JPS63185398A - 生理活性物質測定法 - Google Patents

生理活性物質測定法

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JPS63185398A
JPS63185398A JP62225959A JP22595987A JPS63185398A JP S63185398 A JPS63185398 A JP S63185398A JP 62225959 A JP62225959 A JP 62225959A JP 22595987 A JP22595987 A JP 22595987A JP S63185398 A JPS63185398 A JP S63185398A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生理活性物質の測定法に関する。更に詳しくは
、血漿カリクレインの生成過程に作用を及ぼす生理活性
物質の測定法に関する。
（従来の技術） カリクレインは種々の動物の血漿中並びにｍ織に床机に
存在するタンパク分解酵素であり、カリクレイン・キニ
ン系なる酵素系が知られている。
このカリクレイン・キニン系は生体内において、他の様
々な酵素反応系、例えばレニン・アンジオテンシン系、
血液凝固系、線溶系、補体系やプロスタグランジン、ロ
イコトリエン、トロンボキサンを中心とするアラキドン
酸カスケード並びにカテコールアミン等と密接な関連性
をもって作用しており、生体内の機能調節に重要な意義
を有している。従って、カリクレイン・キニン系は、他
の酵素系と関連することにより血圧調節作用、血液凝固
−線溶一補体系を通じての作用、或いはアラキドン酸カ
スケードにより生成する種々の生理活性物質による生体
調整作用や末梢循環改善作用等に深く関わっているもの
である。
カリクレイン・キニン系の生成産物であるキニン類は、
末梢血管拡張に伴う降圧、血管透過性の光道、平滑筋の
収縮或いは弛緩、発癌、白血球の遁走、副腎皮質からの
カテコールアミンの遊離作用など種々の生理活性を有す
るほか、アレルギー反応を含めた急性炎症のメディエー
タ−としても知られており、生体内における存在意義は
大きい。
従って、カリクレインの生成に作用する物質、即ちカリ
クレインの生成を抑制或いは促進する物質の作用を簡便
、且つ正確に測定する方法を確立することは、上記のよ
うな生体機能の調整に役立つ作用を知るうえで又かかる
薬剤を開発する上で非常に有用な手段となるものである
。
尚、カリクレイン・キニン系自身は以下のような一連の
酵素反応の上に成立するものである。
即ち、この酵素系には血液凝固第■因子（ハーゲマン因
子、以下ＦＭ［と略す）が重要な役割を果しており、血
漿中のＦＸＩＩはガラス、カオリン、エラジン酸等の負
に荷電した物質、若しくはコラーゲン、ホモシスチン、
血小板膜、硫酸化糖脂質等の生体内に存在する物質と接
触することにより、或いは組織に対する侵害刺激等によ
り活性化される。この活性化されたＦＭ（ＦＭａ）は同
じく血漿中に存在するプレカリクレインに作用して、こ
れをカリクレインへと変換し、このカリクレインが血漿
中の高分子キニノーゲンに作用してノナペプチドである
プラジキニンを遊離させるという一連の反応が引き起こ
されることになる。
さらに引き続いて、遊離されたキニン類は、前述のよう
な作用により直接的には炎症、痛みやアラキドン酸カス
ケードに対する作用を引き起こすなど種々の影響を及ぼ
すことになる。
本発明者らは、このようなカリクレイン・キニン系に関
連する一連の酵素反応系を踏まえ、これらの反応を試験
管内にて再構成することにより、本発明の反応系が作用
物質の測定法として極めて有用で且つ信頼性が高く、又
、操作も簡便であることを見出し本発明を完成した。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、カリクレインの生成に作用する生理活
性物質の測定法並びにこの測定法の為の有用な反応系を
提供することにある。
（問題点を解決するための手段） 本発明は、血漿中のＦＭを活性化することにより血漿中
のプレカリクレインをカリクレインへ変換し、生じたカ
リクレインを測定することを特徴とする生理活性物質の
測定法である。
さらに詳しくは、 動物血漿、 血液凝固第■因子活性化剤、 電解質、 被検薬、 から成る溶液を混合反応させ、次いでカリクレイン活性
に実質的に無影響で活性型血液凝固第■因子活性のみを
特異的に阻害する阻害剤を加え、生成したカリクレイン
の活性を定量することを特徴とするものである。
好ましい態様としては、 動物血漿、 血液凝固第■因子活性化剤、 電解質、 被検薬、 から成る混合溶液を反応させた後（以下第一次反応とい
う）、カリクレイン活性に実質的に無影響で、活性型血
液凝固第■因子活性のみを特異的に阻害する阻害剤を加
え、次いでこの第一次反応液を、カリクレインに対する
基質、 緩衝液、 から成る第二次反応液と混合反応させ（以下第二次反応
という）、生成したカリクレインによる分解産物を定量
する方法が挙げられる。
本発明における反応系は、前記のように二段階の反応に
より構成されるものであり、第一次反応は血漿にカオリ
ン等のＦＭ［活性化剤を添加して活性型Ｆ■とすること
により、該血漿中のプレカリクレインからカリクレイン
を生成させる反応系である。
引き続いて行われる第二次反応は、第一次反応で生成し
たカリクレインを定量する反応系であり、例えば、カリ
クレインの活性（生成量）をカリクレインに対する特異
的基質を用いて測定する方法で行うことができる。
即ち、本発明の測定法は、カリクレインの生成に影響を
及ぼす生理活性物質を上記第一次反応系に共存させ、生
成したカリクレイン量を第二次反応系において定量する
ことを特徴とする。
本発明で用いる動物血漿は、血液凝固系並びにカリフレ
イン・キニン系を有するものであればいかなる動物でも
用いることができ、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、
ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、
ラット、マウス等のものが挙げられ、ヒト、ラット等が
好ましい。
これらの血漿は通常の方法により調製したものを使用す
ることができ、例えばクエン酸存在下に採血した後、遠
心分離して得たクエン酸油血漿等を用いることができる
。又、本発明の反応系には常法によって製造された凍結
乾燥血漿を用いてもよい。
調製された血漿はそのままで若しくは必要に応じて適宜
希釈して用いるが、第一次反応において血漿の希釈率と
カリクレイン活性との間に直線的な関係が成立する濃度
を選ぶことが好ましい。
本発明において、ＦＭの活性化剤としては、種々の物質
、例えばカオリン、コラーゲン、硫酸デキストラン、エ
ラジン酸、セライト等を用いることができる。ＦＭ活性
化剤は、ＦＭ［を活性化するためにその至適濃度に調整
することが好ましく、例えばヒト血漿を用いて、カオリ
ン懸濁液によって活性化する場合、最終濃度１乃至３■
／−１好ましくは１．２５乃至２■／−に調整して用い
ることができる。
前項のＦＭ活性化剤の作用をより完全なものとするため
に加えられる電解質は、例えばナトリウムイオン等の一
価の正電荷イオンを含むものが用いられ、塩化ナトリウ
ム或いは酢酸ナトリウムなどが好ましい。例えばヒト血
漿を用いた場合には、第一次反応における塩化ナトリウ
ムの最終濃度は５０乃至２００ｍ　Ｍ　、好ましくは７
５乃至１５０ｍＭに調整することが好ましい。　第一次
反応は、前述のように血漿にＦＭ活性化剤を添加してＦ
Ｘｌ［を活性型Ｆ■とすることにより、プレカリクレイ
ンからカリクレインを生成させる反応系であるが、この
反応は温度が高い時には急激に進行するとともに内因性
のインヒビターが働き、カリクレイン活性の測定に非常
に影響を及ぼすため、内因性のインヒビターが働かずに
反応がゆっくり進行するように、第一次反応は低温下、
例えば０乃至４℃で行うことが好ましい。
第一次反応液のｐＨは、第一次反応の最終産物であるカ
リクレインの生成に対しての至適ｐＨであることが好ま
しく、例えばヒト或いはラット血漿を用いた場合には、
ｐＨ７，０乃至９．０、好ましくはｐｌ（７，５乃至８
．５範囲で反応を行うことができる。
第一次反応の反応時間は、第一次反応液中に加えた血漿
の量、ＦＭ活性化剤、被検薬の濃度或いは反応液のｐＨ
等によって変化するが、反応時間と生成したカリクレイ
ン量（カリクレイン活性）との間に直線的な関係が成立
する時間内に設定することが必要である。なぜならば、
本発明測定法はカリクレイン生成に影響を与える生理活
性物質の作用を、生成カリクレイン活性で定量する方法
が好ましいため、カリクレイン活性が飽和してしまう時
間前の直線部分で行わねばならないからである。しかし
ながら、実際の測定操作上の観点より１５乃至３０分の
間に反応時間を設定することが実際的で好ましい。
第一次反応の停止は、活性型ＦＭのみを特異的に阻害し
てさらに余分のカリクレインが生成しないようにし、且
つ第二次反応においては測定するカリクレイン活性には
実質的に無影響な阻害剤を第一次反応系に添加すること
で行うことができる。
このような阻害剤として、Ｌ　Ｂ　Ｔ　Ｉ　　（Ｌｉｍ
ａ　ＢｅａｎＴｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：リ
マ豆由来のトリプシンインヒビター）或いはＣＨＦ　Ｉ
　　（Ｃｏｒｎ　Ｈａｇｅｍａｎ　ＦｒａｇｍｅｎｔＩ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ：　）ウモロコシ由来のハーゲマンフ
ラグメントインヒビター）等が挙げられる。
これらの阻害剤は、第一次反応において残存する活性型
ＦＭを完全に阻害し、更に第二次反応において測定する
カリクレイン活性に実質的に影響しない濃度範囲になる
よう第一次反応停止時に加えるのがよい。例えば、ヒト
血漿を用いた場合、ＬＢＴＩはその最終濃度が４乃至１
５■／艷となるように加えることができる。
第二次反応は、前述のように第一次反応で生成したカリ
クレインを定量する反応系であるが、生成カリクレイン
活性（生成量）をカリクレインに対する特異的基質を用
いて測定する方法が好ましい。
カリクレインに対する特異的基質としては、種々の物質
を用いることができるが、例えば、血漿中に存在する高
分子キニノーゲン、或いは、合成基質、例えばＢｅｎｚ
ｏｙｌ−Ａｒｇ−ＯＥｔ　（Ｎ　−ヘンシイルーＮ−ア
ルギニンエチルエステル □　　ルート−アルギニンメチルエステル）　、Ｄ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　　（　Ｄ−プロリルフ
ェニルアラニルアルギニＪＬ／−ｐ−ニトロアニリド）
　、Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−ｐＮ八
　（ベンツ゛イループロリルフェニルアラニルアルギニ
ル−（プロリルフェニルアラニルアルギニル−ナフチル
アミド）、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　（ヘンシルオ
キシカルボニル−フェニルアラニルアルギニル−４−メ
チルクマリンアミド）等を用いることができる。
高分子キニノーゲンを用いた場合には、生成するプラジ
キニンはバイオアッセイであるモルモット回腸若しくは
ラット子宮筋等の平滑筋を用いたマグヌス法、或いはラ
ジオイムノアッセイ法（ＲＩ　Ａ）等の通常の定量方法
により定量することができる。
カリクレインのエステラーゼ作用を用いて、その活性を
測定する場合には、Ｂｅｎｚｏｙｌ−＾ｒｇ−ＯＥｔ、
　Ｔｏｓ−Ａｒｇ−ＯＭｅ等の基質を用いることができ
、測定法としては、例えば、加水分解に伴う吸光度の変
化を測定する方法、発色物質に誘導し分光学的に定量す
る方法、例えば、ヒドロキサメート法、クロモトロープ
酸を用いる方法、ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ペンゾチ
アソロンヒドラジン）を用いる方法、螢光物質へ誘導す
る方法、アルコールデヒドロゲナーゼを用いる方法或い
は放射性合成基質を用いて放射化学的に検出する方法な
どが挙げられる。
更に、発色或いは螢光合成ペプチド基質を用いる場合に
は、例えばＤ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｂｅ
ｎｚｏｙｌ−Ｐｒ。
−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣ
Ａ等を使用することができ、カリクレインの加水分解作
用によって生成した発色物質或いは螢光物質、例えばｐ
ＮＡ　（＋）−ニトロアニリン）或いはＡＭＣ（７−ア
ミノ−４−メチルクマリン）の量を分光学的に測定し、
カリクレイン活性を定量することができる。
第二次反応系において、ｐＨはカリクレインの至適活性
ｐＨ付近のｐＨ７，０乃至９．０が好ましく、反応温度
は同様に至適条件としての室温、即ち２０乃至４０℃の
範囲に設定することが好ましい。反応時間は、温度、ｐ
Ｈ１基質濃度等によって変動する。
従って、如何なる反応時間を設定することも可能である
が、測定操作上の観点より３０分以内程度が適当である
。
（実施例） 実施例１゜ 動物血漿として、ヒト血漿を用いた場合についての実施
例を以下に詳細に説明する。
（１）ヒトクエン酸油血漿の調整 健常な成人より常法に従い、ヒト血液：３．８％クエン
酸ナトリウム（９：１）となるように採血した後遠心分
離し、ヒトクエン酸油血漿（以下単にヒト血概という）
を上清として得た。
（２）第一次反応 ヒト血漿　　　　　　　　　　　０・１−カオリン懸濁
液　　　　　　　　０．５−但し、上記組成中、ヒト血
漿は第二次反応において１．６乃至２．２ｍ　Ｕのカリ
クレイン活性を示す濃度に生理食塩液で希釈したものを
用いた。尚、カリクレイン活性は第二次反応において１
μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／＋ａｅのｐ−ニトロアニリンを生
成する量をＩＵ（１，０００ｍＵ）として表した。
標準組成中、カオリン懸濁液の濃度は２．５■／−Ｃ５
０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０））　、０．４艷
混液の塩化ナトリウム濃度は０．２５Ｍで行った。
上記反応液を氷水浴中２０分間反応させた後、０．５−
のＬＢＴ　Ｔ溶液（４５１１Ｗ／ｍ乏・５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０））を加え反応を停止した。
或いは、０．２艷の反応液を採取して、０．１艷のＬＢ
ＴＩ溶液に加えてもよい。（以下これを第一次反応液と
する） （３）第二次反応 第−次反応液　　　　　　　　　０．１ｍ１合成基質　
　　　　　　　　　　０．１−緩衝液　　　　　　　　
　　　　０．２−但し、上記組成中、合成基質はＤ　−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡの４ｍＭ水溶液を、緩
衝液は１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用
いた。
反応に際しては、上記反応液を３０℃で２０分間反応さ
せた後、１％クエン酸０．８−を加え、必要に応じて遠
心分離して懸濁物を除去した後、ｐ−ニトロアニリンの
４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（４）第一次反応の至適ｐＨ 各種ｐＨに調整した５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液を用い
て第一次反応を行い、生成したカリクレイン活性を第二
次反応にて測定した結果、第一次反応におけるｐＨは７
．０乃至９．０の範囲、好ましくはｐＨ７，５乃至８．
５の範囲が至適であることが示された。
（５）第一次反応における至適塩化ナトリウム濃度第一
次反応において種々の濃度の塩化ナトリウム水溶液を用
いて第一次反応を行い、その後第二次反応により生成し
たカリクレイン活性を測定した結果、第一次反応におけ
る塩化ナトリウムの最終濃度は５０乃至２００ｍＭ、好
ましくは７５乃至１５０ｍＭが至適であることが示され
た。
尚、上記塩化ナトリウムの最終濃度は血漿中の塩化ナト
リウム量を換算せず、添加したもののみから算出した。
（６）第一次反応における至適カオリン濃度５０ｍＭ）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で種々の濃度に調整した
カオリン懸濁液を第一次反応に用い、生成したカリクレ
イン活性を第二次反応により測定した。その結果、第一
次反応においてカオリン濃度は最！８濃度１乃至３■／
ｍ１ｌ−好ましくは１．２５乃至２■／　ｉｌｌで行う
ことができる。
（７）第一次反応の反応時間 第一次反応を種々の時間行って生成するカリクレイン活
性を第二次反応により測定した。第一次反応は０乃至２
０分の間にて、反応時間とカリクレイン活性との間に直
線的な関係が成立する。従って、本実施例において、第
一次反応は２０分以内とすることができる。
（８）第一次反応におけるＬＢＴＴ量 第−次反応を０℃で２０分間行い、種々の濃度のＬＢＴ
Ｉ溶液を加えた後、該第−次反応液の０．１−を用いて
第二次反応を行いカリクレイン活性を測定した。
ＬＢＴＩは最終濃度４■／−以上で活性型ＦＸＩ［を完
全に阻害した。又、第二次反応におけるカリクレイン活
性へのＬＢＴＩの影響を調べたところ、ＬＢＴｌは第一
次反応最終濃度１５■７１見においても、カリクレイン
活性を低下させるような有意の影響は与えなかった。
（９）第一次反応液におけるヒト血漿の濃度ヒト血漿を
生理食塩液で適宜希釈して第一次反応を行い生成したカ
リクレイン活性を第二次反応により測定した。ヒト血漿
を１１５乃至１／１０希釈の範囲で用いた時、希釈率と
カリクレイン活性との間に直線的な関係が成立した。
（１０）第二次反応における基質濃度 第二次反応において種々の濃度の合成基質Ｄ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用い、前述のとおり３０℃で
２０分間反応させた結果、第二次反応におけるＫｍ値は
０．３４ｍＭであった。
（１１）第二次反応の酵素量 第二次反応の酵素Ｎ（即ち第一次反応液の量）を種々の
量で用いた場合の、酵素量とカリクレイン活性との関係
を調べた。第二次反応に用いる第一次反応液の量が０乃
至０．１−までの範囲でカリクレイン活性との間に直線
的な関係が成立した。
（１２）第二次反応の反応時間 第二次反応を種々の時間で行い、反応時間とカリクレイ
ン活性との関係を調べた。第二次反応においては０〜２
０分の間で、反応時間とカリクレイン活性との間に直線
的な関係が成立した。従って、本実施例においては第二
次反応は２０分以内とすることができる。
（１３）第二次反応の至適ｐＨ 種々のｐＨのトリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）を調整し
て第二次反応を行い、反応ｐＨとカリクレイン活性との
至適条件を調べた。第二次反応においてはｐＨ７，０乃
至９．０、好ましくはｐＨ７，５乃至８．５の範囲で行
うことができる。
実施例２゜ 動物血漿としてヒト血漿、活性型ＦＸＩ［の特異的阻害
剤としてＣＨＦ　Ｔ、カリクレインに対する特異的基質
としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いた実施例を以
下に示す。
ｆｉｌ第一次反応 第一次反応系は実施例１と同じものを用いた。
反応液を水浴中２０分間反応させた後、０．５社の３■
／−Ｃ）（Ｆｌ溶液（５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ　
Ｈ８，０，０℃）〕を加える。或いは、０．２−の反応
液を採取して、０．１ｄのＣＨＦＩＨＦ−加えてもよい
。（以下これを第一次反応液とする）（２）第二次反応 合成基質　　　　　　　　　　０．１２艷但し、上記組
成中、合成基質は螢光基質Ｚ　−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣ
Ａの１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液を用い、緩衝液
は１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用いた
。
反応に際しては、上記反応液を３０℃で２０分間反応さ
せた後、０．１Ｍ＃酸２−を加え、必要に応して遠心分
離して懸濁物を除去した後、７−アミノ−４−メチルク
マリンアミドの螢光（Ｅｘ３８０ｎｍ、　　Ｅｍ４６０
ｎ田）を測定した。
（３）実施例１と同様にして、第−次反応及び第二次反
応の条件を検討した。
その結果、第一次反応においては、反応停止時のＣＨＦ
　Ｔ濃度は２■／−以上で活性型Ｆ■を抑制できた。
本実施例の第一次反応は、反応の停止時にＣＨＦ■を用
いている部分のみが実施例１と異なっているので、その
他の条件は実施例１と同様であった。
第二次反応においては、その反応ｐＨはｐＨ７，０乃至
９．０、好ましくはｐＨ７，５乃至８．５の範囲であり
、合成螢光基質Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｍ−に対するＫｍ
値は約１ｍＭであった。
又、第二次反応時間とカリクレイン活性には０乃至３０
分の間に直線的な関係がみられたので、反応時間は３０
分以内に行うことができる。
実施例３゜ 動物血漿としてヒト凍結乾燥血漿を用いた実施例を以下
に示す。
（１）第一次反応 ヒト凍結乾燥血漿　　　　　　　０．１−カオリン懸濁
液　　　　　　　　０．５艷ヒト凍結乾燥血漿は蒸留水
にて溶解した後、第二次反応において１．６乃至２．２
ｍ　Ｕのカリクレイン活性を示す濃度に生理食塩液で希
釈したものを用いた。
カオリン懸濁液、塩化ナトリウム溶液、反応温度、反応
時間、反応停止操作などは実施例１と同様に行った。
（２）第二次反応は実施例１と同様に行った。
（３）実施例１と同様にして第−次反応及び第二次反応
の条件を検討した結果、ヒト凍結乾燥血漿を用いても、
新鮮ヒト血漿の場合と同様の条件で行なえることがわか
った。
実施例４゜ 動物血漿として、ラット血漿を用いた実施例を以下に示
す。
（１）ラットクエン酸血漿の調整 エーテル麻酔下のラット腹部大動脈より、３．８％クエ
ン酸ナトリウム：血液（１：　９）となるように採血し
た後、遠心分離してラット血漿を上清として得た。
（２）第一次反応 ラット血漿　　　　　　　　　　０．１．Ｉ１１カオリ
ン懸濁液　　　　　　　　０．５−但し、上記組成中、
ラット血漿は生理食塩液で３乃至５倍希釈液であり、カ
オリン懸濁液及び塩化ナトリウム水溶液は実施例１と同
様のものを用いた。
上記反応液を０℃で１５分間反応させた後、０．５−の
４５　ｍｇ／艷Ｌ　Ｂ　Ｔ　Ｉ溶液（５０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０））を加えた。
（３）第二次反応 実施例１と同様に行ったが、反応時間は３０分で行った
。
（４）実施例１と同様にして、第−次反応及び第二次反
応の条件を検討した。
その結果、第一次反応においては、ｐＨは７．０乃至９
．０、好ましくはｐ）ＴＬｏ乃至８．５の範囲で、塩化
ナトリウム水溶液は、０乃至１５０ｍＭ、好ましくは２
５乃至１２５ｍＭで、 カオリン懸濁液温度は、１乃至３．５■／−１好ましく
は１．５乃至３■／−で行うことができる。
又、反応時間と生成するカリクレイン活性はＯ乃至２０
分の間に直線的な関係が見出されたので、第一次反応は
２０分以内とすることが好ましい。
第二次反応においては、その反応ｐＨはｐＨ７乃至９の
範囲で至適であり、合成基質Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡに対するＫｍ値は０．２９ｍＭであった。
又、第２次反応時間とカリクレイン活性には０乃至６０
分の間に直線的な関係がみられた。従って、第二次反応
は６０分以内に行うことができ、操作上は３０分程度が
好ましい。
実施例５゜ デキストラン硫酸（分子量約５０万）をＦ）ｌｆｆｌ活
性化剤として用いた実施例を以下に示す。他の条件は実
施例１と同様に行ったが、動物血漿としては、新鮮ヒト
血漿及びヒト凍結乾燥血漿を用いた。
（１１デキストラン硫酸濃度は最終濃度１乃至５μｇ／
ｍｌ、好ましくは１．５乃至３μｇ／艷で行うことがで
きる。
（２）第一次反応における塩化ナトリウム濃度を種々に
変えて行ったところ、最終濃度５０乃至８５ｍＭ、好ま
しくは７０乃至８０ｍＭが至適であることが示された。
（３）第一次反応の反応時間に関しては、４乃至２０分
の間にて反応時間とカリクレイン活性との間に直線関係
が成立した。
（４）第一次反応の至適ｐＨを検討した結果、ｐＨ７，
８乃至８．３で行うのが好ましいことが示された。
以上のように、ＦＷ活性化剤としてカオリン懸濁液の代
わりにデキストラン硫酸を用いても、本発明測定法を実
施できる。
実施例６．〔ブラジキニン遊離抑制作用の検定〕本発明
反応系において、被検薬により発癌・起炎物質ブラジキ
ニンの産生が抑制されているかを調べた。
ブラジキニンの分解を抑えるため、実施例１の第一次反
応系にキニナーゼ活性阻害剤。−フェナントロリンを共
存させた。ブラジキニンはカオリンに吸着する性質があ
り、従って、第一次反応終了後、Ｆ■活性化剤として添
加したカオリンに吸着した分のブラジキニンを抽出する
ため、アセトンを最終濃度５０％になるように第一次反
応液に加えた。
ブラジキニン量はラジオイムノアッセイ法により測定し
た。即ち、上記のように調整した抽出ブラジキニンの試
料２００μｌとアッセイ用緩衝液（０，１％ゼラチン−
７ｍＭ塩化カルシウム−〇、０１％Ｔｗｅｅｎ２０−０
．０２％アジ化ナトリウム含有トリス−酢酸緩衝液ｐＨ
８，５）　２００ＩＪＡＳ”’Ｉ−Ｔｙｒ−ブラジキニ
ン（約５０、ＯＯＯｃｐｍ／ｍｌ）　２００．ｃｌ　１
．及び１　／１５’、０００希釈ウサギ抗ブラジキニン
抗血清２００μｌを加え、４℃で４８時間反応させた。
次いで、正常羊血清２００μｌ及びデキストラン硫酸被
覆活性炭溶液５００μβを加え、４℃でさらに３０分間
反応させ、遠心分離して上清を除去した後、ガンマ−カ
ウンターにて放射線量を測定し、試料の代わりにブラジ
キニン標準液を用いて同様に得られた検量線から試料中
のブラジキニン量を求めた。
結果の一例を第２閏に示す。
（作用） 実施例１の反応系を用いて、インドメタシン、ケトプロ
フェン、モルヒネ、アミノピリン等の各ｉ　６３痛剤の
カリクレイン生成阻害活性を測定した。尚、これらの被
検薬は中性付近の水溶液に調製して使用した。
結果の一例を第１図に示す。第１図より明らかなように
、鎮痛作用の一因がブラジキニンの遊離抑制作用である
インドメタシンやケトプロフェンは本発明測定法により
顕著なカリクレイン生成阻害作用が観察されたが、中枢
神経系に作用する鎮痛剤であるモルヒネやアミノピリン
はカリクレイン生成阻害作用をほとんど示さなかった。
さらに、本発明測定系において、最終生成物である発癌
・起炎物質ブラジキニンの被検薬による遊離抑制作用を
調べた結果の一例を第２図に示す。
第２図より明らかなように、第１図で顕著なカリクレイ
ン生成阻害作用を示した薬剤は、同様に優れたブラジキ
ニン遊離抑制作用を有することが示された。
以上のように、カリクレイン生成阻害（第１図）とブラ
ジキニン遊離抑制（第２図）とは良く相関関係を示し、
従って、本発明測定法はカリクレイン−キニン系に関与
する生理活性物質の測定法として信幀性が高いものであ
る。
（効果） 前記の測定結果より、本発明の生理活性物質想定法は、
カリクレインの生成に影響を及ぼす物質、例えばブラジ
キニン遊離抑制作用を有する物質等の測定法として有用
であることが明らかに示される。
本発明の反応系は複雑な一連の酵素反応を利用し、従っ
て、種々の酵素が必要とされるものであるが、酵素源と
して動物血漿或いはその凍結乾燥血漿を用いることによ
り、必要とされる一連の酵素の分離精製という、捲めて
煩雑で時間を要する準備段階を不用とすることができる
ので、この点において非常に有利なものである。又、本
発明の反応系は一連の酵素反応を利用しているものであ
るから、被検薬として用いる生理活性物質の作用点が多
数存在し、従って、本発明の反応系を利用することで、
多観点からみた生理活性物質のスクリーニングを同時に
、且つ簡便に行うことができる。
前述のようにカリクレイン・キニン系は種々の酵素系に
密接な関連を有し、様々な生体制御機能に関わっている
ので、例えば、アラキドン酸カスケードにより生成する
プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン
等による生理作用の調整物質、レニン・アンジオテンシ
ン系と関連した血圧調節作用物質、血液凝固系、線溶系
に対する調整物質、さらには生成物であるプラディキニ
ンの生理作用を調整する物質、例えば抗炎症物質、鎮痛
物質、抗アレルギー物質等の測定法として本発明の反応
系は極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明測定法よって種々の鎮痛剤のカリクレイ
ン生成阻害活性を測定した結果を示したグラフであり、
第２図は本発明測定系におけるブラジキニン遊離抑制作
用を調べた結果を示したものである。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）血漿中の血液凝固第ＸII因子を活性化することに
    より血漿中のプレカリクレインをカリクレインに変換さ
    せ、生じたカリクレインを定量することを特徴とする生
    理活性物質の測定法。
  2. （２）動物血漿、 血液凝固第ＸII因子活性化剤、 電解質、 被検薬、 から成る溶液を混合反応させ、次いでカリクレイン活性
    に実質的に無影響で活性型血液凝固第ＸII因子活性のみ
    を特異的に阻害する阻害剤を加え、生成したカリクレイ
    ンの活性を定量することを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載の生理活性物質想定法。
  3. （３）動物血漿、 血液凝固第ＸII因子活性化剤、 電解質、 被検薬、 から成る溶液を混合反応させた後、カリクレイン活性に
    実質的に無影響で活性型血液凝固第ＸII因子活性のみを
    特異的に阻害する阻害剤を加え、次いでこれを、 カリクレインに対する基質、 緩衝液、 から成る溶液と混合反応させ、生成したカリクレインに
    よる分解産物を定量することによる特許請求の範囲第２
    項記載の生理活性物質測定法。
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