DE2740323A1 - Verfahren zur bestimmung von bakteriellem endotoxin sowie dazu verwendete reagenzien - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von bakteriellem endotoxin sowie dazu verwendete reagenzien

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DE2740323A1 DE19772740323 DE2740323A DE2740323A1 DE 2740323 A1 DE2740323 A1 DE 2740323A1 DE 19772740323 DE19772740323 DE 19772740323 DE 2740323 A DE2740323 A DE 2740323A DE 2740323 A1 DE2740323 A1 DE 2740323A1
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Description

DR. E. WIEGAND D1PL-:NG. W. ΝΙΞΜΑΝΝ DR. M. KOHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT
TELEFON: 55547« 8000 M 0 N CH E N 2, TELEGRAMME: KARPATENT MATHUDENSTRASSE 12 TELEX: 529OiIKARPD „non
7. September 1977
Vi. 42 975/77 - Ko/Li
Seikagaku Kogyo Co., Ltd. Tokyo (Japan)
Verfahren zur Bestimmung von "bakteriellem Endotoxin sowie dazu verwendete Reagenzien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines "bakteriellen Endotoxins (in der vorliegenden Anmeldung häufig abgekürzt als "Endotoxin") unter Verwendung eines Amöbozytenl3Tsats von Königekrabben und/oder eines aus dem Lysat abgetrennten Pro-Gerinnurigssysteus und eine dazu verwendete Kombination von Reagenzien. Gemäß der Erfindung können verschiedene Vorteile,beispielsweise verbesserte Zuverlässigkeit, verbesserte Messeopfindlichkeit,
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Einfachheit der Messung und rasche Meßbarkeit gegenüber üblichen Verfahren zur Endotoxinbestimraung unter Verwendung des obigen Lysats oder Enzyms erreicht werden und die Messempfindlichkeit der üblichen Verfahren, die bei etwa 10**5 bis 10 yug/ml liegt, kann auf etwa 10 bis 10 yug/ml erhöht werden.
Königskrabben sind Wassertiere, die zum Stamm Arthropoda, der Klasse Merostomata, Unterklasse Xiphosurida der Ordnung Limulidacea gehören und sind wissenschaftlich als lebende Possile interessant. Zu den lebenden Spezies gehören Ein-Genus-ein-Species (Limulus Polyphemus) längs der Atlantikküste der U.S.A. und Zwei-Genus-drei-Species in nähe der Südostkv.ste des asiatischen Kontinents einschließlich Japan, China, Malaysia und Philippinen. In Japan bewohnt die japanische Königskrabbe (Tachypleus tridentatus) einen Teil der Seto-Binnensee und einen Teil des nördlichen Kyushu.
Das Kreislaufsystem der Königskrabbe ist ein offenes Gefäßsystem und sein Blut enthält Amöbozyten. Es ist bekannt, daß wenn ein Gram-negatives Bakterium oder ein Endotoxin zu einer Suspension von Amöbozyten in einem Puffer zugegeben wird, Körnchen in den Amöbozyten bald verschwinden und die Amöbozyten aus ihrer Porm herausgehen und schmelzen und in der Zwischenzeit werden die Zellen oder das Endotoxin von einem faserförmigen Gel umgeben. Dieses Phänomen ist eine Körperabwehrreaktion der Königskrabbe und ist als eine übliche Art von Königskrabben unabhängig von ihrer Spezies bekannt. Ein durch Behandlung der Amöbozyten mit einer hypotonischen Lösung erhaltener Extrakt (als "Amöbozytenlysat" be-
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zeichnet) bildet ein Gel durch Reaktion mit einer sehr geringen Menge (etwa 10""' bis 10"4 /ug/ml)Endotoxin. Methoden zur MikrobeStimmung von Endotoxin unter Verwendung des Gelphänomens, das bei der Reaktion des Amöbozytenlysats von Königskrabben mit einer sehr geringen Menge Endotoxin auftritt, wurden entwickelt und kamen bereits auf dem Gebiet der Medizin, pharmazeutischen Wissenschaft und Umgebungshygiene zur Anwendung. Es wurde weitgehend festgestellt, daß eine recht hohe Beziehung zwischen den gemessenen Wert an Endotoxin unter Verwendung einer Gelreaktion zwischen den Amöbosytenlysat und einem Endotoxin (insbesondere ein Endotoxin eines Gram-negativen Bakteriums) und dem gemessenen Wert eines Pyrogentests unter Verwendung beispielsweise von Kaninchen besteht, wenn das verwendete Pyrogen ein Endotoxin ist. Diese Tatsache wurde beispielsweise in einem vorläufigen Teil des Pyrogentests oder in der Qualitätskontrolle bei der Herstellung injizierbarer Pharmazeutika zur Verhinderung eines durch die Verunreinigung von Pharmazeutika durch Pyrogen verursachten Pyrogenunfalls verwendet.
Bekannte übliche Methoden zur Bestimmung von Endotoxinen unter Verwendung des Amöbozytenlysats von Königskrabben umfassen ein Verfahren, bei dem die Harte des als Ergebnis der Gelreaktion gebildeten Gels visuell durch das bloße Auge bewertet wird, ein Verfahren, bei dem die Gelbildingszeit gemessen wird, ein Verfahren, bei dem Veränderungen der Trübung unter Anwendung eines Trübungsmessers ermittelt wird (beispielsweise in II. S. Young et al. J. Ciin. Invest: 11,1790 (1972) und E. T. Yin et al. B.B.A. 26I-, 284 (1972) beschrieben) und eine Methode zur Bestimmung von Gerinnungsprotein (beispielsweise in M. Niwa et
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al. Jpn. J. Med. Sei. Biol. 22, 108-111 (1974) beschrieben), wobei die erste Methode die am häufigsten angewendete ist. Da diese bisherigen Methoden sämtlich das Gelbildungsphänomen ausnutzen, haben sie den Nachteil, daß der Endpunkt der Gelbildung oder Flockung schwierig zu bewerten ist. Die Schwierigkeit wird erhöht, wenn die Versuchsprobe eine hohe Viskosität aufweist. Die Messempfindlichkeit von Endotoxin durch diese üblichen Me-
-3 -4. / thoden ist höchstens etwa 10 J bis 10 yug/ml obgleich
sie beispielsweise gemäß der Aktivität des Amöbozytenlysats, der Art des Endotoxins und der Mittel und des Standards der Bewertung variiert, und es war erwünscht, eine Bestimmungsnethode mit höherer Empfindlichkeit zu entwickeln.
Diese bisherigen Techniken sind hinsichtlich der Empfindlichkeit, Schnelligkeit und Einfachheit gegenüber der Methode der Bestimmung von Endotoxinen durch einen Ityrogentest oder Test mit tödlichem Ausgang unter Verwendung eines Versuchstieres vorteilhaft. Da sie jedoch auf die direkte oder indirekte Bestimmung des Gelierungsgrades bezug nehmen, können sie praktisch keine Verzögerung oder Inhibierung der Gelierung in Gegenwart eines Gelierungsinhibitors in der Versuchsprobe oder eine Beschleunigung der Gelierung in Gegenwart einer bestimmten Protease in der Versuchsprobe verhindern.
Es wurden nun auf den Gelierungsmechanisraus des Amöbozytenlysats von Königskrabben hin gearbeitet und gefunden, daß ein Endotoxin mit überlegener Zuverlässigkeit und sehr hoher Empfindlichkeit aufgrund eines neuen Mechanismus ermittelt und bestimmt werden kann, der erheblich von dem in den bekannten Methoden angewendeten Gelierungsphänomen abweicht.
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Die hier vorgenommenen Untersuchungen führten zu der Peststellung, daß, wenn (A) ein Material aus einem Amöbozytenlysat von Königskrabben und/oder ein aus dem Lysat abgetrenntes Pro-Gerinnungsenzym und (B) ein Substrat vom Peptidtyp einer spezifischen Struktur mit einer Versuchsprobe kontaktiert wird, ein spezifischer Endstrukturteil des Substrats (B) durch enzymatische Hydrolyse freigesetzt wird, wenn die Versuchsprobe ein Endotoxin enthält und daß die Menge des freigesetzten Endteiles mit zunehmender Menge an in der Versuchsprobe vorliegendem Endotoxin erhöht wird. Es wurde auch festgestellt, daß die durch diese Hydrolyse freigesetzte Substanz ermittelt und bestimmt werden kann und die Messempfindlichkeit so gut ist, daß es möglich ist, eine sehr geringe Menge (etwa 10" bis etwa 10 /ug/ml) eines Endotoxins zu ermitteln und zu bestimmen.
Es wurde auch gefunden, daß das Substrat vom Peptidtyp (B) eine Struktur aufweisen muß, in der L-Aminosäurei in der Reihenfolge Arginin (Arg) und Glycin (GIy) beginnend am C-Ende des abzutrennenden Endteils verbunden sind und daß das Substrat vom Peptidtyp (B) dieser spezifischen Struktur in Gegenwart eines Endotoxins auf da3 in dem Amöbozytenlysat
vorliegenden
der Königskrabbe/oder daraus abgetrennten Pro-Gerinnungsenzym einwirkt und spezifisch enzymatischer Hydrolyse durch das erzeugte aktive Enzym unterliegt und somit den Endteil freisetzt. Es wurde auch gefunden, daß die Menge des freizusetzenden Endteils eine gute Beziehung mit der Menge des Endotoxins innerhalb eines bestimmten Bereichs zeigt und die Menge des freigesetzten Endteils proportional zu der Erhöhung des Endotoxingehalts ansteigt. Es wurde auch gefunden, daß, da nur das Pro-Gerinnungsenzym in Gegenwart von Endotoxin quantitativ
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aktiviert wird und an der Abspaltung des Endteils des Substrats vom Peptidtyp (B) beteiligt ist, daß Endotoxin In einfacher Weise ermittelt und bestimmt werden kann, ohne irgendeine nachteilige Auswirkung anderer Proteasen und/oder Esterasen, die in dem Amöbozytenlysat oder dem aus dem Lysat abgetrennten Enzym vorliegen können oder anderen Proteasen und/oder Esterasen, die in der Versuchsprobe vorliegen können.
Der detaillierte Mechanismus der Aktivierung des Pro-Gerinnungsenzyms ist nicht vollständig geklärt, jedoch wird angenommen, daß das Pro-Gerinnungsenzym (ein Amidasenvorläufer und/oder ein Esterasenvorläufer) in dem Amöbozytenlysat durch den Einfluß von Endotoxin aktiviert wird und somit in ein Gerinnungsenzym überführt wird (amidasenähnliche Substanz und/oder esterasenähnliche Substanz) und daß das aktivierte Enzym selektiv auf den Endteil des Peptidsubstrats (B) der angegebenen Struktur unter dessen Abspaltung und Freisetzung einwirkt.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher In einem überlegenen Verfahren zur Ermittlung und/oder Bestimmung von Endotoxinen unter Verwendung des Amöbozytenlysats von Königskrabben und/oder eines aus dem Lysat abgetrennten Pro-GerInnungsenzyms.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in einer Kombination von in diesem Verfahren verwendeten Reagenzien<
Die obigen und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich im einzelnen aus der nachfolgenden Beschreibung.
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Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung eines bakteriellen Endotoxins angegeben, bei dem eine Versuchsprobe mit (A) einem Material bestehend aus einem AmSbozytenlysat von Königskrabben und/oder einem aus dem Lysat abgetrennten Pro-Gerinnungsenzym und (B) einem Substrat vom Peptidtyp der Formel:
R1 - GIy - Arg - R2 (1)
worin R^ einen L-Amlnosäureanteil-dessen N-Ende durch eine Schutzgruppe geschützt ist, einen Peptidsnteil bestehend aus einer L-Amlnosäure und die durch eine Schutzgruppe an Ihrem N-Ende geschützt ist, einen durch D-Aminosäuresubstituierten L-Aminosäureanteil und/oder einen durch D-Aminosäure substituierten Peptidanteil bestehend aus einer L-Amlnosäure und wobei der Rest R1 mit der Amlnogruppe des Glycinanteils, ausgedrückt als GIy, durch eine Peptidblndung verbunden ist und R2 einen Anteil darstellen, der mit dem C-Ende eines L-Argininanteils, ausgedrückt durch Arg, durch eine Säureamldblndung und/oder eine Esterblndung verbunden ist und in Gegenwart des Materials (A) und des Endotoxins zur Freisetzung von R2H enzymatisch hydrolysiert werden kann und/oder deren Mineralsäuresalz kontaktiert wird, das er haltene R2H, wobei R2 die oben angegebene Bedeutung besitzt, ermittelt wird und gegebenenfalls bestimmt wird und ein Reagenz zum Nachwels oder zur Bestimmung eines Endotoxins, das eine Kombination der Bestandteile (A) und (B) aufweist.
Das gemäß der Erfindung verwendete AmSbozytenlysat von Königskrabben kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, bei dem Im Blut von Kcnlgskrabben enthaltene Amöbozyten alt einer hypotonischen Lösung behandelt
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wird (z.B. E.T. YIn et al B.B. A. 261, 284 (1972) und S. NakaiBura et al J. Biochera. 80, 1011-1021 (1976)). Es ist auch im Handel erhältlich unter den eingetragenen Warenzeichen Pregel (Teikoku Hormone Co., Ltd., Japan) Pyrotest (Difco Rabo., USA), Pyrogent (Mallinckradt Che*. Yorks, USA), Pyrostat (Worthington, USA), LAL (Haemachem, USA) und Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Microbiological Associates, USA).
Das erhaltene Am&bozytenlysat kann einem Verfahren unterworfen werden, wie beispielsweise Säulenchromatographie, Elektrophorese, isoelektrische Fraktionierung (Elektro-Fokusslerung, eine Handelsbezeichnung LKB), Affinitätschromatographie oder Gelfiltration zur Abtrennung des Pro-Gerinmmgsenzyms in dem Lysat. Der Trennungsvorgang ist beispielsweise in N.S. Young et al, J. Clin. Invest, «ü, 1790 (1972), J.S. Salivan et al, B.B.R.C. 66, 848 (1975), J.Y. Tai et al, J. Biol. Chem. 252. 2178 (1977) und S. Nakamura et al, J. Biochem. 80, 1011 (1976) beschrieben und kann zur Herstellung des gemäß der Erfindung eingesetzten Pro-Gerinnungsenzyms verwendet werden.
Wenn das in dem Amöbozytenlysat enthaltene gerinnbare Protein unter Verwendung eines Gelfiltrationsverfahrens entfernt wird, kann die Empfindlichkeit der Probe auf wenigstens das Zehnfache erhöht werden.
Beispiele für die Schutzgruppe an R1 im Substrat vom Peptidtyp (B) gemäß der Formel (1) sind a-N-Benzoylgruppen, a-N-Carbobenzoxygruppen, K-tert.-Butoxycarbonylgruppen und p-Toluolsulfonylgruppen. Spezifische Beispiele für R1 sind Bz-Ile-Glu(-Y-OHe)-, Z-Ile-Glu (-γ-OMe)-, Tos-He-Glu-, Z-Ile-Glu-, Bz-VaI-, Boc-Val-Leu-, Bz-VaI-Leu-, (D-Aminosäureanteil )-Ile-Glu-(-Y-OMe)-, (D-Amino-
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-y-
säureanteil)-Val-Leu-, Bz-Val-Ser- und D-(Aminosäureanteil )-Ser-Gly-Val-Ser-Gly-Arg-, In den obigen und anderen Beispielen dieser Anmeldung bedepten Bz eine Benzoylgruppe·, Z eine Carbobenzoxygruppe> Boc eine tert.-Butoxycarbonylgruppe-, Tos eine p-Toluolsulfonylgruppe·, Me eine Methylgruppe·, He L-Isoleucin·, GIu L-Glutaminsäure·, VaI L-Valin·, Ser L-Serin und Leu L-Leucin.
R2 in dem Substrat (B) vom Peptidtyp der Formel (1) ist eine Schutzgruppe für das C-Ende des L-Argininanteils,ausgedrückt als Arg und 1st mit dem C-Ende durch eine Säureamidbindung und/oder eine Esterbindung verbunden. In Gegenwart der Komponente (A) und des Endotoxins unterliegen die Säureamidbindung und/oder Esterbindung der Einwirkung der enzymatischen Hydrolyse und der Freisetzung von R2H. Nach dem Verfahren der Erfindung kann die Anwesenheit oder Abwesenheit (wenn R2H nicht freigesetzt wird) eines Endotoxins durch Feststellung des freigesetzten RpH ermittelt werden. Die Menge des Endotoxins kann durch Bestimmung der Menge des R2H festgestellt werden. Somit kann R2 eine Einheit darstellen, die in der Lage ist, die Feststellung und/ oder Bestimmung des freigesetzten R2H zu ermöglichen. Jede beliebige Spezies von R2, die beispielsweise durch physikalische oder chemische Mittel wahrgenommen werden kann, kann zur Verwendung gemäß der Erfindung ausgewählt werden. Ein geeignetes Anzeigemittel ist ein solches, injdem ein R2 verwendet wird, das zur Erzeugung von chromogenem R2H befähigt ist, und die Anwesenheit und Menge von R2H wird durch optische Mittel bestimmt, wie beispielsweise die Messung der Absorptionsfähigkeit. Beispiele für R2, das zur Verwendung in diesem Verfahren geeignet ist, sind eine p-Nitroanilidgruppe (PNA), die eine Verbindung R2H erzeugt, welche eine gelblich-orange
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Farbe bildet, ein 5-Nitro-a-naphthylamid (5-NNA), das eine Verbindung R2H erzeugt, die eine orangegelbe Farbe bildet und ß-Naphthylamid (U-NA), oc~ Naphthylester (cc-NE), ß-Naphthylester (ß-NE), Indoxylester (INDE), N-Methylindoxylester (MINDE), (A-Methyl)umbelliferylester und Resorfinester, welche Fluoreszenzverbindungen R2H erzeugen.
Beispiele für geeignete Substrate (B) vom Peptidtyp der Formel (1) sind:
Bz-IIe-GIu(Y-OMe)-GIy-Arg-PNA, Tos-Ile-Glu-Gly-Arg-PNA,
Boc-Val-Leu-Gly-Arg-PNA,
Bz-Val-Gly-Arg-PNA,
Bz-Val-Ser-Gly-Arg-5-NNA,
Bz-Val-Leu-Gly-Arg-ß-NA,
Tos-Ile-Glu-Gly-Arg-ß-NE,
Boc-Val-Gly-Arg-INDE,
Z-Val-Leu-Gly-Arg-4-Methylumbelliferylester Bz-Val-Ser-Gly-Arg-Resorfinester und D-Val-Ser-Gly-Val-Ser-Gly-Arg-MINDE;
Einige dieser Substrate (B) sind im Handel erhältlich und einige können durch eine Kombination üblicher Peptidsynthetisierungsmethoden hergestellt werden. Grundsätzlich können sie beispielsweise durch folgende zwei Methoden hergestellt werden. Eine Methode ist eine stufenweise Methode,die darin besteht, daß eine Verbindung von R2 in Formel (1) mit Arg gekuppelt wird und dann aufeinanderfolgend GIy und andere Aminosäurereste gekuppelt werden. Die andere Methode besteht darin, daß ein Aminosäureaufbau der gewünschten Peptidstruktur stufenweise gebildet wird und schließlich eine Verbindung R2 mit dem C-Ende von Arg der Peptidstruktur gekuppelt wird«
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Beispiele geeigneter Kupplungsmethoden sind die DCC-Methode, entwickelt von J.C.Sheehan et al [Jacs ZZ» 1067 (1955) und Jacs, TjJ, 1367 (1956)] und deren Verbesserung, eine gemischte Säureanhydridmethode, die darin besteht, daß ein Säureanhydrid von Äthylchlorcarbonsäure oder Isobutylchlorcarbonsäure mit einer Aminosäure gebildet wird und die Aminkomponente kondensiert wird und die HOSu-DCC-Methode, die darin besteht, daß eine Säurekomponente mit N-Oxysuccinimid unter Bildung von N-Oxysuccinimidester umgesetzt wird und durch Zugabe einer Aminkomponente und DCC- kondensiert wird.
Die Guanidingruppe von Arg kann durch eine Nitrogruppe geschützt werden·, die -OH-Gruppe von Ser durch eine Benzylgruppe und die γ-Carboxylgruppe von Glutaminsäure als ein Methylester oder ein Benzylester.
Die Messung durch optische Mittel, wie oben beschrieben, basiert auf der Tatsache, daß das durch enzymatische Hydrolyse gebildete R2H ein ganz verschiedenes Absorptionsspektrum von dem des Substrats (B) aufweist. Diese Meßmethode hat sich in den letzten Jahren erheblich entwickelt als eine Untersuchungsmethode für Enzyme unter Verwendung homogener Substrate (New Method for the Analysis of Coagulation Using Chromogenic Substrates: Proceedings of the Symposium of the Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie, Titisee, Breisgan, Westdeutschland, Juli 1976, herausgegeben von I. Witt Walter de Gruyter, Berlin, New York 1977).
Die Meßmethode ist in größeren Einzelheiten unter
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- yr-
Bezugnahme auf die Verwendung von Bz-Ile-Glu(-y-OMe)-Gly-Arg-PNA.HCl als ein Substrat beschrieben.
Dieses Substrat besitzt ein Absorptionsmaximum mit einem molekularen Extinktionskoeffizienten von 12 bei 316 nm und seine Absorption in der Nähe von 405 nm ist nicht klar und ist sehr klein. Andererseits besitzt p-Nitroanilin, das aus dem Substrat durch enzymatische Hydrolyse gebildet und freigesetzt wurde, ein Absorptionsmaximum mit einem molekularen Extinktionskoeffizienten von 13 200 bei 380 nm und eine klare und große Absorption mit einem molekularen Extink tionskoeffizienten von 9 <J20 bei 405 nm. Somit wird die Menge des p-Nitroanilins durch die spektrophotometrische Methode bei 405 nm gemessen und bestimmt; und die Menge des Endotoxins proportional zu der Menge des p-Nitroanilins kann leicht unter Anwendung einer Standardkurve (Eichkurve), die vorher unter Verwendung einer Standardprobe, die einen bekannten Gehalt an Endotoxin aufwies, hergestellt wurden, bestimmt werden.
Die folgenden Verbindungen mit Fluoreszenz, die durch enzymatische Hydrolyse erzeugt werden, können durch ein übliches Fluoreszenzspektrophotometer unter Auswahl der Erregungswellenlänge (ex.) und Messung der Wellenlänge (em.), wie in der nachfolgenden Tabelle angegeben, bestimmt werden.
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Verbindung
AS
Strukturformel
Erregungs- MeßwellenlMnge Yfellenlänge (ex., nm) (em., nm)
ß-Naphthylamin
α-Naphthol
NH,
OH
335 330
410
46o _
ß-Naphthol
OH
330
410
Indoxyl
N-Methylindoxyl
4-Methylumbelliferon
oh
CH3
CH3 OH
395 430 330
470
500
450
Resorfin
540
580
Diese optischen Mittel können im sichtbaren Bereich, dem Ultraviolettbereich, dem Fluoreszenzbereich und dergleichen, je nach der Auswahl der durch R2H ausgedrückten Verbindung verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in näheren Einzelheiten.
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Herstellungsbeispiel 1
Herstellung des Amöbozytenlysats:
Etwa 100 ml einer hämolymphatischen Flüssigkeit wurden aus Tachypleus tridentatus (Körpergewicht etwa 2 kg), eine Japanische Königskrabbe, gemäß der in der Japanischen Patentveröffentlichung 40131/76 angegebenen Methode unter strikter Vermeidung von Verunreinigung extrahiert. Die Amöbozyten wurden durch Zentrifugalabtrennung abgetrennt und mit einer 3%igen wäßrigen Natriumchloridlösung unter Erhalt von Amöbozytenkügelchen gewaschen. Zu den Amöbozytenkügelchen wurde destilliertes Wasser oder ein Puffer (tris-HCl, 0,05 M*, CaCl2, 0,001 Mf NaCl 0,15 M; pH 7,2) in einer Menge von 1/10 des Volumens der hämolymphatischen Ausgangsflüssigkeit zugegeben. Das Gemisch wurde in einem sterilisierten Homogenisator gut gerührt, gefroren und geschmolzen und dann 15 min bei einer Geschwindigkeit von 5000 Upm unter Bildung des Amöbozytenlysats Tachypleus (ALT) zentrifugiert.
Herstellungsbeispiel 2
Die hämolymphatische Flüssigkeit von Limulus polyphemus, eine in USA auftretende Königskrabbe,wurde in der gleichen Weise, wie in Herstellungsbeispiel 1, zur Erzielung eines Amöbozytenlysats Limulus (ALL) behandelt. Das ALL wurde unter Verwendung von Sephadex G 50 nach der Methode von N.S. Young, J.Clin. Invest., £1., 1790 (1972) unter Bildung einer Fraktion I gelfiltriert, die einen Amidasenvorläufer (ALL-FI) enthielt.
Beispiel 1 Ein Endotoxin von Salmonella minesota R 595, herge-
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stellt nach der Methode von H. Niwa et al., Japan J. Med. Sei. Biol. 26, 20 (1973) ließ man auf ALT und ALL aus Königskrabben, erhalten in den Herstellungsbeispielen 1 und 2, einwirken und die Wirksamkeit der erhaltenen Amidase wurde unter Verwendung verschiedener synthetischer Substrate gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben. Die Methode zur Messung der Wirksamkeit der Amidase auf ALT und ALL war wie folgt:
Ein Gemisch, bestehend aus 0,8 ml 0,1 mM synthetischem Substrat,gelöst in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 50 μΐ 0,5 M MgCl2 und 20 μΐ 0,1 #iger> Endotoxinlösung wurde bei 370C 3 min präinkubiert. Dann wurden 5 bis 20 μΐ des Lysats zugegeben und gut gemischt. Das Gemisch wurde bei 370C während 15 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μΐ Eisessig zur Bestimmung der Reaktion zugegeben. Die Absorption des erhaltenen p-Nitroanilins bei 405 nm wurde gemessen.
Tabelle I zeigt die Menge des p-Nitroanilins in η-Mol, berechnet aus der Absorption und dessen relative Menge in %, wobei die Menge des mit Bezug auf das Bz-IIe-Glu(-Y-OMe)-Gly-Arg-PNA-Substrat ermittelten p-Nitroanilins als 100 angenommen wurde.
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Tabelle I
Nr. Substrat ALT Relat.
Wirk
samkeit
(#) 		ALL Relat.
Wirk
samkeit
<*>
1 Bz-Ile-Glu(-γ-OMe)-GIy-
Arg-PNA 		Menge
(n-Mol) 		100 Menge
(n-Mol) 		100
2 Tos-Ile-Glu-Gly-Arg-PNA 17,7 41 4,4 318
3 Boc-Val-Leu-Gly-Arg-PNA 7,3 62 14,1 431
4 Bz-Val-Gly-Arg-PNA 11,0 70 19,1 227
VJl Bz-Phe-Val-Arg-PNA 12,4 3 10,1 5
6 Z-Gly-Pro-Arg-PNA 0,5 3 0,2 9
7 H·D·Phe-Pig-Arg-PNA 0,5 - 0,4 6
θ H·Glu-Gly-Arg-PNA - < 1 0,3 <3
9 H«D Val-Leu-Arg-PNA < 0,1 < 1 ^0,1 <3
10 H»D Val-Leu-Lys-PNA 4.0,1 <1 <0,1 <3
11 HO Pro-Phe-Arg-PNA <0,1 <1 ^0,1 <3
<0,1 <0,1
Die in Tabelle I gezeigten Substrate 1 und 2 sind spezifisch für den Blutkoagulierfaktor Xa und sind sehr interessant im Hinblick auf die Tatsache, daß sie auch spezifisch für Amidase sind, was sich aus der Aktivierung eines Amöbozytenlysats von Königskrabben durch ein Endotoxin ergibt. Das synthetische Substrat 3 ist ein Substrat, das im Hinblick auf die Aminosäureanordnung ... Asp-Glu-Pro-Gly-Val-Leu-Gly-Arg- ... (Α-Kette) an der durch ein Gerinnungsenzym bewirkten Spaltstelle von. Koagulogen synthetisiert wurde. Das synthetische Substrat 4 ist ein Substrat für Urokinase. Die Substrate 5, 6 und 7 sind Substrate für α-Thrombin und haben keine wesentliche Aminosäurestruktur gemäß der vorliegenden Erfindung. Das synthetische Substrat 8 erfüllt nicht das Erfordernis des R1-Anteils des gemäß der Erfindung verwendeten Bestandteils (A). Die synthetischen Substrate 9 und 11 sind für
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Kallikrein und das synthetische Substrat 10 ist für Plasmin. Diese Substrate 9 bis 11 unterliegen nicht den Einflüssen von Enzymen in einem Blutkoagulierungs-Fibrinolysesystem und können daher die Wahrnehmung und Bestimmung eines Endotoxins durch ein Gelierungsphänomen ermöglichen, wobei ein Amöbozytenlysat von Königskrabben ohne den Nachteil der bisherigen Methoden (die Anwesenheit verschiedener im Blut vorliegender Enzymsysteme verursacht eine nicht spezifische Gelierung des Amöbozytenlysats, was wiederum zum Versagen des Nachweises und der Bestimmung des Endotoxins führt) und dio Bestimmung eines Endotoxins in Proteasepräparaten verwendet werden.
Beispiel ?.
Unter Verwendung von ALT, das Endotoxin von Salmonella minesota R 595 und Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-PNA wurde die Beziehung zwischen der Konzentration des Endotoxins und der Absorption des erhaltenen PNA untersucht. Tabelle II und Fig. 1 zeigen die Absorption von PNA bei einer Substratkonzentration von 0,05 mM,nachdem das Reaktionsgemisch 15, 30 und 60 min inkubiert worden war.
Tabelle II
Konzentration Absorption von PNA nach einer Inkubations 60 min
an Endotoxin zeit von 0,38
^g/ml) 15 min 30 min 0,38
1 0,38 0,38 0,37
10"1 0,34 0,37 0,35
ΙΟ"2 0,23 0,34 0,30
10"3
■		 0,07 0,25 0,18
10"4 0,01 0,13 0,08
ΙΟ"5 0,00 0,05 0,03
10-6 0,01 0.01
10"7 0,00
10-8
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iO
Wie sich aus Tabelle II und Fig. 1 ergibt, nimmt die Absorption von PNA mit zunehmender Konzentration des Endotoxins zu und die Beziehung zwischen der Konzentration des Endotoxins und der Absorption von FNA ist geradlinig innerhalb eines Endotoxinkonzentrationsbereichs von 2 χ 10"' bis 2 χ 10 μg/ml. Dies zeigt, daß das Verfahren der Erfindung hohe Empfindlichkeit und Stabilität im Vergleich mit der Peststellungsgrenze der üblichen Endotoxinbestimmungsmethode, die bei ΙΟ"3 bis 10~* Rg/ml liegt, aufweist.
Beispiel 3
Unter Verwendung von ALL-FI und Z-Ile-Glu-Gly-Arg-PNA wurden aus verschiedenen Spezies von Bakterien stammende Endotoxine bestimmt. Die Konzentrationsbereiche der Endotoxine, die ermittelt werden konnten, wurden aus der Beziehungskarte der Konzentrationen verschiedener Endotoxine gegen die Absorption von FNA, das gemäß Beispiel 2 hergestellt worden war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben.
Tabelle III
Endotoxine Festgestellte Endotoxinkonzen-
trationen (pg/rnl) 		X 10-5 bis 2 X 10-7 (5 X 10-4)
Endotoxin aus Salmo
nella minesota R 595 		2 X 10-5 bis 6 X 10-7 (2 X 10-4)
E. coil UKTB 6 X ΙΟ"4 bis 2 X 10"6 (4 X ΙΟ"3)
Shigella K3 2 X 10-* bis VJ. X 10-6 (3 X ΙΟ"3)
E. coli 0111:B4 VJl X 10-5 bis 2 X 10-5 (5 X ΙΟ"1)
Ps. eeruginosa 2
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Fußnote;
Die Zahlen In Klammern sind die Konzentrationen der Endo- toxine, die durch die übliche Gelierungsmethode bestimmt wurden.
Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß mit dem Verfahren der Erfindung bakterielle Endotoxine mit einer Empfindlichkeit des 100- bis 1000-fachen gegenüber der üblichen Gelierungsmethode unter Verwendung von ALL festgestellt und bestimmt werden kennen und die Ermittlung von Endotoxinen unter Verwendung eines Amöbozytenlysats von Königskrabben ermöglicht wird.
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Le e rs e i t e

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur Bestimmung eines bakteriellen Endotoxinii, dadurch gekennzeichnet, daß eine Uhtersuchungsprobe mit (A) einem Material,bestehend aus einem Amöbozytenlysat von Königskrabben und/oder einem aus dem Lyeat abgetrennten Pro-Gerinnungsenzym und (B) einem Substrat vom Peptidtyp der Formel
    R1 - GIy - Arg - R2
    worin R1 einen L-Aminosäureanteil,dessen N-Ende durch eine Schutzgruppe geschützt ist, einen Peptidenteil, der aus einer L-Aminosäure besteht und durch eine Schutzgruppe an seinem N-Ende geschützt ist, einem durch D-Aminosäure substituierten L-Aminosäureanteil und/oder einem durch D-Aminosäure substituiertem Peptidanteil, bestehend aus einer L-Aminosäure und wobei die Aminogruppe des Glycinanteils, ausgedrückt als GIy, durch eine Peptidbindung verbunden ist und R2 einen Anteil,der mit dem C-Ende eines L-Argininanteils, ausgedrückt durch Arg, durch eine Säureamidbindung und/oder Esterbindung verbunden ist und in Gegenwart des Materials (A) und des Endotoxins unter Freisetzung von R2H enzymatisch hydrolysiert werden kann, darstellen,
    und/oder dessen Mineralsäuresalz kontaktiert wird und das erhaltene R2H; in dem R2 die oben angegebene Bedeutung besitzt, ermittelt wird.
    2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe aus einer a-N-Benzoylgruppe, einer o-N-Carbobenzoxygruppe, einer N-tert.-Butoxycarbonylgruppe und/oder einer p-Toluolsulfonylgruppe besteht.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R2 aus p-Nitroanilid, 5-Nitro-a-naphthylamid,
    ORIGINAL INSPECTED 809851/0548
    ß-Naphthylamid, α-Naphthylester, ß-Naphthylester, Indoxylester, N-Methyllndoxylester, (4-Methyl)umbelliferylester und/oder Resorfinester besteht.
    4« Rqfgegnz zur Ermittlung oder Bestimmung eines Endotoxins, gekennzeichnet durch
    (A) ein Material, bestehend aus einem Amö'bozytenlysat von Königskrabben und/oder einem aus dem Lysat abgetrennten Pro-Gerinnungsenzym und
    (B) ein Substrat vom Peptidtyp der Formel
    R1 - GIy - Arg - R2
    worin R1 einen L-Amlnosäureanteil dessen N-Ende durch eine Schutzgruppe geschützt ist, einen Peptidanteil, bestehend aus einer L-Aminosäure und geschützt durch eine Schutzgruppe an ihrem N-Ende, einem durch D-Aminosäure substituierten L-Aminosäureanteil und/oder einem durch D-Aminosäure substituierten Peptidanteil, bestehend aus einer L-Aminosäure, bedeutet und mit der Aminogruppe des Glycinanteils, ausgedrückt durch GIy, durch eine Peptidbindung verbunden ist und Rp einen mit dem C-Ende eines L-Argininantells, ausgedrückt durch Arg, durch eine Säureamldbindung und/oder Esterbindung verbundenen Anteil. bedeutet und der in Gegenwart des Materials (A) und des Endotoxins unter Freisetzung von RpH enzymatisch hydrolysiert werden kann.
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