PT86584B

PT86584B - Processo para a producao de avermectinas b e culturas para esse fim

Info

Publication number: PT86584B
Application number: PT86584A
Authority: PT
Inventors: Shih-Jen Edward Lee; Edmund William Hafner; Kelvin Scott Holdom
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-21
Publication date: 1991-12-31
Also published as: KR900004419B1; FI90088B; YU47878B; EP0276131A3; AU1074288A; EP0276103B1; PL270239A1; ATE87927T1; HUT47978A; IL85165A0; AU603416B2; MY103514A; EP0276103A3; DD267512A5; FI90091C; IL85118A0; HU201973B; GR3007586T3; AR241798A1; EP0276131A2

Description

processo de produção das referidas avermectinas B consiste em se proceder à fermentação, sob condições aéróbicas, de uma estirpe de Streptomyces avermitilis desprovidas das actividades atrás referidas, num meio nutritivo aquoso, constituído por uma fonte assimilável de azoto, carbono e sais inorgânicos, e um composto susceptível de ser empregado na biossintese de uma aver mectina.

Este invento diz respeito a Streptomyces avermitilis desprovidas de actividade de avermectina B-O-metiltransferase e actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase, a métodos para a produção das re feridas SL avermitilis e ao uso das S_. avermitilis para produzir avermectinas B naturais e não naturais.

As Patentes dos EUA 4.310.519 e 4.429. 042 descrevem as avermectinas, um complexo de agentes rela_ cionados tendo actividade antiparasitica potente, e sua produção por fermentação aeróbica de estirpes Streptomyces avermitilis; designadamente, S_. avermitilis ATCC Nos. 31267, 31271 e 31272. As últimas duas estirpes referidas representam um frasquinho congelado e um tubo liofilizado, respectivamente, de uma cultura obtida por irradiação ultravioleta de S_. avermitilis ATCC 31267.

A EP 214731, publicada em 18 de Março de 1987, correspondente ao Pedido de Patente dos EUA da S£ rie N° 886,867, apresentada em 16 de Julho de 1986, divulga um número de compostos (aqui referidos como avermectinas não naturais) relacionados com as avermectinas naturais ou conhecidas mas tendo um novo grupo substituinte na posição 25, e um processo para a sua preparação por fermentação de um organismo produtor de avermectina na presença de certos ácidos carboxílicos especificados, ou seus derivados ou seus percursores.

Os organismos £. avermitilis usados para produzir os referidos novos avermectinas C-25 substituídos são S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 e NCIB 12121. O último organismo descrito na EP 214.731, é derivado de S. avermitilis ATCC 31271.

Origina rendimentos melhorados das novas avermectinas C-25 substituídas quando é cultivado um meio semi-definido. Cada um de ATCC 31267, 31271, 31272 e NCIB 12121 pode também produzir, além dos novos derivados C-25 substituídos, quantidades variáveis dos avermectinas conhecidos, ou naturais, em que o substituinte 25 é isoprq pilo ou (S)-sec-butilo(1-metilpropilo).

O esqueleto carbono dos avermectinas (descrito na fórmula (I) a seguir) derivou de acetatos e propionatos e o substituinte C-25 de avermectinas naturais de L-isoleucina (R = (S) - sec-butilo) ou L-valina (R = = isopropilo) /Fischer and Mrozik, Macrolide Antibiotics, Academic Press (1984) Ch. 147.

Por avermectinas conhecidas ou na turais subentende-se as avermectinas produzidas por avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 e ATCC 31272 em que o substituinte da posição 25 ou é isopropilo ou (S)-sec-butiloí1-metilpropilo). As avermectinas em que o substituin te da posição 25 é outro além de isopropilo ou sec-butilo (forma S) são aqui referidas como avermectinas novas ou não-naturais.

As variedades de £. avermitilis refe ridas nas patentes dos EUA atrás mencionadas produzem uma classe de substâncias aqui genéricamente descritas como C-076. A classe compreende oito compostos distintos mas infimamente relacionados, descritos como C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a e B2b. Os compostos das séries a referem-se às avermectionas naturais em que o substituinte 25 é (S)-sec-butilo e os da série b aqueles em que o substituinte 25 é isopropilo.

As designações A e B referem-se a avermectinas em que o substituinte é metoxi ou hidroxi, respectivamente. Por último, o numeral 1 refere-se às avermectinas em que uma dupla ligação está presente na posição 22-23; e o numeral 2 a avermectinas tendo um hidro génio na posição 22 e hidroxi na posição 23.

Neste pedido de patente nenhuns de tais identificadores são usados no que diz respeito ao substituinte 25 das avermectinas não naturais. Os identificadores Al, A2, BI e B2 foram retidos para referir as aver mectinas não naturais tendo os aspectos estruturais corres pondentes aos das avermectinas naturais como atrás referido .

A geração de mutantes desprovidas de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase foi assinalada relativamente a Bacillus subtilis, Willecke and Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264-72 (1971) e Pseudomonas putida, Martin et al., J. Bacteriology, 115 198-204 (1973), mas não para Streptomyces.

£5. avermitilis Agly-1, uma estirpe mutante que produz virtualmente somente agliconas de avermectina Ala e A2a é assinalada por Schulman et al., J. Antibiot. 38 (11), 1494-1498 (1985). Também assinalado é a fermentação de S_. avermitilis Agly-1 na presença de sinq fungina o qual origina a produção crescente de componentes aglicona de avermectina B.

Do mesmo modo, S_. avermitilis 08 , uma estirpe altamente produtora de avermectinas, quando fermen tada na presença de sinefungina como inibidor de O-metil-transferases, resultou na produção de avermectinas faltan

do os grupos O-metilo na aglicona em C-5 e na porção diss£ carídica oleandrose.

A Patente dos EUA 4378353 descreve compostos C-076 relacionados e sua preparação por cultura de MA-5218, uma estirpe mutante de S_. avermitilis ATCC 31272, dai obtida por irradiação ultravioleta. 0 mutante é identificado como ATCC 31780. Aos compostos C-076 relacionados produzidos pelo referido mutante falta o anel C-076 furano. Adicionalmente, em certos dos compostos assi^ nalados, uma ou ambas das porções açúcar oleandrose foram clivadas enquanto noutros o grupo da posição 5 foi oxidado num grupo ceto.

Três classes de mutantes 0-metiltran.s ferase de ÍS. avermitilis que produzem avermectinas a que faltam os grupos O-metilo foram assinaladas por Ruby et al., 6th. International Symposium on the Biology og Actinomycetes, Debrecen, Hungria, 26-30 (1985) e por Schulman et al. , Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 (1987).

A primeira classe produz primariamen te avermectinas B devido à sua incapacidade para metilar o hidroxilo C-5 do anel lactona macrociclico. A segunda classe produz 3'-0, 3-O-bis-desmetilavermectinas (avermec tina faltando o substituinte O-metilo na posição 3 de ambos os resíduos monossacarídicos oleandrose), e os quais são referidos como desmetilavermectinas. A terceira classe é incapaz de metilar em qualquer posição.

Schulman et al. , Fed. Proc. 44 , 931 (1985) divulga a produção crescente de avermectinas B por fermentação de S_. avermitilis na presença de substâncias tais como sinefungina, S-adenosiletionina e S-adenosil-ho-

mocísteina, os quais inibem a metilação do grupo hidroxi C-5 da porção aglicona pela enzima avermectina B-O-metiltransf erase. Os mutantes Streptomyces avermitilis despr£ vidas de actividade O-metiltransferase e que produzem quantidades crescentes de componentes avermectina B são também divulgados e referidos por Schulman et al., em Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29 , 620-624 (1986).

A mutagénese de £. avermitilis produz mutantes desprovidos de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase. Os mutantes já não possuem a capacidade para produzir quantidades significativas das avermectinas naturais na ausência do composto adicionado RCOOH em que R é isopropilo (S)-sec-butilo, onde um compos to convertível em RCOOH durante o processo de fermentação.

Surpreendentemente e inesperadamente, no entanto, verificou-se que mutantes produzem avermectinas naturais e não naturais, quando fermentadas na presen ça de um composto adicionado R-COOH em que R é isopropilo ou (S)-sec-butilo, ou outro grupo aqui divulgado, ou de z um percursor do referido RCOOH. E ainda mais surpreenden te verificar, que os mutantes aqui descritos desprovidos somente de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase, e que são incapazes de degradar L-isoleucina, L-leucina ou L-valina, são capazes de assimilar uma grande variedade de compostos na via biossintética de avermectina com produção de avermectinas não naturais livres da presença de avermectinas naturais.

A mutagénese das mutantes simplesmeii te bloquedas assim produzidas, produz mutantes a que faltam ambas as actividades 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e actividade avermectina B-O-metiltransfe rase.

Os refeidos mutantes duplamente bloqueados surpreendente e inesperadamente produzem substancialmente somente avermectinas B naturais e não naturais quando cultivados na presença de um composto R-COOH adicio nado onde R é como atrás definido.

As avermectinas naturais, como referido, são produzidas como uma mistura complexa de oito com postos distintos mas infimamente relacionados; formulai I) R = isopropilo e (S)-sec-butilo. Embora eles tenham sido recuperados na forma substancialmente pura (ver Patente dos EUA 4.429.042), a metodologia é, no mínimo, laboriosa. As avermectinas B exibem geralmente maior actividade anti-hemintica do que as correspondentes avermectinas A.

A produção de avermectinas não naturais (componentes A e B) de acordo com o processo descrito em EP 214.731 pode também produzir algumas das avermectinas naturais em quantidades variáveis devidas à presença de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e dos aminoácidos L-valina e L-isoleucina na célula dos microorganismos £. avermitilis e no meio usado na sua produção.

A capacidade para produzir somente os componentes B mais bioefectivos de qualquer avermectina natural ou não natural, para minimizar o número dos produtos, e ao fazer assim aumentar a pureza de uma avermec tina escolhida, e simplificando assim os processos de sepa ração, é um objectivo desejável.

As estirpes £. avermitilis desprovidas de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase são produzidas por mutação de variedades de £. avermitilis produtoras de avermectina e especialmente por

-9I mutação de avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 ou NCIB 12121. Os mutantes são incapazes de sintetizar as avermectinas naturais excepto quando o ácido gordo, ou um seu percursor, transportando o grupo isopropilo ou sec-butilo (forma S) é adicionado ao meio no qual os mutantes são fermentados. Eles são capazes de produzir avermectinas naturais e não naturais quando fermentados sob condições aeróbicas aquosas num meio nutriente contendo um ácido iniciador apropriado ou um composto nele convertível no processo de fermentação.

Aqueles mutantes caracterizados por serem desprovidos de actividade 2-oxo-ácido de cadeia rami ficada-desidrogenase são isolados a partir das colónias mu tagenizadas com base num ensaio CO?. Neste processo, a

- 14 , ^Z ausência de evolução CO? por células permeabilizadas a partir de um substrato de ácido 7-2-oxoisocapróico ou ácido Γ l^c-l 7-2-oxo-3-metilvalérico ou ácido /^^C-l 7-2-oxo-3-metilbutirico indica a ausência de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase.

Foi surpreendente e inesperado que os mutantes aqui descritos desprovidos de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase retivessem a cap£ cidade de produzirem avermectinas, especialmente avermect_i nas não naturais. A incapacidade dos mutantes para produzirem os derivados ácido gordo-coenzima-A natural quando crescem num meio convencional podia ter sido uma mutação letal se a integridade damembrana dependesse dos referidos derivados ou se a acumulação do 2-oxo-ácido pelo mutante inicial levasse à citotoxicidade.

Além disso, os mutantes não eram esperados serem capazes de sintetizar acetil-CoA e propionil-CoA a partir do metabolismo degradativo de L-isoleucina e L-valina uma vez que este exige as actividades da enzima que falta nos mutantes. A exigência daqueles derivados acil-CoA para a biossintese de avermectina, atrás referida, leva à espectativa que os mutantes devem ser severamente postos de lado na produção de avermectina não natural, o que, surpreendentemente, não foi o caso.

A falta de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase nos mutantes aqui descritos origina o impedimento da síntese de acil gordo de cadeia ramificada-CoA a partir da degradação de Lisoleucina, L-leucina e L-valina e, por esse meio, a síntese das avermectinas naturais, excepto quando o ácido R-COOH (em que R é (S)-sec-butilo ou isopropilo), ou um seu percursor, é adicionado ao meio de fermentação.

A mutação adicional de mutantes defi^ cientes em actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase produz mutantes os quais são, adicionalmente, deficientes em actividade avermectina B-O-metiltransferase. Os mutantes desprovidos de actividade avermectina B-O-metiltransf erase são incapazes de metilar o oxigénio C-5 da porção aglicona da avermectina. Os mutantes desprovidos de tal actividade produzem essencialmente sómente avermectinas B evitando a preparação de avermectinas A.

O presente invento também inclui qual^ quer organismo, independentemente do seu aspecto ou compor tamento fisiológico, que pode ser desenvolvido por meios de transformação, transdução, recombinação genética ou algum outro processo genético, usando um ácido nucleico ou

um equivalente material a partir das espécies aqui descri^ tas, pelo que adquiriu as características dos mutantes aqui descritos.

Os termos avermectina ou avermectinas conforme aqui usados referem-se a compostos tendo fórmula (I) a seguir mas em que o substituinte 25(R) pode ser qualquer grupo assimilável na referida posição pelo £. avermitilis deste invento.

Os mutantes aqui descritos são altamente valoisos para a produção de avermectinas B não naturais pelos processos divulgados e aqui exemplificados. Eles são especialmente valiosos para a produção de avermec tinas preferidas, i.e., compostos em que o substituinte C-25 é C^-Οθ cicloalquilo ou cicloalquenilo, opcionalmente substituído por grupo C^-C^ alquilo; 1-metiltioetilo, ou um grupo heterocíclico com oxigénio ou enxofre, de 5- ou

6-membros, especialmente 3-tienilo ou 3-furilo.

A mutação de um memebro produtor de avermectina das espécies Streptomyces avermitilis é efectuada de acordo com processos conhecidos usando qualquer um de uma variedade de agentes de mutação incluindo irradiação ultravioleta, irradiação por raios X, N-metil-N' -ni_ tro-N-nitrosoguanidina, etilmetano-sulfonato, ácido nitroso e mustardas de azoto, e.g., N-metilbis(2-cloroetil)amina, ou tratamentos análogos. A mutagénese pode ser conduzida sobre esporos ou sobre uma cultura vegetativa de avermitilis capaz de produzir avermectinas naturais, e,g.

S. avermitilis ATCC 31272.

Seguindo os processos seguintes bem conhecidos dos especialistas da técnica, selecionamos col<5 nias mutagenizadas relativamente à ausência de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase com base num método de ensaio bioquímico o qual permite o rastreio de grandes números de colónias bacterianas aleatoriamente mutagenizadas para produção de a partir de /”^⁴C-1 7-2-oxo-ácidos de cadeia ramificada seleccionados (Tabor et al., J. Bact. 128 , 485-486, 1976).

A metodologia compreende o crescimento das colónias mutantes em cavidades de uma placa de microt£ tulação num meio nutriente apropriado, permeabilizando as células com tolueno, seguido por adição do /”¹⁴C-17-2-oxo-ácido (e.g. ácido 2-oxoisocapróico) a cada cavidade e verificação da atmosfera anterior da fermentação relativamerq 14 te ao ^C02· ,_14 _

Alternativamente, o ácido / C-17-2-oxo-3-metilvalérico, ou ácido /^⁴C-17-2-oxo-3-metilbutirico pode ser usado em vez de ácido _/Ί⁴0-1 7-2-oxo-isoca, , ]_4 ~ proico. A produção de C0₂ é convenientemente verificada através da colocação de papel de filtro húmido saturado com Ba(OH)„ por cima das cavidades individuais para captar 14 14 3 qualquer C0₂ libertado e detecção de Ba CO , se houver, por autoradiografia. Os mutantes desprovidfos de activida de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase originam autoradiogramas que se aproximam dos de controlos em branco (não inoculados); i.e., nenhum Ba^CO^ adicional é produz£ do pelos mutantes.

Os mutantes assim obtidos são submetidos a mutagenese adicional usando gualquer dos agentes mutantes atrás mencionados. As colónias mutagenizadas são ensaiadas relativamente à ausência de actividade avermecti na B-O-metiltransferase por cromatografia (cromatografia de camada fina ou liquida de alta resolução) após ferment£ ção na presença de um percursor adicionado (e.g. ácido 2-metilbutirico). Os compostos avermectina A estão essencialmente ausentes dos caldos de fermentação de tais mutan tes.

Além da produção de alelos desejados de uma dada estirpe de microorganismos por mutagenese, a fusão de protoplastos permite a introdução dos alelos dese jáveis produzidos/identifiçados numa estirpe no cromossoma deoutra estirpe. Por exemplo, uma estirpe de £. avermitilis deficiente em 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogena se e avermectina B-O-metiltransferase pode, por fusão de protoplastos com uma estirpe £. avermitilis tendo as actividades atrás mencionadas, produzir uma estirpe de £. avermitilis deficiente somente em actividade avermectina B-0-metiltransferase.

Como os especialistas da técnica reconhecem, a tecnologia da fusão de protoplastos permite a combinação de alelos desejáveis a partir de linhas de selecção divergentes numa só estirpe.

As características morfológicas e culturais dos mutantes deste invento são geralmente como descritos na Patente dos EUA 4.429.042. A característica que distingue os mutantes deste invento é a sua falta de ac tividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e de actividade avermectina B-O-metiltransferase cujas carac

teristicas são determinadas como aqui descritas. A falta das referidas actividades origina a incapacidade dos mutantes para produzir as avermectinas B naturais quando crescem num meio definido substancialmente livre de ácidos gordos RCOOH em que R é isopropilo ou (S)-sec-butilo, ou compostos convertíveis nos referidos RCOOH durante a fermentação .

Uma investigação taxónómica conduzida pela American Type Culture Collection, confirmou que as características da estirpe mutante 1-3, seleccionadas pelo ensaio C0₂ anterior, têm uma relação intima com a estirpe parentérica ATCC 31272 descrita na Patente dos EUA 4.429. 042, mas com certas excepções. Assim, a estirpe mutante 1-3 (ATCC 53567) forma significativamente menos cadeias do que ATCC 31272.

Em experiências feitas pelos requerentes, a rafinose não parece suportar o crescimento de I-3. Em contraste com a descrição apresentada para ATCC 31272 na Patente dos EUA 4.429.042, não fomos capazes de detectar o crescimento do mutante ou de ATCC 31272 com sacarose como única fonte de carbono. O mutante 1-3 é deficiente em actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-de^ sidrogenase.

O mutante duplamente deficiente deste invento, £. avermitilis 7881, que é desprovido de activida. de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e de actividade avermectina B-O-metiltransferase , produzido por mutagénese adicional do mutante 1-3 (ATCC 53567), tem uma relação taxónómica similar ao ATCC 31272 como tem a variedade mutante 1-3.

Streptomyces avermitilis 1-3 e 7881 foram depositados sob os termos do Tradicional Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection, Rockville Maryland, um depósitorio conhecido e reconhecido que permite a permanência dos depósitos e sua pronta acessibilidafde pelo público se uma patente for condicionalmente concedida sobre este pedido.

Eles receberam a designação Streptomyces avermitilis ATCC 53567 e ATCC 53692, respectivamente os depósitos estão disponiveis durante a pendência deste pedido, para uma pessoa determinada pelo Comissioner of the United States Patent and Trademarck Office que a isso está autorizado sob 37 cFr 1,14 e 35 USC 122, e de comun acordo com leis de patente estrangeiras em paises em que os equivalentes deste pedido ou a sua progénia, são apresentados .

Todas as restricções na disponibilidade para o público dos microorganismos depositados serão irrevogalmente removidos, após a concessão da patente.

Cada um dos S.avermitilis ATCC 31267 ATCC 31271, ATCC 31272 e NCIB 12121 produz as avermectinas naturais, compostos de fórmula (I)

em que a linha a tracejado na posição 22-23 representa uma dupla ligação opcional r! é hidroxi e está presenta sómente quando a ligação dupla está ausente;

R é 4'-(alfa-L-oleandrosil)-alga-L-oleandrosiloxi da fórmula

R é hidrogénio ou metilo; e

R é isopropilo ou (S )-sec-butilo. A patente dos EUA 4285963 descreve uma avermectina de fórmula (I) em que a posição 25 é substituída com um grupo metilo um etilo; R^ é hidroxi e é metilo.

Nas avermectinas não naturais aqui referidos R é um substituinte diferente de isopropilo ou de (S)-sec-butilo e é como a seguir definido.

Os compostos essenciais para a utili^ zação na biosintese de compostos de fórmula (I) o correm na célula de S^. avermitilis e no meio.

Estes compostos surgem da degradação de L-valina e L-isolencina ou dos seus correspondentes 2-oxo-ácidos através da descarboxilação do 2-oxo-ácido pela 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase concomitante com o acoplamento do produto com a coenzima A.

A sua presença pela produção concorrente de ambos os compostos isopropilo e (S)-sec-butilo de fórmula (I). Isto, claro está origina problemas na separa ção dos derivados isopropilo dos derivados (S)-sec-butilo.

Quando fermentados num meio nutriente contendo o composto principal apropriado os mutantes de£ te invento produzem um composto de fórmula (I), ou vão como é mais actualmente o caso, uma mistura de dois compostos de fórmula (I), nos quais R corresponde ao composto principal usado.

Podem ser produzidos até dois produtos, convenientemente trivialmente referidos como R-avermectina B 1 e B 2 de acordo com as designações usadas na Patente dos EUA 4429042.

O grupo R, claro está, refere-se ao substituinte C-25. Por exemplo quando R é ciclopentiloas duas possiveis avermectinas são:

Nome Trivial

CICLOPENTIL

AVERMECTINA B 1

CICLOPENTIL

AVERMECTINA B 2

dupla ligação hidroxi

Nas avermectinas não naturais o subs tituinte R em C-25 na frmula (I) é diferente de isopropilo ou de (S)-sec-butilo.

Compostos de fórmula (I) em que a dupla ligação está presente e OH ausente podem alternativamente ser preparados a partir do correspondente composto de fórmula (I) em que R^ é OH e a dupla ligação está ausente por uma reacção de desidratação.

A reacção é efectuada protegendo pr£ meiro selectivamente os grupos hidroxi nas posições e 5 e 4

e.g., como derivado t-butilodimetilsililoxiacetilo, e a seguir reagendo com um haleto de tiocarbonilo substituído tal como cloreto de (4-metilfenoxi) tiocarbonilo seguido por aquecimento num solvente de alto ponto de ebulição, \ ϊ

V X. “Τ—\

e .g . triclorobenzeno, para efectuar a desidratação.

O produto é finalmente desprotegido para obtermoso composto não saturado. Estes passos juntamente com reagentes e condições de reacção apropriados são descritos na Patente dos Estados Unidos 432335.

Os compostos de fórmula (I) em que R^ é H e a dupla ligação está ausente podem ser preparados a partir de compostos correspondentes em que a dupla ligação está presente e R^x está ausente, por hidrogenação C£ talitica selectiva usando um catalisador apropriado.

Por exemplo, a redução pode ser conseguida usando cloreto de tris(trifenilfosfina) ródio (I) como descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia No. 0001689, e sua Patente equivalente dos EUA 4195969, publicada em 22 de Abril de 1980.

Os compostos de fórmula (I)-em que

R é H são preparados a partir de compostos correspondentes em que R é 4'-(alfa-L-oleandrosil)-alfa-L-oleandrosilo xi por remoção do grupo 4'-(alfa-L-oleandrosil)-alfa-L-oleandrose por hidrólise suave com um ácido num solvente orgânico aquoso para obtermos a aglicona tendo um grupo hidroxi na posição 13; esta está é a seguir halogenada, por exemplo por reacção com um haleto de benzeno-sulfonilo para obtermos o derivado 13-desoxi-13-halo o qual é fi_ nalmente selectivamente reduzido, por exemplo usando hidre to de tributil-estanho.

A fim de evitar reacção secundárias não pretendidas é desejável proteger quaisquer grupos hidroxi que possam estarpresentes, por exemplo um grupo tert-20-

-butil-dimetilsililo. Este á seguir prontamente removido após o passo de halogenação ou de redução por tratamento com metanol contendo vestígios de ácido.

Todas estes passos em conjunto com reagentes e condições de reacção apropriados para o sua realização não descritos na Publicação do Pedido de Pateri te Europeia No. 0002615.

Os compostos capazes de utiliação pela S_. avermitilis deste invento para o biossintese de avermectinas, naturais e não naturais, são compostos de fór mula (II.A)

R-COOH (II-A) incluindo compostos convertiveis em (II-A) durante o processo de fermentação.

Os referidos compostos são referidos aqui como compostos principais. Na fromula (II-A), R é um grupo de cadeia ramificada na posição de o seu átomo de carbono ao qual está ligado o grupo -COOH está também ligado a pelo menos a dois outros átomos ou grupos frontalmente diferentes de hidrogénio.

Esta definição, claro está, engloba os grupos aciclicos e cíclicos saturados e não saturados incluindo os que têm opcionalmente um heteroátomo de enxo fre ou de oxifénio como membro de cadeia aciclica ou do anel ciclico.

Mais especificamente, R, que se tor na substituinte C-25, pode ser um grupo ramificado na posição C^-Cg-alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxialquilo ou alquilotioalquilo; mais um grupo Cg-Cg-cicloalquilalqui^ lo em que o grupo alquilo é um grupo C₂-C^-alquilo ramificado na posição um grupo Cg-Cg-cicloalquilo ou Cg-Cg-cicloalcenilo, qualquer dos quais pode opcionalmente ser substituído por metileno ou por um ou mais grupos C^-C^ al. quilo ou átomos de halogénio (fluoro, cloro, iodo ou bromo); ou um anel heterociclico de 3 a 6 membros contendo ox_i génio ou enxofre que pode ser saturado, ou totalmente ou parcilamente insaturado e que podes ser facultativamente substituído por um ou mais grupos C^-C^ alquilo ou átomos de halogénio.

Compostos convertiveis em RCOOH; i.e., percusortes, no processo de fermentação são compostos da fórmula (II-B) em que R é como acima referido e definido:

R-(CH_) -Z (II-B) z n néO, 2, 4 ou 6; e Z é -CH_OH, -CHO, -CH₉NH_, -COOR⁴ ou -CONHR emq ue R é H ou (C^ θ)-alquilo; R é hidrogénio (C₁_ )-alquilo, ou o residuo de um aminoácido, especialmente de ácido aspártico, ácido glutâmico e metionina, e.g.-CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH e -CH(COOH)(CH₂)₂SCHg respectivamente.

Também incluídas neste invento estão as formas isoméricas dos compostos de fórmula (II-A) e compostos neles convertiveis durante o processo de fermen tação e as avermectinas isoméricas em C-25 resultantes do seu uso no processo aqui descrito.

O processo deste invento é efectuado por fermentação aeróbica com uma estirpe de £. avermitilis desprovida de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase de avermectina-B-ometiltransferase num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte assimilável de azoto, carbono, sais inorgânicos e um composto de fórmulma RCOOH, ou um composto convertivel no referido composto (i.e., um precursor) durante a fermentação.

O ácido, ou o composto convertivel, é adicionado à fermentação ou no momento da inoculação ou em intervalos durante a fermentação.

A produção dos produtos avermectina pode ser vigiada por remoção de amostras da fermentação, e£ tracção com uma solvente orgânico, e seguindo o aparecimen to do produto por cromatografia, por exemplo usando cromatograf ia liquida de alta pressão. A incubação continua até o rendimento do produto ter sido maximizado, geralmente durante um periodo de 4 a 15 dias.

Um nivel preferido de cada adição dos compostos principais (ácido carboxilico ou um composto nele convertivel) é entre 0,05 e 3,0 gramas por litro.

O composto convertivel princiapal po de ser adicionado continuamente, intermetentemente ou todo de uma vez à fermentação.

O ácido (RCOOH) é adicionado tal qual ou como um seu sal, tal como o sal de sódio, litio ou amónio, ou como um composto convertivel no ácido como atrás definido.

O ácido se for sólido, é de preferên cia dissolvido num solvente apropriado tal como água ou álcoois ^ci~^C4»

Os meios usados para a fermentação podem especialmente quando o substituinte C-25 é isopropilo (S )-sec-butilo, ser um meio convencional contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e vestígios de elementos.

Quando o substituinte C-25 é um grupo não natural; i.e., não é isopropilo ou (S)-sec-butilo o meio de fermentação é um no qual os ingredientes escolhi^ dos faltam ou contem sómente quantidades mínimas dos compos tos iniciadores em que a posição R é isopropilo ou (S)-sec-butilo.

Após fermentação durante um periodo de vários dias a uma temperatura de preferência na gama de 24 a 33°C, o caldo de fermentação é centrifugado ou filtrado e o bolo é extraído com preferência com acetona e metanol.

O extracto de solvente é concentrado e o produto desejado é então extraído num solvente orgânico não miscivel com água, tal como cloreto de metileno cetato de etilo, clorofórmio, butanol ou metil-isubutil-cetona.

extracto do solvente e o produto em bruto é a seguir purificado conforme necessário por cromatografia, por exemplo usando cromatografia preparativa liquida de alta pressão, de fase reversa.

O produto é geralmente obtido como uma mistura dos compostos de fórmula (I) em que é 4'-24-

-(alfa-L-oleandrosil)-alfa-L-oleandrosiloxi, é OH e a dupla ligação ausente ou está ausente e a dupla liga3 ção está presente e em que R é H.

Compostos em que R é CH^ estão essencialmente ausentes. No entanto as proporções de cada composto podem variar dependendo do mutante particular e composto principal empregado e as condições usadas.

A fonte do grupo R; i.e., se provam directamente de R-COOH ou se é produzido a partir de um dos percursores anteriormente referidos a partir de qualquer precursor, não é relevante relativamente à produção das avermectinas.

Uma exigência fundamental do processo deste invento para a sua produção, é de que o desejado gru po R seja tornado disponivel nas estirpes S_. avermitilis deste invento no processo de fermentação.

Compostos apropriados incluem os seguintes :

ácido 2,3-dimetilbutirico ácido 2-metil-hexanoico ácido 2-metilpent-4-enóico ácido 2-ciclopropil propionico sal de litio do ácido 4,4-difluorociclo-hexanocarboxilico ácido 4-metileno-ciclo-hexano-carboxilico

ácido 3-metilciclo-hexano-carboxilico (cis/trans) ácido 1-ciclopenteno-carboxilico ácido 1-ciclo-hexeno-carboxilico ácido tetra-hidropirano-4-carboxilico ácido tiofeno-2-carboxilico ácido 3-furoico ácido 2-clorotiofeno-4-carboxilico ácido ciclobutano-carboxilico ácido ciclopenteno-carboxilico ácido ciclo-hexano-carboxilico ácido ciclo-heptano-carboxilico ácido 2-metilciclopropano-carboxilico ácido 3-ciclo-hexeno-l-carboxilico ácido 2-metiltiopropiónico ácido 2-metil-4-metoxibutirico ácido tiofeno-3-carboxilico hidroximetil-ciclopentano

3-tiofeno-carboxaldeido ácido 3-ciclo-hexilpropionico ácido 3-ciclopentilpropionico hidroximetil-ciclobutano ácido tetra-hidrotiofeno-3-carboxilico

3-ciclopentil-l-propanol sal de litio do ácido 3-metilciclobutano-carboxilico ácido 3-fluorociclobutano-carboxilico sal de litio do ácido 3-metilenociclobutano-carboxilico ácido 2-metil-4-metiltiobutirico ácido tetyra-hidrotiopirano-4-carboxilico ciclobutil-metilamina ciclobutano-carboxilato de etilo

4-hidroximetil-ciclopenteno éster etilico do ácido 2-(3-tiofenocarbonil)propionico ácido S-2-metilpentanoico ácido R-2-metilpentanoico

Três classes de mutantes de O-metiltrans podem ser obtidas a partir dos aqui descritos mutantes negativos de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrognase.

Mutantes nos quais uma mutação na acti^ vidade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase activa se combina com uma ou mais mutações de O-metiltrans ferase, para obtermos estirpes de S.avermitilis que produ zirão quando são formados compostos RCOOH ou compostos con vertiveis em RCOOH durante o processo de fermentação, prim£ riamente avermectinas B, desmetil-avermectinas ou avermecti nas que não foram de todo metiladas.

Os referidos mutantes são obtidos por mutagenase dos mutantes aqui descritos desprovidos de acti. vidade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase por meio de luz ultravioleta e/ou mutagénios quimicos tal como N-metil-N-nitrouretanop, nitroguanidina ou outro agen te tal como os anteriormente enumerados.

Alternativamente, os mutantes positivos de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase aos quais falta uma ou mais das O-metiltransferases podem sofrer mutações por tratamento com luz UV ou um agente muta genizante para produzir mutantes negativos de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase.

As avermectinas não naturais produzidas por tais mutantes são caracterizadas por presença de grupos hidroxi na posição 5 de porção aglicona e/ou nas po. sições C-3 e/ou C-3'¹ das porções oleandrose.

Os mutantes atrás descritos são iden tificados de acordo com a metodologia descrita por Schulman et al Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29 , 620-624 (1986) .

Esles são uteis para os mesmos fins e da mesma maneira como são as avermectinas conhecidas.

Alternativamente, quantidades crescentes das avermectinas B, incluindo os grupos a que falta o metilo sobre a porção dissacaridica oleandrose são produzidas por fermentação de mutantes deste invento, des provida de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase na presença de uma substância tal como sinefungina, S-adenoiletionina ou S-adenosil-homocisteina os quais inibem actividfade de O-metiltransferase.

Os compostos do invento são agentes antiparasitas altamente activos tendo utilidade particular como antelminticos, ectoparasiticidas insecticidas e acaricidas.

Assim os compostos são eficazes no tratamento de uma variedade de condições cansadas por endoparasitas incluindo, em particular, helmintiase a qual é mais frequentemente cansada por um grupo de vermes parasitas descritos como mematodos e os quais podem cansar per. das económicas severas em mimos, ovinos , suinos , cavalos, e vacas bem como afectar animais, domésticos e criação.

Os compostos são também eficazes con tra outros nematodos os quais afectam várias especies de animais incluindo por exemplo, Dirofilaria em cães e vá rios parasitas que podem injectar seres humanos, incluindo

-29parasitas gastro-intestinais tal como Ancylostona, Necator,

Ascaris , Strongyloides, Trinchinella , Capillaria, Trichuris , j

Enterobius e parasitas que são observados no sangue ou ou tros tecidos e órgãos tal como vermes filariais e estágios intestinais extra de Strongyloides e Trichinella.

Os compostos são também de valor no tratamento de infecções ectoparasitas incluindo em particular ectoparasitas artrópodes de animais e pássaros tal como carraças, piolhos, pulgas, mosca varejeira, insectos de picada e larvas dptereas de migração as quais podem afectar vacas e cavalos.

Os compostos são também insecticidas contra pragas do lar tal como baratas, traça da roupa, es caravelho das carpetes e a mosca doméstica, bem como sendo úteis contra pragas de insectos de cereais armazenados e de plantas agricolas tal como aranhas, ácaros, afídeos, lagartas e contra ortopteranos migratórios tal como gafanhotos .

Os compostos de fórmula (I) são adm£ nistrados como uma formulação apropriada para o uso específico em vista e para as espécies particulares de animais hospedeiros a serem tratados e dos parasitas e insec tos envolvidos. Para uso como antelmíntico os compostos podem ser administrados oralmente na forma de uma cápsula, bolus, comprimido ou um remédio para animais liquido, ou alternativamente, eles podem ser administrados por injecção ou como um implante. Tais formulações são preparadas numa maneira convencional de acordo com práticas veteriná rias padrão.

Assim, cápsulas, bólus, ou comprimidos podem ser preparados por mistura do ingrediente activo com um diluente ou suporte apropriado finamente dividido contendo adicionalmente um agente desintegrante e/ou ligan te tal como amido, lactose, talco, estearato de magnésio, etc. Uma formulação de remédio para animais pode ser preparada por dispersão do ingrediente activo numa solução aquosa em conjunto com agentes dispersantes ou molhantes, etc, e formulações injectáveis podem ser preparadas na for ma de uma solução estéril as quais podem conter outras substâncias, por exemplo, sais suficientes ou glicose para tornar a solução isotónica com sangue.

Estas formulações variarão no que diz respeito ao peso de composto activo dependendo das espécies de animal hospedeiro a ser tratado, a severidade e tipo de infecção e o peso do corpo do hospedeiro. Geralmente, para administração oral uma dose de cerca de 0,001 a 10 mg por Kg de peso do corpo do animal, dada como uma dose simples ou em doses divididas num período de 1 a 5 dias, será satisfatória, mas claro, há casos onde gamas de dosagem superiores ou inferiores são indicadas, e tais estão dentro do âmbito deste invento.

Como uma alternativa os compostos po dem ser administrados com a ração e com este objectivo um aditivo de alimentação concentrado ou premix pode ser preparado por mistura com a ração normal do animal.

Para uso como um insecticida ou para tratamento de pragas agrícolas os compostos são aplicados como pulverizações, poeiras, emulsões e análogos de acordo com a prática agrícola padrão.

PRODUÇÃO DE S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567)

Passo 1 - £. avermitilis ATCC 31272 foi feito crescer co mo um relvado confluente em meio New Patch Agar durante 12 dias a 30°C. O meio compreendia

Sumo V-8*	200 ml
CaCO₃	3 gramas
Agar	15 gramas
H₂0 até	1000 ml
Caldo nutriente	1,0 gramas/L
Acetato de sódio. 3Η₂<3	1,4 gramas/L
Acido isovalérico	50 mg/L
Acido metilbutirico	50 mg/L
Isoleucina	250 mg/L
Leucina	250 mg/L
Valina	250 mg/L
Solução de elementos vestigiais	1 ml/L

Uma mistura de oito sumos vegetais (tomate, cenouras, aipo, beterrabas, salsa, alface, agrião e espinafre) mais sal, ácidos ascórbico e citrico e aromas naturais. Disponível a partir de Campbell Soup Company, Camden, N.J.

-32**

Composição da solução de elementos vestigiais:

FeCl₃.6H₂O	2,7 g
MnSO..H_o0 4 2	4,2 g
CuSO₄.5H₂O	0,5 g
CaCl₂	ii,o g
^H3^BO3	0,62 g
CoC1₂.6H₂O	0,24 g
ZnCl₂	0,68 g
Na.MoO. 2 4	0,24 g

Dissolver o anterior num litro de

HC1 O,1N.

Os esporos foram colhidos das 3 refe^ ridas placas e suspensos em 20 ml de tampão tris-ácido maleico 0,05M, pH 9,0.

Passo 2 - Adicionamos 10 ml da suspensão de esporos a um frasco contendo 10 mg de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanid£ na (NTG). O frasco foi incubado e agitado a 28°C durante 60 minutos e os esporos a seguir profusamente lavados com solução NaCl a 1%.

Passo 3 - Os esporos foram lavados e foram suspensos em NaCl a 1% e misturados com um volume igual de etileno glicol a 80%. Esta suspensão foi preservada a -20°C e usada como uma fonte de células a serem rastriadas relativamente a mutantes. Originou aproximadamente 10^ colónias/ml quan do germinou.

Este conjunto de esporos foi espalha do em placas YPD para obtermos aproximadamente 100 colónias por placa (meio YPD compreende 10 g/1 de cada de extracto de levedura, peptona Bacto* e dextrose e 15 g/1 de agar Bacto , ajustado a pH 6,9 antes da autoclave). Os ingredientes marcados com um asterisco são disponíveis a partir dos Laboratórios Difco, Detroit, Michigan 48238.

Passo 4 - Colónias simples foram retiradas das placas após 2-3 semanas de crescimento a 28°C e colocadas em cavidades individuais de uma placa de microtitulação padrão de 96 cavidades. Também uma pequena porção da colónia foi colocada num meio agar fresco para servir como fonte de células viáveis quando os mutantes são identificados.

Passo 5 - A cada cavidade juntámos aproximadamente 75 micro litros de um meio de sais líquidos M9 contendo 1% de glico se, 0,1% de casamino-ácidos, e 0,01% de cada um dos ácidos isovalérico, isobutirico e 2-metilbutirico. Após vários dias de incubação a 28°C, as células foram ensaiadas relativamente à presença de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase. (Cada litro de meio de sais M9 compreende 6 g de NaHPO₄, 3 g de KH₂PO₄, 0,5 g de NaCl e 1 g de NH₄C1. O meio foi submetido a autoclave e a seguir juntamos assépticamente 1 ml de cada um de entre MgSC>₄ IM e CaCl₂ 0,lM esterilizados).

Passo 6 - Uma microsuspensão de 5% de tolueno em meio de sais M9 foi preparada submetendo ligeiramente a ultrasons a mistura imiscivel. A 25 ml desta suspensão juntamos 1,2 ml de uma solução contendo ácido Γ C-l^-/ -2-oxo-isocapró£

co, 2,5 microcurie/ml e 10,0 microcurie/micromole. Juntamos 50 microlitros desta mistura global a cada uma das cavidades das placas de microtitulação contendo as colónias a serem ensaiadas.

Passo 7 - O CC>2 produzido a partir de cada cavidade foi captado e visualizado pelo processo descrito por Taylor et al., J. Bacteriol. 128 485-486 (1976), intitulado Con14 venient Method for Detecting CO₂ in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants. Os mutantes desprovidos de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidroge14 nase activa não produzem Ba CO^ para além do observado para os controlos.

Um método mais refinado que aumenta 14 o contraste entre um ensaio positivo para CO₂, indicado por uma mancha escura no autoradiograma como um resultado 14 de formação de Ba CO^, e um ensaio negativo indicado por nenhuma mancha ou uma mancha muito ligeira, compreende o seguointe rastreio modificado.

Colónias simples (ver Passo 4 atrás) foram recolhidas do meio agar após 7-14 dias de crescimento (em vez de 2-3 ensaiadas e ensaiadas directamente pelas etapas 6 e 7 atrás). 0 Passo 5 do processo anterior é omi tido.

Um método de ensaio ainda mais refinado o qual e de natureza quantitativa no que diz respeito ' ~ 14 a libertação de CO₂ compreende o crescimento de mutantes detectado pelos rastreios anteriores num meio apropriado compreendendo um meio de sais M9 com glicose, 1% e Syncasa-bcaa, 0,1% (uma mistura sintética de L-amino-áci

dos com a composição aproximada de casamino-ácidos comerciais, mas sem a presença de L-valina, L-isoleucina e L-leucina, ver a seguir).

Após crescimento em células de eleva da densidãde, as células foram lavadas com meio de sais M9 e resuspensas em meio de sais M9 frio contendo 1% de tolu£ no o qual foi submetido a ultra-sons para produzir uma dispersão branca leitosa do tolueno. A suspensão células/ /tampão/tolueno foi incubada durante 40 minutos a 30°C a fim de permeabilizar as células.

As células permeabilizadas foram a seguir lavadas em meio de sais M9 e finalmente resuspensas num quinto do volume original de meio tampão M9. Usamos 180 microlitros desta suspensão por ensaio.

Um volume de reacção de 300 microlitros continha as células toluenizadas , pirofosfato de tiamina (PFT), 0,4 mM; coenzima A (CoA), 0,11 mM; nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (NAD), 0,68 mM, ditiotreitol (DTT), 2,6 mM; MgCl₂, 4,1 mM; Tris-HCl, 60 mM; Tris-HCl, 60 mM, pH 7,5; e Γ ¹⁴C-1 7-2-oxoisocaproato, 6.000 cpm, microcurie por micromole. A eficiência da contagem foi 73%. A reacção foi efectuada em frascos de cintilação de 15 ml contendo um quadrado de papel Whatman=||^4 de 2 x 2 cm na tampa de rosa do frasco. O papel contem 30 microlitros de hidróxido de Hiamina 1M (solução 1M de hidróxido de metilbenzotonina em metanol; disponível a partir da Sigma Chemical CO., St. Louis, MO 63178 ), o qual capta

CO₂ libertado na reacção.

Após incubação durante 2 horas, os papéis são imersos em 10 ml de Aquasol II Beckman (universal LSC (contador de cintilações liquido) disponivel a par tir do New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118) e a radioactividade medida num contador de cintilações líquido após equilíbrio neste solvente durante 4 horas ou mais. Uma reacção de controle em branco (i.e. sem células) origina ca. 50 - 300 cpm.

Os mutantes 1-3 e outros como eles originam pontos que foram menos do que ou iguais à reacção de controlo em branco, enquanto que a estirpe progenitora originou totais várias vezes superiores ao valor de contro lo em branco.

Composição de Syncasa-bccaa, 100 vezes Concentrada gramas/litro

L-alanina 3

L-arginina

Acido L-aspártico

L-cistina

Acido L-glutâmico

Glicina

L-histidina

L-lisina

L-metionina

L-fenilalanina 6 L-prolina 10 L-serina 6 L-treonina 4 L-tirosina 4 L-triptofano 1

A mistura é ajustada a pH7, e esteri lizada por filtração. Juntamos um volume de concentrado a 99 volumes do meio para obtermos concentrações de uso padrão .

Produção de Mutantes de Sh avermitilis 7881 (ATCC 53692) duplamente bolquedas deficientes em 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e em Avermectina B-O-metiltransferase

Passo 1 - S^. avermitilis ATCC 53567 crescem como um relva do confluente no Meio New Patch Agar durante 12 dias a 30°C.

Os esporos foram colhidos das 3 refe^ ridas placas e suspensos em 20 ml de tampão tris-ácido maleico 0,05 M, pH 9,0.

Passo 2 - Adicionamos 10 ml da suspensão de esporos a um frasco contendo 10 mg de N-metil-N'-nitro-N'-nitrosoguanidina (NTG). O frasco foi incubado e agitado a 28°C durante 60 minutos e os esporos a seguir profusamente lavados com solução NaCl a 1%.

Passo 3 - Os esporos lavados foram suspensos em NaCl a 1% e misturados com um volume igual de 80% de etileno-glicol. Esta suspensão foi preservada a -20°C e usada como uma fonte de células a serem rastreadas relativamente a mutantes.

Este conjunto de esporos foi espalha do em placas YPD para obtermos aproximadamente 100 colónias por placa. Colónias da população mutagenizada (tratadas com nitroso-guanidina) de estirpe 1-3 de Streptomyces avermitilis (ATCC 53567) são recolhidas , e espalhadas como remendos num meio agar preparado como se segue (gramas por litro): amido fino, 80; Ι^ΗΡΟ^,Ι; MgSO₄.7H₂O, 1; ardamina pH, 5; CaCO₃, 5; P-2000, 1 ml; FeSO₄.7H₂O,

0,01; MnCl₂.4H₂O, 0,001; ZnSO₄.7H₂O, 0,001; agar Bacto, 17; H₂0 destilada até 980 ml.

O pH é ajustado a 7,0 com NaOH antes de ser submetido a autoclave a 121°C, durante 20 minutos. Após autoclave, juntamos 20 ml de uma solução de estoque a 5%, estéril, de ácido ( 1 ) -2-metilbutirico, pH 7,0.

As culturas de agar são incubadas 8 a 12 dias a 28°C. As células (micélios) são removidas da superfície do agar, e colocadas em 250 microlitros de acetona. Vinte e cinco (25) microlitros dos extractos de ace tona são a seguir assinalados em placas de cromatografia de camada fina pre-revestidas por Analtech Silica Gel GF.

O cromatograma é efectuado durante 30 a 40 minutos com acetato de etilo como solvente, a seguir seco, e pulverizado com vanilina a 3% em etanol. As placas são colocadas num forno a 100°C durante 1 a 3 minutos, e a seguir pulverizadas com ácido sulfúrico a 3% em etanol, e novamente colocadas num forno a 100°C durante 10 a 15 minutos. Os mutantes deficientes em avermectina B-O-metiltransferase são identificados por uma mudança na configuração cromatográfica, i.e., os locais correspondendo a componentes avermectina B (Rf ca 0,54, 0,42 para BI e B2, respectivamente, estão ainda presentes, mas os locais cor-40-

respondentes a componentes avermectina A (Rf ca 0,69, 0,58 para Al e A2 respectivamente) faltam.

Processos Genéricos de Cromatografia Líquida de alta Resolução (HPLC)

Fase Móvel:

150 ml de água ml de acetonitrilo levando até 1 litro com metanol

Coluna:

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments,

Fullerton, CA 92634-3100) caudal: 0,75 ml/minuto detecção: UV a 240 nm atenuação: cerca de 6

Diluente de amostra (D):

35	ml de	acetonitrilo mais	390	ml de	metanol
1.	pesar	0,5 mg de avermectina	A2A num frasco
	de 10	ml e preencher até	ao	volume	com me-
	tanol
2 .	pesar	0,5 mg do produto	e testar um frasco
	de 10	ml e preencher até	ao	volume	com meta
	nol

e 2 são soluções de estoque/padrão; para que a solução padrão fique completa:

tomar 100 /11 (D e 100 jul (2) num frasco juntar 800 ml de fase móvel

Amostras:

1. Tomar 1 ml de caldo bem agitado, rodar para baixo

2. Remover tanto sobrenadante quanto possível sem pastilha perturbadora

3. Juntar 100 jul de água HPLC à pastilha e agitar com vortex para dispersar

4. Juntar 2 ml de diluente (D) e agitar bem

5. Filtrar o mesmo e realizar HPLC

As avermectinas naturais e não-naturais aqui descritas foram submetidas a este processo croma tográfico HPLC e o tempo de retenção dos picos das avermec tinas individuais divididos pelo tempo de retenção observado para a oligomicina A presente e que serve como padrão interno para uma dada determinação HPLC.

A oligomicina A é quase sempre obse£ vada por HPLC como sub-produto de fermentação S_. avermitilis e é o único produto visto em HPLC produzido pelos mutantes aqui descritos quando eles são cultivados num meio livre de ácido RCOOH em que R é como aqui definido ou num meio livre de compostos convertíveis em ácidos da fórmula RCOOH em que R é como aqui definido.

Tipicamente, o tempo de retenção ol£ gomicina A é 12,5 - 14 minutos. A relação dos tempos de retenção (RT) origina uma base mais significante para comparação da identidade e rendimentos de produtos avermectinas . A ordem geral de aparecimento dos produtos na HPLC é B2, A2, Bl e Al.

Avermectina

Natural____ RT/RT (oligomicina A)

B2b	0,70
B2a	0,84
A2b	0,90
A2a	1,09
Blb	1,40
Bla	1,83
Alb	1,83
Ala	2,42

Not ar que Bla e Alb não são resolvidos .

Avermectina não-natural ciclopentil-B2 ciclopentil-A2 ciclopentil-Bl ciclopentil-Al

RT/RT (oligomicina A)

0,94

1,23

1,99

2,62

Os tempos de retenção variam 1-2 minutos em dias diferentes, com oligomicina A aparecendo geralmente próximo de 12,5 - 14 minutos.

Nos exemplos seguintes as avermectinas foram determinadas pelo processo HPLC atrás descrito, excepto quando assinalado.

As composições do meio usado nos exemplos seguintes são apresentados a seguir.

Meio AS-7 çj/1 amido fino20

Ardamina pH°5

Pharmamedia15

CaCO₃2

Preparado por hidrólise de amido por alfamilase a partir de Bacillus licheniformis (disponível a partir de Novo Enzymes, Wilton, CT e vendido sob a marca registada Termamil) até um equivalente de dextrose de 40% ± 5%.

¹³ A partir de Yeast Products , Inc. , Clifton, NJ 07012.

^C A partir de Traders Protein., Memphis , TN 38108

Ajustar o pH a 7,2 com NaOH.

Meio AP-5
	2/1
amido fino	80
Ardamina pH	5
K₂ ^hpo ₄	1
MgSO₄.7H₂O	1
NaCl	1
CaCOg	7
FeSO₄.7H₂O	0,01
MnCl₂.7H₂O	0,001
ZnSO₄.7H₂O	0,001
P-2000 (antiespuma) ^a	1 ml/1

A partir da The Dow Chemical Company., Midland, Michigan

48640

Ajustar o pH a 6,9 com NaOH a 25%.

EXEMPLOS 1-4

Avermectinas a partir de Streptomyces avermitilis

1-3 (ATCC 53567)

£. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) a par tir de uma placa V-8 esporulada como inoculado em 80 ml de meio AS-7 num frasco de 500 ml de três divisórias. O fra£ co foi incubado num agitador a 200 rpm a 28 - 30°C. Após 24 horas de incubação, 1 ml de caldo completo foi inoculado em frascos de 300 ml contendo 40 ml de meio AP-5. Fermentações duplicadas foram efectuadas a 28 - 30°C na presença de 400 ppm de cada um dos compostos principais lista, dos a seguir, adicionados após 24 horas.

Após 312 horas , amostras de 2 ml do caldo completo foram misturadas com 8 ml de metanol: acet£ nitrilo (390:35). Após filtração, injectámos amostras de 50 Ail numa coluna Ultrasphere ODS Beckman (3,9 x 250 mm). A coluna foi eluida com metanol: acetonitrilo: água (89:14: :7) a 0,8 ml/min. e o eluido vigiado por detecção uv a 240 mm. Os tempos de retenção das novas avermectinas são apresentados a seguir.

	Tempo de Retenção de	Avermectina	(Minutos)
Composto Principal	B2	A2	BI	Al
1)	ácido ± 2-metil butirico	*11,60, 12,40	*14,75 , 16,10	23,1	29,82
2)	Acido ciclopentanocarboxílico	12,32	15,86	25,28	32,96
3)	ácido ciclo-hexano-carboxílico	14,84	19,26	31,46	41,14
4 )	ácido +2 metilbutirico	11,60	14,75	23,1	29,82

*

Ambos os ácido + metilbutirico e - ácido -metilbutirico são incorporados em avermectinas. Sob as condições de cro matografia adoptada, a resolução das + e - avermectinas é conseguida somente com B2 e A2.

EXEMPLO 5

Ciclo-hexil-Avermectinas a partir de Streptomyces avermitilis 7881 (ATCC 53692)

Um frasco congelado de cultura S^. avermitilis 7881 (ATCC 53692) foi inoculado em 100 ml de meio AS-7 num frasco de 500 ml de três divisórias. O fras co foi incubado num agitador rotativo com agitação a 200 rpm a 28 - 30°C.

I

Após 28 horas deincubação, 5 ml do caldo completo foram inoculados noutros 100 ml de meio AS-7 ou um frasco de 500 ml de três divisórias. O frasco foi novamente incubado num agitador rotativo com agitação a 200 rpm a 28 - 30°C. Após 24 horas de incubação, 1 ml do caldo completo foi inoculado num frasco de 300 ml contendo 40 ml de meio AP-5. Os frascos foram incubados a 28 - 30°C a 200 rpm.

Após 24 horas, juntamos 400 ppm de ácido ciclo-hexano-carboxílico, após 312 horas, tomamos amostras de 2 ml e submetemos a cromatografia líquida de alta resolução como descrito no Exemplo 1. Sob estas condições , os únicos componentes avermectina detectados na fermentação foram eluidos a 14,84 (54,9 mg/1) e 31,46 (32,1 mg/1) minutos correspondendo a ciclohexil-B2 e BI, respectivamente.

EXEMPLO 6

Sec-Butil-Avermectinas a partir de Streptomyces avermitilis 7881 (ATCC 53692)

Repetimos o processo do Exemplo 5 mas usando 400 ppm de ácido ± 2-metilbutirico em lugar de ácido ciclo-hexano-carboxílico, todas as outras condições foram as mesmas que as descritas no Exemplo 2. Somente sec-butil-avermectina B2 (11,60; 12,40 minutos; 63,5; 42,4 mg/1), e sec-butil-avermectina BI (23,1 minutos; 105,5 mg/1) foram detectadas na fermentação.

Claims

lâ. - Streptomyces avermitilis, caracterizado por estar desprovidade actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada desidrogenase e de actividade de avermectina B-O-metiltransferase.
2ê. - Streptomyces avermitilis desprovida de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e de actividade de avermectina B-O-metiltransferase caracterizada por as suas células permeabilizadas serem incapazes de produzir a partir do ácido

Γ l^c-l _7-2-oxo-isocaproico adicionado.
3â. - Streptomyces avermitilis caracteriuzada por apresentar as caracteristicas de identificação de ATCC 53692.
4â. - Streptomyces avermitilis, caracterizado por ser ATCC 53692.
5a. - Processo para a produção de uma avermectina B, caracterizado por se proceder à fermentação sob condições aerobicas de uma estirpe de Streptomyces avermitilis desprovida de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-de desidrogenase e de actividade de avermectina-B-O-metiltransferase, um meio nutritivo aquoso, constitui, do por uma fonte assimilável de azoto, carbono e sais inor gânicos, e um composto susceptivel de ser empregado no bio ssintese de uma avermectina.

Processo de acordo com a rei65. vindicação 5, caracterizado per a S.avermitilis ter as caracteristicas de identificação de ATCC 53692.

75. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o composto ser de fórmula R-COOH em que R representa um grupo de cadeia ramificada na posição alfa cujo átomo de carbono ao qual se encontra ligado o gru po -COOH está também ligado a pelo menos dois outros átomos ou grupos diferentes de hidrogénio; ou ser um composto convertivel no referido composto durante o processo de fer mentação.

85. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por R representar um grupo ramificado na posição alfa C^-Cg-alquilo, alcenilo, alcinilo, alcoxialquilo ou alquiltioalquilo; um grupo Cj--C8-cicloalquilalquilo em que o grupo alquilo representa um gru po C2~C|--alquilo ramificado na posição alfa; um grupo C^-Cg-cicloalquilo ou C^-Cg-cicloalcenilo cada um dos quais pode estar facultativamente substituido por metileno ou por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio ou um anel heterociclico de 3 a 6 membros, contendo oxigénio ou enxofre, que pode ser saturado, ou total ou parcial, mente insaturado e que pode estar facultativamente substituido por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio, ou um composto convertivel no referido composto durante o respectivo processo de fermentação.
9ê. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o composto convertivel no substrato RCOOH ser

R-(CH_) -Z

2 n em que R é como previamente definido; n é igual a 0, 2, 4,

4 5 ou 6; e Z represnta -CH-OH, -CHO, -COOR , -CH_NH„ ou -CONHR

4 ^Z 5 ^{2 Z} onde R significa H ou (C^ g)-alquilo; R representa hidrogénio , (Ο_χ_₄) alquilo, -CH(COOH)CH₂COOH, -(COOH)CH(CH₂)₂COOH ou -CH(COOH) (CH₂)₂SCH₃.

lOâ. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por R representar:

ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo , ciclo-heptilo, 2-metilciclopropilo, 3-ciclo-hexenilo, 1-ciclopentenilo, 1-cilo-hexenilo, 3-metilciclo-hexilo (cis/trans), 4-metileno ciclo-hexilo, 3-metilciclobutil, 3-met.ilenociclobutilo, 3-cilopentenilo, 1-ciclopropiletilo, 3-fluorociclobutilo, 4 -difluorociclo-hexilo, isopropilo, sec-butilo, 2-pentilo,

2,3-dimetilpropil, 2-hexilo, 2-pent-4-enilo, 2-metiltioetilo, S-2-pentilo, R-2-pentilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 4-tetra^ -hidropiranilo, 3-furilo, 2-clorotienilo, 3-tetra-hidrotienilo, 4-metiltio-2-butilo, 4-tetra-hidrotiopiranilo, 4-metoxi-3-butilo ou 4-metiltio-2-butilo.

lia. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por R ser derivado de um ácido carboxílico de fórmula R-COOH
12â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por R representar ciclopentilo, ciclo-hexilo ou tienilo.
13â. - Processo de acordocom a reivindicação 10, caracterizado por R ser derivado de um compoq to convertivel em R-COOH durante a fermentação em que o referido composto tem a fórmula R_(CH₂)_n~Z em que R é como previamente difinido; n é igual a 0, 2, 4 ou 6; Z represen ta -CH₂OH, -CHO, -COOR⁴, -CH2NH2 ou -CONHR⁵ onde R⁴ representa ()-alquilo, representa hidrogénio, (C^ ^)-alquilo, -CH (COOH )CH2COOH , -CH(COOH) (CH^COOH ou -CH(COOH) (ch₂)₂sch₃.
14ê. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por R representar um grupo Cg-Cg-alquilo ramificado na posição alfa, não ser isopropilo ou (S)-sec-butil.
15â. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto da variedade de S. avermitilis ser S. avermitilis ATCC 53692.
16^. - Estirpe pertencente ao género Streptomyces, caracterizado porser essencialmente incapaz de produzir avermectinas C-076 quando submetida a fermen tação num meio nutritivo aquoso constituído por uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânicos, sob cond£ ções aeróbicas, em que o referido meio nutritivo é substancialmente isento e um ácido de fórmula R-COOH ou de um composto convertivel no referido ácido por S.

-53avermitilis em que R representa isopropilo ou (S)-sec-bu- j tilo, mas ser capaz de produzir essencialmente apenas aver mectinas B, quando submetidas a fermentação no referido meio · ¹nutritivo, desde que o meio contenha acido de formula R-COOH | ou um composto convertivel no referido ácido por S.avermi- I tilis, em que R representa isopropilo ou (S)-sec-butilo. !

I em que a referida estirpe é obtida por um processo que com preende a mutação de Streptomyces avermitilis ATCC 53567.