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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung:
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden einer
Vielzahl von neuen physiologisch aktiven Substanzen und die Herstellung
derselben.
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Stand der Technik:
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Physiologisch
aktive Substanzen unbekannter Arten wurden bisher durch Analysieren
von Substanzen, die in Körperflüssigkeiten
oder Geweben vorkommen, und Identifizieren und Trennen neuer Substanzen daraus,
um die biologischen Aktivitäten
der Substanzen zu bestimmen, aufgefunden.
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Das
Verfahren des Standes der Technik, das oben geschrieben wurde, umfasst
die Schritte des Analysierens von Bestandteilen in lebenden Organismen,
des Auffindens und Isolierens neuer Substanzen, und des Identifizierens
der physiologischen Aktivitäten
davon. Es ist jedoch offensichtlich, dass es eine extrem große Zahl
von Substanzen innerhalb eines lebenden Organismus gibt, und viele
physiologisch aktive Substanzen sind häufig in sehr geringen Konzentrationen
anwesend, was es schwierig macht, neue Substanzen zu isolieren.
Weil lebende Organismen weiterhin eine Vielzahl von physiologischen
Aktivitäten
ausführen,
kann es auch schwierig sein, die physiologischen Aktivitäten einer
neu isolierten Substanz zu identifizieren. Wie aus der obigen Diskussion
geschlossen werden kann, machen es die Verfahren des Standes der
Technik schwierig, neue physiologisch aktive Substanzen aufzufinden
und zu isolieren.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Auffinden
neuer physiologisch aktiver Substanzen, mit größerer Wirksamkeit und einem
gewissen Grad an Vorhersagbarkeit, bereitzustellen.
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Der
Erfinder der vorliegenden Erfindung hat herausgefunden, dass es
Fälle geben
kann, in denen es Rezeptoren gibt, die zwei oder mehr Größen aufweisen,
wenn die Rezeptoren funktionell zueinander identisch sind, der Rezeptor
ein Rezeptor einer Substanz ist, wenn im menschlichen Körper eine
Substanz oder Zelle anwesend ist, die einen funktionellen Antagonismus
aufweist, oder der Rezeptor ein Rezeptor von Substanz A ist, wenn
im menschlichen Körper
eine Zelle oder Substanz anwesend ist, die einen funktionellen Antagonismus
gegenüber
von Zellen aufweist, auf welche die Substanz A einige Wirkungen
ausübt,
und dass die Aminosäure-Sequenz
des fehlenden Abschnitts oder gespleißten Abschnitts eine physiologische
Bedeutung aufweist. Zum Beispiel kann Beispiel Calcitonin an einen
Calcitonin-Rezeptor gebunden sein, der auf Osteoklasten anwesend
ist, um die Knochenerweichung (Deossifikation), die durch Osteoklasten
bewirkt wird, zu supprimieren, während
es Osteoblasten gibt, die einen funktionellen Antagonismus gegenüber den
Osteoklasten aufweisen. Bezüglich
der Calcitonin-Rezeptoren wurde bereits die Aminosäure-Sequenz
davon beschrieben, aber es wurden zwei oder mehr verschiedene Arten
mit verschiedenen Größen beschrieben.
Nissenzveig et al., J. Biol. Chem. 269 28123-28129 (1994) offenbaren
verschiedene physiologische Wirkungen von zwei verschiedenen Isoformen
des menschlichen Calcitonin-Rezeptors. Der Erfinder der vorliegenden
Erfindung hat vorhergesagt, dass im Fall von Calcitonin-Rezeptoren
solcher Arten, die zwei oder mehr Größen aufweisen, ein Bereich
bzw. eine Domäne
in dem Rezeptor mit der längeren
Größe gespleißt wird,
wodurch der Rezeptor kürzerer
Größe gebildet
wird, und dass die gespleißte
Domäne
Wirkungen auf Osteoblasten ausüben
kann, die antagonistische Wirkungen zu den Wirkungen von Osteoklasten
sind, auf welche Calcitonin Wirkungen ausübt. Nach der Untersuchung der
gespleißten
Domäne
nach dem chemischen Synthetisieren der Domäne wurde bestätigt, dass
dieses neue Peptid Osteogenese durch Binden an Rezeptoren auf den
Osteoblasten fördert.
Eine solche Bestätigung,
wie oben, zeigte die Richtigkeit der vorangegangenen Vorhersage,
die vom Erfinder der vorliegenden Erfindung gemacht wurde, und die
vorliegende Erfindung wurde gemacht.
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In
anderen Worten stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Identifizieren physiologisch aktiver Peptide, wie in Anspruch 1
definiert, bereit.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt zum ersten Mal ein Verfahren
zum Auffinden von neuen physiologisch aktiven Substanzen, mit Wirksamkeit
und einem gewissen Grad an Vorhersagbarkeit, bereit. Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können neue physiologisch aktive
Substanzen durch Analysieren von Rezeptoren von Substanzen, die
mit funktionellem Antagonismus assoziiert sind, identifiziert werden,
wodurch die Notwendigkeit des Isolierens von physiologisch aktiven
Substanzen, die in einer kleinen Menge in einer Probe des menschlichen
Körpers
anwesend sind, der eine sehr große Zahl von Bestandteilen einschließt, wie
dies zuvor im Stand der Technik notwendig war, eliminiert wird.
Weil weiterhin die physiologische Aktivität der identifizierten physiologisch
aktiven Substanz mit dem funktionellen Antagonismus assoziiert ist,
kann es sehr viel leichter als zuvor sein, die physiologischen Aktivitäten davon
zu identifizieren. Deshalb wurde es gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren
möglich
gemacht, neue physiologisch aktive Substanzen in einer wirksameren
Weise als zuvor zu identifizieren.
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DIE BESTE WEISE, DIE ERFINDUNG
AUSZUFÜHREN
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Gemäß einem
erfindungsgemäßen Verfahren
liegt der Fokus auf Rezeptoren, deren physiologische Funktion Gegenstand
von funktionellem Antagonismus in vivo ist. Der funktionelle Antagonismus
ist eine grundliegende Funktion für die Homeostase im menschlichen
Körper,
und es gibt eine große
Anzahl von Substanzen oder Zellen, die wechselseitige Antagonismen
innerhalb des menschlichen Körpers
aufweisen. Beispiele von relevanten Rezeptoren schließen Calcitonin-Rezeptoren
(Osteoklasten, auf die Calcitonin wirkt, zeigen funktionellen Antagonismus
gegenüber
Osteoblasten), Glucagon-Rezeptoren (Glucagon weist funktionellen
Antagonismus gegenüber
Insulin auf), Somatostatin-Rezeptoren (Somatostatin weist funktionellen
Antagonismus gegenüber
Wachstumshormonen auf) und Parathyroid-Hormon (das Hormon weist funktionellen
Antagonismus gegenüber
Calcitonin, etc. auf) und ähnliche.
Solche Rezeptoren schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf 7-Transmembran-Typ-Rezeptoren, wie Calcitonin-Rezeptoren.
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Gemäß einem
erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Aminosäure-Sequenz oder Größen von
solchen Rezeptoren analysiert, um Rezeptoren zu finden, die verschiedene
Größen aufweisen
und die identische Rezeptoren sind. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden,
indem viele Male die Aminosäure-Sequenzen oder
die Größen der
identifizierten Rezeptoren identifiziert werden, oder indem die
Literatur verwendet wird, wenn sie darin beschrieben sind. Einige
Beispiele von Rezeptoren, die Rezeptoren mit zwei oder mehr Arten mit
verschiedenen Größen sind,
während
sie identische Rezeptoren sind, können in Calcitonin-Rezeptoren, Glucagon-Rezeptoren, Somatostatin-Rezeptoren
und ähnlichem
gefunden werden.
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Nach
dem Identifizieren von zwei oder mehr Arten von Rezeptoren mit verschiedenen
Größen für identische
Rezeptoren, werden die Aminosäure-Sequenzen dieser
zwei oder mehr Arten von Rezeptoren miteinander ver glichen, um zu
identifizieren, welche Domäne
des Rezeptors mit längerer
Größe fehlt
und dadurch den Rezeptor in der Größe kürzer macht. Die fehlende Domäne in dem
Rezeptor mit kürzerer
Größe ist die physiologisch
aktive Substanz, die einige Wirkungen auf den funktionellen Antagonismus
aufweist. Mit anderen Worten sind einige der Elemente in der gespleißten Struktur
die physiologisch aktiven Substanzen. Es kann geschlossen werden,
dass eine physiologisch aktive Substanz an einen Rezeptor gebunden
ist, wodurch ein Abschnitt des Rezeptors gespleißt wird, und dieses gespleißte Stück des Rezeptors
zeigt einige physiologische Aktivität, wie eine Kontrollwirkung
auf den funktionellen Antagonismus. Es wurde bestätigt, dass
zum Beispiel, wie in den Beispielen unten gezeigt, die fehlende
Domäne
in einem Calcitonin-Rezeptor an einen Rezeptor gebunden ist, der
auf einem Osteoblasten anwesend ist, wodurch Osteogenese gefördert wird.
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Weil
die fehlende Domäne,
die durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wurde, physiologische
Aktivitäten
aufweist, kann eine physiologisch aktive Substanz durch Herstellung
einer solchen Domäne erhalten
werden. In den meisten Fällen
weist die fehlende Domäne
Peptide von relativ kurzen Größen auf,
und deshalb kann in solchen Fällen
ein kommerziell erhältliches
Peptid-Synthetisiergerät
verwendet werden, um einfach die physiologisch aktiven Substanzen
chemisch synthetisiert herzustellen. Alternativ dazu können solche
Substanzen unter Verwendung eines Verfahrens von der Art des genetischen
Engineerings gemäß bekannter
Verfahren hergestellt werden.
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Die
physiologische Aktivität
der derart erhaltenen physiologisch aktiven Substanz steht in Verbindung mit
dem oben erwähnten
Antagonismus, und deshalb kann die Aktivität einfach durch irgendein geeignetes
anwendbares Verfahren in Abhängigkeit
von jedem funktionellen Antagonismus bestätigt werden.
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Es
ist dem Fachmann gut bekannt, dass in Peptiden mit physiologischer
Aktivität
im Allgemeinen, die physiologische Aktivität davon aufrecht erhalten sein
kann, selbst wenn einige der Aminosäuren daraus durch andere Aminosäuren substituiert
sind, oder wenn einige Aminosäuren
hinzugefügt
sind, oder wenn einige Aminosäuren
fehlen. Deshalb schließt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz
ein, die physiologische Aktivitäten
inhärent
zu den physiologisch aktiven Substanzen aufweist, umfassend die
fehlende Domäne,
wobei einige der Aminosäuren,
welche die fehlende Domäne
bilden, durch andere Aminosäuren
ersetzt sind, oder einige andere Aminosäuren zu den Aminosäuren hinzugefügt sind,
welche die fehlende Domäne
bilden, oder einige der Aminosäuren
aus den Aminosäuren
fehlen, welche die fehlende Domäne
bilden (die zuvor genannte Substanz wird im Folgenden in der vorliegenden
Anmeldung als „Derivat" der fehlenden Domäne bezeichnet).
Ein solches Derivat weist vorzugsweise nicht weniger als 70%, und
weiter bevorzugt 90%, an Homogenität mit der oben erwähnten fehlenden
Domäne
auf.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird spezifischer unten mit Bezugnahme auf
die Beispiele beschrieben. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass
die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist.
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[Beispiel 1] Identifizierung
der fehlenden Domäne
des Calcitonin-Rezeptors:
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Die
Aminosäure-Sequenzen
von Calcitonin-Rezeptoren sind im Journal of Clinical Investigation,
Vol. 90, Nr. 5 (1992) beschrieben. Wenn die beschriebenen Aminosäure-Sequenzen
der Calcitonin-Rezeptoren, die in der obigen Referenz beschrieben
sind, verglichen werden, fehlen die Aminosäuren an der 175. bis 190. Sequenzposition
der Aminosäure-Sequenz
des längeren
Rezeptors in der Aminosäure-Sequenz
des kürzeren Rezeptors.
Die Aminosäure-Sequenz
der fehlenden Domäne
ist in Sequenz 1 gezeigt.
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[Beispiel 2] Herstellung
von Peptiden:
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Unter
Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Peptid-Synthetisiergeräts
wurde ein Peptid mit der Aminosäure-Sequenz,
die in Sequenz 1 gezeigt ist, synthetisiert.
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[Beispiel 3] Proliferationsförderung
von Osteoblasten:
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ROS-Zellen
aus einer Ratte, die Osteoblasten sind (erhältlich von ATCC) wurden in
F10 Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (erhältlich von
Dainippon Pharmaceutical) kultiviert und in einer Kammer mit einer
konstanten Temperatur von 37°C
unter feuchter Luft enthaltend 5% CO2 Gas
inkubiert. Unter Verwendung einer Trypsin-Behandlung wurden die
Zellen in eine 24-Vertiefungskulturplatte mit einer Rate von 1 × 105 Zellen/Vertiefung verteilt, und wenn die
Kolonien konfluent waren, wurde das Medium gegen F10 Medium mit
1% fötalem
Rinderserum ausgetauscht und für
24 Stunden kultiviert. Anschließend
wurde das erfindungsgemäße Peptid,
das in Beispiel 2 hergestellt wurde, in F10 Medium mit 1% fötalem Rinderserum
gelöst, das
zu den Vertiefungen in verschiedenen Mengen hinzugefügt wurde,
und das Kultivieren wurde für
zusätzliche
24 Stunden fortgesetzt. Nach dem Kultivieren wurde die Wirkung der
Förderung
der Zellproliferation durch das Peptid unter Verwendung eines MTT-Assays
gemessen, um das Niveau der Proliferationsförderungswirkung im Vergleich
zu den Proben ohne irgendeine Behandlung zu bestimmen. In diesem
Fall wurden der MTT-Assay und die Berechnung des Proliferationsförderungsverhältnisses
wie folgt durchgeführt:
gemäß dem Protokoll
des MTT-Zellwachstums Assay Kits, der kommerziell erhältlich ist
von Funakoshi, Co. Ltd., wurde die erfindungsgemäße Substanz zu den Vertiefungen
in verschiedenen Mengen hinzugefügt,
und dann wurden sie für
einen Tag und eine Nacht stehengelassen, gefolgt durch Zählen, unter
Verwendung von Kolorimetrie, der Zahl der lebenden Zellen, wobei
das Phänomen
verwendet wurde, dass MTT (3-4,5 Dimethylthiazol-2yl)-2,5 diphenyl-tetrazolium-bromid
in dunkelblaues Formazan durch Enzyme, die in Mitochondrien von
lebenden Zellen anwesend sind, gespalten wird. Die folgenden Ergebnisse
der kolorimetrischen Werte wurden durch Hinzufügen von verschiedenen Mengen
der erfindungsgemäßen Substanz
erhalten, während
der Wert für
die Kontrollgruppe, zu der keine erfindungsgemäße Substanz hinzugefügt wurde,
bei 100% lag. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten gezeigt.
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Wie
Tabelle 1 entnommen werden kann, wurde für das Peptid, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
identifiziert wurde, bestätigt,
dass es Wirkungen in der Förderung
der Proliferation von Osteoblasten hervorruft. Somit wird von dem
erfindungsgemäßen Peptid
angenommen, dass es eine Erhöhung
in der Knochendichte verursacht und somit in der Behandlung von
Osteopathie, wie Osteoporose und ähnlichem, verwendet werden
kann.
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[Beispiel 4] Anwesenheit
von Osteoblasten auf den Rezeptoren von erfindungsgemäßen Peptiden:
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Es
wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Peptide fördernde
Wirkung auf die Proliferation von Osteoblasten aufweisen, weshalb
angenommen wird, dass Osteoblasten Rezeptoren für die erfindungsgemäßen Peptide
aufweisen. Wenn die Rezeptoren anwesend sind, kann angenommen werden,
dass die erfindungsgemäßen Peptide
eine wesentliche Substanz für
das Leben sind, und deshalb wurde untersucht, ob es Rezeptoren auf
Osteoblasten gibt.
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Das
Peptid, das in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde mit Biotin markiert,
und das erfindungsgemäße Peptid,
das mit einer vorbestimmten Menge markiert wurde, wurde zu ROS-Zellen
hinzugefügt,
die in einem ähnlichen
Verfahren wie in Beispiel 3 kultiviert wurden, gefolgt von Lösen, um
eine kompetitive Reaktion zu bewirken, in F10 Medium mit 10% fötalem Rinderserum,
in dem das erfindungsgemäße Peptid
nicht markiert war, und danach durch Hinzufügen, während die Menge variierte,
um die kompetitive Reaktion zu beobachten. Die zuvor genannte experimentelle
Durchführung
wurde spezifischer wie folgt durchgeführt: das erfindungsgemäße Peptid
wurde gemäß dem Protokoll
des Protein Biotinlabelling-Kit von SUMILON Co., biotinyliert, und eine
vorbestimmte Menge des biotinylierten Peptids wurde zu einer vorbestimmten
Zahl von Zellen, die in Vertiefungen verteilt waren, hinzugefügt, gefolgt
von Hinzufügen
von 0-0,512 μg/Vertiefung
von nicht markiertem Peptid, das zu jeder Vertiefung hinzugefügt wurde,
um für
6 Stunden eine kompetitive Reaktion zu bewirken, und danach wurden
die Zellen mit PBS gespült,
und die biotinylierten Peptide, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche gebunden
waren, wurden mit Peroxidase, die mit Streptavidin markiert war,
umgesetzt, um eine Farbentwicklungsreaktion zu beobachten. Wenn
irgendein Rezeptor der erfindungsgemäßen Peptide auf der Zelloberfläche anwesend
ist, wird eine kompetitive Reaktion mit den erfindungsgemäßen Peptiden,
die nicht markiert sind, bewirkt, und die Farbintensität wird verringert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt:
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Wie
in Tabelle 2 gezeigt, variiert das Verhältnis der hinzugefügten Menge
an Peptiden des markierten Typs in Abhängigkeit von der hinzugefügten Menge
der Peptide des nicht markierten Typs, und deshalb ist es offensichtlich,
dass die Osteoblasten Rezeptoren für das erfindungsgemäße Peptid
aufweisen, und es wird angenommmen, dass die erfindungsgemäße Substanz
eine grundlegende Rolle spielt.
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[Akuter Toxizitätstest]
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Ein
akuter Toxizitätstest
des Peptids, das in Beispiel 2 hergestellt wurde, wurde unter Verwendung
von ddy männlicher
Mäuse (Gewicht
40-45 Gramm) durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Peptid
wurde in einer Salzlösung
(pH 6,0) gelöst,
um die Lösung
durch die kaudale Vene zu verabreichen, und danach wurden die Mäuse für 14 Tage
beobachtet. Die Dosis wurde auf 1, 10 und 100 μg/kg eingestellt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 3 unten gezeigt:
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[Beispiel 5] Identifizierung
der fehlenden Domäne
in Glucagon-Rezeptoren:
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Unter
Verwendung der gleichen Methodik wie in Beispiel 1 wurden die Glucagon-Rezeptoren,
die in FEBS Letters (351 (1994), S. 271-275) beschrieben sind, verglichen,
um die Aminosäure-Sequenz
der Domäne,
die in den Rezeptoren der längeren
Größe anwesend
ist, aber in den Rezeptoren der kürzeren Größe fehlt, zu identifizieren.
Die so identifizierte Aminosäure-Sequenz der fehlenden
Domäne
ist in Sequenz 2 gezeigt.
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[Beispiel 6] Identifizierung
der fehlenden Domäne
in Somatostatin-Rezeptoren:
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Unter
Verwendung der gleichen Methodik wie in Beispiel 1 wurden die Aminosäure-Sequenzen
von Somatostatin-Rezeptoren, die in Molecular Pharmacology, 44:
S. 1008-1015 (1993) beschrieben sind, verglichen, um die Aminosäure-Sequenz
in der Domäne,
die in den Rezeptoren der längeren
Größe anwesend
ist, aber in den Rezeptoren der kürzeren Größe fehlt, zu identifizieren.
Die so identifizierte Aminosäure-Sequenz der
fehlenden Domäne
ist in Sequenz 3 gezeigt.
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