PT86583B - Processo para a producao de desmetil-avermectinas nao naturais - Google Patents
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-
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Description
Este invento diz respeito a agentes parasiticidas; designadamente, desmetilavermectinas e a um processo para a sua preparação.
As Patentes dos EUA 4.310.519 e 4. 429.042 descrevem as avermectinas, num complexo de agentes relacionados tendo potente actividade antiparasitica, e sua produção por fermentação aeróbica de estirpes de Streptomyces avermitilis; designadamente, £. avermitilis ATCC Nos. 31267, 31271 e 31272. As últimas duas variedades referidas representam um frasco gelado e um tubo liofilizado, respectivamente, de uma cultura obtida por irradiação ultravioleta de S. avermitilis ATCC 31267.
A EP 214.731, publicada em 18 de Mar ço de 1987, o eguivalente do Pedido de Patente dos EUA No. de série 886.867, apresentada em 16 de Julho de 1986, divulga um número de compostos (agui referidos como avermectinas não naturais) relacionados com as avermectinas naturais ou conhecidas mas tendo um grupo substituinte novo na posição 25., e um processo para a sua preparação por fermen tação de um organismo produtor de avermectina na presença de certos ácidos carboxílicos específicos, ou seus derivados ou percursores. Os organismos £. avermitilis usados para produzir as referidas novas avermectinas substituidas em C-25 são S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 e NCIB 12121. 0 último organismo, descrito na EP 214.731, é deri_ vado a partir de £. avermitilis ATCC 31271. Dá rendimentos melhorados de novas avermectinas substituídas em C-25 quan do é cultivado num meio semi-definido.
Cada um de ATCC 31267, 31271, 31272, e NCIB 12121 pode também produzir além do novo derivado substituido em C-25, quantidades variáveis das avermecti-5-
nas conhecidas ou naturais, em que o substituinte 25 é iso propilo ou (S)-sec-butilo (1-metilpropilo).
esqueleto de carbono das avermecti. nas (representado na fórmula (I) a seguir) é derivado a partir de acetatos e propionatos e o substituinte em C-25 de avermectinas naturais a partir de L-isoleucina (R = (S)-sec-butilo) ou L-valina (R = isopropilo) /Fisher and Mrozik, Macrolide Antibiotics, Academic Press (1984) ch. 147Por avermectinas conhecidas ou n£ turais subentende-se as avermectinas produzidas por avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 e ATCC 31272 em que o substituinte da posição 25 ou é isopropilo ou (S)-sec-buti. lo (1-metilpropilo).
As avermectinas em que o substituinte da posição 25 é diferente de isopropilo ou sec-butilo (for ma S) são aqui referidas como avermectinas novas ou não naturais.
As estirpes de S. avermitilis referi das nas patentes dos EUA atrás mencionadas produzem uma classe de substâncias aqui genericamente descritas como C-076. A classe compreende oito compostos distintos intima mente relacionados descritos como C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a e B2b. A série a de compostos refere-se às avermectinas naturais em que o substituinte 25 é (S)-sec-butilo e a série b àqueles em que o substituinte 25 é isopropilo. As designações A e B referem-se a avermec tinas em que o substituinte 5 é metoxi ou hidroxi, respecti^ vamente.
Por último, o numeral 1 refere-se a avermectinas em que uma dupla ligação está presente na posição 22-23; e o numeral 2 a avermectinas tendo um hidrogénio na posição 22 e hidroxi na posição 23.
Neste pedido de patente, nenhuns de£ tes identificadores são usados no que diz respeito ao substituinte 25 das avermectinas não naturais. Identificado res Al, A2, Bl, B2 foram retidos para referir as avermect£ nas não naturais tendo os aspectos estruturais correspondentes aos das avermectinas naturais como atrás mencionado .
A geração de mutantes sem actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase foi assinalada para Bacillus subtilis, Willecke and Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264-72 (1971) e Pseudomonas putida, Martin et al., J. Bacteriology, 115 198-204 (1973), mas não para
A Ptente dos EUA 4.285.963, descreve um derivado avermectina A em que a posição 25 é substituída com um grupo metilo e um etilo; e o substituinte da posição 23 é hidroxi. A Patente dos EUA 4.378.353 descreve compostos C-076 relacionados e sua preparação por cultura de MA-5218, uma estirpe mutante de £. avermitilis ATCC 31272, obtida a partir de irradiação ultravioleta. O mutante é identificado como ATCC 31780. Aos compostos C-076 relacionados, produzidos pelo referido mutante falta o anel C-076 furano. Adicionalmente, em certos dos compostos assinalados, uma ou ambas as porções açúcar oleandrose foram clivadas, enquanto noutros o grupo da po sição 5 foi oxidado num grupo ceto.
7I
Três classes de mutantes O-metil-trans^ ferase de S. avermitilis que produzem avermectinas a que faltam grupos O-metilo foram assinalados por Ruby et al., 6th. International Symposium on the Biology of Actinomycetes, Debrecen, Hungria, Agosto 26-30 (1985) e por Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 744-7 (1987).
A primeira classe produz primariamen te avermectinas B devido à sua incapacidade para metilar o hidroxi em C-5 do anel lactona macrociclico. A segunda classe produz 3'-0, 3-O-bis-desmetilavermectinas (avermec tinas a que falta o substituinte O-metilo na posição 3 de ambos os resíduos monossacarídicos oleandrose, e as quais são referidas como desmetilavermctinas. A terceira classe é incapaz de metilar em qualquer posição.
Schulman et al. , Fed. Proc. 44, 931 (1985) divulgam a produção aumentada de avermectinas B por fermentação de avermitilis na presença de substâncias tal como sinefungina, S-adenosiletionina e S-adenosilhomocisteina, as quais inibem a metilação do grupo hidroxi em C-5 da porção aglicona pela enzima avermectina B-O-metil-transferase. Mutantes de Streptomyces avermitilis desprovidas da actividade O-metiltransferase e que produzem quantidades aumentadas de componentes avermectina B são também divulgados e referidos por Schulman et al. , in Anti^ microbial Agents and Chemotherapy 29 , 620-624 (1986).
Schulman et al., J. Antibiot. 38 (11), 1494-1498 (1985) assinalam que S_. avermitilis Agly-1, uma estirpe mutante que produz virtualmente somente agliconas de avermectina Ala e A2a quando fermentada na presença de sinefungina, produz quantidades aumentadas de componentes aglicona de avermectina B.
-8Do mesmo modo, Í5. avermitilis 08, uma estirpe altamente produtora de avermectinas, quando fermen tada na presença de sinefungina como inibidor de O-metil-transferase, originou a produção de avermectinas a que faltam grupos O-metilo na aglicona em C-5 e na porção olean drose dissacaridica.
A mutagénese de £5. avermitilis produz mutantes desprovidas de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia | ramificada-desidrogenase. Os mutantes já não possuem a capacidade para produzirem quantidades significativas das avermectinas naturais na ausência do composto adicionado RCOOH em que R é isopropilo ou (S)-sec-butilo, ou de um composto convertível em RCOOH durante o processo de fermen tação. Surpreendentemente, e inesperadamente, no entanto, verificou-se que os mutantes produziram avermectinas, naturais e não naturais, quando fermentadas na presença de um composto adicionado R-COOH em que R é isopropilo ou (S)-sec-butilo, ou outro grupo aqui divulgado, ou de um percur sor do referido RCOOH.
z
E mesmo mais surpreendente que os mu
I tantes aqui descritos que são desprovidos da actividade de
2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e que são incapazes de degradar L-isoleucina, L-leucina ou L-valina, são capazes de assimilar uma grande variedade de compostos na via avermectina biossíntética com produção de avermecti^ I nas não naturais livres da presença de avermectinas naturais .
As avermectinas naturais, como referido, são produzidas como uma mistura complexa de oito com postos distintos mais infimamente relacionados; fórmula (I), R = isopropilo e (S)-sec-butilo. Embora eles tenham
sido recuperados na forma substancilamente pura (ver Paten te dos EUA 4.429.042), a metodologia é, no mínimo, laborio sa. A produção de avermectinas não naturais de acordo com o processo descrito na EP 214.731 pode também produzir algumas das avermectinas naturais em guantidades variáveis devido à presença de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desi. drogenase e dos aminoácidos L-valina e L-isoleucina na célula dos microorganismos avermitilis usados na sua pro dução. A cultura das estirpes de £. avermitilis conhecidas antes deste invento na presença de sinefungina, um aná logo de S-adenosilmetionina, produz desmetil-avermectinas das séries A e B.
A capacidade de escolha para produzir avermectinas ou desmetilavermectinas, quer naturais ou não naturais, demodo a minimizar o número e complexidade dos produtos, ao fazer aumentar assim a pureza de uma avermectina escolhida, e assim simplificar os processos de separa ção, é um objectivo desejável.
Desmetilavermectinas parasiticidas de fórmula (I)
em que a linha a tracejado na posição 22-23 representa uma dupla ligação opcional;
r! é hidroxi e está presente sómente quando a dupla ligação está ausente;
é uma porção dissacarídica da fór mula
5/ em que cada um de R e R é hidrogénio ou metilo, com a condição de que pelo menos um de R^ e R^ é hidrogénio;
R é hidrogénio ou metilo; e
R é um grupo ramificado na posição alfa Cg-Cg alquilo, alcenilo, alcinilo, alcoxialquilo ou alquiltioalquilo; um grupo Cg-Cg cicloalquiloalquilo em que o grupo alquilo é um grupo C 2“C5 alãuilo ramificado na posição alfa; um grupo CyCg cicloalquilo ou Cg-Cg cicloalcenilo cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído por metileno ou um ou mais grupos C^-C^ alquil ou áto mos de halogénio; ou um anel heterociclico de 3 a 6 membros contendo oxigénio ou enxofre, o qual pode ser saturado com total ou parcialmente insaturado e o qual pode opcio
-11nalmente ser substituído por um ou mais grupos C^-C^ alqui lo ou átomos de halogénio; com a condição de que quando R é alquilo, não é isopropilo ou sec-butilo, e sua prepar£ ção por cultura de estirpes avermitilis desprovidas de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e/ou actividade aminoácido de cadeia ramificada-transaminase na presença de sinefungina.
As estirpes S. avermitilis desprovidas de actividade 2-oxoácido de cadeia ramificada-desidrogenase são produzidas por mutação de estirpes produtoras de avermectina de avermitilis e especialmente por mutação de S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 e NCIB 12121. Os mutantes são incapazes de sintetizar as avermectinas naturais excepto onde o ácido gordo , ou um seu percursor, ligado ao grupo isopropilo ou sec-butilo (forma S), é adicionado ao meio no qual os mutantes são fermentados. Eles são capazes de produzir avermectinas na turais e não naturais quando fermentados sob condições aeróbicas aquosas num meio nutriente contendo um ácido inici£ dor apropriado ou composto nele convertível no processo de fermentação.
Conduzindo a fermentação na presença de sinefungina produzem-se avermectinas A e B desmetiladas desprovidas de um ou mais grupos metoxi na posição 3'e/ou 3- da porçãõ dissacarídica, tendo então a referida posição ou posições um grupo ou grupos hidroxi.
Os mutantes caracterizados pela sua falta de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase são isolados a partir de colónias mutagenizadas com base no ensaio C02’
Neste processo a ausência de liberta ção de por células permeabilizadas a partir de um substrato de ácido /~Χ*Ο-1 7-2-oxoisocapróico ou ácido /^c-l 7-2-oxo-3-metilvalérico ou ácido /d^C-l 7-2-oxo-3-metilbutirico, indica a ausência de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase.
Foi surpreendente e inesperado que os mutantes aqui descritos desprovidos de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase retivessem a capacidade para produzir avermectinas e, na presença de sin£ fungina, desmetilavermectinas.
A incapacidade dos mutantes para pro duzir os derivados naturais de ácido gordo coenzima A quan do crescem num meio convencional podia ter sido uma mutação letal se a integridade da membrana dependesse dos referidos derivados ou se a acumulação de 2-oxo-ácido pelo primeiro mutante levasse à citotoxicidade. Além disso, os mutantes não eram esperados serem capazes de sintetizar acetil-CoA e propionil-CoA a partir do metabolismo degradativo de L-isoleucina e L-valina, uma vez que este precisa da actividade da enzima que falta aos mutantes.
A exigência destes derivados acil-CoA para biossíntese de avermectinas, atrás referida, leva à expectativa de que os mutantes devem ser severamente prejudicados na produção de avermectina não natural, que, sur_ preendentemente, não foi o caso.
Os termos avermectina ou avermectinas11 como aqui usados referem-se a compostos tendo fórmu la (I) a seguir mas em que o substituinte em 25 (R) pode ser qualquer grupo assimilável na referida posição pelo
13I
£. avermitilis deste invento. 0 termo desmetilavermectinas como aqui usado refere-se a avermectinas tipo A e B em que uma ou ambas das posições 3'-, 3- da porção dissa carídica é substituída por hidroxi em vez de metoxi.
Os mutantes aqui descritos são altamente valiosos para a produção de desmetilavermectinas não naturais pelos processos divulgados e aqui exemplifiçados. Eles são especialmente valiosos para a produção de desmetil avermectinas preferidas, i.e., compostos em que o substituinte em C-25 é um grupo C^-C*. cicloalquilo ou cicloalque nilo, opcionalmente substituído por C^-C^, 1-metiltioetilo, ou um grupo heterociclico de 5- ou 6-membros com oxigénio ou enxofre, especialmente 3-tienilo ou 3-furilo.
A mutação de um membro produtor de avermectina das espécies Streptomyces avermitilis é efectuada de acordo com processos conhecidos usando qualquer um de uma variedade de agentes mutantes incluindo irradiação ultravioleta, irradiação por raios X, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina; etilmetano-sulfonato, ácido nitroso e mostardas de azoto, e.g. N-metilbis (2-cloroetil) amina, ou tratamentos análogos. A mutagénese pode ser efectuada sobre os esporos ou sobre uma cultura vegetativa de S. avermitilis capaz de produzir avermectinas naturais, e.g. J5. avermitilis ATCC 31272 .
Seguindo processos bem conhecidos dos especialistas da técnica, as colónias mutagenizadas são se leccionadas relativamente à falta de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase na base de um método de ensaio bioquímico o qual permite o rastreio de grandes números de colónias bacterianas aleatoriamente mutagenizadas para prq dução de ^CO a partir de Λ^^-1 7-2-oxo-ácido de cadeia ramificada seleccionados (Tabor et al., J. Bact. 128,
485-486, 1976).
A metodologia compreende o crescimen to de colónias mutantes em cavidades de uma placa de micro titulação sobre um meio nutriente apropriado, permeabilizando as células com tolueno seguido por adição de /”d^C-17-2-oxo-ácido (e.g. ácido 2-oxoisocapróico) a cada cavidade e verificação da atmosfera sobre a fermentação relativamen 14 te ao C02.
, r-14 ~t
Alternativamente, o acido / C-l/-2-oxo-3-metilvalérico, ou ácido /~χ c-l 7-2-oxo-3-metilbutirico podem ser usados em lugar de ácido /~^^C-1 7-2-oxoisocapróico. A produção de é convenientemente verificada pela colocação de papel de filtro húmido saturado com Ba(OH)„ por cima das cavidades individuais para captar Z 14 14 qualquer C02 libertado e por detecçao de Ba CO^, se houver, por auto-radiografia. Os mutantes desprovidos de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase dão auto-radiogramas que se aproximam dos de controlo em branco; i.e., nenhum Ba^^CO^ é produzido pelos mutantes .
As características morfológicas e culturais dos mutantes aqui dezcritos são geralmente como descritos na Patente dos EUA 4.429.042. A característica que distingue os miutantes é a sua falta de actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase cuja característica é determinada como a seguir se descreve.
A falta da referida actividade resul_ ta na incapacidade dos mutantes para produzir as avermecti. nas naturais quando crescem num meio definido substancialmente livre de ácidos gordos RCOOH em que R é isopropilo
ou (S)-sec-butilo, ou compostos convertíveis nos referidos RCOOH durante a fermentação. Uma investigação taxonómica efectuada pela American Type Culture Collection, confirmou que as características de duas estirpes mutantes 1-3 e HL14
-26, seleccionados pelo ensaio C09 anterior, têm uma rek ' lação intima com a estirpe parentérica ATCC 31272 descrita na Patente dos EUA 4.429.042, mas com certas excepções.
Assim, a estirpe de mutante 1-3 (ATCC
53567) forma significativamente menos cadeias de esporos do que forma o ATCC 31272, e a estirpe mutante HL-026 (ATCC 53568) é praticamente desprovida de micélios aéreos e esporos, mas as poucas cadeias de esporos produzidas são de carácter semelhante ao do ATCC 31272. Também, o mutante HL-026 exibe uma capacidade duvidosa para utilizar rafinose como uma única fonte de carbono, ao.passo que a estirpe ATCC 31272 e a estirpe mutante 1-3 são capazes de usar rafinose. (Em experiências realizadas pelos requerentes, a rafinose não parece suportar o crescimento de qualquer daquelas estirpes).
Uma outra caracterísitica da estirpe | mutante HL-026 foi que ela produziu menos pigmento melanina do que as outras duas estirpes e unicamente nenhuma tirosina agar. Finalmente, em contraste com a descrição dada para ATCC 31272 na patente dos EUA 4.429.042, nós somos incapazes de detectar crescimento dos mutantes ou de ATCC | 31272 com sacarose como fonte única de carbono.
Streptomyces avermitilis 1-3 e HL-026 foram depositadas sob os termos do Tratado de Budapeste no American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, um depositório conhecido que permite a permanência dos depósitos e sua pronta acessibilidade pelo público se uma patente for conhecida sobre este pedido.
Foram-lhe dadas a designação Strepto myces avermitilis ATCC 53567 e ATCC 53568, respectivamente. Os depósitos estão disponíveis, durante a pendência deste pedido, para uma pessoa designada pelo Comissioner of the United States Patent and Trademark Office, para isso autorizado sob o 37 CFR 1,14 e 35 USC 122, e de acordo com leis das patentes estrangeiras em países em que os equivalentes deste pedido, ou sua progénie, são apresentados. Todas as restrições sobre a disponibilidade para o público dos microorganismos depositados serão irrevogavelmente removidos após a concessão da patente.
Quando fermentados num meio nutriente contendo o composto iniciador apropriado, os mutantes deste invento produzem um composto de fórmula (I) ou, como é mais vulgarmente o caso, uma mistura de dois ou mais compostos de fórmula (I) nos quais R corresponde ao composto iniciador usado. Podem ser produzidos até quatro produtos, conveniente e trivialmente referidos como R-avermectina Al, A2, Bl, e B2, de acordo com as designações usadas na U.S. 4.429.042. O grupo R refere-se, claro está, ao substituinte em C-25. Por exemplo, quando R é ciclopentilo as quatro possíveis avermectinas são:
| Nome Trivial ou Vulgar | R1 | R3 |
| ciclopentil-avermectina Al | dupla ligação | ch3 |
| ciclopentil-avermectina A2 | hidroxi | ch3 |
| ciclopentil-avermectina Bl | dupla ligação | H |
| ciclopentil-avermectina B2 | hidroxi . | H |
Na presença de sinefungina, produzem
-se as correspondentes desmetilavermectinas. Um decresci, mo nas quantidades de componentes desmetilavermectina A e um aumento na quantidade de componentes desmetilavermecti na B é geralmente observado.
Compostos de fórmula (I) em que a du pia ligação está presente e OH está ausente pode alternativamente ser preprado a partir do correspondente composj to de fórmula (I) em que R1 é OH, e a dupla ligação está ausente, por uma reacção de desidratação. A reacção é efectuada protegendo primeiro selectivamente os grupos hi_ droxi nas posições 5 e 4, e.g. como o derivado t-butildimetilsililoxi-acetilo, e a seguir reacção com um haleto de tiocarbonilo substituído, tal como cloreto de (4-metil. fenoxi)tiocarbonilo, seguido por aquecimento num solvente de alto ponto de ebulição e.g. triclorobenzeno, para efec tuar a desidratação. 0 produto é finalmente desprotegido para originar o composto não saturado. Estes passos, em conjunto com reagentes e condições de reacção apropriadas, são descritos na Patente dos Estados Unidos 4.328.335.
) Os compostos de fórmula (I) em que
R é H podem também ser preparados a partir dos compostos correspondentes em que R é CH^ por desmetilação. Esta reacção é efectuada por tratamento do composto 5-metoxi, ou um seu derivado apropriadamente protegido, com acetato I mercúrico e hidrólise do resultante éter 3-acetoxi enólico com ácido diluido para obtermos o composto 5-ceto. Este é a seguir reduzido, usando, por exemplo, boro-hidreto de sódio para obtermos o derivado 5-hidroxi. Reagentes e con dições de reacção apropriados para estes passos são descri, tos na Patente dos Estados Uniodos 4,423,209.
Os compostos de fórmula (I) em que R^ é H e a dupla ligação está ausente podem ser preparados a partir do composto correspondente em que a dupla ligação está presente e R está ausente por hidrogenação catalítica selectiva usando um catalisador apropriado.
Por exemplo, a redução pode ser efectua da usando cloreto de tris (trifenilfosfina) ródio como descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia No. 000 1689, e sua equivalente Patente dos Estados Unidos da América 4199 569, publicada em 22 de Abril de 1980.
Os compostos capazes de utilização p£ lo S. avermitilis deste invento para a biossintesze das desmetil avermectinas de fórmula (I), são compostos de fórmula (II-A)
R-COOH (II-A) incluindo compostos convertives em (II-A) durante o processo de fermentação.
Os referidos compostos são aqui referi dos como compostos indicadores. Na fórmula (II-A), R é um grupo de cadeia ramificada no principio alfa estando o seu átomo de carbono ao qual está ligado o grupo -COOH também ligado pelo menos dois outros átomos ou grupos diferentes de hidrogénio.
Esta definição, claro está, engloba grupos aciclico e ciclicos saturados e insaturados incluin do os que têm opcionalmente um heteroátomo de enxofre ou oxigénio como membro da cadeia aciclica ou anel ciclico.
Mais especificamente, R, o qual se torna o substituinte C-25, pode ser um grupo ramificado na função alta C^-Cg alquil, o alcenilo, alcinilo, alcoxialquilo ou alquiltioalquilo; um grupo C^-Cg cicloalquilalqui lo em que o grupo alquilo é um grupo C2“C5 alc3uil ramificado no posição alfa; um grupo C^-Cg cicloalquilo ou C^-Cg cicloalcenilo, qualquer um dos quais pode opcionalmente ser substituído por metilano ou um ou mais grupos C^-C^ alquilo ou de halogênio (fluor,cloro, iodo ou bromo); ou um anel heterociclico com 3 a 6 membros contendo oxifénio ou enxofre o qual pode ser saturado, ou completa ou parcialmente não saturado e o qual pode opcionalmente ser substituído por um mais grupos C^-C^ alquilo ou átomos de halogênio.
Compostos convertiveis em RCOOH, i.e., percusores, no processo de fermentação são compostos de fórmula (II-B) em que R ê como atrás definido:
R-(CH0) -Z
Z n (II-B) n é 0,2,4 ou 6; e Z é -CH OH, -CHO, -CH?NH?, -COOR5 ou
5 Z z u
-CONHR0 em que R3 é H ou ^ci_6) alguil°' R ® hidrogénio, (Cj_4) alquilo ou o residuo de um amino-ácidfo, especial-20-
mente de ácido aspártico, ácido glutâmico e metionina, e.g., -CH(COOH)CH2 COOH, -CH(COOH) (CH2)2 COOH e -CH(COOH) (CH^ SCH3, respectivamente.
Também incluindo neste invento estão as formas isoméricas de compostos de fórmula (II-A), e com postos nelas convertiveis durante o processo de fermentação, e as sua avermectinas isoméricas ou C-25 resultando do seu uso no processo aqui descrito.
O processo deste invento é efectuado por fermentação aeróbica, na presença de sinefungina ou outro inibidor, com uma estirpe de £. avermitilis , preferivelmente uma desprovida de avtividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte assimilável de azoto, carbono, sais inorgânicos e um composto de fórmula RCOOH, ou um composto convertivel no referido composto (i.e., um percusor) durante a fermentação.
O ácido, ou composto convertivel nele convertivel é adicionado à fermentação quer no momento da inoculação ou a intervalos durante a fermentação.
Pode ser adicionado todo de uma vez ou em porções com intervalos durante a fermentação. A s-adenosiletionina pode também ser adicionado no momento da ino culação ou nalgum momento durante a fermentação, ou todo de uma vez ou em porções intervaladas durante a fermentação ou continuamente.
A produção dos produtos avermectina pode ser vigiada por remoção de amostras de fermentação extraindo com um solvente orgânico, e após o aparecimento do produto por cromatografia, por exemplo, usando cromatografia liquida de alta resolução.
A incubação é continuada até ao momen to do produto ter sido maximizado, geralmente durante um periodo de 4 a 15 dias.
Um nivel preferido de cada adição de compostos iniciadores (ácido carboxilico ou composto nele convertivel) estáentre 0,05 a 3,0 gramas por litro. 0 composto inicoiador pode ser adicionado continuamente, in termitentemente ou todo de uma vez à fermentação.
O ácido (RCOOH) é adicionado tal qual ou como um sal, tal como sal de sódio, litio ou amónio, ou como um composto convertivel no ácido como atrás definido .
O ácido, se for sólido é preferivelmen te dissolvedo num solvente apropriado tal como água ou al_ coois (C1-C4).
A sinefungina é adicionada à fermentação com intervalos e com niveis que não afectam o crescimento de microorganismos. Na prática quantidades que variam entre cerca de 0,01 a cerca de 1,0 mM podem ser usadas, estas quantidades podem ser adicionadas à fermentação preferivelmente entre 24-168 horas após inoculação.
Quantidades favoráveis e preferidas va riam entre 0,05-0,50 mM e entre 0,05-0,25 mM, respectivamente .
O meio usado para a fermentação pode, ser um meio convencional contendo fontes assimiláveis de car bono, azoto e elementos restisiais. No entanto prefere-se usar um meio de fermentação no qual os ingredientes escolhidos faltam ou contêm sómente quantidades minimas de composto iniciadores em que a porção R é isopropilo ou (S)-sec-butilo.
Após fementação durante o periodo de várias dias a uma temperatura preferivelmente na gama de 24 a 33°C, o caldo de fermentação é centrifugado ou filtrado e o bolo micelial é extraido preferivelmente com ac£ tona ou metanol.
O extracto de solvente é concentrado e o produto desejado é a seguir extraido num solvente orgânico imiscivel em água, tal como cloreto de metileno, ace tato de etilo, clorofórmio, butaznol ou metil-isobutil-cetona.
O extracto de solvente é concentrado e o produto em bruo é a seguir purificado conforme necessário por cromatografia, por exemplo usando cromatografia preparativa liquida de alta resolução, de fase reversa.
O produto é geralmente obtido como uma mistura dos compostos de fórmula (I) em que R um ou
5/ 1 ambos de R e R é hidrogénio; R é OH e a dupla ligação
esta ausente ou Rx está ausente e a dupla ligação esta pre. sente; e R é H ou CH^. No entanto as porpoções podem variar dependendo do mutante particular, o composto iniciadore de algum modo da quantidade de sinefingina empregada e das condições usadas.
A fonte do grupo R; i.e., se provem directamente de R-COOH ou é produzido a partir de um dos percusores anteriores ou a partir de qualquer precursor, não é relevante para a produção das desmetilavermectinas.
A exigência fundamental do processo deste invento para a sua produção, éde que o desejado grupo R seja formado disponivel para as estirpes Í5. avermitilis deste invento no processo de fermentação.
Compostos apropirados incluem os seguintes :
ácido 2,3-dimetilbutirico ácido 2-metil-hexanoico ácido 2-metilpent-4-enoico ácido 2-ciclo-propil-propionico sal de litio de ácido 4,4-dilfuorociclo-hexano-carboxilico ácido 4-metilenociucllo-hexano-carboxilico ácido (Cis/Trans) 3-metilciclo-hexano-carboxilico ácido 1-ciclopenteno-carboxilico
ácido 1-ciclo-hexano-carboxilico ácido tetra-hidropirano-4-carboxilico ácido tiofeno-2-carboxilico ácido 3-furoico ácido 2-clorotiofeno-4-carboxilico ácido ciclobutano-carboxilico ácido ciclopentano-carboxilico ácido ciclo-hexano-carboxilico ácido ciclo-heptano-carboxilico ácido 3-metilciclopropano-carboxilico ácido 3-ciclo-hexeno-l-carboxilico ácido 2-metiltiopropionico ácido 2-metil-4-metoxibutirico ácido tiofeno-3-carboxilico hidroximétilciclopentano
3-tiofeno-carboxaldeido ácido 3-ciclo-hexilpropionico ácido 3-ciclopentilpropionico hidroximetilciclobutano ácido tetra-hidrotiofeno-3-carboxilico
3- ciclopentil-l-propanol sal delitio de ácido 3-metilciclobutano carbocilico ácido 3-fluorociclobutano-carboxilico sal de litio de ácido 3-metilenociclo-butano-carboxilico ácido 2-metil-4-metiltiobutirico ácido tetra-hidrotiopirano-4-carboxilico ciclobutilmetilemina ciclobutanocarboxilato de etilo
4- hidroximetilciclopenteno ester de etilico de ácido 2-(3-tiofeno-carbonil)propionico ácido (S)-2-metilpentanoico ácido (R)-2-metilpentanoico
Os mutantes de O-metiltransferase podemser obtidos a partir de mutantes negativos 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase aqui descritos.
Os mutantes nos quais uma mutação na actividade de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase activa se combina com uma ou ambas as mutações ou 0-metil-transferase origina estirpes de S^. avermitilis que produzirão, quando fornecidas de compostos RCOOH ou compostos convertidos em RCOOH, primáriamente e compostos aver mectinas B, desmetilavermectinas ou desmetilavermectinas B.
Os referidos mutantes são obtidos por mutagenase doqui descritos mutantes desprovidos de actividade 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase por meio de luz ultravioleta e/ou mutagénicos quimicos tal como N-metil-N-nitrosouretano, nitroguanidina etilmetano-sulfonato ou outro agente a tal como dos atrás enumerados.
Alternativamente, os mutantes positivos de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase a que faltam uma ou ambas das O-metiltransferases podem ser mutados por tratamento com luz UV ou um agente mutagenante para produzir os mutantes negativos de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e/ou mutantes negativos de amino ácido de cadeia ramificada-transaminase.
As avermectinas não naturais produzidas por tais mutantes são caracterizadas pela presença de grupos hidroxi na posição C-5 da poirção aglicona e/ou nas posições C-31 e/ou C-3'' das porções oleandrose.
Os mutantes atrás descritos são iden tificados de acordo com a metodologia descrita por Schulman et al. Antimicrobial agents and Chemotherapy, 29 620-624 (1986).
Eles são úteis para os mesmos object_i vos e da mesma maneira que são as avermectinas conhecidas.
Os compostos do invento são agentes antiparasitas altamente activos tendo utilidade particular como antelminticos, ectoparasiticidas, insectisidas e acaricidas.
Assim os compostos são eficazes no tratramento de uma variedade de condições cansadas por endoparasitas incluindo, em particular helmintease as quais é mais frequentemente, cansadaa por um grupo de vermes parasitas descritos como nemátodes, e os quais podem originazr perdas económicas em suinos, ovelhas, cavalos,e vacas bem como afectar animais domésticos e criação.
Os compostos são também eficazes con tra outros nemátodes os quais afectam várias especies de animais incluindo por exemplo, Dirofilaria em cães e vários parasitas os quais podem afectar seres humanos incluin do parasitas gastro-intestinais tal como Ancilostona, Necator, Ascaris, Strongyuloides, Trinchinella, Capillaria Enterobius e parasitas que são observados no sangue ou outros tecidos e orgãos tal como vermes filiariais e os estágios intestinais extra Strongyloides e Trinchinella.
Os compostos são também de valor no tratamento de infecções extoparasitas de animais e pássaros tal como carraças, acavos, piolhos, pulgas mosca vare-28-
jeira, insectos mordedores e larvas dipteras migratórias os quais podem afectar vacas e cavalos.
Os compostos são também insectiddas activos contra pragas domésticas tal como baratas, traça da roupa, escaravelho das carpetes e a mosca doméstica, bem como são ínteiramente úteis contra pragas de insectos de cereais armazenados e de plantas agrícolas tal como aracaidos, afisdeo, lagartos e contra urtopteranos migratórios tal como gafanhotos.
Os compostos de fórmula (I) são admi_ nistrados como formulação apropriada para o uso especifico em vista e para as especies particulares de animal hospedeiro a ser tratado e do parasita ou insecto envolvido.
Para uso como um antelmintico os com postos podem ser administrados oralmente na forma de um cápsula, bolus, comprimido ou num remédio liquido para an£ mais, ou alternativamente, eles podem ser administrados por injecção ou como um implante.
Tais formulações são preparadas numa maneira convencional de acordo com a prática veterinária padrão. Assim, cápsulas bólus ou comprimidos podem ser preparados por mistura do ingrediente activo como um diluente ou suporte apropriado finamente dividido e contendo adicionalmente um agente desitregrante e/ou ligante tal como amido lactose, talco, estearato de magn-ésio, etc.
Uma dose de formulação pode ser preparada por dispersão do ingrediente activo numa solução aquosa juntamente com agentes dispersantes ou molhantes, etc., e formulações injectaveis podem ser preparadas na for
ma de uma solução estéril a qual pode conter outras subs- | i tâncias, por exemplo, sais suficientes ou glicose para tor nar a solução isotónica com sangue.
Estas formulações variarão no que diz · respeto ao peso do composto activo dependendo das espécies de animal hospedeiro a ser tratado, a severidade e tipo de injecção e o peso do corpo do hospedeiro.
Geralmente para administração oral uma dose de cerca de 0,001 a 10 mg por kg de peso do corpo do animal, dada como dose simples ou em doses divididas durante um periodo de cerca de 1 a 5 dias, será satisfatória, mas claro, está pode haver casos em que gamas de dosa gem superiores ou inferiores sejam indicadas e tais se estãzo dentro do âmbito deste invento.
Como uma alternativa os compostos podem ser administrados com a ração do animal, com este objectivo um aditivo alimento o concentrado ou premier pode ser preparado para misturas com a ração normal do an£ mal.
Para uso como um insecticida e para tratamento de pestes agrícolas, os compostos são aplicados como pulverização, poeiras, emulsões e análogos de acordo com a prática agrícola padrão.
-30I
J
Produção de S. avermetilis 1-3 (ATCC 53567) deficiente em desidrogenase de ácido 2-oxo-de cadeia ramificada
| Passo 1. S. avermitilis ATCC 31272 cresceu como relvado | ||||
| confluente num meio New Pactch 30°C. 0 maio compreenderia | Ag ar | , durante 12 | dias a | |
| Sumo V-8 * | 200 | ml | ||
| CaCO^ | 3 | gramas | ||
| Ag ar | 15 | gramas | ||
| H2O até | 1000 | ml | ||
| caldo nutriente | 1,0 | gramas | /L | |
| acetato de sódio. 3H2O | 1,4 | gramas | /L | |
| ácido isovalerico | 50 | mg/L | ||
| ácido isobutirico | 50 | mg/L | ||
| ácido 2-metilbutirico | 50 | mg/L | ||
| isoleucina | 250 | mg/L | ||
| leucina | 250 | mg/L | ||
| valina | 250 | mg/L | ||
| solução de elementos vestigiais* | * | 1 | ml/L |
-31* Uma mistura de 8 sumos vegetais (to mate, cenouras, aipo, beterraba, salsa, alface, agrião e espinafre) mais sal, ácidos ascorbico e citrico e aromas naturais disponível a partir de Campbell Soup Company,
Camden, N.J.
tos vestigiais:
FeCl3.6H2O
MnSO4.H2O
CuSO4.5H2O
CaCl3 h3bo3
CoCl2.6H2O
ZnCl2
Na2Mo04 * * Composição de solução de elemen-
2,7 g
4,2
0,5
11,0
0,62
0,24
0,68
0,24
Dissolver o anterior em 1 litro de HC1 o,l N. Os esporos foram colhidos a partir de 3 destes placas e suspensos em 20 ml de tampão tris-ácido maleico 0,05 M, pH 9,0.
Passo 2. Juntamos 10 ml da suspensão de esporos a um fra£ co contendo 10 mg de N-metil-N1-nitro-N-nitrodoguanidina (NTG). O frasco foi incubasdo e agitado a 28°C durante 65 minutos e os esporos a seguir lavados profusamente com solução NaCl a 1%.
Passo 3. Os esporos lavados foram suspensos em NaCl a 1% e misturados com igual volume de etileno-glicol a 80%.
Esta suspensão foi preservada a -20° e usada como uma fon te de células a ser rastreada relativamente a mutantes. Originou aproximadamente 10^ colónias/ml quando germinou.
Este conjunto de esporos foi espalha do sobre placas YPD para obtermos aproximadamente 100 colónias por placa (meio YPD compreende 10 g/1 de cada extra^ to de fermento Bacto peptona e dextrose; e 15 g/1 de Bacto agar e ajustado a pH 6,9 antes de ser submetido a autocla ve) .
Os ingredientes marcados com asteri,s co estão disponíveis a partir de Difco Laboratories, Detroit Michigan 48238.
Passo 4. colónias simples foram colhidas a partir de pla_ cas após 2-3 semanas de crescimento a 28°C e colocadas em cavidades individuais de uma placa micro de titulação padrão de 96 cavidades.
Também uma pequena quantidade de colónias foi colocada num meio agar fresco para servir como uma fonte de células viáveis quando os mutantes foram iden tifiçados.
Passo 5. a cada cavidade juntamos aproximadamente 75 microlitros de um meio liquido de sais M9 contendo 1% de glicose, 0,1 de casamino-ácido e 0,01% de cada um dos ácidos isovalérico, isobutirico e 2-metilbutirico.
Após vários dias de incubação a 28°C as células foram ensaidas relativamente à presença de 2-oxo -ácido de cadeia ramificada-desidrogenase (cada litro de sais do meio M9 compreende 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PC>4 0,5 g de NaCl e 1 g de NH^Cl. O meio foi submetido a autoclave e a seguir juntamos assepticamente 1 ml de cada um de entre MgSO^ 1M e cada CaCl2 0,1 M esterilizados).
Passo 6. Numa microsuspensão de tolueno a 5% em meio dos sais M9 foi preparada submetendo ligeiramente a ultra-sons a mistura imiscivel. a 25 ml desta suspensão juntamos 1,2 ml de uma solução contendo ácido Γ * C-l 7-2-oxo-isocaproico, 2,5 microcuril/ml e 10,0 microcurie/micromole. Juntamos 50 microlitros desta mistura global a cada uma das cavidades das placas de microtibulação contendo as colónias a serem ensaiadas.
Passo 7. O CO2 produzido a partir de cada cavidade foi captado e visualizado pelo processo descrito por Tabor et al., J. Bacteriol 128 485-486 (1976) intitulado Con14 vement Method for Detectmg CC>2 in Multiple Samples: Aplication ao Rapid Screening for Mutants.
Os mutantes desprovidos de 2-oxo-áci do de cadeia ramificada-desidrogenase não produzem Ba CO^ para além do observado para os controlos.
Um método mais refinado que melhora o contraste entre um ensaio positivo para Co2 indicado por uma mancha escura no anto-radiograma como resultado 14 de formação de Ba CO^, e um ensaio negativo indicado por nenhume mancha ou uma amarela mancha muito ligeira, compreende o rastreio seguinte modificado.
Colónias simples (ver Passo 4 anterior) foram recolhidas a partir de um meio agar após 7-14 | dias de crescimento (em vez de 2-3 semanas ensaiadas directa mente pelos Passos 6 e 7 anteriores), o Passo 5 do processo anterior é omitido.
Um método de ensaio ainda mais refinado o qual é de natureza quantitativa no que diz respeito à libertação de ^CO2 compreende o crescimento de mutantes detectados pelos rastreios anteriores sobre um meio apropriado compreendendo sais de meio M9 com glicose, 1% e Syncasa-bcaa, 0,1% (numa mistura sintética de L-aamino-ácidos com a composição aproximada das casamino-ácidos comerciais, mas sem a presença de L-valina, L-isoleucina e L-leucina, ver a seguir.
Após crescer até alta densidade de células foram lavadas num meio de sais M9 e resuspensas em meio de sais M9 frio contendo tolueno a 1% o qual foi submetido a ultra-sons para priduzir uma dispersão branI ca leitosa do tolueno.
a suspensão células/tampão/tolueno foi incubada durante 40 minutos a 30°C a fim de permeabiliezar as células. As células permeabilizadas foram a seguir lavadas em sais de meio M9 e finalmente resuspensas num quinto do volume original de meio tampão M9.
Usámos 180 microlitros desta suspensão por ensaio.
Um volume de reacção de 300 microlitros continha as células toluenizadas, pirosfosfato de tia nina (TPP), 0,4 mM ; coenzima A (CoA), 0,11 mM .; nicotina^ mida-adenina-dinucleotídeo (NAD); 0,68 mM, ditiotreitol (DTT), 2,6 mM; MgCl„, 4,1 mM; Tris-HCl, 60 mM; Tris-HCl 60 mM, pH 7,5; e / C-l 7-2-oxoisocaproato, 6000 cpm, mi.
crocurie por micromole. A eficiência da contagem foi 73%.
A reacção foi efectuada em frascos de cintilação de 15 ml contendo um papel quadrado Whatman-f}^ de 2 x 2 cm comprimido na tampa de enroscar do frasco. O papel contem 30 microlitros de hidróxido de Hiamina 1M (so lução 1 M de hidróxido de metilbenzotónio em metanol; di£ ponível a partir de Sigma Chemical CO., St. Louis, MO 63178), 14 o qual capta o C02 libertado na reacçao. Apos incubaçao durante 2 horas, os papéis são imersos em 10 ml de Aquasol Beckman II (Universal LSC (Contador de cintilações líquido) disponível a partir de New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118) e a radioactividade medida num contador líquido de cintilação após equilíbrio neste solvente duran te 4 horas ou mais. Uma reacção de controlo em branco (i.
e. - nenhumas células) originou ca. de 50 - 300 cpm.
O mutante 1-3 e outros análogos originaram contagens que foram menores do que ou iguais à reacção de controlo em branco, ao passo que a estirpe progenitora originou contagens várias vezes superiores ao valor de controlo em branco.
Isolamento do Derivado HL-026 (ATCC 53568) de S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567)
S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) foi listrado sobre placas nutrientes de agar. Apareceu uma frequência relativamente elevada de variantes espontâneos, a alguns dos quais faltando micélios aéreos após 4 dias de incubação a 30°C. Diversos de tais variantes foram isolados e testados para a sua capacidade em produzir avermecti^ nas não naturais quando fermentadas em meio AP-5 ao qual juntamos ácido ciclopentano-carboxílico. A partir dos is£ lados, muitos dos quais produzem avermectinas não naturais livres de avermectinas naturais, a uma estirpe que origina títulos mais elevados de avermectinas em experiências em frascos,.do que a sua progenitora í>. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) foi atribuído o numero de identificação HL-026 (ATCC 53568) .
Composição de Syncasa-bcaa, 100 vezes Concentrado gramas/litro
L-alanina3
L-arginina4
Acido L-aspártico6
L-cistina1
Acido L-glutâmico
Glicina
Composição de Syncasa-bcaa , 100 vezes Concentrado (cont.) gramas/litro
L-histidina2
L-lisina7
L-metionina3
L-fenilalanina6
Lprolina10
L-serina6
L-threonina4
L-tirosina4
L-triptofano1
A mistura é ajustada a pH 7 e esteri_ lizada por filtração. Um volume de concentrado é adicionado a 99 volumes de meio para obtermos concentrações de utilização padrão.
As composições do meio utilizado nos Exemplos seguintes são apresentados a seguir.
MEIO AS-7 g/i a
amido fino20
Ardamina pH5
Pharmamedia15
CaCO32 a
Preparado por hidrólise de amido por alfa-amilase a partir de Bacillus licheniformis (disponível a partir de Novo Enzymes, Wilton, CT e vendido sobre a marca registada Termamyl) até uma dextrose equivalente de 40% ± 5%.b
A partir de Yeast Products, Inc, Clifton, NJ 07012 c
A partir de Traders Protein, Memphis, TN 38108
Ajustar o pH a 7,2 com NaOH.
MEIO AP-5 g/i amido fino80
Ardamina pH5 k2hpo41
MgSO4.7H2O1
NaCl1
CaCO37
FeSO4.7H2O0,01
MnCl2.7H2O0.001
ZnSO,.7H„O0,001
P-2000 (agente anti-espuma) 1 ml/1
Ajustar o pH a 6,9 com NaOH a 25%.
-40Processos Genéricos de Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC)
Fase Móvel:
150 ml de água ml de acetonitrilo preencher até 1 litro com metanol
Coluna:
Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments,
Fullerton, CA 92634-3100) caudal: 0,75 ml/minuto detecção: UV a 240 nm atenuação: próximo de 6
Diluente da amostra (D):
ml de acetonitrilo mais 390 ml de metanol
Padrões:
1. pesar 0,5 mg de avermectina A2A num frasco de 10 ml e levar ao volume com metanol
2. pesar 0,5 mg do produto de teste num frasco de 10 ml e levar ao volume com metanol e 2 são soluções de estoque padrão, para efectuar a solu ção padrão:
tomar 100 jul (1) e 100 jul (2) num fraco juntar 800 jul de fase móvel
Amostras:
1. Tomar 1 ml de caldo bem agitado, rodar para baixo
2. Remover tanto sobrenadante quanto possível sem pastilha perturbadora
3. Juntar 100 ul de água HPLC às pastilhas e agitar com vortex para dispersar
4. Juntar 2 ml de diluente (D) e agitar bem
5. Filtrar o mesmo e realizar HPLC.
As avermectinas naturais foram subme. tidas a este processo cromatografico HPLC e o tempo de retenção dos picos das avermectinas individuais dividido pelo tempo de retenção observado para a oligomicina A presente e que serve como padrão interno para uma dada determinação HPLC.
A oligomicina A é quase sempre obser vada por HPLC como sub-produto de fermentações £. avermiti lis e é o único produto observado em HPLC produzido pelos mutantes aqui descritos quando eles são cultivados num meio sem ácidos RCOOH em que R é como aqui definido ou num meio livre de compostos convertíveis em ácidos da fórmula RCOOH em que;R é como aqui definido. Tipicamente, o tempo de retenção oligomicina A é 12,5 - 14 minutos. A relação dos tempos de retenção (RT) origina uma base mais significativa para compparação da identidade e rendimentos de pro. dutos avermectina. A ordem geral de aparecimento dos produtos avermectina na HPLC é B2, A2, BI e Al.
Avermectina
Natural
B2b
B2a
A2b
A2a
Blb
Bla
Alb
Ala das.
RT/RT (oligomicina A)
0,70
0,84
0,90
1,09
1,40
1,83
1,83
2,42
Notar que Bla e Alb são não resolvi.
Avermectina
Não-Natural
RT/RT (oligomicina A)
| ciclopentil-B2 | 0,94 |
| ciclopentil-A2 | 1,23 |
| ciclopentil-Bl | 1,99 |
| ciclopentil-Al | 2,62 |
Os tempos de retenção variam 1-2 minutos em dias diferentes, com oligomicina A aparecendo ge ralmente próximo de 12,5 - 14 minutos.
Nos Exemplos seguintes as avermectinas foram determinadas pelo processo HPLC atrás descrito.
EXEMPLO 1
Ciclo-hexil-Avermectinas Desmetiladas
Um frasco gelado de avermitilis HL-026 (ATCC 53568) foi usado para inocular 100 ml de meio AS-7 num frasco como divisórias de 500 ml o qual foi incubado com agitação durante 24-28 horas a 28 - 30°C. A seguir, 1 ml desta cultura foi usado para inocular um frasco de 300 ml contendo 40 ml de meio AP-5 (menos NaCl mas mais 0,6 g/1 de ácido glutâmico). Após aproximadamente 96 horas de incubação a 28 - 30°C com agitação, juntamos 0,2 g/1 de ácido ciclo-hexano-carboxílico (sal de sódio) e 0,1 mM de sinefungina.
A cromatografia HPLC de uma amostra de 312 horas mostrou ciclo-hexil-avermectinas desmetiladas B2, A2 e BI presentes com as relações do tempo de retenção seguintes em relação às suas correspondentes ciclo-hexil-avermectinas,
| di-Desmet | CH - | B2/CH | - B2 = 0,470 |
| mono-Desmet | CH — | B2/CH | - B2 = 0,515 |
| di-Desmet | CH - | A2/CH | - A2 = 0,466 |
| mono-Desmet | CH - | A2/CH | - A2 =0,520 |
| di-Desmet | CH - | Bl/CH | - BI = 0,486 |
| mono-Desmet | CH - | Bl/CH | - BI = 0,517 |
CH = ciclo-hexil
Desmet = desmetil
EXEMPLO 2
Ciclopentil-Avermectinas Desmetiladas
Num frasco gelado de S. avermitilis
HL-026 (ATCC 53568) foi usado para inocularlOO ml de meio AS-7 num frasco com divisórias de 500 ml o qual foi incubado com agitação durante 24 - 28 horas a 28 - 30°C. A se guir, 1 ml desta cultura foi usado para inocular um frasco de 300 ml contendo 40 ml de meio AP-5 (menos NaCL mas mais 0,6 g/1 de ácido glutâmico). Após aproximadamente 96 horas de incubação a 28 - 30°C com agitação, juntamos 0,4 g/1 de ácido-pentano-carboxílico (sal de sódio) e 0,1 mM de sinefungina. A cromatografia HPLC de uma amostra de 312 horas mostrou ciclopentil-avermectinas desmetiladas B2, A2, e BI presentes, com as relações de tempos de retenção seguintes em relação às suas ciclopentil-avermectinas correspondentes,
| di-Desmet | CP | - B2/ | CP | - B2 | = 0,519 |
| di-Desmet | CP | - B2/ | CP | - B2 | = 0,564 |
| di-Desmet | CP | - A2/ | CP - | - A2 | = 0,513 |
| di-Desmet | CP - | - A2/ | CP - | - A2 | = 0,567 |
| di-Desmet | CP - | - A2/ | CP - | - A2 | = 0,538 |
| mono-Desmet | CP - | - Bl/ | CP - | - Bl | = 0,593 |
CP = ciclopentil
-46EXEMPLO 3
Ciclobutil-Avermectinas Desmetiladas
Num frasco gelado de S_. avermitilis
HL-026 (ATCC 53568) foi usado para inocular 100 ml de meio AS-7 num frasco com divisórias de 500 ml o qual foi incuba do com agitação durante 24-28 horas a 28 - 30°C. A seguir, 1 ml desta cultura foi usado para inocular um frasco de 300 ml contendo 40 ml de meio AP-5 (menos NaCl mas mais 0,6 g/1 de ácido glutâmico). Após aproximadamente 96 horas de incubação a 28 - 30°C com agitação, juntamos 0,4 g/1 de ácido ciclobutano-carboxílico (sal de sódio) e 0,1 mM de sinefungina. A cromatografia HPLC de uma amostra de 312 horas mostrou ciclobutil-avermectinas desmetiladas (CB) B2, A2 e BI presentes com as relações de tempos de retenção se guintes, em relação às suas ciclobutil-avermectinas corres pondentes, di-Desmet mono-Desmet di-Desmet monó-Desmet Di-Desmet monô-Desmet
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CB - B2/
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CB - Bl = 0,581 = 0,627 = 0,570 = 0,626 = 0.574 = 0,623
CB = ciclobutil
-47EXEMPLO 4
2-Pentil-Avermectinas Desmetiladas avermitilis
100 ml de meio
Um frasco gelado de
HL-026 (ATCC 53568) foi usado para inocular
AS-7 num frasco com divisórias de 500 ml o qual foi incubado com agitação durante 24-28 horas a 28 - 30°C. A seguir, 1 ml desta cultura foi usado parainocular um frasco de 300 ml contendo 40 ml de meio AP-5 (menos NaCl mas mais 0,6 g/1 de ácido glutâmico). Após aproximadamente 96 horas de incubação a 28 - 30°C com agitação, juntamos 0,4 g/1 de ácido 2-metil valérico (sal de fungina. A cromatografia HPLC de mostrou 2-pentil(IP)-avermectinas presentes com as relações dos tempos de retenção seguintes em relação às suas 2-pentil-avermectinas sódio) e 0,1 mM de sineuma amostra de 312 horas desmetiladas B2, A2 e B1 correspondentes,
| di-Desmet | IP - | - B2/ | IP - | - B2 | = 0,497 |
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| di-Desmet | IP | - A2/ | IP - | = A2 | = 0,493 |
| mono-Desmet | IP | - A2/ | IP - | - A2 | = 0,545 |
IP = 2-pentil
EXEMPLO 5
1-Metil-3-Butenil-Avermectinas Desmetiladas
Num frasco gelado de S.. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) foi usado para inocular 100 ml de meio AS-7 num frasco com divisórias de 500 ml o qual foi incub£ do com a agitação durante 24-28 horas. A seguir, 1 ml de£ ta cultura foi usado para inocular um frasco de 300 ml con tendo 40 ml de meio AP-5 (menos NaCl mas mais 0,6 g/1 de ácido glutâmico). Após aproximadamente 96 horas de incubação a 28 - 30°C com agitação, juntamos 0,4 g/1 de ácido 2-metil-4-pentenóico (sal de sódio) e 0,1 mM de sinefungina. A cromatografia HPLC de uma amostra de 312 horas mostrou l-metil-3-butenil (1M3B)-avermectinas desmetiladas B2, A2 e B1 presentes, com relações de tempo de retenção seguintes em relação às suas avermectinas 1M3B corresponden tés,
| di-Desmet | 1M3B | - B2/ | 1M3B = 0,547 |
| mono-Desmet | 1M3B | - B2/ | 1M3B = 0,591 |
| di-Desmet | 1M3B | - A27 | 1M3B = 0,532 |
| mono-Desmet | 1M3B | - A2/ | 1M3B = 0,586 |
| di-Desmet | 1M3B | - A2/ | 1M3B = 0,551 |
1M3B = l-metil-3-butenil
EXEMPLO 6
Ciclopentil-Avermectinas
Um frasco gelado de S·. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) foi usado para inocular 100 ml de meio AS-7 num frasco com divisórias de 500 ml o qual foi incubado durante 24-28 horas a 28 - 30°C. A seguir, usamos 1 ml desta cultura para inocular um frasco de 300 ml contendo 40 ml de meio AP-5 (menos NaCl mas mais 0,6 g/1 de ácido glutzmico). Após 96 horas de incubação a 28 - 30°C com agi. tação, juntamos 0,4 g/1 de ácido ciclopentano-carboxílico (sal de sódio). A cromatografia HPLC de uma amostra de 216 horas apresentou ciclopentil-avermectinas B2, A2, BI e Al presentes com tempos de retenção de 12,32; 15,86;
25,28 e 32,96 minutos, respectivamente.
EXEMPLO 7
Ciclo-hexil-Avermectinas
Neste Exemplo, juntamos 0,2 g/1 de ácido ciclo-hexano-carboxílico em 96 horas em vez de ácido ciclopentano-carboxilico, e todas as outras condições foram as mesmas que as descritas no Exemplo 6. Identificamos quatro ciclo-hexil-avermectinas sobre o cromatograma HPLC de uma amostra de 240 horas. Os tempos de retenção para as ciclo-hexil-averemectinas B2, A2, B1 e Al foram 14,84; 19,26; 31,46 e 41,14 minutos, respectivamente.
EXEMPLO 8
2-Pentil-Avermectinas
Neste Exemplo, juntamos 0,2 g/1 de
I ácido 2-metil valérico em 96 horas em vez de ácido ciclopentano carboxílico, e todas as outras condições foram as mesmas que as descritas no Exemplo 6. Quatro 2-pentil-aver mectinas foram identificadas sobre o cromatograma HPLC de
I uma amostra de 312zxhoras. Os tempos de retenção para as
2-pentil-avermectinas B2, A2, BI e Al foram 12,88; 16,58;
31,90 e 41,92, respectivamente.
EXEMPLO 9 l-Metil-3-Butenil-Avermectinas
Neste Exemplo, 0,2 g/1 de ácido 2-me. til-4-pentenóico foram adicionadas a 96 horas em vez de ácido ciclopentano-carboxílico, e todas as outras condições foram as mesmas que as descritas no Exemplo 6. Quatro 1-metil-3-butenil-avermectinas foram identificadas sobre o cromatograma HPLC de uma amostra de 312 horas. Os tempos de retenção foram respectivamente 11,13; 14,78; 22,10 e
28,92 minutos para as l-metil-3-butenil-avermectinas B2, A2, BI e Al.
EXEMPLO 10
Ciclopentil-AvermectinaA
£. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) foi cultivada a 28 - 30°C num meio AS-7 com agitação durante 24 horas. Uma porção de 5 ml foi usada para inocular um frasco de 500 ml contendo 100 ml de um meio AS-7, e a incu bação continuou sob as mesmas condições durante 24 horas; usamos 1 ml desta cultura para inocular o meio AP-5 (40 ml num frasco de 300 ml), ao qual juntamos 24 horas mais tarde 0,4 g/1 de ácido ciclopentanp-carboxílico (sal de sódio).
Os frascos com os produtos foram agjL tados a 28 -30°C. Após 240 horas havia 35 mg/1 de ciclopentil-avermectina A2 produzida enquanto o título da correspondente natural A2 era 0. Outras ciclopentil-avermectinas foram também produzidas.
Repetimos os processos anteriores mas substituimos os compostos principais listados a seguir por ácido ciclopentano-carboxílico. As avermectinas (compostos de fórmula I em que R é a porção dissacarídica olean1 3 drose dissacarídica e R, R e R são como apresentados) identificadas a partir de uma dada fermentação, são listadas a seguir.
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Cpd (A2) (Al) (B2) (Bl) (A2)
Outros dados fisicos-quimicos para dos compostos anteriores são apresentados a seguir:
Dados Fisico-Quimicos pó branco; p.f. 135-140°C; peso molecular= = 925; m/e 596, 454, 321, 303, 275, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
pó branco; p.f. 120-124°C; peso molecular= = 907; m/e 578,303, 275, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
pó branco; p.f. 110-112°C; peso molecular= = 911; m/e 321, 303, 261, 257, 237, 219, 209, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
pó branco; p.f. 135-138°C; peso molecular= = 893; m/e 303, 261, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
pó branco; p.f. 112-117°C; peso molecular= = 953; m/e 624, 482, 349, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
(Α2) pó branco; p.f. 131-135°C; peso molecular= = 951; m/e 624, 480, 347, 329, 275, 263, 245, 235, 217, 205, 193, 179, 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
(A2) pó branco; p.f. 167°C; peso molecular= 953 m/e 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219 195, 145, 127, 113, 95 e 87.
Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES la.- Processo para produção de um composto de fórmulad) em que a linha a tracejado na posição 22-23 representa uma dupla ligação está ausente ou a ligação facultativa; R' re z 1 presenta H ou OH e a dupla ligaçao esta presenta e R esta ausente; R representa um grupo ramificado na posição alfa C3-C8 alcenilo, alcinilo, alcoxialquilo ou alqui.1 tioalquilo; um grupo Cg-Cg-cicloalquilalquilo em que o gru po alquilo é um grupo C2-Cg-alquilo ramificado na posição alf a; um grupo Cg-Cg-cicloalquilo ou Cg-Cg-cicloalcenilo, cada um dos quais podem estar facultativamente substituído por metileno por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio; ou um anel heterociclico, de 3 a 6 membros contendo oxigénio ou enxofre que pode ser saturado, ou to tal ou parcialmente insaturado, e o qual pode estar facultativzmente substituído por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio; com a condição que quando R for 2 alquilo, não seja isopropilo ou sec-butilo; R representa uma porção dissacaridica de fórmula4 5 onde cada um dos R e R representa hidrogénio ou metilo,4 5 com a condição de que pelo menos um dos R e R seja hidro ,3 génio; e R representa hidrogénio ou metilo, caracterizado por se proceder à fermentação sob condições aróbicas, na presença de sinefungina de uma estirpe de StreptomycesL <avermitilis desprovida de uma ou ambas as actividades 2-oxo-ácido de a cadeia ramificada-desidrogenase e aminoáci^ do de cadeia ramificada-transaminase, num meio nutritivo a aquoso, constituído por uma fonte assimilável de azoto, carbono e sais inorgânicos, e um composto susceptivel de ser empregado na biossintese de uma avermectina.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o composto susceptivel de ser empregado na biossintese de uma vermectina ser um áci^ do da fórmulaR-COOH ou um composto convertivel no referido ácido por S.avermitilis em que R é diferente de isopropilo ou (S)-sec-butilo.3a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a S.avermitilis ter as ca racteristicas de identificação de ATCC 53567 ou ATCC 53568.4â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto ser de fórmulaR-COOH*. » Γ em que R representa um grupo de cadeia ramificado na posição alfa cujo átomo de carbono ao qual se encontra ligado o grupo -COOH está também ligado a pelo menos dois outros átomos ou grupos, diferentes de hidrogénio; ou ser um composto convertivel no referido composto durante o processo de fermentação.5a. - Processo de acordo com a reivindicação 4,cracterizada por R representar um grupo ramificado na posição alfa Cg-Cg-alquilo, alcenilo, alcinilo, alcoxialquilo ou alquiltioalquilo; um grupo Cg-Cg-cicloalquil^ alquilo respectivo em que o grupo alquilo é um grupo ^2-<“5_ -alquilo ramificado na posição alfa; um grupo Cg-Cg-cicloalquilo ou Cg-Cg-cicloalcenilo, cada um dos quais pode estar facultativamente substituido por metileno ou por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio; ou um anel heterociclico, de 3 a 6 membros, contendo oxigénio ou enxofre que pode ser saturado, ou total ou parcialmente insaturado e que pode estar facultativamente substituido por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio ou um composto convertivel no referido composto durante o processo de fermentação.6â.- Processo de acordo com e reivindicação 4, caracterizado por o composto convertivel no substracto RCOOH serR-(CH_) -Z
- 2 n em que R é como previamente definido, n é igual a 0, 2, 4 5 ou 6; e Z representa -CH„GH, -CHO, -COOR , -CH^NH- ou65 Z Z6 Z-CONKR onde R significa H ou (C^ θ)alquilo; R representa hidrogénio, (C^_4)alquilo, -CH(COOHJCHgCOOH, -CH(COOH)(CH2)2COOH ou -CH(COOH)(CH2)2SCH3 ou se a estirpe de S.avermitilis só for desprovida de actividade de aminoácido de cadeia ramificada-transaminase, o composto convertivel no substracto RCOOH ser R-CO-Z.I
- 7â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por R representar ciclobutilo ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, 2-metilciclopropilo, 3-ciclo-hexenilo, 1-ciclopenenilo, 1-ciclo-hexenilo, 3-metilcilo-hexilo (cis/trans) 4-metilenociclo-hexilo, 3-meticiclobutilo, 3-metilenociclobutilo, 3-ciclopent£ nilo, 1-ciclopropiletilo, 3-fluorociclobutilo, 4,4-difluorociclo-hexilo, isopropilo, sec-butilo, 2-pentilo, 2,3-dimetilpropilo; 2-hexilo, 2-pent-4-enilo, 2-metiltioetiloS-2-pentilo, R-2-pentilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 4-tetra-hidropiranilo, 3-furilo, 2-clorotienilo, 3-tetra-hidrotÍ£ nilo, 4-metiltio-2-butilo, 4-tetra-hidrotipiranilo, 4-meF toxi-2-butilo ou 4-metiltio-2-2-butilo.
- 8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por R representar ciclopentiI lo, ciclo-hexilo, 3-tienilo, 3-furilo ou 1-metiltioetilo.ι ζ >-62I tI
- 9â. - Processo, de acordo com a reinidicação 5, caracetrizado por na hipótese de R representar um grupo C^-Cg-alquilo, ramificado na posição alfa, este grupo não representar isopropilo ou (S)-sec-butilo.lOâ. - Processo para a preparação de uma composição para o tratamento e prevenção de infecções parasiticas em seres humanos e animais, caracterizado por se incluir na referida composição um composto produzido de acordo com a reivindicação 1, juntamente com um diluente ou suporte inerte.llâ. - Método para combater infecção ou infestação parasitica, caracterizado por compreender o contacto do organismo responsável pela referida infecção ou infestação ou a localização do referido organismo com uma quantidade anti-parasatica de um composto produzido de acordo com a reivindicação 1, sendo a gama de dosagem de composto activo de 0,001 a 10 mg por kilograma de peso cor poral do animal, como dose unica ou em doses divididas du rante um periodo de 1 a 5 dias.
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