CN111057745B - 一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法 - Google Patents

一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，包括：将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35‑40℃下孵育0‑60min；加入血浆激肽释放酶检测底物后，监测酶反应在5‑30min内的荧光变化；以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。该方法具有耗时短，操作简单，灵敏度高，结果重现性好，定量响应范围广，适于高通量检测等优点，可在化学品或污染物环境健康风险评价领域有重要应用。

Description

一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及一种基于血浆激肽释放酶原活化评价物质的血液毒性效应的高通量方法，属于化学品环境健康风险评价领域。
背景技术
新型化学品的环境健康效应得到日益增加的关注，外源物质进入血液并与血浆功能性酶原相互作用是其靶器官毒性调控的关键环节。因此，血液毒性效应评价是化学品环境健康风险评估的重要方面。血管舒缓素-激肽***(KKS)调控了机体一系列生理学过程，如炎症反应、血压和血管通透性等。血浆激肽释放酶原是KKS***的重要组成元素，其剪切活化生成血浆激肽释放酶的过程是表征KKS激活的重要方式之一。新型化学品结构复杂，种类繁多，尽管许多化合物存在血液富集的风险，受限于毒性评价体系的筛选通量，新型化学品健康风险评估的滞后已成为限制其安全使用的重要因素。同时，我们亟需灵敏的血液毒性评价方法为新型化学品环境健康风险评估提供重要保障。因此，开发基于血浆激肽释放酶原活化评价化学品血液毒性效应的高灵敏度、高通量方法对化学品的合理管控和安全使用具有重要意义。
现有的血浆激肽释放酶原活化检测方法，主要包括蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附法、酶活性检测法等。蛋白质免疫印迹法和酶联免疫吸附法主要缺点是耗时长，操作复杂，灵敏度低，定量响应范围窄，不能满足高通量检测要求。原有的酶活性检测方法存在灵敏度低，定量响应范围窄，不能满足高通量检测要求等不足。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于血浆激肽释放酶原活化评价物质的血液毒性效应的高通量方法。
本发明采用以下技术方案：
一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，包括：
将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35-40℃(例如36℃、37℃、38℃或39℃)下孵育0-60min(例如10min、20min、30min、40min或50min)；
加入血浆激肽释放酶检测底物后，监测酶反应在5-30min(例如8min、10min、12min、15min、20min或25min)内的荧光变化；
以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。
在一些实施例中，所述血浆为大鼠血浆、小鼠血浆或人血浆，优选为四周龄Sprague Dawley(SD)大鼠血浆。
在一些实施例中，所述反应缓冲液为含有0-100μM(例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或90μM)硫酸锌的磷酸盐缓冲溶液。
在一些实施例中，血浆与最终反应体系的体积比为1∶(30-300)(例如1∶30、1∶60、1∶90、1∶120、1∶150、1∶180、1∶210、1：240或1∶270)。
在一些实施例中，在与待测物质混合之前，所述血浆利用反应缓冲液稀释10-100倍(例如20、30、40、50、60、70、80或90倍)。
在一些实施例中，所述酶反应在黑色酶标板中进行。
在一些实施例中，所述底物为HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl。
在一些实施例中，所述底物在最终反应体系中的浓度为100-150μM(例如110μM、120μM、130μM或140μM)。
在一些实施例中，激发波长为395-405nm，发射波长为500-510nm。
在一些实施例中，监测荧光变化时，测试间隔为0.5-1min，测试时长为5-30min(例如10min、15min或20min)。
与现有的血浆激肽释放酶原活化检测方法(例如蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法)相比，本发明的方法具有耗时短，操作简单，灵敏度高，结果重现性好，定量响应范围广，适于高通量检测等优点，可应用于化学品或污染物环境健康风险评价领域。
附图说明
图1为本发明实施例中血浆与反应体系体积比与酶活的关系；
图2为本发明实施例中血浆与待测物质孵育时间与酶活的关系；
图3为本发明实施例中硫酸葡聚糖钠盐暴露后血浆激肽释放酶反应动力学曲线；
图4为本发明实施例中全氟辛基磺酸暴露后血浆激肽释放酶反应动力学曲线；
图5为本发明对比例中全氟辛基磺酸暴露后血浆激肽释放酶反应动力学曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
在本发明的说明书中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本发明的说明书中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体特征、参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
本发明涉及一种基于血浆激肽释放酶原活化评价物质的血液毒性效应的高通量方法。在原有酶活性检测的基础上，对血浆来源、血浆稀释倍数、反应缓冲溶液组成、待测物质与血浆孵育时间、检测时长、反应体系体积等条件进行优化。本发明基于底物HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl检测血浆激肽释放酶活性变化，从而评价化学品对KKS***的激活能力。此方法具有简单快速，灵敏度高，定量响应范围广，适于高通量检测等优点，可应用于新型化学品环境健康风险评价领域。
本发明的方法主要包括以下步骤：
将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35-40℃(例如36℃、37℃、38℃或39℃)下孵育0-60min(例如10min、20min、30min、40min或50min)；
加入血浆激肽释放酶检测底物HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl后，监测5-30min(例如8min、10min、12min、15min、20min或25min)内的荧光变化；
以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。
在本发明的实施例中，血浆作为反应体系中血浆激肽释放酶原的来源，血浆可以为大鼠血浆、小鼠血浆或人血浆，优选为四周龄Sprague Dawley(SD)大鼠血浆。反应缓冲液为含有0-100μM(例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或90μM)硫酸锌的磷酸盐缓冲溶液。
在一个实施例中，首先在黑色96孔酶标板的各孔中，分别加入30-70μL(例如40μL、50μL或60μL)系列浓度梯度的待测物质工作溶液。在加样槽中，采用反应缓冲液将新鲜收集的大鼠血浆稀释10-100倍(例如20、30、40、50、60、70、80、90倍)，使用多孔道移液器(或自动化移液工作站)将30-70μL(例如40μL、50μL或60μL)血浆稀释溶液加入黑色96孔酶标板相应孔中。
在检测血浆激肽释放酶活性时，使用多孔道移液器(或自动化移液工作站)向黑色96孔酶标板各孔中加入30-70μL(例如40μL、50μL或60μL)浓度为100-500μM(例如200μM、300μM或400μM)的底物工作溶液，立即使用全波长多功能酶标仪监测荧光变化(激发波长：395-405nm，例如400nm，发射波长：500-510nm，例如505nm)，每1min测定一次，测试时长为5-30min。
在分析待测物质对血浆激肽释放酶原激活效应时，若实验组的酶反应速率显著大于溶剂对照组的酶反应速率，则认为待测物质对血浆激肽释放酶原表现出激活效应，否则，认为待测物质对血浆激肽释放酶原无激活效应。
实施例1确定血浆与反应体系的体积比
1)仪器、材料与试剂
仪器：全波长多功能酶标仪，鼓风干燥箱，移液枪(或自动化移液工作站)。
材料：黑色96孔板，1.5mL离心管，加样槽，移液器吸头。
试剂：硫酸葡聚糖钠盐，血浆激肽释放酶底物(HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl)(Merck Millipore，USA)，新鲜采集的四周龄Sprague Dawley(SD)大鼠血浆，磷酸盐缓冲溶液，硫酸锌，去离子水。
2)实验步骤
在加样槽中，分别采用反应缓冲液将新鲜收集的大鼠血浆稀释10倍、20倍和50倍(血浆与整个反应体系的体积比分别为1∶30、1∶60和1∶150)，使用多孔道移液器(或自动化移液工作站)将50μL血浆稀释溶液加入黑色96孔酶标板相应孔中。采用去离子水梯度稀释硫酸葡聚糖钠盐，获得一系列硫酸葡聚糖钠盐工作溶液(0，320，640，1280μg/L)。在黑色96孔酶标板各孔中，分别加入50μL系列浓度梯度的硫酸葡聚糖钠盐工作溶液。于37℃条件下孵育30min，待测。由于反应体系存在2倍稀释，因此硫酸葡聚糖钠盐终浓度分别为0，160，320，640μg/L。孵育完成后，使用多孔道移液器(或自动化移液工作站)向黑色96孔酶标板各孔中加入50μL浓度为400μM底物工作溶液，立即使用全波长多功能酶标仪监测荧光变化(激发波长：400nm，发射波长：505nm)，每1min测定一次，测试时长为10min。以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合，求取各实验组斜率，即为酶反应速率。将不同的血浆与反应体系体积比条件下测得的酶反应速率进行对比，选取对应硫酸葡聚糖钠盐检测灵敏度最高、酶反应速率变化倍数最大的体积比为优选参数(如图1所示)。
实施例2确定血浆与待测物质的孵育时间
与实施例1相比，区别点仅在于1)采用反应缓冲液将新鲜收集的大鼠血浆稀释50倍(血浆与整个反应体系的体积比为1∶150)；2)采用的硫酸葡聚糖钠盐工作溶液浓度为0和320μg/L，由于反应体系存在2倍稀释，因此硫酸葡聚糖钠盐终浓度分别为0和160μg/L；3硫酸葡聚糖钠盐工作溶液与血浆稀释溶液孵育时间分别为0，30，60min；4)将不同孵育时间条件下测得的酶反应速率进行对比，选取对应硫酸葡聚糖钠盐检测灵敏度最高、酶反应速率变化倍数最大的体积比为优选参数(如图2所示)。
实施例3硫酸葡聚糖钠盐对血浆激肽释放酶原的活化评价
1)仪器、材料与试剂
仪器：全波长多功能酶标仪，鼓风干燥箱，移液枪(或自动化移液工作站)。
材料：黑色96孔板，1.5mL离心管，加样槽，移液器吸头。
试剂：硫酸葡聚糖钠盐，血浆激肽释放酶底物(HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl)(Merck Millipore，USA)，新鲜采集的四周龄Sprague Dawley(SD)大鼠血浆，磷酸盐缓冲溶液，硫酸锌，去离子水。
2)实验步骤
在加样槽中，采用反应缓冲液将新鲜收集的大鼠血浆稀释50倍，使用多孔道移液器(或自动化移液工作站)将50μL血浆稀释溶液加入黑色96孔酶标板相应孔中。采用去离子水梯度稀释硫酸葡聚糖钠盐，获得一系列硫酸葡聚糖钠盐工作溶液(0，320，640，1280μg/L)。在黑色96孔酶标板各孔中，分别加入50μL系列浓度梯度的硫酸葡聚糖钠盐工作溶液。于37℃条件下孵育30min，待测。由于反应体系存在2倍稀释，因此硫酸葡聚糖钠盐终浓度分别为0，160，320，640μg/L。孵育完成后，使用多孔道移液器(或自动化移液工作站)向黑色96孔酶标板各孔中加入50μL浓度为400μM底物工作溶液，立即使用全波长多功能酶标仪监测荧光变化(激发波长：400nm，发射波长：505nm)，每1min测定一次，测试时长为10min。以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合，求取各实验组斜率，即为酶反应速率(如图3所示)。将实验组酶反应速率与相应溶剂对照组进行比较，若实验组酶反应速率显著大于溶剂对照组，则认为待测化合物对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。
实施例4全氟辛基磺酸对血浆激肽释放酶原的活化评价
与实施例1相比，其区别点仅在于化学品为全氟辛基磺酸，获得工作溶液浓度分别为0，50，100μM。在最终血浆反应体系中，由于存在2倍稀释，全氟辛基磺酸终浓度为0，25，50μM。荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合，求取各实验组斜率，即为酶反应速率(如图4所示)。将实验组酶反应速率与相应溶剂对照组进行比较，若实验组酶反应速率显著大于溶剂对照组，则认为待测化合物对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。
对比例1基于改进前酶活性检测方法评价全氟辛基磺酸对血浆激肽释放酶原的活化
仪器：全波长多功能酶标仪，鼓风干燥箱，移液枪(或自动化移液工作站)。
材料：黑色96孔板，1.5mL离心管，移液器吸头。
试剂：全氟辛基磺酸，血浆激肽释放酶底物(HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl)(MerckMillipore，USA)，新鲜采集的六周龄C57/BL/6小鼠血浆，磷酸盐缓冲溶液，硫酸锌，去离子水。
2)实验步骤
分别向1.5mL离心管中，采用单孔道移液器(或自动化移液工作站)加入9μL新鲜收集的小鼠血浆(因为体积太小且血浆粘稠，无法使用多孔道移液器或者自动化移液工作站进行操作)。采用去离子水梯度稀释全氟辛基磺酸，获得一系列全氟辛基磺酸工作溶液(0，250，500μM)。分别向1.5mL离心管中，加入1μL系列浓度梯度的全氟辛基磺酸工作溶液。于37℃条件下孵育15min，待测。由于反应体系存在10倍稀释，因此全氟辛基磺酸终浓度分别为0，25，50μM。孵育完成后，使用单孔道移液器(或自动化移液工作站)依次向黑色96孔酶标板各孔中加入94μL反应缓冲溶液、5μL待测血浆样品和1μL浓度为20mM底物储备液，立即使用全波长多功能酶标仪监测荧光变化(激发波长：400nm，发射波长：505nm)，每1min测定一次，测试时长为10min。以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合，求取各实验组斜率，即为酶反应速率(如图5所示)。将实验组酶反应速率与相应溶剂对照组进行比较，若实验组酶反应速率显著大于溶剂对照组，则认为待测化合物对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。
在对比例1中，应用改进前的血浆激肽释放酶原活化检测方法，在25μM和50μM暴露浓度下，未观察到全氟辛基磺酸对血浆激肽释放酶原的活化效应(p＞0.05)。改进前酶活检测方法针对全氟辛基磺酸的检出限约为3mM。在实施例2中，25μM和50μM全氟辛基磺酸暴露诱导血浆激肽释放酶活性显著上升(p＞0.05)，实验组酶活性分别为溶剂对照组的13.8倍和36.4倍。改进后酶活检测方法针对全氟辛基磺酸的检出限约为15μM，与改进前检测方法相比灵敏度提高200倍。上述结果表明，本发明极大地提高了原有血浆激肽释放酶原活化检测方法的灵敏度。此外，在对比例1中，由于涉及小体积(1μL)移液过程且血浆粘稠，无法使用多孔道移液器或者自动化移液工作站进行操作。在实施例2中，血浆经由反应缓冲液稀释，且整个实验操作过程中移液体积不小于50μL，能够保证多孔道移液器及自动化移液工作站移液操作的准确性和稳定性，本发明很好地克服了原有酶活检测方法不适于高通量检测的局限性。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其特征在于，包括：
将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35-40℃下孵育0-60min，所述反应缓冲液为含有10-100μM硫酸锌的磷酸盐缓冲溶液；
加入血浆激肽释放酶检测底物后，监测酶反应在5-30min内的荧光变化，所述底物为HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl；
以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。
2.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，在36℃、37℃、38℃或39℃下孵育10min、20min、30min、40min或50min。
3.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，监测酶反应在8min、10min、12min、15min、20min或25min内的荧光变化。
4.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述血浆为大鼠血浆、小鼠血浆或人血浆。
5.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述血浆为四周龄Sprague Dawley(SD)大鼠血浆。
6.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述反应缓冲液为含有10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或90μM硫酸锌的磷酸盐缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，血浆与最终反应体系的体积比为1:(30-300)。
8.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，血浆与最终反应体系的体积比为1:30、1:60、1:90、1:120、1:150、1:180、1:210、1:240或1:270。
9.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，在与待测物质混合之前，所述血浆利用反应缓冲液稀释10-100倍。
10.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，在与待测物质混合之前，所述血浆利用反应缓冲液稀释20、30、40、50、60、70、80或90倍。
11.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述酶反应在黑色酶标板中进行。
12.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述底物在最终反应体系中的浓度为100-150μM。
13.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述底物在最终反应体系中的浓度为110μM、120μM、130μM或140μM。
14.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，激发波长为395-405nm，发射波长为500-510nm。
15.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，监测荧光变化时，测试间隔为0.5-1min，测试时长为5-30min。
16.根据权利要求15所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，测试时长为10min、15min或20min。
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