレアンドロシロキシであり、 R3は水素またはメチルであり、 Rはイソプロピルまたは(S)−sec−ブチルである〕 によって示される化合物を産生する。米国特許第4,285,
963号は25位置がメチル基またはエチル基によって置換
され、R1がヒドロキシであり、R3がメチルである式
(1)のアベルメクチンを述べている。
上記の非天然アベルメクチンでは、Rはイソプロピル
または(S)−sec−ブチル以外の置換基であり、下記
のように定義される。
または(S)−sec−ブチル以外の置換基であり、下記
のように定義される。
式(1)化合物の生合成に用いる重要な化合物はスト
レプトマイセス アベルミチリスの細胞中および培地中
に生成する。これらの化合物はL−バリンとL−イソロ
イシンの分解から、または分枝鎖2−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼによる2−オキソ酸の脱炭酸により対応2−オ
キソ酸から、同時に生成物を補酵素Aと結合させること
によって得られる。これらの存在は式(1)のイソプロ
ピル化合物と(S)−sec−ブチル化合物の両方が同時
に生成する原因となる。これは当然、(S)−sec−ブ
チル誘導体からイソプロピル誘導体を分離するという問
題を招く。
レプトマイセス アベルミチリスの細胞中および培地中
に生成する。これらの化合物はL−バリンとL−イソロ
イシンの分解から、または分枝鎖2−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼによる2−オキソ酸の脱炭酸により対応2−オ
キソ酸から、同時に生成物を補酵素Aと結合させること
によって得られる。これらの存在は式(1)のイソプロ
ピル化合物と(S)−sec−ブチル化合物の両方が同時
に生成する原因となる。これは当然、(S)−sec−ブ
チル誘導体からイソプロピル誘導体を分離するという問
題を招く。
本発明の変異株は、適当なプライマー化合物を含む栄
養培地中で発酵させると、式(1)の化合物または、よ
り通常の場合には、式(1)の2種類の化合物(Rは使
用プライマー化合物に相当する)の混合物を産生する。
米国特許第4,429,042号に用いられている名称によると
R−アベルメクチンB1とB2と便宜的かつ慣用的に呼ばれ
る、2種類までの化合物が産生される。R基は当然、C
−25置換基を意味する。例えば、Rがシクロペンチルで
ある場合には、2種類の可能なアベルメクチンが存在す
る: 非天然アベルメクチンでは、式(1)のC−25置換基
「R」はイソプロピルまたは(S)−sec−ブチル以外
の基である。
養培地中で発酵させると、式(1)の化合物または、よ
り通常の場合には、式(1)の2種類の化合物(Rは使
用プライマー化合物に相当する)の混合物を産生する。
米国特許第4,429,042号に用いられている名称によると
R−アベルメクチンB1とB2と便宜的かつ慣用的に呼ばれ
る、2種類までの化合物が産生される。R基は当然、C
−25置換基を意味する。例えば、Rがシクロペンチルで
ある場合には、2種類の可能なアベルメクチンが存在す
る: 非天然アベルメクチンでは、式(1)のC−25置換基
「R」はイソプロピルまたは(S)−sec−ブチル以外
の基である。
二重結合が存在し、OHが存在しない式(1)の化合物
は、この代りに、R1がOHであり、二重結合が存在しな
い式(1)の対応化合物から脱水反応によって製造され
る。この反応は例えばt−ブチルジメチルシリルオキン
アセチル誘導体として、5および4″位置のヒドロキシ
基を最初に選択的に保護し、次に例えば(4−メチルフ
ェノキシ)チオカルボニルクロリドのような、置換チオ
カルボニルハライドと反応させ、次に例えばトリクロロ
ベンゼンのような高沸点溶媒中で加熱することによって
脱水させることによって行われる。最後に、生成物を脱
保護して、不飽和化合物を得る。これらの工程は適当な
試薬と反応条件とともに、米国特許第4,328,335号に述
べられている。
は、この代りに、R1がOHであり、二重結合が存在しな
い式(1)の対応化合物から脱水反応によって製造され
る。この反応は例えばt−ブチルジメチルシリルオキン
アセチル誘導体として、5および4″位置のヒドロキシ
基を最初に選択的に保護し、次に例えば(4−メチルフ
ェノキシ)チオカルボニルクロリドのような、置換チオ
カルボニルハライドと反応させ、次に例えばトリクロロ
ベンゼンのような高沸点溶媒中で加熱することによって
脱水させることによって行われる。最後に、生成物を脱
保護して、不飽和化合物を得る。これらの工程は適当な
試薬と反応条件とともに、米国特許第4,328,335号に述
べられている。
R1がHであり、二重結合が存在しない式(1)化合
物は二重結合が存在し、R1が存在しない対応化合物か
ら適当な触媒を用いる選択的接触水素化によって製造す
ることができる。例えば、ヨーロッパ特許出願公報第00
01689号およびそれに対応する米国特許第4,199,569号
(1980年4月22日発行)に述べられているように、トリ
ス(トリフェニルホスフィン)ロジウム(I)クロリド
を用いて還元が行われる。
物は二重結合が存在し、R1が存在しない対応化合物か
ら適当な触媒を用いる選択的接触水素化によって製造す
ることができる。例えば、ヨーロッパ特許出願公報第00
01689号およびそれに対応する米国特許第4,199,569号
(1980年4月22日発行)に述べられているように、トリ
ス(トリフェニルホスフィン)ロジウム(I)クロリド
を用いて還元が行われる。
R2がHである式(1)の化合物は、R2が4′−(α
−L−オレアンドロシル)−α−L−オレアンドロシロ
キシである対応化合物から、水性有機溶媒中での酸によ
る緩和な加水分解によって4′−(α−L−オレアンド
ロシル)−α−L−オレアンドロース基を除去して13位
置にヒドロキシ基を有するアグリコーンを得ることによ
って製造される。次にこのアグリコーンを例えばベンゼ
ンスルホニルハライドとの反応によってハロゲン化し
て、13−デオキシ−13−ハロ誘導体を形成し、最後にこ
れを例えば水素化トリブチルスズを用いて選択的に還元
する。好ましくない副反応を避けるために、存在する他
のヒドロキシ基を例えばtert−ブチルジメチルシリル基
によって保護することが望ましい。この保護基は次に微
量の酸を含むメタノールによる処理によって、ハロゲン
化または還元後に容易に除去される。これらの工程は全
て、その実施のために適当な試薬および反応条件ととも
に、ヨーロッパ特許出願公報第0002615号に述べられて
いる。
−L−オレアンドロシル)−α−L−オレアンドロシロ
キシである対応化合物から、水性有機溶媒中での酸によ
る緩和な加水分解によって4′−(α−L−オレアンド
ロシル)−α−L−オレアンドロース基を除去して13位
置にヒドロキシ基を有するアグリコーンを得ることによ
って製造される。次にこのアグリコーンを例えばベンゼ
ンスルホニルハライドとの反応によってハロゲン化し
て、13−デオキシ−13−ハロ誘導体を形成し、最後にこ
れを例えば水素化トリブチルスズを用いて選択的に還元
する。好ましくない副反応を避けるために、存在する他
のヒドロキシ基を例えばtert−ブチルジメチルシリル基
によって保護することが望ましい。この保護基は次に微
量の酸を含むメタノールによる処理によって、ハロゲン
化または還元後に容易に除去される。これらの工程は全
て、その実施のために適当な試薬および反応条件ととも
に、ヨーロッパ特許出願公報第0002615号に述べられて
いる。
本発明のストレプトマイセス アベルミチリスによっ
て式(1)のデメチルアベルメクチンの生合成に用いる
ことのできる化合物は式(II−A): RCOOH (II−A) で示される化合物および発酵過程中に(II−A)に転化
できる化合物である。前記化合物をここでは「プライマ
ー化合物」と呼ぶ。式(II−A)では、Rはα−分枝鎖
基であり、−COOHが付着した、この基の炭素原子は水素
以外の少なくとも2個の他の原子または基にも結合す
る。この定義は当然、非環式鎖または環の要素としての
硫黄もしくは酸素のヘテロ原子を任意に含む飽和および
不飽和の非環式基および環式基を含む。
て式(1)のデメチルアベルメクチンの生合成に用いる
ことのできる化合物は式(II−A): RCOOH (II−A) で示される化合物および発酵過程中に(II−A)に転化
できる化合物である。前記化合物をここでは「プライマ
ー化合物」と呼ぶ。式(II−A)では、Rはα−分枝鎖
基であり、−COOHが付着した、この基の炭素原子は水素
以外の少なくとも2個の他の原子または基にも結合す
る。この定義は当然、非環式鎖または環の要素としての
硫黄もしくは酸素のヘテロ原子を任意に含む飽和および
不飽和の非環式基および環式基を含む。
さらに詳しくは、C−25位置基になるRはα−分枝鎖
C3‐C8アルキル,アルケニル,アルキニル,アルコキ
シアルキルまたはアルキルチオアルキル基;アルキル基
がα−分枝鎖C2‐C5アルキル基であるC5‐C8シクロ
アルキルアルキル基;メチレンまたは1個以上のC1‐
C4アルキルもしくはハロゲン原子(フルオロ,クロ
ロ,ヨードもしくはブロム)によって任意に置換するこ
とのできるC3‐C8シクロアルキルまたはC5‐C8シク
ロアルケニル基;1個以上のC1‐C4アルキル基もしくは
ハロゲン原子によって任意に置換することのできる、飽
和なまたは完全にもしくは部分的に不飽和な、3員〜6
員の酸素もしくは硫黄含有複素環式基である。
C3‐C8アルキル,アルケニル,アルキニル,アルコキ
シアルキルまたはアルキルチオアルキル基;アルキル基
がα−分枝鎖C2‐C5アルキル基であるC5‐C8シクロ
アルキルアルキル基;メチレンまたは1個以上のC1‐
C4アルキルもしくはハロゲン原子(フルオロ,クロ
ロ,ヨードもしくはブロム)によって任意に置換するこ
とのできるC3‐C8シクロアルキルまたはC5‐C8シク
ロアルケニル基;1個以上のC1‐C4アルキル基もしくは
ハロゲン原子によって任意に置換することのできる、飽
和なまたは完全にもしくは部分的に不飽和な、3員〜6
員の酸素もしくは硫黄含有複素環式基である。
発酵過程中にRCOOHに転化可能な化合物;すなわち前
駆体は式(II−B): R−(CH2)n−Z (II−B) 〔式中、Rは上記で定義した通りであり;nは0,2,4ま
たは6であり; Zは−CH2OH,−CHO,−CH2N2,−COOR4または−CONHR
5であり; R4はHまたは(C1‐C6)アルキルであり; R5は水素,(C1‐C4)アルキル,またはアミノ酸
残基,特にアスパラギン酸,グルタミン酸およびメチオ
ニンの残基、例えば−CH(COOH)CH2COOH,−CH(COOH)
(CH2)2COOH,および−CH(COOH)(CH2)2SCH3であ
る〕 で示される化合物である。
駆体は式(II−B): R−(CH2)n−Z (II−B) 〔式中、Rは上記で定義した通りであり;nは0,2,4ま
たは6であり; Zは−CH2OH,−CHO,−CH2N2,−COOR4または−CONHR
5であり; R4はHまたは(C1‐C6)アルキルであり; R5は水素,(C1‐C4)アルキル,またはアミノ酸
残基,特にアスパラギン酸,グルタミン酸およびメチオ
ニンの残基、例えば−CH(COOH)CH2COOH,−CH(COOH)
(CH2)2COOH,および−CH(COOH)(CH2)2SCH3であ
る〕 で示される化合物である。
本発明には、式(II−A)化合物の異性体形、発酵過
程中にそれに転化可能な化合物およびここに述べる方法
への使用から生ずるC−25における異性体アベルメクチ
ンをも含む。
程中にそれに転化可能な化合物およびここに述べる方法
への使用から生ずるC−25における異性体アベルメクチ
ンをも含む。
本発明の方法は、窒素,炭素,無機塩および式RCOOH
で示される化合物または発酵過程中に前記化合物に転化
可能な化合物(すなわち前駆体)の同化可能なソースを
含む水性栄養培地中で、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性とアベルメクチンB−O−メチルトランスフ
ェラーゼ活性とを有さないストレプトマイセス アベル
ミチリス菌株による好気性発酵によって実施する。接種
時にまたは発酵中に時々、酸または酸に転化可能な化合
物を発酵に加える。これは一度に全部、または発酵中に
間隔をおいて加える。発酵からサンプルを採取し、有機
溶媒で抽出し、例えば高速液体クロマトグラフィを用い
たクロマトグラフィによる生成物の表示に従って、アベ
ルメクチン生成物の産生を監視することができる。生成
物の収量が最大になるまで、一般には4〜15日間インキ
ュベーションを続ける。
で示される化合物または発酵過程中に前記化合物に転化
可能な化合物(すなわち前駆体)の同化可能なソースを
含む水性栄養培地中で、分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性とアベルメクチンB−O−メチルトランスフ
ェラーゼ活性とを有さないストレプトマイセス アベル
ミチリス菌株による好気性発酵によって実施する。接種
時にまたは発酵中に時々、酸または酸に転化可能な化合
物を発酵に加える。これは一度に全部、または発酵中に
間隔をおいて加える。発酵からサンプルを採取し、有機
溶媒で抽出し、例えば高速液体クロマトグラフィを用い
たクロマトグラフィによる生成物の表示に従って、アベ
ルメクチン生成物の産生を監視することができる。生成
物の収量が最大になるまで、一般には4〜15日間インキ
ュベーションを続ける。
プライマー化合物(カルボン酸またはカルボン酸に転
化可能な化合物)の各添加の好ましいレベルは0.05〜3.
0g/lの範囲である。プライマー化合物は連続的、間欠的
にまたは一度に全部を発酵に加えることができる。酸は
そのものとして、または例えばナトリウム,リチウムも
しくはアンモニウム塩のような塩として、または上記で
定義したような酸に転化可能な化合物として加える。酸
が固体である場合には、酸を水または(C1‐C4)アル
コールのような適当な溶媒に溶解するのが好ましい。
化可能な化合物)の各添加の好ましいレベルは0.05〜3.
0g/lの範囲である。プライマー化合物は連続的、間欠的
にまたは一度に全部を発酵に加えることができる。酸は
そのものとして、または例えばナトリウム,リチウムも
しくはアンモニウム塩のような塩として、または上記で
定義したような酸に転化可能な化合物として加える。酸
が固体である場合には、酸を水または(C1‐C4)アル
コールのような適当な溶媒に溶解するのが好ましい。
発酵に用いる培地は、特にC−25置換基がイソプロピ
ルまたは(S)−sec−ブチルである場合には、同化可
能な炭素,窒素および微量元素源を含む慣習的培地であ
る。C−25置換基が非天然基である場合、すなわちイソ
プロピルまたは(S)−sec−ブチル以外の基である場
合には、発酵培地は特定成分が欠損しているまたはR基
がイソプロピルまたは(S)−sec−ブチルであるプラ
イマー化合物の少量のみを含む培地である。
ルまたは(S)−sec−ブチルである場合には、同化可
能な炭素,窒素および微量元素源を含む慣習的培地であ
る。C−25置換基が非天然基である場合、すなわちイソ
プロピルまたは(S)−sec−ブチル以外の基である場
合には、発酵培地は特定成分が欠損しているまたはR基
がイソプロピルまたは(S)−sec−ブチルであるプラ
イマー化合物の少量のみを含む培地である。
好ましくは24℃〜33℃の範囲内の温度において数日間
発酵させた後に、発酵ブイヨンを遠心分離または過
し、菌糸体ケーキを好ましくはアセトンまたはメタノー
ルによって抽出する。溶媒抽出物を濃縮し、次に目的生
成物を例えば塩化メチレン,酢酸エチル,クロロホル
ム,ブタノールまたはメチルイソブチルケトンのよう
な、水に混和しない有機溶媒中に抽出する。溶媒抽出物
を濃縮し、粗生成物を必要に応じて、例えば調製用逆相
高速液体クロマトグラフィを用いて、クロマトグラフィ
によってさらに精製する。
発酵させた後に、発酵ブイヨンを遠心分離または過
し、菌糸体ケーキを好ましくはアセトンまたはメタノー
ルによって抽出する。溶媒抽出物を濃縮し、次に目的生
成物を例えば塩化メチレン,酢酸エチル,クロロホル
ム,ブタノールまたはメチルイソブチルケトンのよう
な、水に混和しない有機溶媒中に抽出する。溶媒抽出物
を濃縮し、粗生成物を必要に応じて、例えば調製用逆相
高速液体クロマトグラフィを用いて、クロマトグラフィ
によってさらに精製する。
生成物は一般に、R2が4′−(α−L−オレアンド
ロシル)−α−L−オレアンドロシルオキシであり、R
1がOHで二重結合が存在しない。またはR1が存在せず二
重結合が存在し、R3がHである式(1)化合物の混合
物である。R3がCH3である化合物は本質的に存在しな
い。しかし、各化合物の割合は特定の変異株、使用する
プライマー化合物および使用条件に依存して変動しう
る。
ロシル)−α−L−オレアンドロシルオキシであり、R
1がOHで二重結合が存在しない。またはR1が存在せず二
重結合が存在し、R3がHである式(1)化合物の混合
物である。R3がCH3である化合物は本質的に存在しな
い。しかし、各化合物の割合は特定の変異株、使用する
プライマー化合物および使用条件に依存して変動しう
る。
R基の源は、すなわちR基が直接R−COOHから生じた
かまたは上記の前駆体からもしくは何らかの前駆体から
生成したかはデメチルアベルメクチンの産生にとって重
要ではない。本発明の方法のデメチルアベルメクチンの
産生にとって重要な必要な条件は、R基が発酵過程で本
発明のストレプトマイセス アベルミチリス菌株にとっ
て同化可能であるということである。
かまたは上記の前駆体からもしくは何らかの前駆体から
生成したかはデメチルアベルメクチンの産生にとって重
要ではない。本発明の方法のデメチルアベルメクチンの
産生にとって重要な必要な条件は、R基が発酵過程で本
発明のストレプトマイセス アベルミチリス菌株にとっ
て同化可能であるということである。
適当な化合物を次に挙げる: 2,3−ジメチル酪酸 2−メチルヘキサン酸 2−メチルペント−4−エン酸 2−シクロプロピルプロピオン酸 4,4−ジフルオロシクロヘキサンカルボン酸リチウム塩 4−メチレンシクロヘキサンカルボン酸 3−メチルシクロヘキサンカルボン酸(シス/トラン
ス) 1−シクロペンテンカルボン酸 1−シクロヘキセンカルボン酸 テトラヒドロピラン−4−カルボン酸 チオフェン−2−カルボン酸 3−クロン酸 2−クロロチオフェン−4−カルボン酸 シクロブタンカルボン酸 シクロペンタンカルボン酸 シクロヘキサンカルボン酸 シクロヘプタンカルボン酸 2−メチルシクロプロパンカルボン酸 3−シクロヘキセン−1−カルボン酸 2−メチルチオプロピオン酸 2−メチル−4−メトキシ酪酸 チオフェン−3−カルボン酸 ヒドロキシメチルシクロペンタン 3−チオフェンカルボキシアルデヒド 3−シクロヘキシルプロピオン酸 3−シクロペンチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒドロチオフェン−3−カルボン酸 3−シクロペンチル−1−プロパノール 3−メチルシクロブタンカルボン酸リチウム塩 3−フルオロシクロブタンカルボン酸 3−メチレンシクロブタンカルボン酸リチウム塩 2−メチル−4−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオプラン−4−カルボン酸 シクロブチルメチルアミン エチルシクロブタンシクロペンテン 4−ヒドロキシメチルシクロペンテン 2−(3−チオフェンカルボニル)プロピオン酸エチル
エステル (S)−2−メチルペンタン酸 (R)−2−メチルペンタン酸 3種類のO−メチルトランスフェラーゼ変異株がここ
に述べた分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰性変異
株から得られる。有効な分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性の突然変異が1個以上のO−メチルトランス
フェラーゼ突然変異と結合した変異株は、RCOOH化合物
または発酵過程中にRCOOHに転化可能な化合物を供給す
ると、主としてアベルメクチンB,デメチルアベルメクチ
ンまたは全くメチル化されていないアベルメクチンを産
生するストレプトマイセス アベルミチリス菌株を生産
する。前記突然変異株は分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性を有さない、ここに述べた突然変異株の紫外
線および/または例えばN−メチル−N−ニトロウレタ
ン,ニトロソグアニジン,エチルメタンスルホネートも
しくは上記に挙げたような他の作用剤のような化学的突
然変異誘発物質による突然変異誘発によって得られる。
この代りに、O−メチルトランスフェラーズ活性の一方
または両方を有さない分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ陽性突然変異株は紫外線または突然変異誘発剤によ
る処理によって突然変異を起して、分枝鎖2−オキソ酸
デヒドロゲナーゼ陰性突然変異株および/または分枝鎖
アミノ酸トランスアミナーゼ陰性変異株を生ずる。
ス) 1−シクロペンテンカルボン酸 1−シクロヘキセンカルボン酸 テトラヒドロピラン−4−カルボン酸 チオフェン−2−カルボン酸 3−クロン酸 2−クロロチオフェン−4−カルボン酸 シクロブタンカルボン酸 シクロペンタンカルボン酸 シクロヘキサンカルボン酸 シクロヘプタンカルボン酸 2−メチルシクロプロパンカルボン酸 3−シクロヘキセン−1−カルボン酸 2−メチルチオプロピオン酸 2−メチル−4−メトキシ酪酸 チオフェン−3−カルボン酸 ヒドロキシメチルシクロペンタン 3−チオフェンカルボキシアルデヒド 3−シクロヘキシルプロピオン酸 3−シクロペンチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒドロチオフェン−3−カルボン酸 3−シクロペンチル−1−プロパノール 3−メチルシクロブタンカルボン酸リチウム塩 3−フルオロシクロブタンカルボン酸 3−メチレンシクロブタンカルボン酸リチウム塩 2−メチル−4−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオプラン−4−カルボン酸 シクロブチルメチルアミン エチルシクロブタンシクロペンテン 4−ヒドロキシメチルシクロペンテン 2−(3−チオフェンカルボニル)プロピオン酸エチル
エステル (S)−2−メチルペンタン酸 (R)−2−メチルペンタン酸 3種類のO−メチルトランスフェラーゼ変異株がここ
に述べた分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰性変異
株から得られる。有効な分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性の突然変異が1個以上のO−メチルトランス
フェラーゼ突然変異と結合した変異株は、RCOOH化合物
または発酵過程中にRCOOHに転化可能な化合物を供給す
ると、主としてアベルメクチンB,デメチルアベルメクチ
ンまたは全くメチル化されていないアベルメクチンを産
生するストレプトマイセス アベルミチリス菌株を生産
する。前記突然変異株は分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性を有さない、ここに述べた突然変異株の紫外
線および/または例えばN−メチル−N−ニトロウレタ
ン,ニトロソグアニジン,エチルメタンスルホネートも
しくは上記に挙げたような他の作用剤のような化学的突
然変異誘発物質による突然変異誘発によって得られる。
この代りに、O−メチルトランスフェラーズ活性の一方
または両方を有さない分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ陽性突然変異株は紫外線または突然変異誘発剤によ
る処理によって突然変異を起して、分枝鎖2−オキソ酸
デヒドロゲナーゼ陰性突然変異株および/または分枝鎖
アミノ酸トランスアミナーゼ陰性変異株を生ずる。
このような突然変異株によって生ずる非天然アベルメ
クチンはアグリコーン成分のC5位置および/またはオレ
アンドロース成分のC3′および/またはC3″位置におけ
るヒドロキシ基の存在を特徴とする。
クチンはアグリコーン成分のC5位置および/またはオレ
アンドロース成分のC3′および/またはC3″位置におけ
るヒドロキシ基の存在を特徴とする。
上記突然変異株はシュルマン等が述べている方法によ
って同定する〔アンチマイクロビアル エイジェント
アンド ケモセラピー,29巻,620-624頁(1986)〕。こ
れらの突然変異株は公知のアベルメクチンと同じ目的
に、同じように有用である。
って同定する〔アンチマイクロビアル エイジェント
アンド ケモセラピー,29巻,620-624頁(1986)〕。こ
れらの突然変異株は公知のアベルメクチンと同じ目的
に、同じように有用である。
この代りに、オレアンドロース二糖成分にメチル基を
有さないアベルメクチンを含めたアベルメクチンBが、
O−メチルトランスフェラーゼ活性を阻害するシネフン
ギン,S−アデノシルエチオニンまたはS−アデノシルホ
モシステインのような物質の存在下で、活性な分枝鎖2
−オキソ酸デヒドロゲナーゼを有さない本発明の変異株
を発酵させることによって多量に産生される。
有さないアベルメクチンを含めたアベルメクチンBが、
O−メチルトランスフェラーゼ活性を阻害するシネフン
ギン,S−アデノシルエチオニンまたはS−アデノシルホ
モシステインのような物質の存在下で、活性な分枝鎖2
−オキソ酸デヒドロゲナーゼを有さない本発明の変異株
を発酵させることによって多量に産生される。
本発明の化合物は駆虫薬,外部寄生虫撲滅剤,殺虫剤
およびダニ駆除剤として特定の用途を有する非常に活性
な駆虫薬である。
およびダニ駆除剤として特定の用途を有する非常に活性
な駆虫薬である。
このように、これらの化合物は特に、線虫と呼ばれる
寄生虫群によって非常に頻繁に誘発され、ブタ,ヒツ
ジ,ウマおよびウシの重度な経済的損失を招き、家畜お
よび家きんに影響を与える蠕虫病を含めた、内部寄生虫
によって生ずる種々な症状の治療に有効である。この化
合物は例えばイヌのイヌ糸状虫および例えば鉤虫属(An
cylostoma),鉤虫(Necator),回虫(Ascaris),円
虫(Strongyloides),旋毛虫(Trichinella),毛頭虫
(Capiliaria),鞭虫(Trichuris),蟯虫(Enterobiu
s)のような胃腸寄生虫,ならびに例えばフィラリァ虫
および円虫と旋毛虫の腸外期のような、血液またはその
他の組織および器官に検出される寄生虫を含めた、ヒト
に感染しうる種々な寄生虫を含めて、種々な動物種に影
響を与える線虫に対して有効である。
寄生虫群によって非常に頻繁に誘発され、ブタ,ヒツ
ジ,ウマおよびウシの重度な経済的損失を招き、家畜お
よび家きんに影響を与える蠕虫病を含めた、内部寄生虫
によって生ずる種々な症状の治療に有効である。この化
合物は例えばイヌのイヌ糸状虫および例えば鉤虫属(An
cylostoma),鉤虫(Necator),回虫(Ascaris),円
虫(Strongyloides),旋毛虫(Trichinella),毛頭虫
(Capiliaria),鞭虫(Trichuris),蟯虫(Enterobiu
s)のような胃腸寄生虫,ならびに例えばフィラリァ虫
および円虫と旋毛虫の腸外期のような、血液またはその
他の組織および器官に検出される寄生虫を含めた、ヒト
に感染しうる種々な寄生虫を含めて、種々な動物種に影
響を与える線虫に対して有効である。
この化合物はまた、例えばウシおよびウマに影響を与
えるマダニ,ダニ,シラミ,ノミ,クロバエ,刺虫(bi
ting insect)および移住性双翅目幼虫のような、特に
動物および鳥の昆虫網外部寄生虫を含めた外部寄生虫感
染症の治療にも有効である。
えるマダニ,ダニ,シラミ,ノミ,クロバエ,刺虫(bi
ting insect)および移住性双翅目幼虫のような、特に
動物および鳥の昆虫網外部寄生虫を含めた外部寄生虫感
染症の治療にも有効である。
この化合物はまた、ゴキブリ,イガ,ヒメマルカツオ
ブシムシおよびイエバエのような家庭害虫に対して有効
かつ貯蔵穀粒の害虫およびハダニ,アブラムシ,イモ虫
のような農作物の害虫ならびにダイミョウバッタのよう
な移住性直翅目に対して有効である殺虫剤である。
ブシムシおよびイエバエのような家庭害虫に対して有効
かつ貯蔵穀粒の害虫およびハダニ,アブラムシ,イモ虫
のような農作物の害虫ならびにダイミョウバッタのよう
な移住性直翅目に対して有効である殺虫剤である。
式(1)の化合物は予定の特定の用途ならびに治療す
べき特定の宿主動物種および関係する寄生虫または害虫
に適した製剤として投与する。駆虫薬として用いるため
には、化合物をカプセル剤,巨丸剤,錠剤または水薬と
して経口投与する、またはこの代りに、注射によってま
たはインプラントとして投与する。このような製剤は標
準的な獣医学的方法に従って、慣習的な方法で製造され
る。従って、有効成分を例えば殿粉,ラクトース,タル
ク,ステアリン酸マグネシウム等のような、崩壊剤およ
び/または結合剤を補助的に含む、適当な微粉状希釈剤
またはキャリィーと混合することによって、カプセル
剤,巨丸剤または錠剤を製造することができる。水薬製
剤は有効成分を分散剤または湿潤剤等とともに水溶液中
に分散させることによって製造し、注射可能な製剤は例
えば、溶液を血液と等張性にするために充分な塩または
グルコースのような、他の物質を含む無菌溶液として製
造することができる。これらの製剤では被治療宿主動物
種、感染症の重症度と種類および宿主の体重に依存し
て、有効成分量が変化する。一般に経口投与用には、1
回量または分割量として動物体重1kgにつき約0.001〜10
mg量1日〜5日間投与が充分であるが、これより高いま
たは低い用量範囲が指示される場合も当然あり、このよ
うな用量範囲も本発明の範囲内に含まれる。
べき特定の宿主動物種および関係する寄生虫または害虫
に適した製剤として投与する。駆虫薬として用いるため
には、化合物をカプセル剤,巨丸剤,錠剤または水薬と
して経口投与する、またはこの代りに、注射によってま
たはインプラントとして投与する。このような製剤は標
準的な獣医学的方法に従って、慣習的な方法で製造され
る。従って、有効成分を例えば殿粉,ラクトース,タル
ク,ステアリン酸マグネシウム等のような、崩壊剤およ
び/または結合剤を補助的に含む、適当な微粉状希釈剤
またはキャリィーと混合することによって、カプセル
剤,巨丸剤または錠剤を製造することができる。水薬製
剤は有効成分を分散剤または湿潤剤等とともに水溶液中
に分散させることによって製造し、注射可能な製剤は例
えば、溶液を血液と等張性にするために充分な塩または
グルコースのような、他の物質を含む無菌溶液として製
造することができる。これらの製剤では被治療宿主動物
種、感染症の重症度と種類および宿主の体重に依存し
て、有効成分量が変化する。一般に経口投与用には、1
回量または分割量として動物体重1kgにつき約0.001〜10
mg量1日〜5日間投与が充分であるが、これより高いま
たは低い用量範囲が指示される場合も当然あり、このよ
うな用量範囲も本発明の範囲内に含まれる。
代替手段として、化合物を動物の飼料とともに投与す
ることもでき、この目的には濃厚な飼料添加剤またはプ
レミックスを通常の動物飼料との混合用に製造すること
ができる。
ることもでき、この目的には濃厚な飼料添加剤またはプ
レミックスを通常の動物飼料との混合用に製造すること
ができる。
殺虫剤としておよび農業の害虫駆除のために使用する
には、化合物をスプレー,ダスト,エマルジョン等とし
て標準の農業的方法に従って用いる。
には、化合物をスプレー,ダスト,エマルジョン等とし
て標準の農業的方法に従って用いる。
ストレプトマイセスI−3(ATCC53567)の産生 工程1.ストレプトマイセス アベルミチリスATCC31272
をニューパッチ寒天培地(New Patch Agar Medum)上に
集密的ローンとして、30℃において12日間増殖させた。
をニューパッチ寒天培地(New Patch Agar Medum)上に
集密的ローンとして、30℃において12日間増殖させた。
V−8ジュース※ 200ml CaCO3 3g 寒天 15g H2O 100mlになるまで 栄養ブイヨン 1.0g/l 酢酸ナトリウム三水和物 1.4g/l イソ吉草酸 50mg/l イソ酪酸 50mg/l メチル酪酸 50mg/l イソロイシン 250mg/l ロイシン 250mg/l バリン 250mg/l 微量元素溶液※※ 1ml/l ※ 8種類の野菜ジュース(トマト,ニンジン,セロ
リ,ビート,パセリ,レタス,オランダガラシ,ホウレ
ン草)に塩,アスコルビン酸,クエン酸および天然フレ
ーバーを加えた混合物,キャンベル スープ カンパニ
ー(Campbell Soup Campany)(ニュージャージー州,
キャムデン)から入手可能。
リ,ビート,パセリ,レタス,オランダガラシ,ホウレ
ン草)に塩,アスコルビン酸,クエン酸および天然フレ
ーバーを加えた混合物,キャンベル スープ カンパニ
ー(Campbell Soup Campany)(ニュージャージー州,
キャムデン)から入手可能。
※※ 微量元素溶液の組成: FeCl3・6H2O 2.7g MnSO4・H2O 4.2 CuSO4・5H2O 0.5 CaCl2 11.0 H3BO3 0.62 CoCl2・6H2O 0.24 ZnCl2 0.68 Na2MoO4 0.24 上記成分を0.1NHCl1に溶解・ このような3プレートから胞子を回収して0.05Mトリ
スマレイン酸緩衝液(pH9.0)20ml中に懸濁させる。
スマレイン酸緩衝液(pH9.0)20ml中に懸濁させる。
工程2.胞子懸濁液10mlをN−メチル−N′−ニトロ−N
−ニトロソグアニジン(NTG)10ml含有バイアルに加え
た。このバイアルを28℃において60分間振とうインキュ
ベートし、次に1%NaCl溶液で充分に洗浄した。
−ニトロソグアニジン(NTG)10ml含有バイアルに加え
た。このバイアルを28℃において60分間振とうインキュ
ベートし、次に1%NaCl溶液で充分に洗浄した。
工程3.洗浄した胞子を1%NaCl中に懸濁し、等量の80%
エチレングリコールと混合した。この懸濁液を−20℃で
保存し、突然変異株を検出するための細胞源として用い
た。これは発芽時に約104コロニー/mlを生じた。
エチレングリコールと混合した。この懸濁液を−20℃で
保存し、突然変異株を検出するための細胞源として用い
た。これは発芽時に約104コロニー/mlを生じた。
この胞子ストックをYPDプレート上に展げて、約100コ
ロニー/プレートを形成した〔YPD培地は酵母抽出物、
バクトペプトン※(Bacto peptone)およびデキストロ
ース各10g/lと、バクト寒天※(Bacto agar)15g/lを含
み、加圧滅菌前にpH6.9に調節する〕。星印を付けた成
分はディフコ ラホラトリーズ(Difco Labolatories)
(ミシガン48238,デトロイト)から入手可能。
ロニー/プレートを形成した〔YPD培地は酵母抽出物、
バクトペプトン※(Bacto peptone)およびデキストロ
ース各10g/lと、バクト寒天※(Bacto agar)15g/lを含
み、加圧滅菌前にpH6.9に調節する〕。星印を付けた成
分はディフコ ラホラトリーズ(Difco Labolatories)
(ミシガン48238,デトロイト)から入手可能。
工程4.28℃において2〜3週間増殖させた後に、独立コ
ロニーをプレートから採取して、標準96孔マイクロタイ
タープレートの孔に入れた。コロニーの少量は新しい寒
天培地にパッチして、変異株を確認する場合の生育可能
細胞としても用いた。
ロニーをプレートから採取して、標準96孔マイクロタイ
タープレートの孔に入れた。コロニーの少量は新しい寒
天培地にパッチして、変異株を確認する場合の生育可能
細胞としても用いた。
工程5.各孔に、グルコース1%,カザミノ酸0.1%,お
よびイソ吉草酸,イソ酪酸および2−メチル酪酸各0.01
%を含む液体M9塩培地約75μlを加えた。28℃において
数日間インキュベートした後、分枝鎖2−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼの存在に関して細胞を検査した。(M9塩培
地1はNa2HPO46g,KH2PO33g,NaCl0.5gおよびNH4C1g
を含有する。この培地を加圧滅菌し、殺菌した1M MgSO4
と0.1M CaCl2各1ml無菌添加する) 工程6.混和不能な混合物を短時間超音波処理することに
よって、M9塩培地中5%トルエンのミクロ懸濁液を調製
した。この懸濁液25mlに、〔14C−1〕−2−オキソ−
イソカプロン酸2.5マイクロキューリー/ml,10.0マイク
ロキューリー/μmoleを含む溶液1.2mlを加えた。この
総混合物50μlを被検コロニー含有マイクロタイタープ
レートの各孔(ウェル)に加えた。
よびイソ吉草酸,イソ酪酸および2−メチル酪酸各0.01
%を含む液体M9塩培地約75μlを加えた。28℃において
数日間インキュベートした後、分枝鎖2−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼの存在に関して細胞を検査した。(M9塩培
地1はNa2HPO46g,KH2PO33g,NaCl0.5gおよびNH4C1g
を含有する。この培地を加圧滅菌し、殺菌した1M MgSO4
と0.1M CaCl2各1ml無菌添加する) 工程6.混和不能な混合物を短時間超音波処理することに
よって、M9塩培地中5%トルエンのミクロ懸濁液を調製
した。この懸濁液25mlに、〔14C−1〕−2−オキソ−
イソカプロン酸2.5マイクロキューリー/ml,10.0マイク
ロキューリー/μmoleを含む溶液1.2mlを加えた。この
総混合物50μlを被検コロニー含有マイクロタイタープ
レートの各孔(ウェル)に加えた。
工程7.タボール(Tabor)等がジェイ.バクテリオル
(J.Bacteriol.)128巻,485-486頁(1976) 「多重サンプル中の14CO2検出の簡便方法:突然変異体
の迅速検出への適用(Convenient Method for Detectin
g 14CO2 in Multiple Sample:Application to Rapid Sc
reening for Mutants)」 に述べている方法に従って、各孔から発生する14CO2を
捕捉し、可視化した。活性な分枝鎖2−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼを有さない変異株は対照で観察された以上の
Ba14CO3を産生しない。
(J.Bacteriol.)128巻,485-486頁(1976) 「多重サンプル中の14CO2検出の簡便方法:突然変異体
の迅速検出への適用(Convenient Method for Detectin
g 14CO2 in Multiple Sample:Application to Rapid Sc
reening for Mutants)」 に述べている方法に従って、各孔から発生する14CO2を
捕捉し、可視化した。活性な分枝鎖2−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼを有さない変異株は対照で観察された以上の
Ba14CO3を産生しない。
Ba14CO3形成の結果としてのオートラジオグラム上の
暗色スポットとして示される14CO2陽性分析と、スポッ
トなしまたは非常に淡色のスポットとして示される陰性
分析との対比を改良した、より正確な方法は次の改良検
査方法から成る。
暗色スポットとして示される14CO2陽性分析と、スポッ
トなしまたは非常に淡色のスポットとして示される陰性
分析との対比を改良した、より正確な方法は次の改良検
査方法から成る。
独立コロニー(上記工程4参照)を7〜14日間増殖後
に寒天培地から採取する(2〜3週間ではなく、工程6
と7によって直接検査)。上記方法の工程5は省略す
る。
に寒天培地から採取する(2〜3週間ではなく、工程6
と7によって直接検査)。上記方法の工程5は省略す
る。
14CO2放出に関して定量的な性質であるさらに正確な
分析方法は、M9塩培地とグルコース1%および「シンカ
サ(Syncasa)−bcaa」(L−アミノ酸と適当な組成の
市販のカザミノ酸との合成混合物,L−バリン,L−イソロ
イシンおよびL−ロイシンは存在せず、下記参照)0.1
%とから成る適当な培地上での上記検査方法によって検
出された変異株を増殖させることから成る。
分析方法は、M9塩培地とグルコース1%および「シンカ
サ(Syncasa)−bcaa」(L−アミノ酸と適当な組成の
市販のカザミノ酸との合成混合物,L−バリン,L−イソロ
イシンおよびL−ロイシンは存在せず、下記参照)0.1
%とから成る適当な培地上での上記検査方法によって検
出された変異株を増殖させることから成る。
高細胞密度に増殖した後に、M9塩培地内で細胞を洗浄
し、超音波処理によってトルエンの乳白色分散系を生じ
た1%トルエン含有冷M9塩培地中に再懸濁させた。細胞
を透過性化するために、細胞/緩衝液/トルエン懸濁液
を30℃において40分間インキュベートした。透過性化細
胞をM9塩培地中で洗浄し、M9培地緩衝液の最初の量の1/
5中に最終的に懸濁させた。この懸濁液180μlを分析に
用いた。
し、超音波処理によってトルエンの乳白色分散系を生じ
た1%トルエン含有冷M9塩培地中に再懸濁させた。細胞
を透過性化するために、細胞/緩衝液/トルエン懸濁液
を30℃において40分間インキュベートした。透過性化細
胞をM9塩培地中で洗浄し、M9培地緩衝液の最初の量の1/
5中に最終的に懸濁させた。この懸濁液180μlを分析に
用いた。
反応量300μlはトルエン化細胞、チアミンピロホス
フェート(TPP)0.4mM,補酵素A(CoA)0.11mM,ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレチオド(NAD)0.68mM,ジチオ
スレイトール(DTT)2.6mM,MgCl24.1mM,トリスHCl 60m
M,トリスHCl 60mM(pH7.5),および〔14C−1〕−2
−オキソイソカプロエート6,000cpm(マイクロキューリ
ー/μmol)を含有した。計数率は73%であった。反応
はバイアルのねじ込みキャップ2×2cmホワットマン(W
ha tman)♯4方形紙を押込んだ、15mlシンチレーシ
ョンバイアル内で実施した。紙は1Mヒアミンヒドロキ
シド(Hyamine Hydroxide)〔メタノール中メチルベン
ズエトニムヒドロキシドの1M溶液、シグマケミカル社
(Sigme Chemical Co.)(ミズーリ63178,セントルイ
ス)から入手可能〕30μlを含み、反応から発生する14
CO2を捕捉する。2時間インキュベートした後に、紙
をベックマンアクアゾルII〔ユニバーサル(Univeras
l)LSC(液体シンチレーション計数管)、ニューイング
ランドニュークレアーリサーチプロダクツ(New Englan
d Nuclear Research Products),マサチュセッツ0211
8,ボストンから入手可能〕10ml中に浸せきし、この溶液
中で4時間以上平衡させた後に液体シンチレーション計
数管で放射能を測定した。ブランクの対照反応(細胞を
含まず)は約50-300cpmを示した。変異株I−3および
これと同様な他の変異株はブランク対照反応以下のカウ
ントを示したが、親菌株はブランク対照値よりも数倍高
いカウントを示した。
フェート(TPP)0.4mM,補酵素A(CoA)0.11mM,ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレチオド(NAD)0.68mM,ジチオ
スレイトール(DTT)2.6mM,MgCl24.1mM,トリスHCl 60m
M,トリスHCl 60mM(pH7.5),および〔14C−1〕−2
−オキソイソカプロエート6,000cpm(マイクロキューリ
ー/μmol)を含有した。計数率は73%であった。反応
はバイアルのねじ込みキャップ2×2cmホワットマン(W
ha tman)♯4方形紙を押込んだ、15mlシンチレーシ
ョンバイアル内で実施した。紙は1Mヒアミンヒドロキ
シド(Hyamine Hydroxide)〔メタノール中メチルベン
ズエトニムヒドロキシドの1M溶液、シグマケミカル社
(Sigme Chemical Co.)(ミズーリ63178,セントルイ
ス)から入手可能〕30μlを含み、反応から発生する14
CO2を捕捉する。2時間インキュベートした後に、紙
をベックマンアクアゾルII〔ユニバーサル(Univeras
l)LSC(液体シンチレーション計数管)、ニューイング
ランドニュークレアーリサーチプロダクツ(New Englan
d Nuclear Research Products),マサチュセッツ0211
8,ボストンから入手可能〕10ml中に浸せきし、この溶液
中で4時間以上平衡させた後に液体シンチレーション計
数管で放射能を測定した。ブランクの対照反応(細胞を
含まず)は約50-300cpmを示した。変異株I−3および
これと同様な他の変異株はブランク対照反応以下のカウ
ントを示したが、親菌株はブランク対照値よりも数倍高
いカウントを示した。
「シンカサ−bcaa」の組成,100倍濃縮物g/l L−アラニン 3 L−アルギニン 4 L−アスパラギン酸 6 L−システィン 1 L−グルタミン酸 20 グリシン 1 L−ヒスチジン 2 L−リシン 7 L−メチオニン 3 L−フェニルアラニン 6 L−プロリン 10 L−セリン 6 L−スレオニン 4 L−チロシン 4 L−トリプトファン 1 混合物をpH7に調節し、フィルター殺菌する。濃縮部
1容量部を培地99容量部に加えて、標準的な使用濃度に
する。
1容量部を培地99容量部に加えて、標準的な使用濃度に
する。
分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼとアベルメクチ
ンBO−メチルトランスフェラーゼとが欠損したストレプ
トマイセス アベルミチリス7881 (ATCC53567)の二重阻害変異株の調製 工程1.ストレプトマイセス アベルミチリスATCC53567
をニューパッチ寒天培地上の集密的ローンとして、30℃
において12日間増殖させた。このような3プレートから
胞子を回収して、0.05Mトリスマレイン酸緩衝液(pH9.
0)20ml中に懸濁させた。
ンBO−メチルトランスフェラーゼとが欠損したストレプ
トマイセス アベルミチリス7881 (ATCC53567)の二重阻害変異株の調製 工程1.ストレプトマイセス アベルミチリスATCC53567
をニューパッチ寒天培地上の集密的ローンとして、30℃
において12日間増殖させた。このような3プレートから
胞子を回収して、0.05Mトリスマレイン酸緩衝液(pH9.
0)20ml中に懸濁させた。
工程2.胞子懸濁液10mlをN−メチル−N′−ニトロ−N
−ニトロソグアニジン(NTG)10ml含有バイアルに加え
た。このバイアルを28℃において60分間振とうインキュ
ベートし、次に胞子を1%NaCl溶液で充分に洗浄した。
−ニトロソグアニジン(NTG)10ml含有バイアルに加え
た。このバイアルを28℃において60分間振とうインキュ
ベートし、次に胞子を1%NaCl溶液で充分に洗浄した。
工程3.洗浄した胞子を1%NaCl中に懸濁させ、等量の80
%エチレングリコールを加えた。この懸濁液を−20℃に
おいて保存し、変異株を検出するための細胞ソースとし
て用いた。
%エチレングリコールを加えた。この懸濁液を−20℃に
おいて保存し、変異株を検出するための細胞ソースとし
て用いた。
この胞子ストックをYPDプレート上に展げて約100コロ
ニー/プレートを得た。ストレプトマイセス アベルミ
チリス菌株I−3(ATCC53567)の突然変異生成集団
(ニトロソグアニジン処理)コロニーを採取し、次のよ
うに調製した寒天培地上にパッチとして展げた。寒天培
地の調製(g/l):希薄化殿粉80;K2HPO41;MgSO4・7H2O
1;アルダミンpH5;CaCO35;P−2000 1ml;FeSO4・7H2O0.0
1;MnCl2・4H2O0.001;ZnSO4・7H2O0.001;バクト寒天17;
蒸留水980mlになるまで加える。NaOHによってpHを7.0に
調節してから、121℃において20分間加圧滅菌する。加
圧滅菌後、(±)−2−メチル酪酸の無菌5%ストック
溶液20ml(pH7.0)を加える。
ニー/プレートを得た。ストレプトマイセス アベルミ
チリス菌株I−3(ATCC53567)の突然変異生成集団
(ニトロソグアニジン処理)コロニーを採取し、次のよ
うに調製した寒天培地上にパッチとして展げた。寒天培
地の調製(g/l):希薄化殿粉80;K2HPO41;MgSO4・7H2O
1;アルダミンpH5;CaCO35;P−2000 1ml;FeSO4・7H2O0.0
1;MnCl2・4H2O0.001;ZnSO4・7H2O0.001;バクト寒天17;
蒸留水980mlになるまで加える。NaOHによってpHを7.0に
調節してから、121℃において20分間加圧滅菌する。加
圧滅菌後、(±)−2−メチル酪酸の無菌5%ストック
溶液20ml(pH7.0)を加える。
寒天培養物を28℃において8−12日間インキュベート
する。細胞(菌糸体)を寒天表面から採取し、アセトン
250μl中に入れる。次にアセトン抽出物25μlをアナ
ルテクシリカゲル(Analtech Silica Gel)GFプレコー
ト薄層クロマトグラフィープレートにスポットする。溶
媒として酢酸エチルを用いて、クロマトグラムを30〜40
分間展開させ、乾燥し、エタノール中3%バニリンをス
プレーした。このプレートを100℃の乾燥器に1〜3分
間入れ、次にエタノール中3%硫酸をスプレーし、再び
100℃の乾燥器に10-15分間入れた。アベルメクチンBO−
メチルトランスフェラーゼ欠損突然変異株はクロマトグ
ラフィーパターンの変化によって確認する;すなわちア
ベルメクチンB成分に相当するスポット(B1とB2のRfは
それぞれ、約0.54と0.42)がまだ存在するが、アベルメ
クチンA成分に相当するスポット(A1とA2のRfはそれぞ
れ約0.69と0.58)は存在しない。
する。細胞(菌糸体)を寒天表面から採取し、アセトン
250μl中に入れる。次にアセトン抽出物25μlをアナ
ルテクシリカゲル(Analtech Silica Gel)GFプレコー
ト薄層クロマトグラフィープレートにスポットする。溶
媒として酢酸エチルを用いて、クロマトグラムを30〜40
分間展開させ、乾燥し、エタノール中3%バニリンをス
プレーした。このプレートを100℃の乾燥器に1〜3分
間入れ、次にエタノール中3%硫酸をスプレーし、再び
100℃の乾燥器に10-15分間入れた。アベルメクチンBO−
メチルトランスフェラーゼ欠損突然変異株はクロマトグ
ラフィーパターンの変化によって確認する;すなわちア
ベルメクチンB成分に相当するスポット(B1とB2のRfは
それぞれ、約0.54と0.42)がまだ存在するが、アベルメ
クチンA成分に相当するスポット(A1とA2のRfはそれぞ
れ約0.69と0.58)は存在しない。
一般的高速液体クロマトグラフィ(HPLC)処置 移動相: 水 150ml アセトニトリル 70ml メタノールを加えて、1にする。
カラム: ウルトラスフェア(Ultrasphere)ODS 25cm〔ベック
マンインストル−メンツ(Beckman Instruments)(カ
リフォルニア 92634-3100,フラートン)〕 流量:0.75ml/分 検出:紫外線240nm 減衰:約6 サンプル希釈剤: アセトニトリル35ml+メタノール390ml 標準: 1.アベルメクチンA2A 0.5mgを10mlフラスコに秤り入
れ、メタノールを10mlまで加える。
マンインストル−メンツ(Beckman Instruments)(カ
リフォルニア 92634-3100,フラートン)〕 流量:0.75ml/分 検出:紫外線240nm 減衰:約6 サンプル希釈剤: アセトニトリル35ml+メタノール390ml 標準: 1.アベルメクチンA2A 0.5mgを10mlフラスコに秤り入
れ、メタノールを10mlまで加える。
2.試験生成物0.5mgを10mlフラスコに秤り入れ、メタノ
ールを10mlまで加える。
ールを10mlまで加える。
1と2は標準ストック溶液である;標準溶液の操作: (1) 100μlと(2)100μlをバイアルに入れ、移
動相800μlを加える サンプル: 1.充分に振とうしたブイヨン1mlを採取し、遠心分離す
る 2.ペレットを損傷しないように、できるだけ多くの上清
を除去する 3.HPLC水100μlをペレットに加え、混合物を攪拌して
分散させる 4.希釈剤(D)2mlを加え、充分に混合する 5.混合物を過し、HPLC分析する 前記天然アベルメクチンと非天然アベルメクチンに対
して、このHPLCクロマトグラフィ処置を行い、各アベル
メクチンのピークの保持時間を存在するオリゴマイシン
Aに観察された保持時間で除した、オリゴマイシンAは
特定HPLC測定の内部標準として役立つ。オリゴマイシン
Aはストレプトマイセス アベルミチリス発酵の副生成
物として、HPLCによって殆んど常に観察され、酸RCOOH
(Rは前記で定義した通りである)を含まない培地また
は酸RCOOH(Rは前記で定義した通りである)に転化可
能な化合物を含まない培地中で培養した場合に前記変異
株が産生する、HPLCで観察される唯一の生成物でわる。
オリゴマイシンAの保持時間は典型的に12.5-1.4分間で
ある。保持時間(RT)の比はアベルメクチン生成物の同
一性および収率を比較するための重要な根拠を与える。
HPLC上のアベルメクチン生成物の一般的な出現順序はB
2,A2,B1およびA1である。天然アベルメクチン RT/RT(オリゴマイシンA) B2b 0.70 B2a 0.84 A2b 0.90 A2a 1.09 B1b 1.40 B1a 1.83 A1b 1.83 A1a 2.42 B1aとA1aが不溶であることに注意する。非天然アベルメクチン RT/RT(オリゴマイシンA) シクロペンチルB2 0.94 シクロペンチルA2 1.23 シクロペンチルB1 1.99 シクロペンチルA1 2.62 保持時間は日によって1〜2分間変動し、オリゴマイ
シンAは一般に約12.5-14分間に変動する。
動相800μlを加える サンプル: 1.充分に振とうしたブイヨン1mlを採取し、遠心分離す
る 2.ペレットを損傷しないように、できるだけ多くの上清
を除去する 3.HPLC水100μlをペレットに加え、混合物を攪拌して
分散させる 4.希釈剤(D)2mlを加え、充分に混合する 5.混合物を過し、HPLC分析する 前記天然アベルメクチンと非天然アベルメクチンに対
して、このHPLCクロマトグラフィ処置を行い、各アベル
メクチンのピークの保持時間を存在するオリゴマイシン
Aに観察された保持時間で除した、オリゴマイシンAは
特定HPLC測定の内部標準として役立つ。オリゴマイシン
Aはストレプトマイセス アベルミチリス発酵の副生成
物として、HPLCによって殆んど常に観察され、酸RCOOH
(Rは前記で定義した通りである)を含まない培地また
は酸RCOOH(Rは前記で定義した通りである)に転化可
能な化合物を含まない培地中で培養した場合に前記変異
株が産生する、HPLCで観察される唯一の生成物でわる。
オリゴマイシンAの保持時間は典型的に12.5-1.4分間で
ある。保持時間(RT)の比はアベルメクチン生成物の同
一性および収率を比較するための重要な根拠を与える。
HPLC上のアベルメクチン生成物の一般的な出現順序はB
2,A2,B1およびA1である。天然アベルメクチン RT/RT(オリゴマイシンA) B2b 0.70 B2a 0.84 A2b 0.90 A2a 1.09 B1b 1.40 B1a 1.83 A1b 1.83 A1a 2.42 B1aとA1aが不溶であることに注意する。非天然アベルメクチン RT/RT(オリゴマイシンA) シクロペンチルB2 0.94 シクロペンチルA2 1.23 シクロペンチルB1 1.99 シクロペンチルA1 2.62 保持時間は日によって1〜2分間変動し、オリゴマイ
シンAは一般に約12.5-14分間に変動する。
次の例では、アベルメクチンを特に指示した場合以外
は上記HPLC方法によって測定する。
は上記HPLC方法によって測定する。
次の例に用いる培地の組成は下記の通りである:AS-7培地 g/l 希薄化殿粉a 20 アルダミン(Ardamine)pHb 5 アァルマメディア(Pharme media)c 15 CaCO3 2 a.バチリス リチュニホルミス(Bacillus lichenifor
mis)からのα−アミラーゼ〔ノボエンザイム(Novo En
zymes)(コネティカット州,ウィルトン)から商品名
「ターマル(Termamyl)」として入手可能〕によっ殿粉
から40%±5%に等しいデキストロースへの加水分解に
よって調製。
mis)からのα−アミラーゼ〔ノボエンザイム(Novo En
zymes)(コネティカット州,ウィルトン)から商品名
「ターマル(Termamyl)」として入手可能〕によっ殿粉
から40%±5%に等しいデキストロースへの加水分解に
よって調製。
b イーストプロダクツ社(Yeast Products.Inc.)
(ニュージャーシー07012クリフトン)から c トレーダー プロティン(Trader Protein)(テネ
シー38108,エムフィス)から NaOHによって、pHを7.2に調節する。AP-5培地 g/l 希薄化殿粉 80 アルダミンpH 5 K2HPO4 1 MgSO4・7H2O 1 NaCl 1 CaCO3 7 FeSO4・7H2O 0.01 MnCl2・7H2O 0.001 ZnSO4・7H2O 0.001 P−2000(消泡剤)a 1ml/l a ダウケミカル社(Dow Chemical Co.)(ミシガン48
640ミッドランド)から 25%NaOHによってpHを6.9に調節する。
(ニュージャーシー07012クリフトン)から c トレーダー プロティン(Trader Protein)(テネ
シー38108,エムフィス)から NaOHによって、pHを7.2に調節する。AP-5培地 g/l 希薄化殿粉 80 アルダミンpH 5 K2HPO4 1 MgSO4・7H2O 1 NaCl 1 CaCO3 7 FeSO4・7H2O 0.01 MnCl2・7H2O 0.001 ZnSO4・7H2O 0.001 P−2000(消泡剤)a 1ml/l a ダウケミカル社(Dow Chemical Co.)(ミシガン48
640ミッドランド)から 25%NaOHによってpHを6.9に調節する。
(実施例) 例1−4 ストレプトマイセス アベルミチリスI−3(ATCC53
567)からのアベルメクチン 胞子形成V−8プレートからのストレプトマイセス
アベルミチリスI−3(ATCC53567)を500ml−トリプル
バッフルフラスコ(Triple baffled flask)中のAS−7
培地80mlに接種した。このフラスコを回転シェーカー上
で20〜30℃において200rpmで攪拌しながら、インキュベ
ートした。24時間インキュベートした後に、全ブイヨン
の1mlをAP−5培地40ml含有300ml−フラスコに接種し
た。下記の各プライマー化合物(24時間後に添加)400p
pmの存在下、28-30℃において2通りの発酵を実施し
た。
567)からのアベルメクチン 胞子形成V−8プレートからのストレプトマイセス
アベルミチリスI−3(ATCC53567)を500ml−トリプル
バッフルフラスコ(Triple baffled flask)中のAS−7
培地80mlに接種した。このフラスコを回転シェーカー上
で20〜30℃において200rpmで攪拌しながら、インキュベ
ートした。24時間インキュベートした後に、全ブイヨン
の1mlをAP−5培地40ml含有300ml−フラスコに接種し
た。下記の各プライマー化合物(24時間後に添加)400p
pmの存在下、28-30℃において2通りの発酵を実施し
た。
312時間後に、全ブイヨンのサンプル2mlにメタノー
ル:アセトニトリル(390:35)8mlを混合した。過後
に、サンプル50μlをベックマンウルトラスフェアーOD
Sカラム(30×250mm)に注入した。カラムをメタノー
ル:アセトニトリル:水(89:14:7)によって0.8ml/分
において溶出し、溶出物を240nmにおける紫外線検出法
によって監視した。新規なアベルメクチンの保持時間を
下記に示す: 例5 ストレプトマイセス アベルミチリス7881(ATCC5369
2)からのシクロヘキシルアベルメクチン 培養物ストレプトマイセス アベルミチリス7881(AT
CC53692)の凍結バイアルを500ml−トリプルバッフルフ
ラスコ中にAS−7培地100mlに接種した。このフラスコ
を回転シェーカー上で28〜30℃において200rpmで攪拌し
ながらインキュベートした。28時間インキュベートした
後に、全ブイヨン5mlを500ml−トリプルバッフルフラス
コの新たなAS−7培地100mlに接種した。このフラスコ
を回転シェーカー上で28-30℃において200rpmで攪拌し
ながらインキュベートした。24時間インキュベートした
後に、全ブイヨン1mlをAP−5培地40ml含有300ml−フラ
スコに接種した。このフラスコを28-30℃において200rp
mで攪拌しながらインキュベートした。24時間後にシク
ロヘキサンカルボン酸40ppmを加えた、312時間後にサン
プル2mlを採取し、例1に述べたように、このサンプル
に対して高速度液体クロマトグラフィを行った。このよ
うな条件下で、発酵中に検出されたアベルメクチン成分
のみがシクロヘキシルB2とB1にそれぞれ相当する14.84
(54.9mg/l)および31.46(32.1mg/l)分間に溶出し
た。
ル:アセトニトリル(390:35)8mlを混合した。過後
に、サンプル50μlをベックマンウルトラスフェアーOD
Sカラム(30×250mm)に注入した。カラムをメタノー
ル:アセトニトリル:水(89:14:7)によって0.8ml/分
において溶出し、溶出物を240nmにおける紫外線検出法
によって監視した。新規なアベルメクチンの保持時間を
下記に示す: 例5 ストレプトマイセス アベルミチリス7881(ATCC5369
2)からのシクロヘキシルアベルメクチン 培養物ストレプトマイセス アベルミチリス7881(AT
CC53692)の凍結バイアルを500ml−トリプルバッフルフ
ラスコ中にAS−7培地100mlに接種した。このフラスコ
を回転シェーカー上で28〜30℃において200rpmで攪拌し
ながらインキュベートした。28時間インキュベートした
後に、全ブイヨン5mlを500ml−トリプルバッフルフラス
コの新たなAS−7培地100mlに接種した。このフラスコ
を回転シェーカー上で28-30℃において200rpmで攪拌し
ながらインキュベートした。24時間インキュベートした
後に、全ブイヨン1mlをAP−5培地40ml含有300ml−フラ
スコに接種した。このフラスコを28-30℃において200rp
mで攪拌しながらインキュベートした。24時間後にシク
ロヘキサンカルボン酸40ppmを加えた、312時間後にサン
プル2mlを採取し、例1に述べたように、このサンプル
に対して高速度液体クロマトグラフィを行った。このよ
うな条件下で、発酵中に検出されたアベルメクチン成分
のみがシクロヘキシルB2とB1にそれぞれ相当する14.84
(54.9mg/l)および31.46(32.1mg/l)分間に溶出し
た。
例6 ストレプトマイセス アベルミチリス7881(ATCC5369
2)からのsec−ブチルアベルメクチン 例5の方法をくり返したが、この場合にはシクロヘキ
サンカルボン酸の代りに±2−メチル酪酸400ppmを用
い、他の条件は全て例2に述べた条件と同じであった。
sec−ブチルアベルメクチンB2(11.60,12.40分間,63.5,
42.4mg/l)およびsec−ブチルアベルメクチンB1(23.1
分間,105.5mg/l)のみが発酵中に検出された。
2)からのsec−ブチルアベルメクチン 例5の方法をくり返したが、この場合にはシクロヘキ
サンカルボン酸の代りに±2−メチル酪酸400ppmを用
い、他の条件は全て例2に述べた条件と同じであった。
sec−ブチルアベルメクチンB2(11.60,12.40分間,63.5,
42.4mg/l)およびsec−ブチルアベルメクチンB1(23.1
分間,105.5mg/l)のみが発酵中に検出された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シーージェン・エドワード・リー アメリカ合衆国コネチカット州ウォーター フォード,ウォータービュー・ドライブ 12 (56)参考文献 米国特許4310519(US,A) 米国特許4429042(US,A)
Claims (17)
- 【請求項1】分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
およびアベルメクチンBO−メチルトランスフェラーゼ活
性を有さないが、適当なプライマー酸あるいは発酵の過
程で該プライマー酸に転化し得る化合物の存在下にアベ
ルメクチンを産生する能力を有するストロプトマイセス
アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)。 - 【請求項2】その透過性細胞が添加[14C−1]−2−
オキソイソカプロン酸から14CO2を発生させることがで
きないことを特徴とする、特許請求の範囲第1項の、ス
トロプトマイセス アベルミチリス。 - 【請求項3】ストロプトマイセス アベルミチリスATCC
53692である特許請求の範囲第2項のストロプトマイセ
ス アベルミチリス。 - 【請求項4】分枝鎖2−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
とアベルメクチンB−O−メチルトランスフェラーゼ活
性とを有さないが、適当なプライマー酸あるいは発酵の
過程で該プライマー酸に転化し得る化合物の存在下にア
ベルメクチンを産生する能力を有するストロプトマイセ
ス アベルミチリス菌株、同化可能な、窒素、炭素およ
び無機塩源を含む水性栄養培地、およびアベルメクチン
の生合成に利用可能な化合物による好気性発酵からな
る、R3が水素である式(I)のアベルメクチンB化合
物の産生方法。 [式中、22-23位の破線は任意の二重結合を表す; R1はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
のみに存在する; R2は式: で示される4′−(α−L−オレアンドロシル)−α−
L−オレアンドロシロキシであり、 Rは−COOH基が付着した炭素原子に水素以外の少なくと
も2個の他の原子または基が付着しているα−分枝鎖基
である。] - 【請求項5】ストロプトマイセス アベルミチリス菌株
がストロプトマイセス アベルミチリスATCC53692であ
る特許請求の範囲第4項記載の方法。 - 【請求項6】化合物が式 R−COOH [式中、Rは−COOH基が付着した炭素原子に水素以外の
少なくとも2個の他の原子または基が付着しているα−
分枝鎖基である] で示される化合物、または発酵過程中に前記化合物に転
化可能な化合物である特許請求の範囲第4項記載の方
法。 - 【請求項7】Rがα−分枝鎖C3‐C8アルキル、アルケ
ニル、アルキニル、アルコキシアルキルまたはアルキル
チアオルキル基;アルキル基がα−分枝鎖C2‐C5アル
キル基であるC5‐C8シクロアルキル基;任意にメチレ
ンまたは1個以上のC1‐C4アルキル基またはハロゲン
原子によって任意に置換されているC3‐C8シクロアル
キルまたはC5‐C8シクロアルケニル基;または飽和ま
たは完全にもしくは部分的に不飽和で、1個以上のC1
‐C4アルキル基またはハロゲン原子によって任意に置
換される、3員〜6員の酸素もしくは硫黄含有複素環で
ある化合物、または発酵過程中に前記化合物に転化可能
な化合物である特許請求の範囲第6項記載の方法。 - 【請求項8】基質RCOOHに転化可能な化合物が式: R−(CH2)n−Z [式中、Rは前記に定義した通りであり; nは0,2,4または6であり; Zは−CH2OH、−CHO、−COOR4、−CH2NH2または−CONHR
5であり; R4はHまたは(C1‐C6)アルキルであり; R5はH、(C1‐C4)アルキル、−CH(COOH)CH2COO
H、−CH(COOH)(CH2)2COOHまたは−CH(COOH)(C
H2)2SCH3である]で示される化合物である特許請求の
範囲第6項記載の方法。 - 【請求項9】Rがシクロブチル、シクロペンチル、シク
ロヘキシル、シクロヘプチル、2−メチルシクロプロピ
ル、3−シクロヘキセニル、1−シクロペンテニル、1
−シクロヘキセニル、3−メチルシクロヘキシル(シス
/トランス)、4−メチレンシクロヘキシル、3−メチ
ルシクロブチル、3−メチレンシクロブチル、3−シク
ロペンテニル、1−シクロプロピルエチル、3−フルオ
ロシクロブチル、4,4−ジフルオロシクロヘキシル、イ
ソプロピル、sec−ブチル、2−ペンチル、2,3−ジメチ
ルプロピル、2−ヘキシル、2−ペント−4−エニル、
2−メチルチオエチル、S−2−ペンチル、R−2−ペ
ンチル、2−チエニル、3−チエニル、4−テトラヒド
ロピラニル、3−フリル、2−クロロチエニル、3−テ
トラヒドロチエニル、4−メチルチオ−2−ブチル、4
−テトラヒドロチオピラニル、4−メトキシ−2−ブチ
ルまたは4−メチルチオ−2−ブチルである特許請求の
範囲第7項記載の方法。 - 【請求項10】Rが式: R−COOH で示されるカルボン酸から誘導される特許請求の範囲第
9項記載の方法。 - 【請求項11】Rがシクロペンチル、シクロヘキシルま
たはチエニルである特許請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項12】Rが発酵過程中にRCOOHに転化し得る化
合物から誘導される基であり、前記化合物が式: R−(CH2)n−Z [式中、Rは前記に定義した通りであり; nは0,2,4または6であり; Zは−CH2OH、−CHO、−COOR4、−CH2NH2または−CONHR
5であり; R4は(C1‐C6)アルキルであり; R5は水素、(C1‐C4)アルキル、CH(COOH)CH2COO
H、−CH(COOH)(CH2)2COOHまたは−CH(COOH)(C
H2)2SCH3である] で示される化合物である特許請求の範囲第9項記載の方
法。 - 【請求項13】Rがα−分枝鎖C3‐C8アルキル基であ
るときに、イソプロピルおよび(S)−sec−ブチル以
外の基である特許請求の範囲第7項記載の方法。 - 【請求項14】ストロプトマイセス アベルミチリスの
菌株がストロプトマイセス アベルミチリスATCC53692
である特許請求の範囲第7項記載の方法。 - 【請求項15】同化可能な、炭素、窒素および無機塩源
を含む水性栄養培地中好気性条件下発酵させた場合に、
前記培地が式RCOOH(Rはイソプロピルまたは(S)−s
ec−ブチルである)で示される酸またはストロプトマイ
セス アベルミチリスによって前記酸に転化可能な化合
物を含む場合にのみ、前記培地中での発酵時に実質的に
R3がHである下記式(I)の化合物を産生することが
できるストロプトマイセス アベルミチリス種に属する
新規な菌株であって、ストロプトマイセス アベルミチ
リスATCC53567の突然変異である菌株: [式中、22-23位の破線は任意の二重結合を表す; R1はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
のみに存在する; R2は式: で示される4′−(α−L−オレアンドロシル)−α−
L−オレアンドロシロキシであり、 Rはイソプロピルまたは(S)−sec−ブチルであ
る。] - 【請求項16】Rがシクロヘキシルである請求項11の方
法。 - 【請求項17】Rがシクロヘキシルである請求項12の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US651287A | 1987-01-23 | 1987-01-23 | |
US6512 | 1987-01-23 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63291576A JPS63291576A (ja) | 1988-11-29 |
JPH0817693B2 true JPH0817693B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=21721247
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63012462A Expired - Lifetime JPH0681757B2 (ja) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | 非天然デメチルアベルメクチン |
JP63011881A Expired - Lifetime JPH0817693B2 (ja) | 1987-01-23 | 1988-01-23 | アベルメクチンb化合物の産生方法およびそのための培養物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63012462A Expired - Lifetime JPH0681757B2 (ja) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | 非天然デメチルアベルメクチン |
Country Status (30)
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