DE3788762T2

DE3788762T2 - Verfahren zur Bestimmung von physiologisch wirksamen Substanzen.

Info

Publication number: DE3788762T2
Application number: DE3788762T
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Kawakubo; Katsumi Nishikawa; Yoshio Toyomaki
Original assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-09-10
Filing date: 1987-09-09
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2007-09-10
Also published as: EP0259857A2; KR960009766B1; ATE100150T1; EP0259857A3; US4985354A; KR880004314A; DE3788762D1; JPS63185398A; ES2061459T3; JPH0414000B2; EP0259857B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Prüfen physiologisch aktiver Substanzen. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum Prüfen physiologisch aktiver Substanzen, die in das Verfahren der Plasma-Kallikrein-Bildung verwickelt sind.
Kallikrein ist eine Proteasegruppe, welche in breitem Umfang im Plasma und Gewebe von Tieren verteilt ist, und es ist bekannt, daß sie an einem Enzymreaktionssystem, genannt Kallikrein-Kinin-System, teilnimmt.
Dieses Kallikrein-Kinin-System ist eng mit vielen anderen Enzymreaktionssystemen, wie beispielsweise dem Renin-Angiotensin-System, dem Blutkoagulationssystem, dem Fibrinolysesystem, dem Komplementsystem und der Arachidonatkaskade, die Prostaglandin, Leukotrien und Thromboxan erzeugt, wie auch mit dem Verhalten von Katecholamin verbunden, und spielt somit eine wichtige Rolle im Hinblick auf die Funktionskontrolle in lebenden Organismen. Genauer ausgedrückt bedeutet dies, daß es eng durch andere Enzymreaktionssysteme mit der Blutdruckkontrolle, den Kontrollwirkungen, die das Blutkoagulationsfibrinolyse-Komplementsystem betreffen und der peripheralen Blutzirkulationsverbesserung und anderen Kontrollwirkungen, die von verschiedenen physiologisch aktiven Substanzen, die von der Arachidonatkaskade erzeugt werden, verbunden ist.
Es ist bekannt, daß Plasmakinin, welches ein Produkt des Kallikrein-Kinin-Systems ist, verschiedene physiologische Wirkungen, wie beispielsweise Hypotoniewirkung als Ergebnis von Gefäßerweiterung, Vergrößerung von Gefäßdurchlässigkeit, Kontraktion und Entspannung glatter Muskeln, Entwicklung von Schmerzen, Leukozytenchemotaxis und Freigabe von Katecholamin aus dem Nebennierenkortex ausübt. Es ist auch bekannt, daß Plasmakinin als Vermittler für akute Entzündungen einschließlich allergischer Reaktionen wirkt. Somit ist das Vorhandensein von Plasmakinin in lebenden Organismen von großer Bedeutung.
Somit wäre die Begründung eines einfachen Verfahrens zum genauen Prüfen der Wirkung von Substanzen, die in die Kallikrein-Bildung verwickelt sind (Substanzen, die die Bildung von Kallikrein verzögern oder beschleunigen), von großem Nutzen für das Kennenlernen der zuvor beschriebenen Wirkungen für die Funktionskontrolle in lebenden Organismen und auch für die Entwicklung neuer Arzneimittel mit derartigen Wirkungen.
Das Kallikrein-Kinin-System umfaßt eine Serie von Enzymreaktionen, wie im nachfolgenden beschrieben ist.
Der Blutkoagulationsfaktor XII (Hageman Factor; im nachfolgenden als F-XII abgekürzt) ist die Substanz, die die Hauptrolle in diesem Enzymreaktionssystem spielt. F-XII in dem Plasma wird bei Kontakt mit einer negativ geladenen Substanz (wie beispielsweise Glas, Kaolin und Elaidinsäure) oder mit einer Substanz, die in lebenden Organismen vorhanden ist (beispielsweise Collagen, Homocystin, Thrombocytenmembran und sulfatiertes Glykolipid) oder als Ergebnis von schmerzvermittelnder Stimulation in Bezug auf Gewebe aktiviert. Das sich ergebende aktivierte F-XII (F-XIIa) wirkt anschließend auf das im Plasma vorhandene Prekallikrein unter Umwandlung dieses in Kallikrein, welches wiederum auf hochmolekulargewichtiges Kininogen im Plasma wirkt, wobei Bradykinin freigesetzt wird, welches ein Nonapeptid ist.
Eventuell erzeugt das auf diese Weise gebildete Kinin Entzündungen und Schmerzen und übt verschiedene Einflüsse auflebende Organismen durch Wirkung auf die Arachidonatkaskade aus.
EP 0 044 4127, Meths. Enzy. Anal. (1983) 5, 411-414, und Scan. J. Clin. & Labor. Invest. (1985) 45(178), 127-132, offenbaren Tests in Bezug auf die Kallikrein-Aktivität, aber die Kallikrein-Bildungsaktivität wird nicht durch Hinzufügen eines inhibierenden Agenzes gegen F-XIIa wie in der vorliegenden Erfindung beendet. Nature (1980) 286, 456-460 offenbart ein Kallikrein-Bildungsreaktionssystem, umfassend gereinigtes F-XII, hochmolekulargewichtiges Kininogen (HMWK) und Prekallikrein. Hypertension (1983) 5(6), 48-52 berichtet über den Einfluß eines inhibierenden Agenzes gegenüber Cyclooxygease, wenn Prekallikrein in Kallikrein umgewandelt wird. Das Verfahren ist ungenau und nicht quantitativ und kann nicht als Testverfahren für den Zweck der Inhibierung der Kallikrein-Bildung bei zu testenden Substanzen verwendet werden.
Die In-vitro-Stimulierung der zuvor beschriebenen Serien von Enzymreaktionen, die mit dem Kallikrein-Kinin-System verbunden sind, hat uns dazu bewogen, festzustellen, daß das bei dieser Erfindung angenommene Reaktionssystem ein einfaches, sehr zuverlässiges und äußerst effektives Verfahren zum Prüfen physiologisch aktiver Substanzen zur Verfügung stellt. Diese Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Feststellungen vollendet.
Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zum Prüfen physiologisch aktiver Substanzen, die in die Kallikrein-Bildung verwickelt sind, zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Substanz (Droge) in die Bildung von Kallikrein verwickelt ist oder nicht, zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zum Messen des Ausmaßes, in dem eine physiologisch aktive Substanz in die Kallikrein-Bildung verwickelt ist, zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Reaktionssystem, welches für das zuvor beschriebene Verfahren am besten geeignet ist, zur Verfügung zu stellen.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die inhibierenden Wirkungen verschiedener Analgetika gegenüber der Kallikrein-Bildung, gemessen mit Hilfe des Verfahrens gemaß dieser Erfindung, zeigt, und
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die ihre inhibierenden Wirkungen gegenüber der Freigabe von Bradykinin zeigt.
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Prüfen einer physiologisch aktiven Substanz, umfassend Aktivieren von F-XII im Plasma in Anwesenheit dieser physiologisch aktiven Substanz (Testdroge) unter Umwandlung von in dem Plasma enthaltenen Prekallikrein in Kallikrein durch Wirkung des auf diese Weise gebildeten F-XIIa und Messen der Menge des sich ergebenden Kallikreins.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Prüfen einer physiologisch aktiven Substanz, umfassend Ermöglichen des Voranschreitens einer Reaktion durch Mischen von (1) Tierplasma, (2) einem Aktivator für den Blutkoagulationsfaktor XII, (3) einem Elektrolyten und (4) einem zu testenden Arzneimittel; Hinzufügen eines Inhibitors, welcher praktisch keine Wirkung auf die Kallikrein-Aktivität ausübt, und sich dazu eignet, spezifisch die Aktivität des aktivierten Blutkoagulationsfaktors XII zu inhibieren; und Messen der Menge des auf diese Weise gebildeten Kallikreins.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung läßt man eine Reaktion voranschreiten, indem (1) Plasma von Lebewesen, (2) ein Aktivator für den Blutkoagulationsfaktor XII, (3) ein Elektrolyt und (4) ein zu testendes Arzneimittel gemischt werden, und ein Inhibitor mit praktisch keiner Wirkung auf die Kallikrein-Aktivität, und welcher sich dazu eignet, spezifisch die Aktivität des aktivierten Blutkoagulationsfaktors XII zu inhibieren, wird anschließend hinzugegeben. Zu der sich ergebenden Mischung wurde eine Lösung eines Substrats für Kallikrein in einer Pufferlösung hinzugegeben, und die Menge des durch Wirkung von Kallikrein gebildeten Zersetzungsproduktes wurde gemessen, wobei die Wirksamkeit des Testarzneimittels bestimmt wurde.
Das bei dem Verfahren dieser Erfindung angenommene Reaktionssystem umfaßt zwei Stufen, wie zuvor beschrieben. Die primäre Reaktion ist eine Stufe, in der F-XII in dem Plasma in F-XIIa durch Hinzugabe eines Aktivators, wie beispielsweise Kaolin, umgewandelt wird, welcher wiederum auf Prekallikrein unter Bildung von Kallikrein wirkt. Die Sekundärreaktion, die sich daran anschließt, ist eine Stufe, in der die gebildete Kallikreinmenge gemessen wird; beispielsweise kann die Aktivität (oder Menge) von Kallikrein unter Verwendung eines gegenüber Kallikrein spezifischen Substrats bestimmt werden.
Somit ist das Verfahren dieser Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man eine physiologisch aktive Substanz, die in die Kallikreinbildung verwickelt ist, in dem primären, zuvor beschriebenen Reaktionssystem, anwesend sein läßt, und dessen Menge wird in dem Sekundärreaktionssystem bestimmt.
Bei dem Verfahren gemäß dieser Erfindung kann Plasma von jedwedem Lebewesen verwendet werden, solange es die Blutkoagulations- und Kallikrein-Kinin-Systeme enthält. Dieses umfaßt Plasma von Menschen, Affen, Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden, Ziegen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Mäusen. Von diesen sind die Plamen von Menschen und Ratten am bevorzugtesten.
Das bei dem Verfahren gemäß dieser Erfindung verwendete Plasma kann mit Hilfe irgendeines der bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise wird eine entnommene Blutprobe in Anwesenheit von Natriumzitrat zentrifugiert, und der sich ergebende Überstand kann als zitrathaltiges Plasma verwendet werden. Es kann auch gefriergetrocknetes Plasma, welches mit Hilfe eines üblichen Verfahrens hergestellt worden ist, für den Zweck dieser Erfindung verwendet werden.
Das auf diese Weise hergestellte Plasma von Lebewesen kann entsprechend, falls erforderlich, vor Verwendung verdünnt werden. Dessen Konzentration sollte innhalb eines Bereichs liegen, der eine lineare Beziehung zwischen der Verdünnung und der Kallikrein-Aktivität gewährleistet.
Eine Vielzahl von Substanzen kann als Aktivator für F-XII in dem Verfahren gemäß dieser Erfindung verwendet werden. Diese umfassen Kaolin, Collagen, Dextransulfat, Elaidinsäure und CeliteTM. Um eine zufriedenstellende Aktivierung von F-XII zu gewährleisten, sollte jeder dieser Aktivatoren in seiner optimalen Konzentration verwendet werden. Wenn beispielsweise eine wäßrige Kaolinsuspension für menschliches Plasma verwendet wird, sollte deren Endkonzentration vorzugsweise im Bereich von 1 bis 3 mg/ml, am bevorzugtesten im Bereich von 1,25 bis 2 mg/ml liegen.
Der Elektrolyt wird hinzugefügt, wodurch die Wirkung des F-XII Aktivators perfekt gemacht wird. Bevorzugte Beispiele sind diejenigen, die monovalente Kationen (beispielsweise Natrium), wie Natriumchlorid und Natriumacetat, enthalten.
Bei menschlichem Plasma beispielsweise sollte die Endkonzentration von Natriumchlorid in der Primärreaktion vorzugsweise im Bereich von 50 bis 200 mM, am bevorzugtesten im Bereich von 75 bis 150 mM liegen.
Wenn man die Primärreaktion bei erhöhter Temperatur voranschreiten läßt, schreitet sie zu schnell voran, und gleichzeitig werden endogene Inhibitoren zur Arbeit veranlaßt, wodurch signifikant die Messung der Kallikrein-Aktivität beeinflußt wird. Es ist deshalb vorzuziehen, die Primärreaktion bei einer niedrigen Temperatur (beispielsweise bei 0 bis 4ºC) durchzuführen, so daß sie langsam voranschreitet und endogene Inhibitoren nicht arbeiten.
Die Primärreaktion sollte vorzugsweise bei dem optimalen pH-Wert für Kallikrein, welches das Endprodukt dieser Reaktionsstufe ist, durchgeführt werden; wenn menschliches Plasma oder Rattenplasma verwendet wird, liegt ein geeigneter pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9, 0, am bevorzugtesten im Bereich von 7,5 bis 8,5.
Die geeignete Reaktionszeit kann mit den Plasmamengen und den Mengen von hinzugegebenem F-XII Aktivator, der Konzentration des zu testenden Arzneimittels und dem pH-Wert des Reaktionssystems variieren, aber sie sollte innerhalb eines Bereichs gesetzt sein, welcher eine lineare Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Menge des gebildeten Kallikreins (oder Kallikrein-Aktivität) gewährleistet. Dieses sollte deshalb so sein, weil das Verfahren gemäß dieser Erfindung die in die Plasmakallikrein-Bildung verwickelte Aktivität einer physiologisch aktiven Substanz als Kallikrein-Aktivität untersucht, und somit muß die Aktivitätsmessung zu dem Zeitpunkt, bevor die Kallikreinmenge gesattigt wird, und wenn die zuvor beschriebene lineare Beziehung noch andauert, durchgeführt werden. In der Praxis ist es jedoch vorzuziehen, die Reaktionszeit innerhalb eines Bereiches von 15 bis 30 Minuten zu setzen.
Die Primärreaktion kann durch Hinzugabe eines Inhibitors, welcher spezifisch die Aktivität von aktiviertem F-XII inhibiert, beendet werden, wodurch die Bildung von Extra-Kallikrein verhindert wird, und zeigt praktisch keine Wirkung auf die zu messende Aktivität von Kallikrein in der Sekundärreaktion.
Als Beispiele derartiger Inhibitoren können LBTI (Lima Bean Trypsin Inhibitor) und CHFI (Corn Hageman Fragment Inhibitor) genannt werden. Diese Inhibitoren sollten am Ende der Primärreaktion in einer derartigen Menge hinzugegeben werden, das die Aktivität des in der Primärreaktionsmischung zurückgelassenen F-XIIa vollständig inhibiert wird, und daß sich somit praktisch keine Wirkung auf die Messung von Kallikrein in der Sekundärreaktion zeigt. Wenn beispielsweise menschlisches Plasma verwendet wird, sollte LBTI vorzugsweise mit einer Endkonzentration von 4 bis 15 mg/ml hinzugegeben werden.
Die Sekundärreaktion ist, wie zuvor beschrieben, eine Stufe zum Messen der Menge des in der Primärreaktion gebildeten Kallikreins, vorzugsweise unter Verwendung eines gegenüber Kallikrein spezifischen Substrats.
Eine Vielzahl von Substanzen kann als gegenüber Kallikrein spezifisches Substrat verwendet werden. Diese umfassen hochmolekular-gewichtiges Kininogen, welches im Plasma vorhanden ist, und synthetische Substrate, wie beispielsweise N-Benzoyl-N-arginin-Ethylester (Benzoyl-Arg-OEt), N-Tosyl-L-Arginin-Methylester (Tos-Arg-OMe), D-Prolylphenyl-alanylarginyl-p-nitroanilid (D-Pro-Phe-Arg-pNA), Benzoyl-prolylphenylalanylarginyl-p-nitroanilid (Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA), Prolylphenylalanylargininylnaphthylamid (Pro-Phe-Arg-NA) und Benzyloxycarbonyl-phenylalanylarginyl-4-methylcumarinamid (Z-Phe-Arg-MCA).
Wenn hochmolekular-gewichtiges Kininogen als Substrat verwendet wird, kann das so gebildete Bradykinin mit Hilfe üblicherweise verwendeter Techniken mit Hilfe eines Bioassays unter Verwendung glatter Muskeln, wie des Krummdarms vom Meerschweinchen oder des Myometriums von der Ratte (Magnus-Methode) oder mit Hilfe von Radioimmunassay (RIA) bestimmt werden.
Wenn die Aktivität von Kallikrein unter Verwendung ihrer Esterasewirkung gemessen wird, können Benzoyl-Arg-OEt oder Tos-Arg-OMe als Substrat verwendet werden. Die Kallikreinmenge kann mit Hilfe verschiedener Verfahren bestimmt werden. Diese umfassen Messen der Absorptionsänderung aufgrund von Hydrolyse; spektrophotometrische Bestimmung nach Umwandlung in ein gefärbtes Derivat [beispielsweise das Hydroxamatverfahren und das Verfahren unter Verwendung von Chromotropsäure oder MBTH (3-Methyl-3-benzothiazol-on-hydrazin)]; fluorometrische Bestimmung nach Umwandlung in ein fluoreszierendes Derivat; Verfahren unter Verwendung von Alkoholdehydrogenase; und radiochemische Bestimmung unter Verwendung eines radioaktiven synthetischen Substrats.
Daneben können D-Pro-Phe-Arg-pNA, Benzoyl-Pro-Phe-pNA und Z-Phe-Arg-MCA auch als gefärbtes oder fluoreszierendes synthetisches Peptidsubstrat verwendet werden. In diesem Fall kann die Kallikreinaktivität durch spektrophotometrische Messung der gefärbten oder fluoreszierenden Substanz, die durch ihre hydrolytische Wirkung gebildet worden ist, beispielsweise pNA (p-Nitroanilin) AMC (7-Amino-4-methylcumarin) bestimmt werden.
In der Sekundärreaktion sollte der pH-Wert vorzugsweise in dem Bereich von 7,0 bis 9,0 (in der Nähe des optimalen pH-Werts für Kallikrein) gehalten werden, und die Reaktionstemperatur sollte im Bereich von 20 bis 40ºC (in der Nähe der optimalen Temperatur für Kallikrein; Raumtemperatur) gehalten werden. Die geeignete Reaktionszeit kann mit der Temperatur, dem pH-Wert und der Substratkonzentration variieren, aber sie sollte innerhalb von etwa 30 Minuten liegen, um eine hohe Verfahrenswirksamkeit zu gewährleisten.

BEISPIEL 1

Ein Beispiel, bei dem menschliches Plasma als Plasma von Lebewesen verwendet wurde, ist im nachfolgenden gezeigt.

(1) Herstellung von zitrathaltigem menschlichen Plasma

Eine von einem gesunden Erwachsenen entnommene Blutprobe wurde in Anwesenheit von Natriumzitrat gemäß dem üblicherweise verwendeten Verfahren (menschliches Blut: 3,8% Natriumzitrat = 9:1) zentrifugiert, und der Überstand wurde als zitrathaltiges menschliches Plasma gesammelt (im nachfolgenden einfach als menschliches Plasma bezeichnet). (2) Primärreaktion menschliches Plasma wäßrige Kaolinsuspension wärige Natriumchloridlösung wäßrige Lösung des zu testenden Arzneimittels destilliertes Wasser
In der zuvor beschriebenen Formulierung war menschliches Plasma mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine solche Konzentration verdünnt worden, daß eine Kallikrein-Aktivität von 1,6 bis 2,2 mE in der Sekundärreaktion gezeigt wird. Im Hinblick auf die Kallikrein-Aktivität wurde die Menge, die 1 uMol/Min./ml p-Nitroanilin in der Sekundärreaktion erzeugte, als 1 E (1.000 mE) angesehen.
Die Konzentration der Kaolinsuspension betrug 2,5 mg/ml [in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)], und die von Natriumchlorid in der gemischten Lösung (0,4 ml) betrug 0,25 M.
Man ließ die zuvor beschriebene Mischung in einem Eis/Wasserbad 20 Minuten stehen, wodurch die Primärreaktion erzeugt wurde, welche durch Hinzugabe von 0,5 ml LBTI-Lösung [45 mg/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)] beendet wurde, wodurch die Primärreaktionsmischung hergestellt wurde. Sie kann auch hergestellt werden, indem 0,2 ml der Reaktionsmischung vor Beendigung genommen werden und zu 0,1 ml LBTI-Lösung hinzugefügt werden.

(3) Sekundärreaktion

Primärreaktionsmischung 0,1 ml
synthetisches Substrat 0,1 ml
Pufferlösung - 0,2 ml
In der zuvor angegebenen Formulierung war das synthetische Substrat wäßrige 4 mM Lösung von D-Pro-Phe-Arg-pNA, und die Pufferlösung war 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0).
Man ließ die zuvor angegebene Mischung 20 Minuten bei 30ºC stehen, wodurch die Sekundärreaktion erzeugt wurde, 0,8 ml 1%-ige Zitronensäure wurden hinzugegeben, suspendierte Feststoffe, falls vorhanden wurden mittels Zentrifugation entfernt, und die p-Nitroanilinmenge wurde durch Messen der Absorption bei 405 nm bestimmt.

(4) Optimaler pH-Wert für die Primärreaktion

Die Primärreaktion wurde unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl-Puffer-Lösungen mit unterschiedlichen pH-Spiegeln durchgeführt.
Die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Kallikreins wurde in der sich anschließenden Sekundärreaktion gemessen, welche zeigte, daß der optimale pH-Wert für die Primärreaktion im Bereich von 7,0 bis 9,0, insbesondere im Bereich von 7,5 bis 8,5, liegt.

(5) Optimale Natriumchlorid-Konzentration in der Primärreaktion

Die Primärreaktion wurde unter Verwendung von Natriumchlorid-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen durchgeführt. Die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Kallikreins wurde in der sich anschließenden Sekundärreaktion gemessen, welche zeigte, daß die optimale Endkonzentration von Natriumchlorid in der Primärreaktion im Bereich von 50 bis 200 mM, vorzugsweise im Bereich von 75 bis 150 mM liegt.
Beachte, daß die im Plasma enthaltene Natriumchloridmenge nicht in den zuvor angegebenen Konzentrationen enthalten ist.

(6) Optimale Kaolinkonzentration in der Primärreaktion

Die Primärreaktion wurde in 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) unter Verwendung von Kaolinsuspensionen unterschiedlicher Konzentrationen durchgeführt. Die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Kallikreins wurde in der sich anschließenden Sekundärreaktion gemessen, welche zeigte, daß die optimale Endkonzentration von Kaolin im Bereich von 1 bis 3 mg/ml, insbesondere im Bereich von 1,25 bis 2 mg/ml liegt.

(7) Optimale Reaktionszeit für die Primärreaktion

Die Primärreaktion wurde über verschiedene Zeitperioden durchgeführt, und die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Kallikreins wurde in der sich anschließenden Sekundärreaktion gemessen. Es wurde festgestellt, daß eine lineare Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Kallikrein-Aktivität innerhalb des Reaktionszeitbereiches von 0 bis 20 Minuten besteht, was anzeigt, daß die Primärreaktionszeit 20 Minuten nicht überschreiten sollte.

(8) Menge des in der Primärreaktion verwendeten LBTI

Die Primärreaktion wurde 20 Minuten bei 0ºC durchgeführt, LBTI-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen wurden hinzugefügt, und 0,1 ml jeder Reaktionsmischung wurde für die Messung der Kallikrein-Aktivität der Sekundärreaktion ausgesetzt.
Es wurde gezeigt, daß LBTI, wenn es mit einer Endkonzentration von 4 mg/ml oder mehr hinzugefügt wird, vollständig die Wirkung von F-XIIa inhibiert. Es wurde kein signifikanter Abfall der Kallikrein-Aktivität mit einer LBTI-Konzentration bis zu 15 mg/ml beobachtet.

(9) Wirkung der Konzentration von menschlichem Plasma in der Primärreaktion

Die Primärreaktion wurde unter Verwendung von menschlichem Plasma mit unterschiedlichen Verdünnungen durchgeführt, und die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Kallikreins wurde in der sich anschließenden Sekundärreaktion gemessen. Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Verdünnung und der Kallikrein-Aktivität innerhalb des Verdünnungsbereiches von 1/5 bis 1/10 beobachtet.

(10) Substratkonzentration in der Sekundärreaktion

Die Sekundärreaktion wurde 20 Minuten bei 30ºC unter Verwendung von D-Pro-Phe-Arg-pNA unterschiedlicher Konzentrationen als synthetisches Substrat durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß der Km-Wert für die Sekundärreaktion 0,34 mM betrug.

(11) Menge des in der Sekundärreaktion verwendeten Enzyms

Die Sekundärreaktion wurde unter Verwendung unterschiedlicher Mengen an Enzymen (nämlich unterschiedlicher Mengen der Primärreaktionsmischung) für die Untersuchung der Beziehung zwischen der Enzymmenge und der Kallikrein-Aktivität durchgeführt. Es wurde eine lineare Beziehung bei einer Menge primärer Reaktionsmischung von bis zu 0,1 ml beobachtet.

(12) Reaktionszeit für die Sekundärreaktion

Die Sekundärreaktion wurde über verschiedene Zeitperioden für die Untersuchung der Beziehung zwischen der Reaktionszeit und Kallikrein-Aktivität durchgeführt. Eine lineare Beziehung wurde innerhalb des Reaktionszeitbereichs von 0 bis 20 Minuten beobachtet, was anzeigt, daß die Sekundärreaktionszeit 20 Minuten nicht überschreiten sollte.

(13) Optimaler pH-Wert für die Sekundärreaktion

Die Sekundärreaktion wurde in 100 mM Tris-HCl-Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Niveaus für die Untersuchung der Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Kallikrein-Aktivität durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß der optimale pH-Wert für die Sekundärreaktion im Bereich von 7,0 bis 9,0, insbesondere im Bereich von 7,5 bis 8,5 liegt.

BEISPIEL 2

Im nachfolgenden ist ein Beispiel beschrieben, bei dem menschliches Plasma als Plasma von Lebewesen, CHFI als spezifischer Inhibitor gegenüber F-XIIa und Z-Phe-Arg-MCA als spezifisches Substrat für Kallikrein verwendet wurde.

(1) Primärreaktion

Die gleiche Formulierung wie in Beispiel 1 wurde auch in diesem Fall verwendet.
Man ließ die Reaktantenmischung 20 Minuten in einem Eis/Wasserbad für die Erzeugung der Primärreaktion stehen, welche durch Hinzugabe von 0,5 ml CHFI-Lösung [3 mg/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 0ºC)] beendet wurde, wodurch die Primärreaktionsmischung hergestellt wurde. Sie kann auch hergestellt werden, indem 0,2 ml der Reaktionsmischung vor Beendigung entnommen werden und zu 0,1 ml CHFI-Lösung hinzugefügt werden.

(2) Sekundärreaktion

Primärreaktionsmischung 0,1 ml
synthetisches Substrat 0,12 ml
Pufferlösung 0,18 ml
In der zuvor angegebenen Formulierung war das synthetische Substrat 10 mM-Lösung von Z-Phe-Arg-MCA (ein fluoreszierendes Substrat) in Dimethylsulfoxid, und die Pufferlösung war 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0).
Man ließ die zuvor angegebene Mischung 20 Minuten bei 30ºC für die Erzeugung der Sekundärreaktion stehen, 2 ml 0,1 M Essigsäure wurden hinzugefügt, suspendierte Feststoffe, falls vorhanden, wurden mittels Zentrifugation entfernt, und die 7-Amino-4-methylcumarin-Menge wurde fluorometrisch bestimmt (Ex: 380 nm; Em: 460 nm). (3) Es wurden die Bedingungen für die Primär- und Sekundärreaktionen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 untersucht.
In der Primärreaktion könnte die Wirkung von F-XIIa durch CHFI-Lösungen von 2 mg/ml und höheren Konzentrationen inhibiert sein.
In diesem Fall unterscheidet sich die Primärreaktion von der in Beispiel 1 nur dadurch, daß eine CHFI-Lösung für die Beendigung der Reaktion verwendet wurde, alle anderen Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
In der Sekundärreaktion lag der optimale pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,0, insbesondere im Bereich von 7,5 bis 8,5, und der Km-Wert für das synthetische fluoreszierende Substrat Z-Phe-Arg-MCA betrug etwa 1 mM.
Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Sekundärreaktionszeit und Kallikreinaktivität innerhalb des Reaktionszeitbereiches von 0 bis 30 Minuten beobachtet, was anzeigt, daß die Sekundärreaktionszeit 30 Minuten nicht überschreiten sollte.

BEISPIEL 3

Im nachfolgenden ist im Detail ein Beispiel beschrieben, bei dem gefriergetrocknetes menschliches Plasma als Plasma vom Lebewesen verwendet wurde. (1) Primärreaktion gefriergetrocknetes menschliches Plasma wäßrige Kaolinsuspension wäßrige Natriumchloridlösung wäßrige Lösung des zu testenden Arzneimittels destilliertes Wasser
Das gefriergetrocknete menschliche Plasma wurde in destilliertem Wasser gelöst und anschließend mit physiologischer Kochsalzlösung bis auf eine solche Konzentration verdünnt, daß sich eine Kallikrein-Aktivität von 1,6 bis 2,2 mE in der Sekundärreaktion zeigte.
Die Kaolinsuspension, Natriumchloridlösung, Reaktionstemperatur und Zeit und Beendigungsoperation waren die gleichen wie in Beispiel 1.
(2) Die Sekundärreaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
(3) Untersuchungen im Hinblick auf die Bedingungen für die Primär- und Sekundärreaktionen, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt wurden, zeigten, daß gefriergetrocknetes menschliches Plasma unter den gleichen Bedingungen wie frisches menschliches Plasma verwendet werden kann.

BEISPIEL 4

Im nachfolgenden ist detailliert ein Beispiel beschrieben, in dem Rattenplasma als Plasma von Lebewesen verwendet wurde.

(1) Herstellung von zitrathaltigem Rattenplasma

Eine aus der abdominalen Aorta einer mit Äther betäubten Ratte entnommene Blutprobe wurde in Anwesenheit von Natriumzitrat (Blut: 3,8% Natriumzitrat = 9 : 1) zentrifugiert, und der Überstand wurde als zitrathaltiges Rattenplasma gesammelt. (2) Primärreaktion Rattenplasma wäßrige Kaolinsuspension wäßrige Natriumchloridlösung wäßrige Lösung des zu testenden Arzneimittels destilliertes Wasser
In der zuvor angegebenen Formulierung war das Rattenplasma mit physiologischer Kochsalzlösung um einen Faktor von 3 bis 5 verdünnt worden, und die Kaolinsuspension und die Natriumchloridlösung waren die gleichen, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden. Man ließ die zuvor angegebene Mischung 15 Minuten für die Durchführung der Primärreaktion bei 0ºC stehen, welche durch Hinzugabe von 0,5 ml LBTI-Lösung [45 mg/ml in 50 mM Tris-HCI-Puffer (pH 8,0)] beendet wurde.

(3) Sekundärreaktion

Die Sekundärreaktion wurde im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Reaktion 30 Minuten fortgesetzt wurde. (4) Die Bedingungen für die Primär- und Sekundärreaktionen wurden auf die gleiche Weise untersucht wie in Beispiel 1.
Es wurde festgestellt, daß in der Primärreaktion der optimale pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,0, vorzugsweise im Bereich von 7,5 bis 8,5 liegt, daß die optimale Konzentration der Natriumchloridlösung im Bereich von 0 bis 150 mM, vorzugsweise im Bereich von 25 bis 125 mM, liegt, und daß die optimale Konzentration der Kaolinsuspension im Bereich von 1 bis 3,5 mg/ml, besonders im Bereich von 1,5 bis 3 mg/ml, liegt.
Die Primärreaktionszeit sollte vorzugsweise innerhalb von 20 Minuten liegen, weil eine lineare Beziehung zwischen der Reaktionszeit und Kallikrein-Aktivität innerhalb des Reaktionszeitbereiches von 0 bis 20 Minuten beobachtet wurde.
Für die Sekundärreaktion wurde gezeigt, daß der optimale pH-Wert im Bereich von 7 bis g liegt, und daß der Km-Wert für D-Pro-Phe-Arg-pNA 0,29 mM ist.
Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Reaktionszeit und Kallikrein-Aktivität innerhalb des Reaktionszeitbereiches von 0 bis 60 Minuten beobachtet. Somit sollte die Sekundärreaktion 60 Minuten nicht überschreiten und sollte vorzugsweise etwa 30 Minuten bei der tatsächlichen Anwendung betragen.

BEISPIEL 5

Im nachfolgenden ist ein Beispiel beschrieben, bei dem Dextransulfat (M.W.: etwa 500.000) als F-XII Aktivator verwendet wurde. Die anderen Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, daß frisches menschliches Plasma und gefriergetrocknetes menschliches Plasma als Plasma von Lebewesen verwendet wurden.

(1) Die optimale Endkonzentration von Dextransulfat lag im Bereich von 1 bis 5 ug/ml, insbesondere im Bereich von 1,5 bis 3 ug/ml

(2) Die optimale Natriumchlorid-Konzentration bei der Primärreaktion lag im Bereich von 50 bis 85 mM, insbesondere im Bereich von 70 bis 80 mM.
(3) Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Sekundärreaktionszeit und Kallikrein-Aktivität über den Reaktionszeitverlauf von 4 bis 20 Minuten beobachtet.
(4) Der optimale pH-Wert für die Primärreaktion lag im Bereich von 7,8 bis 8,3.
Wie aus dem zuvor angegebenen Ergebnis ersichtlich ist, kann das Verfahren gemäß dieser Erfindung erfolgreich unter Verwendung von Dextransulfat als F-XII Aktivator anstelle der Kaolinsuspension durchgeführt werden.

BEISPIEL 6

(Test für die Inhibitorwirkung gegenüber der Bradykinin-Freigabe) Es wurde untersucht, ob ein Testarzneimittel die Erzeugung von Bradykinin, eine Substanz, die Schmerzen und Entzündung induziert, in dem Reaktionssystem gemäß dieser Erfindung inhibiert.
o-Phenanthrolin, ein Inhibitor gegenüber der Kininase-Aktivität wurde zu dem Primärreaktionssystem in Beispiel l gegeben, um die Zersetzung von Bradykinin zu unterdrücken. Am Ende der Primärreaktion wurde Aceton zu der Primärreaktionsmischung (Endkonzentration: 50% Aceton) hinzugefügt, um Bradykinin, welches auf dem Kaolin, das als F-XII Aktivator hinzugegeben war, adsorbiert war, zu extrahieren.
Die Menge des gebildeten Bradykinins wurde mit Hilfe des Radioimmunassays gemäß dem im nachfolgenden beschriebenen Verfahren bestimmt. Der zuvor hergestellte Acetonextrakt von Bradykinin (200 ul) wurde mit 200 ul einer Pufferlösung (Tris-HOAc-Pufferlösung, welche 0,1% Gelatine, 7 mM Calciumchlorid, 0,01% TweenTM-20 und 0,02% 125 Natriumazid enthält; pH 8,5), 200 ul ¹²&sup5;I-Tyr-bradykinin (etwa 50.000 cpm/ml) und 200ul Antibradykinin-Kaninchen-Antiserum (1 : 15.000 Verdünnung) gemischt, und man ließ die Mischung 48 Stunden bei 4ºC stehen.
Normales Schafserum (200 ul) und eine Lösung von Aktivkohle, die mit Dextransulfat (500 ul) überzogen war, wurden anschließend hinzugegeben, und man ließ die sich ergebende Mischung weitere 30 Minuten bei 4ºC stehen. Die auf diese Weise erhaltene Reaktionsmischung wurde für die Entfernung des Überstands zentrifugiert, und es wurde die Strahlungsmenge aus dem Rückstand mit einem Gammazähler gemessen. Die in der Probe enthaltene Menge Bradykinin wurde mit Hilfe einer Kalibrierungskurve, die unter Verwendung von Standard-Bradykininlösungen hergestellt worden war, bestimmt. Ein Beispiel für die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse ist in Fig. 2 dargestellt.
Die Aktivität verschiedener Analgetika (Indomethacin, Ketoprofen, Morphin und Aminopyrin) für die Inhibierung der Kallikrein-Bildung wurde unter Verwendung des Reaktionssystems des Beispiels 1 gemessen. Jedes dieser Arzneimittel wurde in Form einer wäßrigen Lösung, die auf ungefähr Neutralität eingestellt war, untersucht.
Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt. Es ist aus der Figur ersichtlich, daß bemerkenswerte Inhibitorwirkung gegenüber der Kallikrein-Bildung mit Indomethacin und Ketoprofen, deren analgetische Wirkung teilweise auf der Inhibitorwirkung gegenüber der Bradykinin-Freigabe beruht, beobachtet wurde, und daß wenig dieser Wirkung mit Morphin und Aminopyrin, welche Analgetika sind, die hauptsächlich auf das Zentralnervensystem einwirken, beobachtet wurde.
Es wurde die Inhibitorwirkung der Testarzneimittel gegenüber der Freigabe von Bradykinin (die Substanz, die das Endprodukt in dem Reaktionssystem dieser Erfindung ist und Schmerzen und Entzündungen induziert) untersucht. Ein Beispiel der so erhaltenen Ergebnisse ist in Fig. 2 dargestellt.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, zeigen die Arzneimittel, die bemerkenswerte Inhibitorwirkung gegenüber der Kallikrein-Bildung ausüben, auch auffallende Inhibitorwirkung gegenüber der Freigabe von Bradykinin.
Es ist somit klar, daß die Inhibierung der Kallikrein-Bildung (Fig. 1) und Inhibierung der Bradykinin-Freigabe (Fig. 2) gut miteinander korrelieren, was die hohe Zuverlässigkeit des Verfahrens dieser Erfindung als Mittel zum Prüfen physiologisch aktiver Substanzen, die in das Kallikrein-Kinin-System verwickelt sind, zeigt.
Wie aus dem Vorhergehenden ersichtlich ist, eignet sich das Verfahren dieser Erfindung zum Prüfen jener physiologisch aktiven Substanzen, die die Kallikrein-Bildung beeinflussen, beispielsweise derjenigen Substanzen, die Inhibitorwirkung gegenüber der Bradykinin-Freigabe aufweisen.
Bei dem Verfahren gemäß dieser Erfindung wird eine Serie von komplexen Enzymreaktionen, die verschiedene Enzymarten umfassen, welche im allgemeinen viel Zeit und Mühe für ihre Isolierung und Reinigung benötigen, verwendet. Diese Schwierigkeit wird durch Verwendung von Plasma von Lebewesen oder einem gefriergetrockneten Produkt davon als Enzymquelle eliminiert, was einen herausragenden Vorteil des Verfahrens gemäß dieser Erfindung liefert. Daneben enthält das Reaktionssystem, das eine Serie von Enzymreaktionen umfaßt, eine Menge aktiver Stellen, die die Wirkung der physiologisch aktiven Substanz (das zu testende Arzneimittel) erfahren, was somit ermöglicht, daß multilaterale Screening-Tests gleichzeitig mittels eines einfachen Verfahrens durchgeführt werden können.
Wie zuvor festgestellt, ist das Kallikrein-Kininsystem eng mit verschiedenen Arten von Enzymsystemen verbunden und in viele Kontrollfunktionen in lebenden Organismen verwickelt. Somit eignet sich das Reaktionssystem gemäß dieser Erfindung sehr zum Testen derjenigen Substanzen, die die Wirkungen von Prostaglandin, Leukotrien und Thromboxan, erzeugt von der Arachidonatkaskade, kontrollieren, zum Testen von Blutdruck-Kontrollsubstanzen, die mit dem Renin-Angiotensin-System verbunden sind, zum Testen von denjenigen Substanzen, die die Blutkoagulations- und Fibrinolyse-Systeme kontrollieren, und zum Testen derjenigen, die die physiologische Wirkung von Bradykinin kontrollieren (beispielsweise entzündungshemmende, analgetische und antiallergische Mittel).

Claims

1. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors, welches die Stufen umfaßt:

Bilden einer Reaktionsmischung, welche im wesentlichen aus (1) Plasma von Lebewesen, (2) einem Aktivator für den Blutkoagulationsfaktor XII, (3) einem Elektrolyten und (4) einem zu untersuchenden Kallikrein-Bildungsinhibitor besteht;

Inkubieren der Reaktionsmischung;

Hinzufügen eines Inhibitors, der im wesentlichen keine Wirkung auf die Kallikrein-Aktivität ausübt und sich dazu eignet, spezifisch die Aktivität des aktivierten Blutkoagulationsfaktors XII zu inhibieren, wodurch im wesentlichen die Erzeugung von Kallikrein in der Reaktionsmischung beendet wird, wobei das Hinzufügen durchgeführt wird, während eine im wesentlichen lineare Beziehung zwischen der Reaktionszeit und Kallikrein-Bildung besteht; und

Messen der Menge des auf diese Weise gebildeten Kallikreins.

2. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemaß Anspruch 1, wobei das Plasma von Lebewesen menschliches Plasma ist.

3. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemaß Anspruch 2, wobei das Plasma von Lebewesen ein zitrathaltiges Plasma oder ein davon erhaltenes gefriergetrocknetes Produkt ist.

4. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemäß Anspruch 1, wobei die Kallikrein-Menge gemessen wird, indem eine substrathaltige Pufferlösung zu dem Kallikrein gegeben wird, und das so gebildete Reaktionsprodukt gemessen wird.

5. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemäß Anspruch 4, wobei das Plasma von Lebewesen menschliches Plasma ist.

6. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemaß Anspruch 4, wobei das Plasma von Lebewesen Plasma von einem Säuger, ausgewählt aus Rindern, Schaf, Schwein, Pferd, Ziege, Affe, Hund, Katze, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte und Maus ist.

7. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemaß Anspruch 1, wobei die Reaktion bei einer Temperatur von 0 bis 4ºC voranschreitet.

8. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemaß Anspruch 1, wobei das Plasma von Lebewesen 5- bis 10-fach verdünnt wird.

9. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemäß Anspruch 1, wobei der Aktivator für den Blutkoagulationsfaktor XII eine wäßrige Kaolinsuspension ist.

10. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemäß Anspruch 1, wobei der Elektrolyt eine Verbindung ist, die ein monovalentes Kation enthält.

11. Verfahren zum Untersuchen der Inhibitorwirkung eines Kallikrein-Bildungsinhibitors gemäß Anspruch 10, wobei das monovalente Kation Natriumion ist.