CZ279782B6 - Způsob výroby derivátů avarmectinu B - Google Patents

Abstract

Způsob výroby avermectinu B tak, že se pěstuje kmen Streptomyces avermitilis, jemuž chybí dehydrogenáza 2-oxokyselin s rozvětvěným řetězcem a O-methyltransféeráza avermectinu B. Získané přírodní i nepřírodní avermectiny B je možno užít jako parasiticidních prostředků. Streptomyces avermitilis ATCC 53 692.ŕ

Description

Streptomyces avermitilis ATCC 53692 a způsob přípravy avermectinu B

Vynález se týká způsobu výroby derivátů avermectinu B, které je možno získat pěstováním kmenů Streptomyces avermitilis, které nemají avermectin B-O-metyltransferázovou účinnost a účinnost dehydrogenázy 2-oxo kyselin v postranním řetězci. Získat je možno přírodní i polosyntetické deriváty avermectinu B.

V US patentových spisech č. 4 310 519 a 4 429 042 se popisují avermectiny jako komplex příbuzných látek, které mají vysokou antiparazitární účinnost, a také jejich výroba aerobních fermentací kmenů Streptomyces avermitilis, a to zejména S. avermitilis ATCC č. 31267, 31271 a 31272. Zvláště dva uvedené poslední kmeny jsou k dispozici ve zmrazené nebo lyofilizované formě a byly získány ozářením kmene S. avermitilis ATCC 31267 ultrafialovým světlem.

V evropském patentovém spisu č. 214 731 , uveřejněném 18.března 1987, který odpovídá US patentové přihlášce č. 886 867, podané 16. července 1986, se uvádí celá řada sloučenin, které jsou příbuzné přírodním nebo známým avermectinovým derivátům, avšak nejsou přírodního původu a mají nový substituent v poloze 25. Ve spisu se rovněž popisuje způsob výroby těchto látek fermentací mikroorganismů, produkujícího avermectin za přítomnosti určitých karboxylových kyselin nabo derivátů těchto kyselin, nebo jejich prekurzorů. Mikroorganismy S. avermitilis, užité k výrobě uvedených nových avermectinových derivátů, substitovaných na uhlíkovém atomu v poloze 25, jsou S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 a NCIB 12121. Poslední z těchto organismů, popsaný v evropském patentovém spisu č. 214 731, je odvozen od S. avermitilis ATCC 31271. Při použití tohoto mikroorganismu je možno získat zlepšené výtěžky nových avermectinových derivátů, substitovaných v poloze 25 v případě, že se tyto mikroorganismy pěstují na určitém prostředí. Každý z kmenů ATCC 31267, 31272, 31271 a NCIB 12121 může také produkovat kromě nových derivátů, substitovaných v poloze 25, ještě různá množství známých přírodních avermectinů, v nichž je substituentem v poloze 25 izopropylová nebo sek-butylová skupina (1-metylpropyl).

Uhlíková kostra avermectinu, která bude dále znázorněna, je odvozena od acetátů a propionátů a substinent v poloze 25 přírodních avermectinů je odvozen od L-izoleucinu (R=(S)-sek-butyl) nebo od L-valinu (R=izopropyl), jak bylo popsáno v publikaci Fisher a Mrozik, Macrolide Antibiotics, Academie Press (1984) kap. 14.

Pod pojmem známé nebo přírodní avermectiny se rozumí ty látky, které jsou produkovány S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 a ATCC 31272, přičemž substituentem v poloze 25 je buď izopropyl nebo (S)-sek-butyl(1-metylpropyl). Avermectiny, které nesou v poloze 25 jiný substituent než izopropyl nebo sek.butyl((S)-forma), se nazývají novými avermectiny, nebo avermectiny jiného než přírodního původu.

Kmeny S. avermitilis, které jsou uvedeny ve svrchu zmíněných US patentových spisech, produkují skupinu látek, které se souhrn

-1CZ 279782 B6 ně označují jako C-076. Tato skupina látek sestává z osmi zřetelně odlišných, avšak blízce příbuzných sloučenin, které se obvykle označují jako C-076, Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a a B2b. Skupina a uvedených sloučenin zahrnuje přírodní avermectiny, v nichž je substituentem v poloze 25 (S)-sek-butyl, skupina b uvedených sloučenin zahrnuje ty látky, v nichž je substituentem v poloze 25 izopropylový zbytek. Označení A a B se týká avermectinu, v nichž substituentem v poloze 5 je v prvním případě metoxyskupina a ve druhém hydroxylová skupina. Číslo 1 znamená avermectiny, v nichž se v poloze 22-23 nachází dvojná vazba a číslo 2 se týká avermectinů, které obsahují v poloze 22 atom vodíku a v poloze 23 hydroxylovou skupinu.

V průběhu této přihlášky nebude užito žádných identifikujících označení, pokud jde o substituent v poloze 25 nových avermectinů. Označení AI, A2, B1 a B2 bylo zachováno pro nové avermectiny, jejichž strukturní vlastnosti odpovídají svrchu uvedeným strukturním vlastnostem dosud známých avermectinových derivátů.

Tvorba mutantů prostých účinnosti dehydrogenázy

2-oxo kyselin postranního řetězce, již byla uvedena pro Bacillus subtilis v publikaci Willecke a Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264 - 72 (1971) a pro Pseudomonas putida v publikaci Martin a další, J. Bacteriology, 115, 198-204 (1973), tvorba podobných mutantů nebyla ještě nikdy popsána v případě čeledi Streptomyces.

S. avermitilis Agly-1, mutant, který produkuje v podstatě pouze aglykony avermictinu Ala a A2a, byl popsán v publikaci Schulman a další J. Antibiot, 38(11), 1494-1498 (1985). V publikaci se popisuje také fermentace S. avermitilis Agly-1 za přítomnosti sinefunginu, čímž je možno dokázat zvýšené produkce složek aglykonu avermectinů B. Stejně tak při pěstování S. avermitilis 0,8, vysoce produkčního kmene za přítomnosti sinefunginu jako inhibitoru O-metyltransferáz dochází k produkci avermectinových derivátů, které jsou prosté 0-metylové skupiny na aglykonu na uhlíkovém atomu v poloze 5 a v oleandrosové disacharidové skupině .

US patentový spis č. 4 378 353 popisuje sloučeniny, příbuzné skupině C-076, a jejich získávání pěstováním MA-5218, což je mutant kmene S. avermitilis ATCC 31272, získaný ozářením tohoto kmene ultrafialovým světlem. Mutant je identifikován jako ATCC 31780. Sloučeniny, příbuzné skupině C-076, produkované fermentací tohoto mutantu, nemají C-076 furanový kruh. Mimoto v některých těchto látkách došlo k odštěpení jedné nebo obou oleandrosových sacharidových skupin, kdežto v jiných látkách této skupiny došlo k oxidaci skupiny v poloze 5 na ketoskupinu.

Tři skupiny O-metyltransferázových mutantů S. avermitilis, které jsou schopné produkovat avermectinové deriváty, v nichž chybí 0-metylové skupiny, byly popsány v publikaci Ruby a další, 6th Internatiónal Symposium on the Biology of Actinomycetes, Debrecen, Maďarsko, 26.-30. srpna 1985, a v publikaci Schulman a další, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7, (1987). První z těchto skupin produkuje převážně avermectiny B vzhledem k neschopnosti metylace hydroxylové skupiny v poloze 5 makrocyklického laktonového kruhu. Druhá skupina těchto mutantů produkuje 3'-O, 3-0-bis-demetylavermectiny (avermectiny, které

-2CZ 279782 B6 nemají O-metylový zbytek jako substituent v poloze 3 na obou oleandrosových monosacharidových zbytcích), tyto látky se nazývají demetylavermectiny. Třetí skupina mutantů není schopna metyláce v žádné poloze.

V publikaci Schulman a další, Fed. Proč. 44, 931 (1985) se popisuje zvýšená produkce avermectinů B fermentací S. avermitilis za přítomnosti různých látek, například sinefunginu, S-adenosylethioninu a S-adenosylhomocysteinu, které inhibují metylaci hydroxylové skupiny v poloze 5 aglykonové skupiny působením enzymu avermectin B-O-metyltransferázy. Mutanty Streptomyces avermitilis, které nemají O-metyltransferázovou účinnost a produkují zvýšené množství složek avermectinů B, již byly rovněž popsány například v publikaci Schulman a další, Antimicrobial Agents and Chemitherapy 29, 620-624 (1986).

Mutagenezí S. avermitilis je možno získat také mutanty, které již nemají účinnost dehydrogenázy 2-oxo kyselin v postranním řetězci. Tyto mutanty již nemají schopnost produkovat větší množství přírodních avermectinů v nepřítomnosti přidaných sloučenin vzorce RCOOH, v nichž R znamená izolpropyl nebo (S)-sek.butyl, nebo sloučenin, které je možno převést na sloučeniny vzorce RCOOH v průběhu fermentace. Je však překvapující a neočekávané, že při pěstování těchto mutantů došlo k produkci avermectinů, přírodních i nepřirodních v případě, že tyto mutanty byly pěstovány za přidání sloučeniny vzorce R-COOH, v němž R je izopropyl nebo (S)-sek.butyl, nebo prekurzoru sloučeniny RCOOH. Je dále překvapující, že uvedené mutanty, jimž chybí účinnost dehydrogenázy 2-oxo kyselin postranního řetězce a které jsou neschopné rozkládat L-izoleucin, L-leucin nebo L-valin, jsou schopné asimilovat celou řadu různých sloučenin do biosyntetických pochodů, které probíhají při tvorbě nepřirodních avermectinů, přičemž dochází k tvorbě těchto látek, které jsou prosté přítomnosti přírodních avermectinů.

Mutagenezí takto získaných jednoduše blokovaných mutantů vznikají mutanty, které jsou prosté účinnosti dehydrogenázy

2-oxo kyselin v postranním řetězci a účinnosti O-metyltransferázy avermectinů B. Takto dvojnásobně blokované mutanty jsou neočekávaně schopné produkovat v podstatě pouze přírodní a nepřírodní avermectiny B v případě, že jsou pěstovány v prostředí, k němuž byla přidána sloučenina obecného vzorce R-COOH, v němž R má svrchu uvedený význam.

Jak již bylo uvedeno, jsou přírodní avermectiny produkovány jako komplexní směs osmi od sebe odlišných, avšak blízce příbuzných sloučenin obecného vzorce I, v němž R znamená izopropyl nebo (S)-sek.butyl. Jednotlivé složky tohoto komplexu byly izolovány v podstatě čisté formě, jak bylo uvedeno v US patentovém spisu č. 4 429 042, přičemž způsob izolace jednotlivých složek je přinejmenším pracný. Avermectiny B mají obvykle vyšší anthelmintickou účinnost, než odpovídající avermectiny A. Při produkci nepřírodních avermectinů (složky A a B) způsobem, popsaným v evropském patentovém spisu č. 214 731, může rovněž docházet ke vzniku přírodních avermectinů v různém množství vzhledem k přítomnosti dehydrogenázy 2-oxo kyseliny v postranním řetězci a aminokyselin L-valinu a L-izoleucinu v buňkách mikroorganismů S. avermitilis a v prostředí, v němž jsou tyto mikroorganismy pěstovány.

-3CZ 279782 B6

Schopnost produkovat pouze účinnější složky B přírodního nebo nepřírodního původu, minimalizace komplexity produktu a počtu složek a zvýšení čistoty zvoleného derivátu avermectinu a tím i zjednodušení izolace jednotlivých složek celého komplexu by tedy bylo velmi žádoucí.

Kmeny S. avermitilis, které nemají účinnost dehydrogenázy

2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, je možno získat mutací kmenů S. avermitilis, produkujících avermectin, a to zejména mutací kmenů S. avermitilis STCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 nebo NCIB 12121. Získané mutanty nejsou schopné syntetizovat přírodní avermectiny s výjimkou případu, že se do živného prostředí, v nichž jsou tyto mutanty pěstovány, přidá alifatická kyselina nebo prekurzor alifatické kyseliny, nesoucí izopropylovou nebo sek.butylovou skupinu (S-formu). Tyto mutanty jsou schopné produkovat přírodní a nepřírodní avermectiny v případě, že jsou fermentovány ve vodném prostředí za aerobních podmínek, přičemž živné prostředí obsahuje příslušnou kyselinu nebo sloučeninu, kterou je možno na příslušnou kyselinu převést v průběhu fermentace.

Ty mutanty , které nemají účinnost dehydrogenázy 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, se izolují ze získaných kolonií při použití ¹⁴CO2· Při tomto postupu je nepřítomnost ¹⁴CO2 v buňkách, pěstovaných na substrátu s obsahem [¹⁴C-l]-2-izokapronové kyseliny nebo [¹⁴C-l]-2-oxo-3-metylvalerové kyseliny nebo [¹⁴C-l]-2-oxo-3-metylmáselné kyseliny důkazem nepřítomnosti účinnosti dehydrogenázy 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem.

Je překvapující a neočekávané, že popsané mutanty, které nemají účinnost dehydrogenázy 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, si uchovávají schopnost produkovat avermectiny, zejména nepřírodního původu. Neschopnost těchto mutantů k produkci derivátů přírodního koenzymu A pro acylovou skupinu alifatických kyselin při pěstování na běžném prostředí by mohla být letální mutací v případě, že by integrita membrány závisela na derivátech

2-oxokyselin, nebo kdyby nahromadění 2-oxo kyselin bylo cytotoxické. Mimoto nebylo možno očekávat, že by uvedené mutanty mohly syntetizovat acetyl CoA, nebo propionyl CoA při degradaci L-izoleucinu a L-valinu, protože vznik těchto sloučenin obvykle vyžaduje účinnost enzymu, kterou mutanty nemají. Nutnost přítomnosti acyl CoA-derivátů pro biosyntézu avermectinu vedla k očekávání, že mutanty patrně nebudou schopny produkce nepřírodních avermectinů, tento předpoklad však proti všemu očekávání nebyl potvrzen.

Nepřítomnost účinnosti dehydrogenázy 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem ve svrchu popsaných mutantech má za následek zábranu syntézy CoA s navázaným rozvětveným acylovým zbytkem alifatických kyselin z degradace L-izoleucinu, L-leucinu a L-valinu, takže do fermentačního prostředí se přidává kyselina obecného vzorce R-COOH (v němž R znamená (S)-sek.butyl nebo izopropyl), nebo prekurzor této kyseliny.

Další mutací mutantů, jimž chybí dehydrogenáza 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, je možno získat mutanty, jimž mimo to

-4CZ 279782 B6 chybí O-methyltransferáza avermectinu B. Mutanty, jimž chybí tato O-metyltransferázová účinnost avermectinu B, nejsou schopné metylace v poloze C-5 aglykonové skupiny avermectinu. Mutanty, které uvedenou účinnost nemají, produkují v podstatě pouze avermectiny B, protože nejsou schopné produkce avermectinu A.

Je zřejmé, že je možno k tomuto účelu užít jakéhokoliv mikroorganismu, který je možno získat transformací, transdukcí, genetickou rekombinací, nebo některými jinými genetickými postupy při použití nukleových kyselin nebo ekvivalentního materiálu z popsaných mikroorganismů a tak přenesením vlastností těchto mikroorganismů na další mikroorganismy.

Pod pojmem avermectin nebo avermectiny, tak, jak se užívají v průběhu přihlášky, se rozumí sloučeniny dále uvedeného vzorce I, v němž substituentem R v poloze 25 může být jakákoliv skupina, která je v této poloze asimilovatelná určitým kmenem S. avermitilis, používaným v průběhu způsobu podle vynálezu.

Popsané mutanty jsou velmi cenné pro produkci nepřírodních avermectinu B způsobem, který bude dále popsán a ilustrován jednotlivými příklady. Postup je zvláště cenný pro výrobu výhodných avermectinových derivátů, tj. sloučenin, v nichž substituentem v poloze 25 je cykloalkyl nebo cykloalkenyl vždy s 4 až 6 atomy uhlíku, popřípadě substituovaný alkylovým zbytkem o 1 až 4 atomech uhlíku, 1-metylthioetyl, nebo heterocyklický kruh s 5 nebo 6 atomy v kruhu a s obsahem kyslíku nebo síry, zvláště

3-thienyl nebo 3-furyl.

Mutace určitého kmene čeledi Streptomyces avermitilis, produkujícího avermectin, se provádí známým způsobem a je možno při ní použít celé řady mutačních činidel, jakým jsou například ultrafialové světlo, X-paprsky, přidání N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinu, etylmetansulfonátu, oxid dusitý a dusíkatý yperit, například N-metyl-bis-(2-chloretyl)aminu a podobně. Tvorbu mutací je možno uskutečnit jak na sporách, tak na vegetativních kulturách kmenů S. avermitilis, které jsou schopné produkovat přírodní avermectiny, je například možno použít kmene S. avermitilis ATCC 31272.

Na základě postupů, které jsou v oboru velmi dobře známy, je možno kolonie, získané mutagenezí podrobit selekci na nepřítomnost dehydrogenázy 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem při použití biochemických postupů, které dovolují vyšetření velkého počtu bakteriálních kolonií, které byly podrobeny náhodné mutagenezi, podle produkce ¹⁴CO₂ ze zvolených [¹⁴C-1] 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, jak bylo popsáno v publikaci Tábor a další, J. Bact. 128, 485-486, 1976.

Tento postup spočívá v tom, že se pěstují kolonie získaných mutantů ve vyhloubeních mikrotitarční plotny na vhodném živném prostředí, prostupnost buněk se zvýší působením toluenu a pak se přidá zvolená [¹⁴C-1]-2-oxo kyselina, například kyselina

2-oxoizokapronová do každého vyhloubení a prostředí se vyšetřuje nad jednotlivými vyhloubeními na přítomnost značeného oxidu uhličitého. Je možno také užít kyselinu [ ^3_4C-l]-2-oxo-3-metylvale

-5CZ 279782 B6 rovou nebo kyselinu [¹⁴C-1]-2-oxo-3-metylmáselnou místo svrchu uvedené kyseliny [¹⁴C-l]-2-oxo-izokapronové. Produkce značeného oxidu uhličitého se snadno zjišťuje tak, že se jednotlivá vyhloubení překryjí vlhkým filtračním papírem, nasyceným hydroxidem barnatým, aby bylo možno zachytit jakýkoliv značený oxid uhličitý a prokázat jej ve formě značeného uhličitanu barnatého autoradiografií. Mutanty, jimž chybí dehydrogenáza 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, poskytují autoradiogramy, které se blíží těm, které byly získány od nenaočkovaných kontrolních kolonií, to znamená, že mutanty neprodukují žádný značený uhličitan barnatý.

Takto získané mutanty se pak podrobí další mutagenezi při použití jakéhokoliv svrchu uvedeného činidla, které může způsobit vznik mutace. Takto získané kolonie se zkouší na nepřítomnost účinnosti O-metyltransferázy avermectinu B chromatografií na tenké vrstvě, nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií po předchozí fermentací, která se provádí za přítomnosti přidaného prekurzoru, například kyseliny 2-methylmáselné. Avermectiny A jsou v podstatě nepřítomné v prostředích, v nichž byly pěstovány uvedené mutanty.

Mimo produkci požadovaných allel daného kmene mikroorganismu mutagenezi umožňuje fúze protoplastů včlenění požadovaných allel jednoho kmene do chromozomu dalšího kmene. Například kmen S. avermitilis, jemuž chybí dehydrogenáza 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem a O-metyltransferáza avermectinu B, může fúzí protoplastů s kmenem S. avermitilis, který obsahuje svrchu uvedenou účinnost, produkovat kmen S. avermitilis, jemuž chybí pouzě O-metyltransferáza avermectinu B. Jak je v oboru známo, je možno získat fúzí protpolastů různé kombinace žádoucích allel z divergentních linií a spojit je v jediném kmeni.

Morfologické vlastnosti a vlastnosti při pěstování v kultuře jsou pro mutanty, získané v průběhu způsobu podle vynálezu, podstatně shodné s vlastnostmi, které byly popsány v US patentovém spisu č. 4 429 042. Rozlišující vlastností mutantů, získaným svrchu uvedeným způsobem, je skutečnost, že tyto mutanty neobsahují dehydrogenázy 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem nebo O-metyltransferázu avermectinu B. Tyto vlastnosti je možno prokázat svrchu uvedeným způsobem. Nedostatek těchto vlastností má za následek neschopnost mutantu produkovat přírodní avermectiny B při pěstování na definovaném prostředí, které je v podstatě prosté alifatických kyselin obecného vzorce RCOOH, v němž R znamená izopropyl nebo (S)-sek.butyl, nebo sloučenin, které je možno v průběhu fermentace na sloučeninu obecného vzorce RCOOH převést. Taxonomické výzkumy, které byly prováděny ve sbírce Američan Type Culture Collection, potvrdily, že vlastnosti mutantu 1-3, izolovaného při použití značeného oxidu křemičitého, jsou velmi blízké vlastnostem původního kmene ATCC 31272, popsaného v US patentovém spisu č. 4 429 042, s některými výjimkami. Mutant 1-3 (ATCC 53567) tvoří podstatně menší počet řetězců spor než mateřský kmen ATCC 31272. V našich pokusech nebylo možno použitím rafinózy zlepšit růst mutantu 1-3. Na rozdíl od pokusu, který je uveden pro kmen ATCC 31272 v US patentovém spisu č. 4 429 042, nebylo možno pozorovat růst mutantu nebo kmene ATCC 31272 při použití sacharózy jako jediného zdroje uhlíku. Mutant 1-3 nemá dehydrogenázu 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem. Dvojnásobně deficitní

-6CZ 279782 B6 mutant, kmen S. avermitilis 7881, který nemá ani dehydrogenázu

2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, ani O-metyltransferázu avermectinu B, produkovaný další mutagenezí při použití kmene 1-3 (ATCC 53567), má k původnímu mateřskému kmeni ATCC 31272 podobné taxonomické vztahy, jako mutant 1-3.

Kmeny Streptomyces avermitilis 1-3 a 7881 byly uloženy v mezinárodní sbírce kultur Americal Type Culture Collection, Rockville, Maryland, odkud je možno oba uvedené kmeny volně získat, jakmile bude udělen patent na původní přihlášku. Tyto kmeny byly označeny Streptomyces Avermitilec ATCC 53567 a ATCC 53692. Uložené kultury jsou v průběhu řízení mateřské přihlášky dostupné pouze podle ustanovení Commissioner of the United States Patent and Trademark Office pod označením 37 CFR 1.14 a 35 USC 122 v souladu se zákonem. Všechna omezení dostupnosti uvedených mikroorganismů, uložených v uvedené sbírce, však budou neodvolatelně zrušena, jakmile bude na původní přihlášku udělen patent.

Každý z kmenů S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 a BCIB 12121 je schopen produkce přírodních avermectinů, které je možno označit obecným vzorcem I

kde přerušovaná čára v poloze 22-23 znamená případnou dvojnou vazbu, η

R znamena hydroxylovou skupinu pouze v případě, že není přítomna dvojná vazba,

R znamená 4 ' -(α-L-oleandrosyl)-α-L-oleandrosylskupinu vzorce

-7CZ 279782 B6

o

R znamena atom vodíku mebo metyl

R znamená izopropyl nebo (S)-sek-butyl.

V US patentovém spisu č. 4 285 963 se popisuje avermectin obecného vzorce I, který je v poloze 25 substituovaný metylovou a etylovou skupinou, R¹ znamená hydroxylovou skupinu a R³ znamená metylový zbytek.

V avermectinech jiného než přírodního původu, které je možno získat způsobem podle vynálezu, znamená R odlišný substituent od izopropylové nebo (S)-sek.butylové skupiny.

Sloučeniny, které jsou nezbytné při biosyntéze sloučenin obecného vzorce I, se nacházejí v buňce S. avermitilis a v živném prostředí. Tyto látky vznikají rozkladem L-valinu a L-izoleucinu, nebo z jejich odpovídajících 2-oxo kyselin dekarboxylací těchto 2-oxo kyselin příslušnou dehydrogenázou za současné vazby získaného produktu na koenzym A. Přítomnost těchto látek zajišťuje současnou produkci sloučenin obecného vzorce I, v nichž substituentem je izopropylová skupina a (S)-sek.butylová skupina. Samozřejmě vznikají problémy při oddělování derivátů s obsahem izopropylové skupiny od derivátů, které obsahují (S)-sek.butylovou skupinu.

V případě fermentace v živném prostředí, které obsahuje příslušné výchozí látky, jsou mutanty, získané svrchu uvedeným způsobem, schopné produkovat sloučeninu obecného vzorce I nebo častěji směs dvou sloučenin obecného vzorce I, v nichž substituent R odpovídá použité výchozí látce. Je možno získat dva produkty, které se obvykle nazývají R-avermectin B1 a B2, podle označení, které bylo použito v US patentovém spisu č. 4 429 042. Substituent R se nachází v poloze 25 získaného výsledného produktu. Například v případě, že R znamená cyklopentylový zbytek, je možno získat následující dva avermectinové deriváty:

triviální název	R1	R3
cyklopentylavermectin B1	dvojná vazba	H
cyklopentylavermectin B2	hydroxyskupina	H

V avermectinových derivátech nepřírodního původu má substituent R v poloze 25 obecného vzorce I odlišný význam od izopropylové nebo (S)-sek.butylové skupiny.

-8CZ 279782 B6

Sloučeniny obecného vzorce I, v nichž je přítomna dvojná vazba a které neobsahují hydroxylovou skupinu, je možno získat také z odpovídajících sloučenin obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxylovou skupinu a sloučenina neobsahuje dvojnou vazbu, dehydratací. Reakce se provádí tak, že se nejprve selektivně chrání hydroxylové skupiny, které se nacházejí v polohách 5 a 4, například navázáním terc.butyldimetylsilyloxyacetylové skupiny, načež se provádí reakce se substituovaným thiokarbonylhalogenidem, například se (4-metylfenoxy)thiokarbonylchloridem s následným zahříváním ve vysokovroucím organickém rozpouštědle, například v trichlorbenzenu, k dosažení dehydratace. V získaném produktu se pak odštěpí ochranné skupiny, čímž se získá nenasycená výsledná látka. Tento postup spolu s příslušnými reakčními činidly a reakčními podmínkami byl popsán v US patentovém spisu Č. 4 328 335.

η

Sloučeniny obecného vzorce I, v němž R znamená atom vodíku a dvojná vazba není přítomná, je možno získat z odpovídajících sloučenin , které obsahují dvojnou vazbu a neobsahují substituent R¹ selektivní katalytickou hydrogenací při použití příslušného katalyzátoru. Redukci je možno uskutečnit například při použití tris-(trifenylfosfin)rhodiumchloridu s obsahem jednovazného rhodia, jak bylo popsáno v uveřejněné evropské patentové přihlášce č. 0001689 a v odpovídajícím US patentovém spisu č. 4 199 569, vydaném 22. dubna 1980.

Sloučeniny obecného vzorce I, v němž R² znamená atom vodíku, je možno získat z odpovídajících sloučenin, v nichž R² znamená 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxyskupinu tak, že se odstraní 4'-(α-L-oleandrosyl)-α-L-oleandrosová skupina mírnou hydrolýzou působením kyseliny ve směsi vody a organického rozpouštědla, čímž se získá aglykon s hydroxyskupinou v poloze 13. Tento aglykon se pak halogenuje, například reakcí s benzensulfonylhalogenidem, čímž se získá 13-deoxy-13-halogenovaný derivát, který se pak podrobí selektivní redukci, například při použití hydridu tributylcínu. Aby bylo možno zabránit nežádoucím vedlejším reakcím, je žádoucí chránit jakoukoliv další hydroxylovou skupinu, například navázáním ochranné terc.butyldimetylsilylové skupiny. Tuto skupinu je pak možno snadno odstranit po provedené halogenaci nebo redukci působením metanolu, který obsahuje malé množství kyseliny. Všechny tyto postupy jsou spolu s příslušnými reakčními činidly a reakčními podmínkami při jejich provádění popsány v uveřejněné evropské patentové přihlášce č. 0002615.

Sloučeniny, které je možno využit při fermentaci S. avermitilis pro biosyntézu avermectinů, jak přírodního tak nepřirodního původu, je možno vyjádřit obecným vzorcem II-A

R - COOH (II-A) včetně sloučenin, které je možno převést na sloučeniny II-A v průběhu fermentačního postupu. Tyto látky jsou také nazývány primery. V obecném vzorci II-A znamená R skupinu s řetězcem, vysvětleným v α-poloze, přičemž atom uhlíku, k němuž je vázána skupina -COOH, je rovněž vázán na alespoň dva další atomy nebo skupinu, odlišné od atomu vodíku. Je zřejmé, že toto vymezení

-9CZ 279782 B6 zahrnuje nasycené i nenasycené acyklické a cyklické skupiny, včetně skupin, které popřípadě obsahují jako heteroatom atom kyslíku nebo síry jako člen acyklického řetězce nebo kruhu.

Substituent R, který se nachází v poloze 25, může tedy být alkylový zbytek, alkenylový zbytek, alkinylový, alkoxyalkylový nebo alkylthioalkylový zbytek vždy o 3 až 8 atomech uhlíku, rozvětvený v poloze a, cykloalkylalkylový zbytek o 5 až 8 atomech uhlíku, v němž alkylová skupina obsahuje 2 až 5 atomů uhlíku a je rozvětvena v poloze a, dále cykloalkyl o 3 až 8 atomech uhlíku nebo cykloalkenyl o 5 až 8 atomech uhlíku, vždy popřípadě substituovaný metylénovým zbytkem nebo jednou nebo větším počtem alkylových skupin o 1 až 4 atomech uhlíku, nebo atomy halogenu, a to fluoru, chloru, jodu nebo bromu, dále heterocyklický zbytek o 3 až 6 atomech v kruhu s obsahem kyslíku nebo síry, a to nasycený, nebo zcela nebo částečně nenasycený a popřípadě substituovaný jednou nebo větším počtem alkylových skupin nebo atomů halogenu.

Sloučeniny, které je možno převést na sloučeniny obecného vzorce RCOOH, tj. prekurzory, které je možno v průběhu fermentačního postupu na tyto sloučeniny převádět, je možno vyjádřit obecným vzorcem II-B

R - (CH₂)_n - Z (II-B) kde R má svrchu uvedený význam, n znamená 0, 2, 4 nebo 6 a

Z znamená skupiny -CH₂OH, -CHO, -CH₂NH₂, -COOR⁴ nebo -CONHR⁵, kde

R⁴ znamená atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 6 atomech uhlíku a

R⁵ znamená atom vodíku, alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, nebo zbytek aminokyseliny, zvláště asparagové, glutamové nebo methioninu, například -CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH a -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃.

Do vynálezu spadají rovněž izomerní formy sloučenin obecného vzorce II-A a sloučeniny, které je na tyto sloučeniny možno převést v průběhu fermentačního postupu, a tedy i způsob izomerních avermectinů v poloze 25, které je možno získat při použití svrchu uvedených sloučenin způsobem podle vynálezu.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se pěstuje za aerobních podmínek kmen S. avermitilis, který neobsahuje dehydrogenázu 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem ani O-metyltransferázu avermectinů B, ve vodném živném prostředí, které obsahuje využitelné zdroje dusíku, uhlíku, anorganické soli a sloučeninu obecného vzorce RCOOH, nebo sloučeninu, kterou je možno na uvedenou sloučeninu převést, tj. prekurzor, který se na uvedenou látku převádí v průběhu fermentace. Uvedená kyselina nebo sloučenina, kterou je na tuto kyselinu možno převést, se do fermentačního prostředí přidává buď při naočkování živného prostředí nebo v různých intervalech v průběhu fermentace. Výroba avermectinových derivátů se sleduje tak, že se odebírají vzorky fermentační

-10CZ 279782 B6 ho prostředí, tyto vzorky se extrahují organickým rozpouštědlem a produkce analyzuje chromatograficky, například při použití vysokotlaké kapalinové chromatografie. Inkubace trvá tak dlouho, dokud se nedosáhne maximálního výtěžku výsledného produktu, za obvyklých podmínek 4 až 15 dnů.

S výhodou se přidává svrchu uvedená sloučenina, a to karboxylová kyselina nebo sloučenina, kterou je možno na tuto karboxylovou kyselinu převést, v množství 0,05 až 3,0 g na litr. Sloučeninu je možno přidávat kontinuálně, přerušovaně nebo je možno přidat celé množství najednou. Kyselinu obecného vzorce RCOOH je možno přidat jako takovou nebo ve formě soli, například ve formě soli sodné, lithné nebo amonné, nebo ve formě sloučeniny, kterou je možno na uvedenou kyselinu převést, jak již bylo uvedeno. V případě, že se kyselina nachází v pevné formě, s výhodou se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, například ve vodě nebo v alkoholu o 1 až 4 atomech uhlíku.

Prostředí, které se užívá pro fermentaci, může být, a to zvláště v případě, že substituentem v poloze 25 má být izopropylový zbytek nebo (S)-sek.butylový zbytek, některé z obvyklých prostředí, která obsahují využitelné zdroje uhlíku, dusíku a stopových prvků. V případě, že substituentem v poloze 25 má být skupina, která se v přírodních avermectinech nevyskytuje, tj. skupina, odlišná od izopropylové nebo (S)-sek.butylové skupiny, je fermentační prostředí voleno tak, aby zvolené složky neobsahovaly látky, v nichž R znamená izopropyl nebo (S)-sek.butyl, nebo aby obsahovaly pouze velmi malé množství těchto látek.

Po fermentaci, která trvá několik dnů při teplotě, pohybující se s výhodou v rozmezí 24 až 33 ^CC, se fermentační prostředí odstředí nebo zfiltruje a takto oddělené mycelium se extrahuje, s výhodou při použití acetonu nebo metanolu. Organický extrakt se zahustí a požadovaný produkt se pak extrahuje organickým rozpouštědlem, mísitelným s vodou, například metylénchloridem, etylacetátem, chloroformem, butanolem nebo metylizobutylketonem. Takto získaný extrakt se pak odpaří do sucha a takto získaný surový produkt se pak dále čistí podle potřeby chromatograficky, například při použití preparativní chromatografie v reverzní fázi, nebo vysokotlaké kapalinové chromatografie.

Výsledný produkt se obvykle získá ve formě směsi sloučenin obecného vzorce I , v němž R znamená 4'-(a)-L-leandrosyl)-a-L, η

-oleandrosyloxyskupinu a bud R znamena hydroxylovou skupinu *] a dvojná vazba není přítomna, nebo R znamena atom vodíku a sloucenina obsahuje dvojnou vazbu, R znamena atom vodíku. K produkci sloučenin, v nichž R³ znamená metylový zbytek, v podstatě nedochází. Podíl určitých sloučenin v získaném produktu se však může měnit v závislosti na použitém mutantu mikroorganismu a na použitém primeru, jakož i na použitých fermentačních podmínkách.

Zdroje substituentů R, a to ať přímo sloučeniny obecného vzorce RCOOH, nebo některého z jejich prekurzorů, nemají žádný podstatný vliv na produkci avermectinového derivátu. Kritickým požadavkem na provádění způsobu podle vynálezu pro výrobu uvedených derivátů je skutečnost, aby požadovaná skupina R byla

-11CZ 279782 B6 dostupná pro použité kmeny S. avermetilis v průběhu fermentačního postupu.

Jako primery je možno užít zejména následující sloučeniny:

2.3- dimethylmáselná,

2-methylhexanová,

2-metyl-4-pentenová,

2- cyklopropylpropionová,

4.4- difluorcyklohexankarboxylová ve formě lithné soli, metyléncyklohexankarboxylová,

3- metylcyklohexankarboxylová (cis/trans), 1-cyklopentenkarboxylová,

1- cyklohexenkarboxylová, tetrahydropyran-4-karboxylová, thiofen-2-karboxylová,

3-a-furankarboxylová,

2- chlorthiofen-4-karboxylová, cyklobutankarboxylová, cyklopentankarboxylová, cyklohexankarboxylová, cykloheptankarboxylová,

2- metylcyklopropankarboxylová,

3- cyklohexen-l-karboxylová,

2-metylpropionová,

2-metyl-4-metoxomáselná, thiofen-3-karboxylové, kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina kyselina hydroxymetylcyklopentan,

3-thiofenkarboxaldehyd, kyselina 3-cyklohexylpropionová, kyselina 3-cyklopentylpropionová, hydroxymetylcyklobutan, kyselina tetrahydrothiofen-3-karboxylové,

3-cyklopentyl-l-propanol,

3- metylcyklobutankarboxylová kyselina ve formě lithné soli, kyselina kyselina kyselina kyselina cyklobutylmeylamin, etylcyklobutankarboxylát,

4- hydroxymetylcklopenten, etylester kyseliny 2-(3-thiofenkarbonyl)propionové, kyselina S-2-metylpentanová, kyselina R-2-metylpentanová.

3-fluorcyklobutankarboxylová, 3-metylénxyklobutankarboxylová ve formě lithné soli, 2-metyl-4-metylthiomáselná, tetrahydrothiopyran-4-karboxylová,

Z mutantů, které neobsahují dehydrogenázu 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem a které byly popsány, je možno získat tři skupiny mutantů s ohledem na přítomnost O-metyltransferázy. Mutanty, v nichž je mutace dehydrogenázové účinnosti pro 2-oxo kyseliny s rozvětveným řetězcem spojena s jednou nebo větším počtem mutací O-metyltransferázy, dávají vznik kmenům S. avermitilis, které budou schopné při dodání sloučenin obecného vzorce RCOOH do živného prostředí nebo při dodání sloučenin, které je možno na uvedené látky převést v průběhu fermentačního procesu, produkovat primárně avermectiny B, demetyl avermectiny nebo avermectiny, které již nejsou vůbec metylovány. Uvedené mutanty je možno získat získáním dalších mutantů z mutantů svrchu uvedených,

-12CZ 279782 B6 které neobsahují dehydrogenázu 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, a to běžnými postupy, jako jsou působení ultrafialového světla a/nebo působením chemických mutagenů, například N-metyl-N-nitrosouretanu, nitrozoguanidinu nebo dalších sloučenin, tak, jak byly svrchu uvedeny. Je také možno postupovat tím způsobem, že se použijí mutanty, které obsahují dehydrogenázu

2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, avšak neobsahují jednu nebo větší počet o-methyltransferáz, a dosáhnout další mutace působením ultrafialového světla nebo působením některých mutagenů chemického původu za získání mutantů, které již neobsahují dehydrogenázu 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem.

Avermectiny nepřírodního původu, které jsou produkovány takto získanými mutanty, jsou charakterizovány přítomností hydroxylové skupiny v poloze 5 aglykonového zbytku a/nebo v poloze 3' a/nebo v poloze 3 oleandrosové skupiny.

Svrchu uvedené mutanty byly identifikovány způsobem, který byl popsán v publikaci Schulman a další, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29., 620-624 (1986). Takto získané avermectinové deriváty je možno použít stejným způsobem a ke stejným účelům, jako známé avermectinové deriváty.

Obdobně je možno získat velká množství avermectinů B včetně derivátů, které neobsahují metylovou skupinu na oleandrosové disacharidové skupině tak, že se k fermentaci užijí svrchu uvedené mutanty, které neobsahují účinnou dehydrogenázu 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem za přítomnosti některých látek, například sinefunginu, S-adenosylethioninu nebo S-adenoxylhomocysteinu, které působí inhibici účinnosti O-metyltransferázy.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu, jsou vysoce účinné antiparazitální látky, které je možno užít zejména jako anthelmintika, ektoparaziticidní, insekticidní a akaricidní prostředky.

Svrchu uvedené látky jsou tedy účinné při léčbě různých stavů, které jsou způsobeny endoparazity, a to zejména helminthiázy, která je nejčastěji způsobena skupinou parazitických hlístů, které se označují jako nematody a které mohou způsobit těžké hospodářské ztráty u vepřů, ovcí, koní a skotu, i u dalších hospodářských zvířat, věčně drůbeže. Uvedené látky jsou rovněž účinné proti dalším nematodům, kteří napadají nejrůznější čeledi zvířat, jako jsou například dirofilaria u psů, a proti dalším parazitům, které mohou napadnout i člověka, včetně parazitů, kteří žijí v zažívací soustavě jako Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trinchinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, a včetně parazitů, které se nacházejí v krvi a dalších tkáních, jako jsou červi a mimostřevní stadia Strongyloides a Trichinella.

Tyto látky jsou rovněž účinné při léčbě ektoparazitárních infekcí, které zahrnují zejména arthropoda u zvířat i ptáků, jako jsou mouchy, ovádi, bodalky, další bodavý hmyz a také migrující larvy čeledi dvoukřídlých, které mohou napadat skot a koně.

Uvedené látky mají rovněž insekticidní účinek proti domácím škůdcům, jako jsou například švábi, moli a moucha domácí. Jsou

-13CZ 279782 B6 účinné i proti hmyzu na osivu a proti parazitům na plodinách, jakož i proti migrujícím jedincům rodu orthoptera.

Sloučeniny obecného vzorce I se podávají ve formě prostředků, které jsou přizpůsobeny specifickému použití těchto látek a potřebám hostitele, ohled je zapotřebí vzít také na to, proti jakému parazitu nebo hmyzu jsou sloučeniny použity. V případě použití jako anthelmintika je možno sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu, podat perorálně jako kapsle, bolus, tablety, nebo v kapalné formě, nebo je tyto látky možno podávat injekčně nebo i v implantované formě. Všechny tyto prostředky je možno připravovat běžným způsobem. Kapsle, bolus nebo tablety se připravují tak, že se účinná složka smísí s vhodným jemně práškovaným ředidlem nebo nosičem, který dále obsahuje ještě činidlo, napomáhající rozpadu a/nebo pojivo, například škrob, laktózu, mastek, stearan hořečnatý a podobně. Kapalný prostředek je možno připravit tak, že se účinná látka disperguje ve vodném roztoku spolu s dispergačním činidlem nebo smáčedlem a podobně, prostředky pro injekční podání je možno připravit například ve formě sterilních roztoků, které mohou obsahovat ještě další složky, například dostatečné množství solí nebo glukózy, aby byl roztok izotonický s krví. Tyto prostředky budou obsahovat různé množství účinné látky v závislosti na typu hostitele, na závažnosti a typu infekce a na hmotnosti hostitele. Při perorálním podání se obvykle podává dávka 0,001 až 10 mg/kg hmotnosti v jediné dávce nebo rozděleně celkem 1 až 5 dní, zásadně je však možno použít i vyšší nebo nižší dávky.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu, je možno podávat také v krmivu pro zvířata, k tomuto účelu je možno připravit také příslušné koncentráty a přidávaná·krmivá, určená k promíchání s běžným krmivém.

Při použití jako insekticidy a proti zemědělským škůdcům ze sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu, užívají jako postřiky λ poprašky, emulze a podobně běžným způsobem.

Fermentace S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567)

Stupeň 1.

S. avermitilis ATCC 31272 se pěstuje v souvislé vrstvě na agarovém prostředí (New Patch) po dobu 12 dnů při teplotě 30 °C.

Užije se živného prostředí s následujícím složením:

I šťáva V-8^X | CaCO₃ agar | voda do | živný bujón octan sodný.3H₂O

200 ml gramy gramů

1000 ml

1,0 gramů/1

1,4 gramů/1

-14CZ 279782 B6

Pokračování

kyselina izovalerová |	50	mg/1
kyselina izomáselná |	50	mg/1
kyselina metylmáselná |	50	mg/1
izoleucin |	250	mg/1
leucin |	250	mg/1
valin |	250	mg/1
roztok stopových prvkůxx I	1	ml/1

^x šťáva V-8 je směs osmi zeleninových šťáv (rajče, mrkev, celer, řepa, petržel, salát, řeřicha a špenát), soli, kyseliny aspergové a citrónové a přírodních příchutí (Campbell Šoup Company, Camden, NJ).

^xx složení roztoku stopových prvků:

složka	množství v g
FeCl3.6H2O	2,7
MnSO4.H2O	4,2
CuS04.5H2O	0,5
CaCl2	11,0
h3bo3	0,62
CoC12.6H20	0,24
ZnCl2	0,68
Na2Mo04	0,24

i_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________i__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________i

Složky se rozpustí v 1 litru O,1N HC1.

Spory se sklidí ze tří ploten a uvedou se do suspenze ve 20 ml 0,05M tris-pufru s kyselinou maleinovou o pH 9,0.

Stupeň 2 ml suspenze spor se přidá do lahvičky s obsahem 10 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidinu (NTG). Lahvička se inkubuje za protřepávání při teplotě 28 ^CC celkem 60 minut, načež se spory důkladně promyjí 1% roztokem chloridu sodného.

Stupeň 3

Promyté spory se uvedou do suspenze v 1% roztoku chloridu sodného a suspenze se smísí se stejným objemem 80% etylénglykolu. Tato suspenze se uchovává při teplotě -10 ’C a užívá se jako

-15CZ 279782 B6 zdroj buněk, které se sledují na přítomnost mutantů. Z tohoto množství je možno získat přibližně 10⁴ kolonií buněk/ml.

Tyto spory se nanesou na plotny s prostředím YPD tak, aby vzniklo přibližně 100 kolonií na jedné plotně. Prostředí YPD obsahuje vždy 10 g/1 extraktu z kvasnic, peptonu Bacto a dextrózy a 15 g/1 agaru Bacto, prostředí se upravuje na pH 6,9 před sterilizací v autoklávu. Složky, označené (x) je možno získat od Dfco Laboratoires, Detroir, Michigan 48238.

Stupeň 4

Jednotlivé kolonie se izolují z ploten po 2 až 3 týdnech růstu při teplotě 28 Ca uloží se do jednotlivých vyhloubení standardní mikrotitrační plotny s 96 vyhloubeními. Malé množství každé kolonie se také nanese na čerstvé agarové prostředí, aby bylo možno získat z kolonie další zdroj životaschopných buněk v případě, že by kolonie byla identifikována jako mutant.

Stupeň 5

Do každého vyhloubení se přidá přibližně 75 mikrolitrů prostředí M9 v kapalném stavu s obsahem 1 % glukózy, 0,1 % aminokyselin z kaseinu a 0,01 % každé z kyselin izovalerové, izomáselné a 2-metylmáselné. Po několika dnech inkubace při teplotě 28 °C se buňky sledují na přítomnost dehydrogenázy 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem.

Každý litr prostředí M9 obsahuje 6 g hydrogenfosforečnanu sodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu sodného a 1 g chloridu amonného. Prostředí se steriluzuje v autoklávu a pak se přidá 1 ml sterilizovaného 1M síranu hořečnatého a 1 ml 0,1M chloridu vápenatého za aseptických podmínek.

Stupeň 6

Mikrosuspenze 5% toluenu v prostředí M9 se připraví tak, že se nemísitelná směs podrobí působení ultrazvuku. K 25 ml získané suspenze se přidá 1,2 ml roztoku s obsahem [¹⁴C-l]-2-oxokapronové kyseliny v množství 2,5 μο/ml a 10,0 μο/μιηοΐ. 50 mikrolitrů této směsi se pak přidá do každého vyhloubení nitrotitrační plotny, která obsahuje zkoumané kolonie.

Stupeň 7

Značený oxid uhličitý, vznikající v jednotlivých vyhloubeních, se zachycuje a stanoví způsobem, popsaným v publikaci Tábor a další, J. Bacteriol. 128, 485-486 /1976/ Convenient Method for Detecting ¹⁴CO₂ in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants. Mutanty, které nemají dehydrogenázu

2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem, neprodukují větší množství značeného uhličitanu barnatého, než kontrolní kolonie.

-16CZ 279782 B6

Dalším způsobem, který zlepšuje kontrast mezi kontrolními pokusy a pozitivním pokusem na značený oxid uhličitý, bylo možno prokázat tmavou skvrnou na autoradiogramu tvorbu značeného uhličitanu barnatého, kdežto negativní výsledek není vyznačen žádnou skvrnou, nebo pouze velmi světlou skvrnou.

Jednotlivé kolonie ve svrchu uvedeném stupni 4 se odebírají z agarového prostředí již po 7 až 14 dnech růstu, a nikoliv až po dvou až třech týdnech jako svrchu, a pak se přímo sledují podle svrchu uvedených stupňů 6 a 7. Původní stupeň 5 se v tomto případě vynechá.

Ještě citlivější způsob, kterým je možno kvantitativně zjišťovat uvolňování značeného oxidu uhličitého, spočívá v tom, že se zjištěné mutanty pěstují na vhodném prostředí, které sestává z prostředí M9 s obsahem 1 % glukózy a 0,1 % Syncasa-bcaa, což je syntetická směs L-aminokyselin, přibližně odpovídající běžným aminokyselinám kaseinu, avšak bez L-valinu, L-izoleucinu a L-leucinu.

Po vypěstování buněk do vysoké hustoty se buňky promyjí prostředím M9 a znovu se uvedou do suspenze v tomtéž prostředí s obsahem 1 % toluenu. Toluen byl předem rozptýlen působením ultrazvuku, takže vznikla mléčně bílá disperze toluenu v prostředí M9. Suspenze buněk, pufru a toluenu se inkubuje 40 minut při teplotě 30 °C, čímž se buňky stanou propustnými. Takto změněné buňky se pak promyjí v prostředí M9 a pak se znovu uvedou do suspenze v 1/5 původního objemu uvedeného prostředí. K provedení zkoušky se pak užije 180 mikrolitrů takto připravené suspenze.

Reakční objem 300 mikrolitrů obsahuje buňky, pozměněné působením toluenu, 0,4 mM thiaminpyrofosfátu (TPP), 0,11 mM koenzymu A (CoA), 0,68 mM nikotinamidadenindinukleotidu (NAD), 2,6 mM dithiothreitolu (DTT), 4,1 mM chloridu hořečnatého, 60 mM tris-HCl, o pH 7,5 a 6,000 cpm [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronátu mikrocurie na mikromol. Účinnost počítání impulzů byla 73 %. Reakce byla prováděna v 15 ml scintilačních nádobkách s obsahem 2x2 cm papíru Whatman 4, který byl natlačen do šroubovacího uzávěru lahvičky. Papír obsahuje 30 mikrolitrů 1M Hyaminhydroxidu (1M roztok metylbenzethonimhydroxidu v metanolu, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), který zachycuje značený oxid uhličitý, vyvíjející se při reakci. Směs se inkubuje 2 hodiny, načež se papír ponoří do 10 ml Beckman Aquasol II (universální LSS (kapalina pro scintilační počítač), New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118) a radioaktivita se měří kapalinovým scintilačním počítačem po dosažení rovnovážného stavu ve svrchu uvedeném rozpouštědle po dobu alespoň 4 hodin. Slepá kontrola, která neobsahuje žádné buňky, poskytuje 50 až 300 impulzů za minutu.

Mutanta 1-3 a podobné mutanty poskytují počty impulzů, které přibližně odpovídají slepé reakci, která neobsahuje buňky, kdežto původní kmen poskytuje několikrát vyšší počty impulzů, než slepá kontrola.

Složení stonásobného koncentrátu Syncasa-bccaa

-17CZ 279782 B6

složka	g/i
L-alanin	3
L-arginin	4
L-asparagová kyselina	6
L-cystin	1
L-glutamová kyselina	20
glycin	1
L-histidin	2
L-lysin	7
L-methionin	3
L-fenylalanin	6
L-prolin	10
L-serin	6
L-threonin	4-
L-tyrosin	4
L-tryptofan	1

Směs se upraví na pH 7 a sterilizuje se filtrací. Jeden objem koncentrátu se přidá k 99 objemům prostředí, aby bylo možno dosáhnout standardní výsledné koncentrace.

Produkce dvojnásobně blokovaných mutantů S.avermitilis 7881 (ATCC 53692), kterým chybí dehydrogenáza 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem a O-metyltransferáza pro avermectin B

Stupeň 1

S. avermitilis ATCC 53567 se pěstuje v souvislé vrstvě na agarovém prostředí (New Patch) celkem 12 dní při teplotě 30 ’C.

Spory se sklidí ze tří ploten a uvedou se do suspenze ve 20 ml 0,05M tris-pufru s kyselinou maleinovou o pH 9,0.

Stupeň 2 ml získané suspenze spor se přidá do lékovky, která obsahuje 10 mg N-methyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidinu (NTG). Lahvička se inkubuje za stálého protřepávání 60 minut při teplotě 28 °C, načež se spory důkladně promyjí 1% roztokem chloridu sodného.

Stupeň 3

Promyté spory se uvedou do suspenze v 1% roztoku chloridu sodného a smísí se se stejným objemem 80% etylénglykolu. Tato suspenze se uchovává při teplotě -20 °C a užívá se jako zdroj buněk, zkoumaných na přítomnost mutantů.

Spory se pak nanesou na plotny s prostředím YPD tak, aby bylo získáno přibližně 100 kolonií na jedné plotně. Kolonie, které byly zpracovány působením nitrózoguanidinu se vzniklými mutacemi kmene Streptomyces avermitilis 1-3 (ATCC 53567), se izolují a nanesou se na agarové prostředí následujícího složení

-18CZ 279782 B6 (gramy/litr): 80 škrobu, 1 hydrogenfosforečnanu draselného, 1

MgSO₄.7H₂O, 5 prostředku ardamine PH, 5 uhličitanu vápenatého, 1 ml P-200, 0,01 FeSO₄.7H₂O, 0,001 MnCl₂.4H₂0, 0,001 ZnSO₄.7H₂O, 17 Bacto agaru, destilovaná voda do 980 ml. Pak se upraví pH na 7,0 hydroxidem sodným, načež se směs sterilizuje v autoklávu 20 minut při teplotě 121 °C. Po sterilizaci v autoklávu se přidá 20 ml sterilního 5% zásobního roztoku kyseliny (±)-2-metylmáselné o pH 7,0.

Agarové kultury se inkubují 8 až 12 dnů při teplotě 28 °C. Pak se buňky (mycelia) z povrchu agaru odeberou a vloží se do 250 mikrolitrů acetonu. Pak se 25 mikrolitrů acetonového extraktu nanese na chromatografické plotny pro chromatografii na tenké vrstvě (Analtech Silica Gel GF). Chromatogram se vyvíjí 30 až 40 minut při použití etylacetátu jako rozpouštědla, načež se usuší a pak se postřikuje tříprocentním roztokem vanilinu v etanolu. Pak se plotny uloží do sušící pece při teplotě 100 °C na 1 až 3 minuty, načež se postříkají 3% roztokem kyseliny sírové v etanolu a znovu uloží do pece při teplotě 100 °C na 10 až 15 minut. Mutanty, kterým chybí O-metyltransferáza avermectinu B, je možno identifikovat změnou chromatogramu, skvrny, odpovídající avermectinu B (Rf přibližně 0,54, 0,42 pro B1 a B2), jsou stále přítomny, avšak skvrny, odpovídající složkám avermectinu A (Rf přibližně 0,69, 0,58 pro AI a A2), chybí.

Postup s použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie

Mobilní fáze

150 ml vody ml acetonitrilu do 1 litru metanol.

Sloupec

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92643-3100) průtok: 0,75 ml/min detekce: ultrafialovým světlem o 240 nm zeslabení: přibližně 6

Ředidlo pro vzorek (D):

ml acetonitrilu + 390 ml metanolu

Standardy:

1. naváží se 0,5 mg avermectinu A2A do baňky o objemu 10 ml a objem se doplní metanolem

2. naváží se 0,5 mg zkoumané látky do baňky o objemu 10 ml a objem se doplní metanolem.

Roztoky 1 a 2 jsou standardní zásobní roztoky. V případě použití se smísí 100 μΐ roztoku 1 a totéž množství roztoku 2 v lahvičce a přidá se 800 μΐ mobilní fáze.

-19CZ 279782 B6

Vzorky:

1. 1 ml protřepaného bujónu se odstředí

2. odstraní se co největší množství supernatantu bez porušení usazeniny,

3. přidá se 100 μΐ vody, vhodné pro vysokotlakou chromatograf ii k usazenině a usazenina se nyní disperguje,

4. přidají se 2 ml ředidla D a vše se promísí,

5. výsledná směs se zfiltruje a provede se chromatografie.

Avermectinové deriváty přírodního a nepřírodního typu, tak, jak byly v průběhu přihlášky popsány, byly podrobeny svrchu uvedené vysokotlaké kapalinové chromatografii a doba retence vrcholu pro jednotlivé avermectinové deriváty byla dělena retenční dobou pro oligomycin A, který byl užit jako vnitřní standard. Oligomycin A je téměř vždy pozorován při vysokotlaké kapalinové chromatograf ii jako vedlejší produkt při fermentaci S. avermitilis a je jediným produktem, který je možno odlišit vysokotlakou kapalinovou chromatografií v produktech popsaných mutantů v případě, že tyto mutanty jsou pěstovány v prostředí, prostém kyselin obecného vzorce RCOOH, v němž R má svrchu uvedený význam, nebo prostředí, prostém sloučenin, které je na uvedené kyseliny možno převést. Typický retenční čas pro oligomycin A je 12,5 až 14 minut. Podíl retenčních dob (RT) poskytuje možnost srovnat totožnost a výtěžky avermectinových derivátů. Pořadím, s jakým se vymývají při provedení chromatografie avermectinové deriváty, je B2, A2, B1 a Al.

přírodní avermectin	RT(RT (oligomycin A)
B2b	0,70
B2a	0,84
A2b	0,90
A2a	1,09
Blb	1,40
Bia	1,83
Alb	1,83
Ala	2,42

Z tabulky je zřejmé, že nedošlo k oddělení derivátu Bia a Alb od sebe navzájem.

nepřírodní avermectin	RT/RT (oligomycin A)
cyklopentyl B2	0,94
cyklopentyl A2	1,23
cyklopentyl B1	1,99
cyklopentyl Al	2,62

Doba retence byla v rozmezí 1 až 2 minuty, oligomycin A se obvykle vymývá přibližně po 12,5 až 14 minutách.

-20CZ 279782 B6

V následujících příkladech byly avermectinové deriváty stanoveny svrchu uvedeným postupem, není-li uvedeno jinak.

Bylo užito následujících živných prostředí:

Prostředí AS-7

3/1 hydrolyzovaný škrob³20

Ardamine pH¹³5

Pharmadeia^c15

CaCO₃2 ³ Připravený hydrolýzou škrobu působením α-amylázy z Bacillus licheniformis (Novo Enzymes, Wilton, CT obchodní název Thermamyl), dextrozový ekvivalent je 40 % ± 5 %.

b je produkt Yeast Products, lne., Clifton, NJ 07012 ^c produkt Traders Protein., Memphis, TN 38108.

Prostředí se upraví na pH 7,2 hydroxidem sodným.

Prostředí AP-5

3/1 hydrolyzovaný škrob80

Ardamin pH5 k₂hpo₄1

MgSO₄.7H₂O1

NaCl1

CaCO₃7

FeSO₄.7H₂O0,01

MnCl₂.7H₂O0,001

ZnSO₄.7H₂O0,001

P-2000 (protipěnivé činidlo)³ 1 ml/1 ³ Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640, pH se upraví na 6,9 25% hydroxidem sodným.

Příklady 1 až 4

Avermectiny kmene Streptomyces avermitilis 1-3 (ATCC 53567)

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) ze sporulované plotny V-8 se naočkuje do 80 ml prostředí AS-7 v baňce o objemu 500 ml. Baňka se inkubuje na rotační třepačce za míchání 200 ot/min při teplotě 28 až 30 °C. Po 24 hodinách inkubace se 1 ml živného prostředí užije k naočkování baněk s objemem 300 ml a obsahem 40 ml prostředí AP-5. Každá fermentace se provádí dvakrát při teplotě 28 až

-21CZ 279782 B6 “C za přítomnosti 400 ppm každého ze svrchu uvedených primerů, které se přidávají po 24 hodinách.

Po 312 hodinách se vzorky o objemu 2 ml smísí s 8 ml směsi metanolu a acetonitrilu v poměru 390 : 35. Po filtraci se 50 μΐ vzorku vstřikne do sloupce Beckman Ultrasphere ODS s rozměrem 3,9x250 mm. Sloupec se promývá směsí metanolu, acetonitrilu a vody v poměru 89:14:7 při průtoku 0,8 ml/min a eluát se sleduje v ultrafialovém světle při 240 nm. Retenční doby nových avermectinů jsou uvedeny v následující tabulce:

Primer	Retenční doby v minutách
B2	A2	Bl	AI
1) kyselina ±2methylmáselná	xll,60	X14,75	23,1	29,82
	12,40	16,10
2) kyselina cyklopentankarboxylová	12,32	15,86	25,28	32,96
3) kyselina cyklohexankarboxylová	14,84	19,26	31,46	41,14
4) kyselina +2 metylmáselná	11,60	14,75	23,1	29,82

V

Do avermectinových derivátů je možno včlenit kyselinu +metylmáselnou i -metylmáselnou. Za použití chromatografických podmínek bylo dosaženo vzájemného oddělení + a - avermectinu pouze v případě derivátu B2 a A2.

Příklad 5

Cyklohexyl avermectinu, produkované kmenem Streptomyces avermitilis 7881 (ATCC 53692)

Zmrazená kultura S. avermitilis 7881 (ATCC 53692) se naočkuje do 100 ml prostředí AS-7 v baňkách o objemu 500 ml. Baňky se inkubují na rotační třepačce při 200 ot/min a teplotě 28 až 30 °C. Po 28 hodinách inkubace se vždy 5 ml prostředí užije k naočkování dalších 100 ml prostředí AS-7, obsaženého v baňce o objemu 500 ml. Tyto baňky se znovu inkubují na rotační třepačce při 200 ot/min a teplotě 28 až 30 “C. Po 24 hodinách inkubace se 1 ml prostředí užije k naočkování baněk o objemu 300 ml s obsahem 40 ml prostředí AP-5. Baňky se inkubují při teplotě 28 až 30 °C při 200 ot/min. Po .24 hodinách se přidá 400 ppm kyseliny cyklohexankarboxylové, po 312 hodinách se odeberou vzorky o objemu 2 ml a provádí se vysokotlaká kapalinová chromatografie způsobem podle příkladu 1. Za těchto podmínek se jediné složky avermectinu, zjištěné ve fermentačním prostředí, vymývaly po 14,84 minutách (54,9 mg/1) a o 31,46 inutách (32,1 mg/1), což odpovídá avermectinu cyklohexyl B2 a Bl.

-22CZ 279782 B6

Příklad 6

Sek. butyl avermectinové deriváty ze Streptomyces avermitilis 7881 (ATCC 53692)

Byl opakován způsob podle příkladu 5 s tím rozdílem, že bylo užito 400 ppm kyseliny ±2-metylmáselné místo kyseliny cyklohexankarboxylové, jinak byly podmínky stejné jako v příkladu 2. Ve fermentačním prostředí bylo možno prokázat pouze sek.butyl avermectin B2 (11,60, 12,40 minut, 63,5 a 42,4 mg/1) a sek.butylavermectin B1 (23,1 minut, 105,5 mg/1).

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Streptomyces avermitilis ATCC 53692, postrádající dehydrogenázovou aktivitu 2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem a O-metyltransferázovou aktivitu avermectinu B, charakterizovaný neschopností svých permeabilizovaných buněk produkovat ¹⁴CO₂ z přidané [¹⁴C-1]-2-oxoizokapronové kyseliny.
2. 2. Způsob přípravy avermectinu B, vyznačující se tím, že se za aerobních podmínek fermentuje kmen Streptomyces avermitilis, který postrádá dehydrogenázovou aktivitu

   2-oxo kyselin s rozvětveným řetězcem a O-metyltransferázovou aktivitu avermectinu B, po dobu až 15 dní při teplotě v rozmezí od 24 'C do 33 ‘C ve vodném živném prostředí, obsahujícím využitelný zdroj dusíku, uhlíku a anorganických solí, jako je hydrolyzovaný škrob, Ardamine pH, uhličitan vápenatý CaC0₃, hydrogenfosforečnan draselný K₂HPO₄, síran hořečnatý MgSO₄, chlorid sodný NaCl, síran železnatý FeSO₄, chlorid manganatý MnCl₂ a síran zinečnatý ZnS0₄, a sloučeninu, schopnou utilizace při biosyntéze avermectinu, která má obecný vzorec

   R-COOH ve kterém znamená R skupinu s α-rozvětveným řetězcem, jehož uhlíkový atom, na který je vázána skupina -COOH, je vázán na přinejmenším dva jiné atomy nebo skupiny odlišné od vodíku, nebo sloučeninu, kterou je možno na uvedenou sloučeninu převést v průběhu fermentace.
3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že jako sloučeniny, která je přeměnitelná na substrát obecného vzorce R-COOH, se použije sloučeniny obecného vzorce

   R-(CH₂)_n-Z ve kterém má R již uvedený význam, n je o, 2, 4 nebo 6,

   -23CZ 279782 B6

   Z je skupina -CH₂OH, -CHO, -COOR⁴, -CH₂NH₂ nebo -CONHR⁵, ve kterých R⁴ je atom vodíku nebo alkylová skupina, obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, a

   R⁵ je atom vodíku, alkylová skupina, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, -CH(COOH)CH₂COOH, -ch(cooh)(ch₂)₂cooh nebo -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃.
4. 4. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že v uvedené sloučenině je skupinou R cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina, cyklohexylová skupina, cykloheptylová skupiny, 2-metylcyklopropylová skupina,

   3-cyklohexenylová skupina, 1-cyklopentenylová skupina,

   1- cyklohexenylová skupina, 3-metylcyklohexenylová skupina (cis/trans), 4-metyléncyklohexylová skupina,

   3-metylcyklobutylová skupina, 3-metyléncyklobutylová skupina,

   3-cyklopentenylová skupina, 1-cyklopropyletylová skupina,

   3-fluorcyklobutylová skupina, 4,4-difluorcyklohexylová skupina, izopropylová skupina, sekundární butylová skupina,

   2- pentylová skupina, 2,3-dimetylpropylová skupina,

   2-hexylová skupina, 2-pent-4-enylová skupina,

   2- metylthioetylová skupiny, S-2-pentylová skupina, R-2-pentylová skupiny, 2-thienylová skupina,

   3- thienylová skupina, 4-tetrahydropyranylová skupina,

   3-furylová skupina, 2-chlorthienylová skupina,

   3- tetrahydrothienylová skupina, 4-metylthio-2-butylová skupina, 4-tetrahydrothiopyranylová skupina,

   4- metoxy-2-butylová skupina nebo 4-metylthio-2-butylová skupina.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že skupina R je odvozená od karboxylové kyseliny obecného vzorce R-COOH.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že R je cyklopentylová skupina, cyklohexylová skupina nebo thienylová skupina.
7. 7. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím, že skupina R je odvozena od sloučeniny, přeměnitelné na sloučeninu R-COOH během provádění fermentačního postupu, přičemž tato sloučenina má obecný vzorec.

   R-(CH₂)_n-Z ve kterém má R již uvedený význam, n je 0, 2, 4 nebo 6,

   Z je skupina -CH₂OH, -CHO, -COOR⁴, -CH_?NH₂ nebo -CONHR⁵, ve kterých R⁴ je atom vodíku nebo alkylova skupina, obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, a

   R⁵ je atom vodíku, alkylová skupina, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, -CH(COOH)CH₂COOH,

   -CH(COOH)(CH₂)₂COOH nebo -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃.
8. 8. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že skupinou R je α-rozvětvená alkylová skupina, obsahující 3

   -24CZ 279782 B6 až 8 atomů uhlíku, kterou není izopropylová (S)-sek.butylová skupina.
9. 9. Způsob podle nároku 2 ,vyznačuj ící že uvedeným kmenem S.avermitilis je S.avermitilis skupina nebo se tím, ATCC 53692.