JPH08507148A - 固相化学カスケードイムノアッセイおよびアフィニティアッセイ - Google Patents
固相化学カスケードイムノアッセイおよびアフィニティアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
分析物の存在をアッセイすべき試料を、カスケードイニシエーターに結合した分析物(ハプテン、抗原、抗体、レセプター、または相補的ポリヌクレオチド)、分析物と反応する抗体または他の結合対パートナー、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触させて反応チャンバー内にアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物をインキュベートし、このアッセイ混合物に振動または移動する静磁界を加え、反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始し、振動または回転する磁界に対する磁性粒子の反応をモニターして時間とともに変化する信号を提供し、この時間とともに変化する信号を分析して試料の分析物濃度を測定することを含むアフィニティアッセイを行うための方法、また、アッセイを行なうためのキット、およびアッセイを行なうための診断システムが開示されている。
Description
【発明の詳細な説明】
固相化学カスケードイムノアッセイおよびアフィニティアッセイ 技術分野
本発明は、イムノアッセイなどの結合対アッセイを固相化学分析(ドライケミ
ストリー)の様式で行なう方法に関する。背景技術
結合対アッセイには種々のものがある。これには、種々のタイプのイムノアッ
セイ、DNAおよびRNAプローブ・アッセイ、並びに生物学的に重要なその他
の種々のリガンド−受容体アッセイが含まれる。今日では、対象とするものであ
るかもしれない特定の抗原または抗体の定量的測定を行なうためにイムノアッセ
イを利用できる。これらのタイプのアッセイの中には、エンザイムイムノアッセ
イがある(Oellerich,J.Clin.Chem.Clin.Bioc
hem.,第22巻,1984年,第895〜904頁;Monroe,Ana
lytical Chemistry,第56巻,第8号,1984年,第92
1a〜931a頁;およびWisdom,Clin.Chem.,22/8,1
976年,第1243〜1255頁参照)。エンザイムイムノアッセイにおいて
は、測定すべき試料におけるのと同一の抗原−抗体対の一方に結合する標識また
はマーカーとして、酵素を使用する。酵素の結合した抗原/抗体は、それに対し
て相補的な抗原/抗体の供給に制限があるため、試料の抗原/抗体と結合部位に
関して競合する。
測定値または結果を得るために、結合対アッセイをなんらかの手段で変換器ま
たは測定システムと組み合わせなければならない。このタイプの全てのアッセイ
は、測定値を得るために別のシステムに結合される。上記のエンザイムイムノア
ッセイにおいては、比色分析、ケミルミネッセンス、螢光分析法、生物発光など
の種々の方法を用いて酵素活性を測定することにより、試料の抗原/抗体レベル
を間接的に測定する。
従来のイムノアッセイ、より一般的には従来の結合対アッセイ、の問題は、こ
れらの方式に3つの明らかな欠点があることである:
1)これらは全血による定量的測定を行なうことかできない。エンザイムイ
ムノアッセイの質は、測定すべき抗原またはハプテンの純度に非常に大きく依存
するため、特に全血試料の分析には有用でない。また、全血は光度測定にあたっ
て光学的な干渉を引き起こし、システムから有用な信号を得るための可能性を非
常に低いものにしてしまう。
2)一回の処理時間が長い。反応が遅く、結果を得るまでの試験時間が長い
。
3)多数の工程が必要となる。手作業で行なうと労働集約的なものとなり、
インキュベーション、洗浄、サンプリング、および試薬添加など多くの工程を自
動化すると高価で複雑な装置が必要となる。
磁性粒子インタロゲーション(interrogation)法により、血液凝固について
の便利な固相化学分析の動的測定を全血試料を対象として行なえることが示され
ている(Oberhardt,米国特許第4,849,340号および第5,1
10,727号参照)。磁性粒子インタロゲーション法では、血液試料を測りと
り、磁性粒子と少なくとも一種の乾燥試薬とを組み合わせたものを含む反応スラ
イドに加える。試料と乾燥試薬とを反応させ、移動または振動する磁界を加えた
後、磁性粒子の運動をモニターして、凝固の終点を検出し、凝固時間を得る。全
血およびその他の困難な生物学的試料の測定を簡便に定量的に行なえる方法は殆
どないためこの方法は重要である。
しかし、これと同じ技術をイムノアッセイ、より一般的には異なるタイプの結
合対アッセイにおいて使用するためには、現行のアッセイ系を、免疫学的または
結合対の“先端(front end)”と組み合わせるための方法を見出さなければな
らない。
一つの可能性のある解決策は、抗体または抗原を磁性粒子に直接結合すること
である。しかし、抗体または抗原を磁性粒子に直接結合することにより免疫反応
を読み取れる系を提供できるものの、そのような系を再現性のある固相化学分析
の様式で使用することは困難である。これは、全ての粒子は凝集する性質がある
ためであり、このためそれらの熱力学的な自由エネルギーが極めて低くなってし
まい、安定ではあるが凝集した系になってしまうからである。例えば、磁性ラテ
ックスは磁気インタロゲーションによって定量化することは困難である。表面抗
原または抗体分子に対して使用した場合、これらの粒子では再現性が悪かった。
表面結合免疫分子に対して他のタイプの磁性粒子を使用することは完全には成功
していない。磁鉄鉱(Fe3O4)粒子を“受動”モードで使用することも考えら
れた。即ち、表面抗体または抗原を使用せず、受動粒子の手法に基づく、作動可
能なアッセイ系の開発は少しは成功している。
受動粒子の手法は概念的には明快であるが、免疫学的または結合対の“先端”
を、今までは凝固または線維素溶解アッセイの測定だけに使用されていた磁性粒
子インタロゲーション技術とどの様に結合したらよいかは明確でない。
抗体または抗原に結合した酵素を利用した酵素結合凝固アッセイが提案されて
おり、これにおいては、凝固カスケード反応系における能動要素(active facto
r)として酵素を用いる(Doellgastら,Analytical Bi
ochemistry,147,1985年,第529〜534頁;152,1
986年,第199〜207頁;162,1987年,第102〜114頁;1 67
,1987年,第97〜105頁;および184,1990年,第375〜
380頁;Clin.Chem.34/2,1988年,第294〜299頁;
およびDoellgast,米国特許第4,668,621号参照)。しかし、
提案された系は何れも、一回またはそれ以上の分離、洗浄および希釈工程を必要
とするか、長い試料処理時間を必要とする。
また、Doellgastらは、プラスミノーゲン活性化因子(例えば、t−
PA)の活性を測定するために酵素結合線維素溶解アッセイを提案した(Thr
ombosis Research,59,1990年、第723〜733頁)
。しかし、上記の凝固アッセイの場合のように、アッセイを行なうために多数の
分離、洗浄および希釈工程を必要とする。Blakeらは、凝固カスケードまた
はその他のカスケード系に基づくイムノアッセイを提案した(Clin.Che
m.,1984年,30/9、第1452〜14156頁)。この系は立体障害
を利用しており、分離および洗浄工程を利用していない。しかし、この系は比色
分析に基づいており、したがって、全血試料または希釈された
血液試料の分析には適さない。現在の所、DNA/RNAプローブや他の結合対
アッセイについて類似の試みを行なった例は存在しない。
したがって、全血試料に使用でき、高速、高感度で便利な結合対アッセイシス
テムであって、定量的で使用が簡単なシステムを提供することが強く望まれてい
る。発明の開示
したがって、本発明の目的は、高速、高感度で便利な、生物学的に困難な試料
に使用される結合対アッセイシステムであって、定量的で使用が簡単なシステム
を提供することにある。
本発明の他の目的は、生物学的に困難な試料に使用される結合対アッセイシス
テムであって、結合対の片方と結合するイニシエーターを利用するシステムを提
供することにあり、このイニシエーターの活性化により反応カスケードが開始さ
れ、分離または洗浄工程を必要とすることなく、興味の対象となっている結合対
メンバーの測定が可能となる。
本発明の他の目的は、上記の結合対アッセイシステムであって、イニシエータ
ーが血液凝固カスケードまたは溶解(lytic)カスケード中の酵素であるシステ
ムを提供することにある。
本発明の他の目的は、全血系に有用なイムノアッセイシステムを提供すること
にある。
本発明の他の目的は、例えばジゴキシン(digoxin)、キニジン(quinidine)
、リドカイン(lidocaine)、メキシレチン(mexiletine)、ソタロール(sotal
ol)、イミプラミン(imipramine)、プロパフェノン(propafenone)、チベン
ゾリン(cibenzoline)、エンカイニド(encainide)、フレカイニド(flecaini
de)、インデカイニド(indecainide)、モリシジン(moricizine)、ペンティ
サミド(pentisamide)、トカイニド(tocainide)、ベタクソロール(betaxolo
l)、ビソプロロール(bisoprolol)、ペンブトロール(penbutolol)、アミオ
ダロン(amiodarone)、ベタニジン(bethanidine)、メオベンチン(meobentin
e)、ベプリジル(bepridil)、ジルチアゼム(diltiazem)などの心血管疾患を
治療
する治療薬、およびその他の抗不整脈薬などの小さい分子のためのアッセイであ
って、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固末端の検出のために磁性
粒子インタロゲーション法を利用するアッセイを提供することにある。
本発明の他の目的は、アポリポタンパクA−1、アポリポタンパクB−100
、アポリポタンパクE、リポタンパクLp(a)、IgMなどのイムノグロブリ
ン、フィブリノーゲンなどの大きな分子のための高速で便利なイムノアッセイで
あって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁
性粒子インタロゲーション法を利用するイムノアッセイを提供することにある。
本発明の他の目的は、CK−MB、ミオグロビン、フィブリノーゲン、プラス
ミノーゲン、トロポニン、PAI−1、トロンボモジュリン、およびトロンビン
−アンチトロビン複合体などの重要な心血管タンパクのためのイムノアッセイで
あって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁
性粒子インタロゲーション法を利用するイムノアッセイを提供することにある。
本発明の他の目的は、血小板またはその特定の受容体(即ち、IIb、III
aなど);赤血球またはその特定の抗原(即ち、Rho);白血球またはその特
定の抗原(即ち、組織適合抗原);または細菌細胞、ウイルス、リケッチア、カ
ビまたはイーストなどの細胞要素またはそれらの表面抗原または受容体分子のた
めの便利なアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固
終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するアッセイを提供す
ることにある。
本発明の他の目的は、HIV抗原、後天性免疫不全症候群(AIDS)におけ
るCD4/CD8およびPAN T、並びに前立腺癌における前立腺特定抗原(
PSA)などの、重要な健康管理のためのスクリーニングおよび疾病管理に応用
される高速で便利な定量的イムノアッセイであって、増幅のために血液凝固カス
ケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用
するイムノアッセイを提供することにある。
本発明の他の目的は、インシュリン、T4、T3、ACTH、hCG、TSH
、アンギオテンシンIIなどのホルモンのための高速で便利な診断イムノアッセ
イであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のため
に
磁性粒子インタロゲーション法を利用する診断イムノアッセイを提供することに
ある。
本発明の他の目的は、コラーゲン、フィブロネクチン等の接着性レセプター、
ピトロネクチン、その他のインテグリン、グリコサミノグリカン、プロテオグリ
カン、アネクシン、細胞骨格成分、サイトカイン、成長因子などの、細胞外また
は細胞内の信号または構造要素のための高速で便利な診断イムノアッセイであっ
て、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒
子インタロゲーション法を利用する診断イムノアッセイを提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞およびウイルス中の遺伝子材料に見られるような特
定のポリヌクレオチドのための高速で便利な診断試験であって、増幅のために血
液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーショ
ン法を利用する診断試験を提供することにある。
本発明の他の目的は、肺洗浄液、または唾液などの血液以外の困難な生物学的
試料のための高速で便利な診断試験であって、増幅のために血液凝固カスケード
を利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用する診
断試験を提供することにある。
本発明の他の目的は、ウシ血液凝固カスケード、ウシ乳凝固カスケード、ヒト
またはウシ線維素溶解カスケード、ブタカスケード、昆虫血液凝固カスケード、
またはカブトガニ血液リンパカスケードなどの、ヒト血液凝固以外に存在する可
能性のあるカスケードシステムに基づく、血液またはその他の困難な生物学的試
料のためのアッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固
終点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用するアッセイを提供す
ることにある。
本発明の他の目的は、フォン・ウィルブランド因子およびそのコラーゲンレセ
プターと血小板GPIbレセプター、トロンビンとトロンボモジュリン、アセチ
ルクロリンとその受容体などの、リガンドまたは受容体のための高速で便利な定
量的診断アッセイであって、増幅のために血液凝固カスケードを利用し、凝固終
点の検出のために磁性粒子インタロゲーション法を利用する診断アッセイを提供
することにある。
本発明の他の目的は、例えば相違するが関連のある分析物のためのイムノアッ
セイなどのアフィニティアッセイのパネルであって、個々のアッセイが行なわれ
る多数の反応容量部と並列に接続された、反応スライドの試料ウエルに試料を適
用することのみによって得られる医療的診断の決定を容易にし、増幅のために血
液凝固カスケードを利用し、凝固終点の検出のために磁性粒子インタロゲーショ
ン法を利用するパネルを提供することにある。
本発明の他の目的は、反応スライドと、回転磁界および光学的な検出・照明手
段を利用する装置とを含む、固相化学分析様式による定量的アフィニティアッセ
イを行なうための便利で効果的なシステムを提供することにある。
これらおよびその他の目的は、アフィニティアッセイを行なう新規な方法を見
出すことによって達成された。この方法は、分析物の存在をアッセイすべき試料
を、反応カスケードイニシエーターに結合した分析物(ハプテン、タンパク、抗
体、レセプター、または相補的ポリヌクレオチドなどの小さな分子または大きな
分子)、前記分析物と反応する抗体、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触
させ、反応チャンバー内でアッセイ混合物を形成させ、アッセイ混合物をインキ
ュベートし、このアッセイ混合物に振動または移動する静磁界を加え、反応カス
ケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ、振動または回転
する磁界に対する磁性粒子の反応を監視して時間とともに変化する信号を提供し
、この時間とともに変化する信号を分析して試料の分析物濃度を測定することを
含むものである。図面の簡単な説明
添付図面との関連を考慮し、下記の詳細な説明を参照することによって本発明
がより良く理解されたとき、本発明および本発明の他の利点の多くがより完全に
理解されるであろう。添付図面中、
図1は、本発明において有用な反応スライド(米国特許第4,849,340
号および第5,110,727号に記載されており、これらを本明細書の一部を
構成するものとして参照する)の分解図であり、ベース支持体(30)、反応プ
レートまたはスペーサ(20)および反応カバー(10)を示すとともに、試料
ウエル(64)、通路(61)および反応チャンバー(62)の位置を示し、通
路(61)と反応チャンバー(62)は反応容量部(66)を含んでいる。
図2は、組み立てられた反応スライドの上面図である。
図3は、試料ウエル(64)上の試料入口(14)へのルアー形アダプター(
15)の取付状態を示す。
図4aおよび4bは、試料を、通路(61)を通して試料ウエル(64)に、
そして反応チャンバー(62)に導入するための2つの方法を示す:a)試料入
口(14)に圧力を加える方法;b)排気口(76)を真空にする方法。
図5は、本発明の結合対アッセイ方法において使用できる立体化学的アッセイ
方法の概略を示す。
図6は、本発明の結合対アッセイ方法において使用できる除去アッセイ方法の
概略を示す。
図7は、実施例1におけるような磁性粒子を用いた反応スライド技術により得
られたウシトロンビンについての標準曲線を示す。
図8aおよび8bは、実施例2におけるような磁性粒子を用いた反応スライド
技術により得られたファクターXaについての標準曲線を示す。
図9aおよび9bは、実施例3におけるような磁性粒子を用いた反応スライド
技術により得られたラッセルクサリヘビ毒についての標準曲線を示す。
図10は、固相化学反応スライドからのファクターXaのアッセイにおける全
凝固時間を測定するための、実施例1の装置を用いた光ダイオード増幅器からの
出力を示す。
図11a、11bおよび11cは、別々に試薬によって満たされ、処理され、
そして乾燥された個々の反応スライドをどの様にして共通のキャリヤ上で組み合
わせ、共通の試料ウエルから試料を満たして、アッセイパネルを提供できるかを
示す。発明を実施するための最良の形態
本発明は、アフィニティアッセイを行なうための方法を提供するものであり、
その方法は、
−分析物の存在をアッセイすべき試料を、反応カスケードイニシエーターに共
有結合的に結合した分析物、この分析物と反応する抗体、および磁性粒子を含有
する乾燥試薬に接触させて反応チャンバー内にアッセイ混合物を形成させ;
−このアッセイ混合物をインキュベートし;
−このアッセイ混合物に磁界を加え;
−反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ;
−光学的手段によって磁性粒子の反応をモニターして光学的な振動信号を得;
そして
−光学的振動信号の分析によって試料中の分析物濃度を決定することを含む。
本発明の方法は、イムノアッセイなどの広範な結合対アッセイに使用できる。
本発明の方法を用いて実施できるアッセイのタイプの例としては、可溶性抗原の
ためのイムノアッセイ、細胞イムノアッセイ、非免疫的である種々のタイプのレ
セプター−リガンドアッセイ、およびDNAおよびRNAプローブが挙げられる
。
特に好ましい態様では、本発明方法は反応スライド上で行われる。反応スライ
ドの一例が図1に示されている。反応スライドは、支持部材(30)を含み、こ
の支持部材(30)に反応プレートまたはスペーサ(20)が取り付けられる。
反応プレートの中央において材料の一部を除去することによって、反応プレート
(20)内に反応チャンバー(62)が画定されている。反応プレートの小さい
方の寸法、即ち厚さ方向に横切って材料が除去される、即ち“打ち抜かれる”場
合、第三の構造要素またはカバー(10)を利用して反応チャンバーの天井を形
成する。反応スライドを含む2個もしくは3個以上の構造要素を種々の方法で一
緒に接着してもよい(例えば、前記のOberhardtの米国特許第4,84
9,340号および第5,110,727号に開示されている)。反応チャンバ
ー(62)内には、磁性粒子、イニシエーターと結合された分析物、およびこの
分析物と反応する抗体を含む乾燥試薬材料が置かれる。アッセイを行なうのに必
要なことは、そのテストカードを試験装置内に置き、微量の(またはピペットに
よって量り分けた少量の)試料を試料ウエル(64)に加え、試料が通路(61
)を通過し、反応チャンバー(62)を満たすようにする。これによって、反応
が起こり、反応終了後にその結果を読む。
好適な試料スライドは、Oberhardtの米国特許第5,110,727
号に記載されている。この特許は、上記のようなスライドの記載と調製を含んで
おり、この特許を本明細書の一部を構成するものとしてここに参照する。
試料を試料ウエルまたは反応チャンバー内に直接置くことのできる任意の手段
により、分析すべき試料を反応スライドに加えることができる。好適な手段とし
ては、マイクロピペット、ピペット、ルアーチップの注射器、毛細管などが挙げ
られる。より好ましい手段は、ピペット、ルアーチップの注射器である。ルアー
チップの注射器を用いる場合、図3に示すように、試料ウエルの入口にルアーア
ダプターを付加することによって反応スライドを変更することが必要となる。
乾燥試薬材料は、典型的には、イニシエーターと結合された分析物、その分析
物と反応する抗体、および磁性粒子を含有する。実施される特定のアッセイと特
定の反応カスケードにより、酵素、基質、活性化剤、中和剤、緩衝剤などのその
他の成分が加えられる。
試料を反応スライドの試料ウエル(64)に加えると、試料は通路(61)を
通過して反応チャンバー(62)内に入り、乾燥試薬との反応を開始する。好ま
しい態様では、試料を試料ウエル(64)から反応チャンバー(62)へ運ぶた
めの移動力は、Oberhardtの米国特許第5,110,727号に記載さ
れているように、毛細管寸法を有する通路(61)と反応チャンバー(62)の
毛細管作用によって発生される。
他の態様では、試料を移動させるための移動力は、反応チャンバー(62)の
排気口(76)を真空源に接続する(図4a参照)か、試料ウエル(64)の入
口(14)に圧力を加える(図4b)ことによって発生される。必要となる真空
レベルまたは圧力レベルは、試料ウエルから反応チャンバーへの試料の動きを引
き起こすのに十分な程度に大気圧に対して負または正方向にそれぞれ偏ったもの
であり、好ましくは、大気圧よりも5〜10mm低くまたは高くなっている。
真空あるいは圧力法を使用するためには、図4aおよび4bに示すように、疎
水性膜(51)を反応チャンバー(62)の排気口(76)の上に設けることが
好ましい。この疎水性膜は、気体透過性であるが液体に対しては非透過性でなけ
ればならない。好ましい膜は、0.5〜3milの厚さのもので、孔の大きさが
0.02〜0.06ミクロンで35〜55%の孔げき率を有し、最も好ましくは
:1milの厚さのもので、孔の大きさが0.04ミクロンで45%の孔げき率
を有するものである。このような膜の例としては、セルガード(CELGARD
)2500と呼ばれる膜で、ヘキスト・セラニーズ社から入手できる。更に、試
料ウエルから反応チャンバーに通じる通路は、毛細管作用が自動的に起きて液体
を移送してしまわないようにするため、非濡れ性であるか、濡れが極力少なくな
ければならない。プラスチック材料を選択するか、またはコーティングにより、
液体/固体界面における接触角が大きくなるようにし、これにより濡れを好まし
い程度にすることができる。
カスケードシステムの生化学は、本アッセイシステムの“バック・エンド(後
部)”に基づいている。カスケードは、一連の反応であり、1番目の反応の生成
物が、2番目の反応における生成物の形成を触媒し、それ以降も同様である。カ
スケードシステムは、2個程度の少ない酵素工程の場合もある。本発明の方法で
使用されるカスケードシステムの例としては、ヒトまたは哺乳動物の血液凝固カ
スケードにおけるチモーゲンから活性形態酵素への変換;カブトガニの血液リン
パにおける相似生化学カスケード;および昆虫血液凝固カスケードが挙げられる
。本発明において使用できる他のカスケードシステムは、ヒトのプラスミノーゲ
ン・アクチベータ/プラスミノーゲンシステムなどの溶解(lytic)カスケード
である。一般に、カスケードシステム上で一つのものが高くなり始めると、アッ
セイ測定で見られる増幅量は増加する。カスケードシステムの増幅が大きい程、
結合対アッセイの感度が高くなる。しかし、ヒト血液凝固カスケードにおけるフ
ァクターXのレベルにおいてでさえ、本発明は、2段のカスケードにおいて、リ
ットル当たり0.1ピコモルのXaという感度を提供する。したがって、商業的
に重要なイムノアッセイの殆ど全てを実施するのに十分な感度を提供できる。3
段のカスケードの場合、リットル当たりフェムトモル(femtomole)程度に感度
が増加するであろう。リットル当たり3.6ピコモルの感度で、25マイクロリ
ットルの試料を受け入れる反応チャンバーの場合、理論的には約10-18モルの
分析物を検出できるであろう。これは、複製後107〜109個の分子を検出する
ことが要求されるDNAおよびRNAプローブアッセイについて必要とされる範
囲に入るかまたは範囲を超えるものである。DNAまたはRNA、一般的にはポ
リヌクレオチド、のためのアッセイにおいては、所定のストランドとその相補的
ストランドが結合対を構成するであろう。幾つかのアッセイでは、カスケードの
最後の酵素であるトロンビンのみを使用するだけで十分である。このような場合
、より高い感度は必要とされない。
結合対から発生された信号を凝固カスケードに結合するために、カスケードシ
ステムに加え、立体化学的または排他的なメカニズムが選択される。立体化学メ
カニズムを選択した場合、均質アッセイとなる。即ち、遊離した分析物と結合し
た分析物の分離を手作業の工程または装置による工程で行なう必要がなくなる。
立体化学メカニズムは、典型的には低分子量の分析物のために選択される。除去
メカニズムでは、洗浄工程なしに、反応スライド内で結合分析物から遊離分析物
を分離する。この手法は、典型的には高分子量分析物あるいは細胞エレメントの
ために選択される。
立体化学的または排他的結合メカニズムの選択可能性に加えてカスケード反応
は次の二つの方法で開始することができる:即ち、開始用の分子をカスケード反
応のための反応成分を含有するチャンバーに単に導入すること、または引き金(
トリガー)となるイニシエーターを使用することである。引き金となるイニシエ
ーターは、カスケード反応のための反応成分と接触するように配置するか、運動
の結果接触かもたらされるようにして、外からのエネルギーの入力、例えば紫外
線光、熱的パルスあるいはステップ機能によって活性化されるかまたはトリガー
されるまで一切反応が起こらないようにされる。トリガーされうることが可能な
イニシエーターの使用はカスケード反応が開始される前に完全に混合できるので
、必要であればより一層精密なアッセイを簡単に行うことができる。
上記のように、本発明方法は様々な種の幅広いアッセイに用いることができる
。アッセイ対象は一般に次の3つに分類される:(1)低分子量種(<2000
ダルトン)、(2)高分子量種(>2000ダルトン)、および、細胞エレメン
ト。以下にこれらの各々を記載する。
I.低分子量種(<2000ダルトン)のアッセイ:
この態様においては、立体化学的あるいは除去メカニズムのいずれかが選択さ
れ、結合対からシステムへと信号を伝達する。分析物−イニシエーター結合体を
用いた立体化学的メカニズムにおいては、結合対反応の後にイニシエーターの機
能との立体化学的干渉が起これば、均質アッセイとなる。そうではなく、イニシ
エーターが結合対の非分析物メンバーに化学的に付着している場合には、立体化
学メカニズムを利用することもできるが、それには、イニシエーターの化学的付
着が結合対の非分析物メンバー上の結合部位に近いこと、およびイニシエーター
機能の立体化学的障害が起こるのは分析物がその結合対補体に結合するときであ
ることが必要となる。図5および6は立体化学メカニズムと除去メカニズムの概
略説明図である。
立体化学メカニズム:立体化学的アッセイを採用する場合は、分析物の遊離(
非結合)結合対パートナーをイニシエーターとともに乾燥試薬中で使用し、イニ
シエーターが(相補的結合対パートナーと反応性を有する)分析物のレプリカに
化学的にカップリングするか、あるいは、分析物の結合対パートナーに化学的に
カップリングしたイニシエーターだけを使用する。対象とする試料を添加して一
定時間インキュベートした後、熱や光などのエネルギーを加え、イニシエーター
を活性化する。
インキュベートの間、試料が対象とする分析物を含有していない場合は、イニ
シエーターにカップリングした分析物レプリカは、対応する結合対パートナーと
反応する。このように、この反応は立体化学的に活性化イニシエーターをブロッ
クしてカスケード反応が始まらないようにする結果、カスケードは阻止されるか
あるいは大幅に進行が遅くなる。あるいは、イニシエーターが分析物の結合対パ
ートナーにカップリングし、また試料が分析物を含有していない場合には、イニ
シエーターは立体化学的な障害を受けず、よってカスケード反応が開始され迅速
に進行する。
しかしながら、試料が対象とする分析物を含有している場合には、インキュベ
ーションの間に、この遊離分析物は、結合対パートナーとともに効果的にイニシ
エーターに結合した分析物と競合反応する。このようにして、イニシエーターが
活性化されると、これは結合対パートナーとは反応していない、結合分析物を含
有するイニシエーターはカスケード反応を自由に開始することになる。カスケー
ド反応の速度はブロックされていない活性イニシエーターの量に比例するか、あ
るいは試料中に存在する分析物の量に直接的に比例する。このように、試料中の
分析物が高レベルになるにつれ、カスケード反応は一層速く進行し、この逆もま
た同様である。
また、イニシエーターにコンジュゲートした分析物の結合対パートナーを乾燥
試薬中で使用する場合には、試料の分析物(もしこれが存在するなら)は結合対
パートナーと反応し、これに結合し、よって立体化学的にイニシエーターに対す
る障害となり、活性化されたりトリガーされたときにイニシエーターがカスケー
ド反応を開始するのを防ぐ。この態様においては、試料からの分析物の添加の後
およびイニシエーターの活性化の後のカスケード反応の速度は、試料中に存在す
る分析物の量に反比例する。従ってこの場合、試料中の分析物のレベルが高いほ
どカスケード反応の速度は遅くなり、この逆も同様である。
除去メカニズム:
除去アッセイを採用する場合、典型的には、固相支持体に結合した分析物の結
合対パートナーが用いられる。例えば、結合対パートナーは、反応スライド反応
チャンバー内の表面、あるいは混合に用いられる磁性粒子、あるいは磁界が加え
られたときに磁性粒子によって迅速に懸濁させることのできる非磁性粒子(例え
ばガラスビーズ)と共有結合的に結合することができる。このように、本発明で
用いられる乾燥試薬系は、例えば結合抗体を、立体化学的アッセイ法における場
合と同様、同じタイプの分析物と結合したイニシエーターと共に含有する。試料
を、乾燥試薬を含有する反応スライドに加え、反応物をインキュベートした後、
液体反応溶液を固相支持体から分離し、カスケード系の残存成分に添加してカス
ケード反応時間を測定する。
対象とする試料が遊離分析物を含有していない場合には、分析物に結合したイ
ニシエーターは、インキュベーションの間に、表面に付着したその結合対パート
ナーと反応する。固相支持体から液体を分離し、この液体をカスケード反応系の
残存成分に添加した後、カスケード反応は大幅に減じるかあるいは停止したよう
にさえ見えるが、これは分析物と結合したイニシエーターが固相支持体と結合し
た抗体によって捕捉されるためである。
しかしながら、対象とする試料が遊離分析物を含有している場合には、遊離分
析物は、結合抗体を有する反応において、イニシエーターにコンジュゲートした
分析物と効果的に競合する。このように、液体が固相支持体から分離され、カス
ケードの残存成分に加えられると、カスケード反応は液体中に存在するイニシエ
ーターの量に比例した速度で進行するか、あるいはもとの試料中の遊離分析物の
レベルに直接比例した速度で進行する。
反応スライド技法によって固相支持体から液体を分離する方法には多くのもの
があることに留意されたい。典型的には、液体の移動は、バルブや通気口を開口
したときの毛細管現象によって、あるいは反応チャンバーの柔軟性のある上部に
置かれたピストンの圧力で物理的に、またあるいは圧力源や真空源に接続された
抜け口を移動させて反応スライド上の適切な抜け口と接触するようにした結果得
られる圧力ポンプ効果や真空ポンプ効果を利用して行われる。これらの方法の幾
つかは本明細書中に記載される。他のものは米国特許第4,849,340号中
に記載されている。適切なタイミングで磁界を加えて第二の反応チャンバーへ液
体が輸送されるまでの間この磁界を保ちつづけることによって、第一のチャンバ
ー中の磁性粒子が第二の反応チャンバー中へ輸送される液体とともに運ばれて移
動することを防ぐことができる。
低分子量分析物の検出のための除去メカニズムの利用に関する別の態様におい
ては、分析物レプリカは直接またはリンカー分子を介して固相支持体およびイニ
シエーターに結合した結合対パートナーに付着する。この態様においては、分析
物はイニシエーターと結合したパートナーコンジュゲートに結合し、コンジュゲ
ートを溶液中に残存させ、これによってコンジュゲートが固相支持体に付着した
分析物に結合することを防ぐ。このように、液体が固相支持体から分離されてカ
スケードの残存成分に加えられると、カスケード反応は液体中に存在するイニシ
エーターの量に比例するか、あるいはもとの試料中の試料分析物のレベルに直接
比例する速度で進行する。
除去メカニズムの他の実施方法は、液体吸収モジュール(LAM)を用いるこ
とによって反応チャンバー中の液体を分離する方法である。これは、吸収部材を
反応チャンバーの通気口と接触させるものである。(米国特許第
4,849,340号参照)。反応チャンバーからの液体の抽出の後、任意に洗
浄工程を行うことができる。この洗浄工程は、付加的カスケード成分を最終工程
で添加した後、反応チャンバー内のコンジュゲートを含有する結合したイニシエ
ーターによってトリガーしうる手段によって行うのが有利であり、このときにカ
スケード反応が開始される。しかしながら、この方法は通常より多くの工程を経
るものであり好ましくない。
本発明方法においては、結合対反応の一メンバーに結合したイニシエーター成
分を律速成分とするために、全てのカスケード成分が過剰量存在しなければなら
ない。例えば、ヒトの血液凝固カスケードが系の基本に選択された場合には、例
えば酵素、コファクター、基質、アクチベーター等の付加的なカスケード成分は
全て大過剰量存在しなければならず、これによって試料に由来するこれらの同じ
成分の欠陥が反応に影響を与えるのを防ぐ。さらに、試料中に存在する可能性の
ある天然の阻害剤は、乾燥試薬調製物中に含有される成分によって中和される。
あるいは、天然の阻害剤は、アッセイを行う前に全試料を一定の希釈率で希釈す
ることによって効果的に中和できる。しかしながら、この方法は追加の工程を要
するものであるとともに希釈率と同じだけ分析物の検出感度を低下させる。
カスケード系の第一の成分はイニシエーターと呼ばれるが、試料中に遊離体と
して存在しないように選択されなければならない。例えばファクターXaの前駆
体であるファクターXおよびトロンビンの前駆体であるプロトロンビンは、通常
血液中に存在する。しかしながら、ファクターXaもトロンビンも通常血液試料
には存在しない。トロンビンまたはXaが存在する場合には、それらは血液中の
天然阻害剤に結合しているので不活性である。従って、ファクターXaおよびト
ロンビンはどちらも、血液凝固カスケードシステムを利用する場合、本発明方法
において好適に使用しうるイニシエーターである。
反応試薬において、イニシエーターは結合対の一方にリンカーを介して化学的
にコンジュゲートを形成するか、あるいは共有結合的に一方と連結してそのコン
ジュゲート体を形成する。ある場合には、主に除去メカニズムを用いる場合、イ
ニシエーターは長いリンカー(例えばビオチン−アビジンのような連結)と結合
することにより、分析物や結合対パートナーから離れた所で保持される。それ以
外の場合には、イニシエーターは分析物や結合対パートナーと近接して保持され
るであろう。いずれの場合においても、コンジュゲート体が用いられる。結合対
反応におけるこのコンジュゲートの反応の範囲は、立体化学メカニズムまたは除
去メカニズムのいずれかによってカスケード反応へと伝達され、本アッセイの測
定を可能とする。さらに、本発明においては、このコンジュゲートは磁性粒子を
含有する固相化学組成物中に含有されるが、この磁性粒子は当該組成物全体中に
実質的に均一に混合されていることが好ましい。場合によっては、分析物と結合
パートナーを同じ固相化学分析の相で分離して、試料の添加前に相互作用が起き
ることを避けることが望ましいかもしれない。これらの場合において、分析物と
結合パートナーは、反応チャンバー内で物理的に分離されてもよい。しかし、場
合によっては分析物レプリカとその結合パートナーを固相化学分析の様式に転換
する前に、意図的に反応させることが望ましいこともあろう。これによってもな
お、アッセイの実行中に試料中の分析物によるレプリカの置換が可能であって、
かつ、反応時間が長くなりまたおそらく対流混合を十分に行うことが必要とはな
ろうが、非分析物である物質種による非特異的結合を減少させるかもしれない。
また、この固相化学分析の組成には、バッファー類が含有されていてもよく、前
記のようにカスケードシステムの他の成分が含有されていてもよい。
イニシエーターとそのコンジュゲート結合対メンバーは多くの方法でアッセイ
系に利用できる。
好ましい態様においては、トリガーされうるイニシエーターが用いられる。ト
リガーされうるイニシエーターは、通常は試料中に存在しないが、反応試薬中に
不活性な形で含有され、例えば熱パルスまたは熱ステップ機能、光子(光エネル
ギー、即ち可視光線、紫外線、赤外線)パルスや光子ステップ機能、電気的エネ
ルギー、音波エネルギー、またはその他のエネルギーなどのエネルギーが与えら
れると活性化され、一定のインキュベート時間ののちにはイニシエーターを活性
にするものである。トリガーされうるイニシエーターの使用によって、アフィニ
ティ反応のカスケード反応からの分離を一層向上させることができ、これらの反
応を連続的に行うことができるという効果が得られる。本発明においては、トリ
ガーされうるイニシエーターは、例えば使用されるカスケードシステムの成分か
ら選択される変性酵素であってもよい。この変性酵素はカスケードシステムの上
流か下流に位置するであろう。
一態様においては、トリガーされうるイニシエーターはアッセイ結合対の一方
に付着している。インキュベーションによって結合対のメンバーを相互に反応さ
せた後、イニシエーターはカスケードの開始点となり、イニシエーターの「引き
金」を引きカスケード反応を開始する。この開始点はカスケード反応におけるど
のような酵素でもよい。
別の態様においては、結合対の一方に結合している酵素はプロトロンビンなど
のチモーゲンであるが、これは、カスケード反応を引き起こすためにはカスケー
ド中におけるすぐ上の酵素を必要とする。この態様では、トリガーされうるイニ
シエーターは、カスケード中の結合対の一方に結合したチモーゲンより上の酵素
であればどれでもよい。この場合も、イニシエーターの「引き金」により、カス
ケード中の活性酵素へと転換することによってカスケード反応が開始される。
好適なトリガーされうるイニシエーターとしては、pHを非常に狭い範囲で変
えながら活性化される酵素を挙げることができる(MahlerおよびCord
es,Biological Chemistry,Harper and R
ow,ニューヨーク,1966年,第263−267頁参照)。また、酵素は一
般に、その酵素反応において最適pHと最適温度を示す(MahlerおよびC
ordes,第263−277頁参照)。基質結合の熱力学上の変化が酵素の野
性型および人工の突然変異体に起こしうる。酵素反応のアレーニウス曲線におい
ては極端な屈曲がしばしば見られるが、これは酵素と溶媒の相互反応の律速段階
や総特性における温度の変化からもたらされることがある。突然変異は、酵素溶
媒シェルや局所的な構造によってエネルギー面での変化をもたらすこともある(
Wellsら,Biochemistry,1991年,30,第5151−5
156頁)。
酵素は、ある閾値を超えて温度が上昇すると非常に活性が高くなることがある
。この閾値より下では、酵素は非常に活性が弱く、基質分子を殆ど意義ある速度
では反応させることができない。酵素の化学修飾によって得られる形態のものは
、一定の波長の十分な強度の光に暴露された時、その化学修飾基が開裂すること
に
よって活性化(あるいは不活化)することが知られている(Porterら,J
.Am.Chem.Soc.,1989年,111,第7616頁;Bioch
em.1990年,29,第4871および8042頁;Photochem.
and Photobiol.1990年,51,第37−43頁;さらにPo
rterら,米国特許第5,114,851号参照)。しかしながら、そのよう
な化学的に修飾された酵素を使用すると、反応媒体に分解生成物を混入させ、本
発明のカスケード反応やカスケード時間の測定を干渉する場合がある。化学試薬
の添加や、あるpHによって活性化されたり、不活化される酵素も知られている
。しかし、これらはあまり役に立たず、またトリガー方式よりも実際的でない。
なぜならこれらは付加的な化学的構成成分を必要とし、それが結合対反応や分析
物の測定に影響を与えるとともに、付加的な反応工程を必要とするからである(
Blakeら,Clin.Chem.1984年,30/9,第1452−14
56頁;Siddigiら,米国特許第4,960,693号;トヨマキら,米
国特許第4,985,354号;エノモト,米国特許第5,093,237号;
及びHallら,ヨーロッパ特許出願第0,123,265号参照)。
本発明のトリガーされうるイニシエーターに基づくシステムにおいては、試料
および試薬の結合対メンバーは、当該試料が乾燥試薬に添加された後、インキュ
ベーションの最初の時期には自由に相互反応する。この時、強制対流混合を行う
ことができる。これは磁性粒子を振動させたり回転移動させることによって行う
のが好ましい。これにより、イニシエーターの「引き金」を引くことによってカ
スケード反応が始まるまで結合対反応が進行し、必要であれば近似的に平衡状態
に至らせることができる。ある一定の時点に至ったとき、試験装置によって自動
的にこの「引き金を引く」プロセスを行うことができる。
他の態様では「引き金を引かない」方式でこのイニシエーターを用いる。この
場合、2工程あるいは2−コンパーメントアッセイとなる。好ましくは磁性粒子
を振動させたり回転させることにより一定時間強制的に対流混合を行いながら試
料とイニシエーター−結合対−メンバー−コンジュゲートをインキュベートした
後、反応混合物は毛細管運動やポンプ動作によって第二チャンバーに送られるが
、
そこには凝固カスケードシステムの残存成分が磁性粒子とともに乾燥状態で存在
する。この磁性粒子は基本的には残存成分と均一に混合されていることが好まし
い。必ずしも必要とされないが、第一のチャンバー中で混合するのに使用される
磁性粒子は当該チャンバー中で磁力保持され、装置の操作によって試料のみが第
二のチャンバーに移動するようにされるのが好ましい。第一のチャンバー内に存
在するヘパリン等の阻害剤は、イニシエーターがカスケード反応を開始するのを
防ぐ。第一のチャンバーからの阻害剤は第二のチャンバー内で中和される。例え
ば、ヘパリンはポリブレンやプロタミンで中和される。次いで磁性粒子は、振動
磁界あるいは回転磁界および光検出器を用いて調べられる。光検出器は好ましく
は発光ダイオード源、より好ましくは900ナノメーターの光を発するダイオー
ド源とともに用いる。凝固反応が進行し、ゲルの形成で終わる。フィブリン凝固
形成に関連する曲線における凝固時間その他の特徴は、終点または動的速度の測
定に用いることができる。凝固時間としては、振動系において振動のピークに達
するまでの時間が採用される。血液凝固時間を求めるために磁性粒子を用いる場
合、米国特許第4,849,340号および第5,110,727号(Ober
hardt)に記載された方法にしたがって実施することができる。これらのう
ち、磁性粒子振動を調べることによって凝固時間を測定すること、およびこのよ
うな測定を行うための装置に関連する部分をここに参照して援用する。高度に対
流的な場における凝固時間は、回転磁界によって駆動される円形移動システムに
おける反射率測定での反応ベースラインからの「リフト−オフ」として測定する
のが好ましい。この場合、磁性粒子は、凝固時間の終点に近づくにつれて凝集す
る傾向を示す。
「引き金を引いて」開始させることのできるシステムにおいては、全ての成分
は、磁性粒子を含有する単一の反応チャンバー内の固相化学混合物中に置くこと
が好ましい。これは好ましい態様であるとともに、測定と全ての反応が同一のチ
ャンバー内で起こるため最も簡単なシステムでもある。前の場合と同様、凝固は
凝固時間として読み取れる。
他の態様として、凝固時間の代わりに溶解発生時間を用いることもできる(O
berhardtら,Dry Reagent Technology
for Rapid,Convenient Measurements of
Blood Coagulation and Fibriolysis,C
lin.Chem.37,第520−526頁,1991年)。しかしながら、
溶解に基づくシステムはカスケードが十分増幅されないため感度が低い。
分析物濃度を決定するために、凝固時間または溶解開始時間を標準曲線から濃
度について読み取る。これは装置で自動的に行うことができるであろう。
低分子量種のアッセイ態様について、約324ダルトンの心臓薬であるキニジ
ン(quinidine)についてのアッセイの例を以下に記載する。
ファクターXaの熱活性化可能な突然変異体をイニシエーターとして選択し、
これを対象とする分析物であるキニジンに結合する。キニジンをXa突然変異体
分子と結合するが、この結合は、キニジン特異抗体とのインキュベーションにお
いて、抗体とキニジンとの結合が立体化学的にXa突然変異体の活性部位と干渉
するような結合である。そうでないときにはこの酵素はなんら影響を受けないま
まであった。
反応スライドを調製する。これには上記のXa突然変異体−キニジンコンジュ
ゲート、所定量の抗キニジン抗体、過剰量のプロトロンビン、フィブリノーゲン
、リン脂質、並びにファクターV、Vaおよび血小板因子3に対する過剰量の阻
害剤(抗体)を、バッファーとしてのHEPESまたはOWRENS、および磁
性粒子としての磁鉄鉱と組み合わせて含有させた。この混合物を反応スライドの
反応容積部(あるいはチャンバー)に加え、凍結乾燥して固相化学分析用反応ス
ライドを調製した。
キニジンのアッセイを行うため、反応スライドを装置内に置き、自動的に操作
温度に至らしめる。このアッセイ系では典型的には37℃である。血液を一滴反
応スライドと試料ウェルに加える。血液は試薬中に入っていきこれを溶解する。
磁性粒子に振動磁界を加えて運動させ、対流によって反応物を混合する。この間
、抗キニジン抗体をXa突然変異体−キニジンコンジュゲート上のキニジンと試
料中に存在するであろうキニジンに結合させる。所定量の抗体は、反応が所定の
インキュベーション時間続く間、コンジュゲートと試料中のキニジンとの間で分
配される。インキュベーション時間の終わりに、温度の設定点を急速に毎分8℃
で、
Xa突然変異体の形態が変わり活性となるレベルまで上昇させる。この時点でX
a酵素はプロトロンビンをトロンビンに変換しはじめるが、その変換率は活性X
a酵素の濃度に比例する。抗体で立体化学的に不活化されたXa酵素はプロトロ
ンビンをトロンビンに変換しないか、または、変換しても極度に低いか無視でき
る変換率である。従って、抗体と反応しなかったXa−キニジンコンジュゲート
の濃度は、プロトロンビンからトロンビンへの変換率を決定する。生成したトロ
ンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、化学信号をさらに増幅する。
フィブリンの形成が臨界段階に至れば、凝固(クロット)ないし終点を、磁性粒
子の運動の変化によって検出する。熱的にトリガーしてからの凝固終点までの経
過時間が凝固時間である。凝固時間はこのように試料中のキニジンに比例する。
試料中の実際のキニジン濃度は、反応スライド中の該当ロットに対して測定装置
中に記憶された標準曲線から自動的に読み取ることができる。この値は、もし必
要ならば血液細胞によって占められる反応容積のフラクションに対して補正する
ことにより、血漿キニジン濃度に変換することができる。全細胞容積に対する補
正係数は、血液中では典型的にはヘマトクリットと等価であり、これを装置のコ
ンピュータメモリに記憶させるか、あるいは簡単なチャートでこの変換を行う。
II.高分子量種(>2000ダルトン)および細胞エレメントのアッセイ:
高分子量の分析物、ポリヌクレオチド、リポプロテイン、および細胞のアッセイ
に対しては、さらに別の態様が使用される。これは酵素−結合対コンジュゲート
を、分析物の二つの結合対パートナーを用いたシステム(即ち抗体、レセプター
、または相補的ポリヌクレオチド)中で用いるものであり、このシステム中では
結合対パートナーの一つがイニシエーターにコンジュゲートしているがどの表面
にも付着しておらず、他方はイニシエーターにコンジュゲートしているが、表面
に付着している。分析物の二つの結合対パートナーの各々は分析物の異なる領域
に結合し、双方とも同時に分析物に結合できる。この態様は除去性およびトリガ
ーに基づくものである。このシステムにおいては、第一の結合対パートナーは固
相支持体に共有結合的に結合する。この支持体は反応スライドの基材であること
もできる一方、磁性粒子であってもよい。この磁性粒子はその後運動を与えられ
て反応チャンバー内に対流を起こす。第一の結合対パートナーは過剰量用いられ
、
分析物の分子または細胞の一以上の領域に結合する。第二の結合対パートナーは
分析物の分子または細胞のこれと異なった領域に結合する。この第二の結合対パ
ートナーは、コンジュゲーション酵素の形態でトリガー可能なイニシエーターに
コンジュゲートされる。この酵素は、上記のように第二の反応チャンバー内でエ
ネルギーによって活性化される。血液凝固カスケードシステム中のフィブリノー
ゲン、カルシウム、プロトロンビンなどのカスケード成分およびその他の成分は
、第二のチャンバー内、Fe3O4などの磁性粒子を含有する乾燥試薬中に存在す
る。第一のチャンバー内における所定のインキュベーション時間の後、開口部の
カバーまたはバルブを開放し、液体を第二のチャンバー内に通す。第一のチャン
バーが試料ウェルであれば、第二のチャンバーは実際には最初のかつ唯一の毛細
管チャンバーである。液体が毛細管チャンバーに流入するとき、第一のチャンバ
ー内の磁性粒子は液体とともに流出せず、永久磁石または直流電磁場によって静
的に保持される。従って、未結合の第二の結合対パートナー分子だけが毛細管チ
ャンバーに入る。この結合対パートナーはイニシエーターにコンジュゲートされ
るか、または血液凝固カスケードの場合には、ファクターXaなどの凝固酵素に
コンジュゲートされる。この凝固酵素はトリガーされるまで不活性のままである
。次いで、熱や紫外線などのエネルギーを与えることによって酵素をトリガーし
、凝固カスケードを開始させる。このように、凝固時間は活性化されたイニシエ
ーターの残存遊離物濃度に逆比例し、よって分析物濃度に直接比例する。その後
、得られた凝固時間を用いて、標準曲線から分析物濃度を読み取る。
高分子量種を用いた態様を、アテローム性動脈硬化症に関連するラージリポプ
ロテイン分子であるアポリポプロテインB−100と、急性心筋梗塞のマーカー
であるCKMBに対するアッセイの例によって以下に記載する。
アポリポプロテインBアッセイ:第一のチャンバーからの液体が装置からの指
令によって第二のチャンバー内に移動できるように、バルブあるいは開口部カバ
ーで連絡された二つのチャンバー固相反応スライドを調製した(このような反応
スライドは米国特許第4,849,340号および5,110,727号(Ob
erhardt)に記載されており、既に参照して本明細書に援用されているも
のである)。第一のチャンバーは固相化学分析における固相混合物を含有
し、これはアポリポプロテインB−100(ApoB)分子の特定のエピトープ
に対して特異的なモノクローナル抗体にコンジュゲートされた所定量のトロンビ
ンと、このモノクローナル抗体によってトリガーされるものとは異なるApoB
分子上の様々なエピトープに対して特異的でかつ共有結合的に結合されたポリク
ローナル抗体を含有する磁性粒子を含有する。トロンビンは化学的に不活性にさ
れているが、紫外線照射で活性化できる。ポリクローナル抗体は過剰量存在し、
磁性粒子の非常に大きい表面積上に分布する。第二のチャンバーはフィブリノー
ゲン、抗体非含有磁性粒子あるいはこの磁性粒子に結合した他の成分、およびH
EPESなどのバッファーを含有する固相化学分析用試薬を含む。固相化学分析
試薬を調製するために、各反応チャンバーを液体試薬混合物で満たし、反応スラ
イド全体を凍結乾燥する。
ApoBのアッセイを行うにあたって、反応スライドを分析装置に置き、両チ
ャンバーを自動的に37℃の定温とする。次いで試料を試料ウェルに過剰量適用
し、第一のチャンバーを満たして乾燥試薬を溶解する。回転磁界によって磁性粒
子を駆動して対流混合させ、所定のインキュベーション時間継続して混合する。
この間、粒子上の抗体は基本的に試料中の全てのApoBに結合する。同時にト
ロンビン−抗体のコンジュゲートの一部は、存在するApoB分子の数に比例し
て選択的にApoBに結合する。このようにApoBは二重に結合する。所定の
インキュベーション時間が終わったとき、開口部のカバーを持ち上げるかバルブ
を動かして、反応液を第二のチャンバーに移動させる。磁性粒子は第一のチャン
バーの下方領域に直流電磁場をかけて保持する。遊離のトロンビン−抗体コンジ
ュゲートを含有する液体は第二のチャンバーに移動し、第二の乾燥試薬を溶解す
る。第二チャンバー内の磁性粒子は所定の短い時間の間回転磁界によって対流様
式で駆動し、次いで装置内のUVランプから、あるいは装置内のフラッシュ管か
らの連続フラッシュ光によって、紫外線光のステップ機能を反応スライドの第二
のチャンバーに適用する。この時点でトロンビンは活性化され、フィブリノーゲ
ンからフィブリンへの凝固カスケードの最終段階を開始する。移動する磁性粒子
を光検出器とこれに接続された信号処理回路により、900nmでモニターする
。粒子の運動の特徴によって凝固の終点を正確に決定することができる。UV照
射
から凝固の終点までの経過時間は試料中のApoB濃度に比例し、標準曲線から
読み取れる。
CKMBアッセイ:第一のチャンバーからの液体が分析装置からの指令によっ
て第二のチャンバー内に移動できるように、バルブあるいは開口部カバーで連絡
された二つのチャンバー固相化学分析用試薬を含有する反応スライドを調製した
。第一のチャンバーは固相化学分析における固相混合物を含有し、これは心筋タ
ンパクCKMBの「B」領域に特異的な抗体を大過剰量含有する。この抗体は磁
性酸化鉄(Fe3O4)粒子に共有結合的に結合し、各粒子の表面積の多くの部分
が抗体で覆われる。残る粒子表面は「ブロック」されるかあるいは受動的に中性
化され結合反応には関与しない。ブロッキングは、ウシ血清アルブミン(BSA
)、カゼイン、あるいはその他、対象とする反応に関与しないタンパクで残る粒
子表面をコーティングすることによって行われる。CKMBのB−領域に対する
粒子と結合した抗体に加え、特定量のM−領域に対する第二抗体もまたコンジュ
ゲートの形態で存在する。このコンジュゲートは、ラッセルクサリヘビ毒(RV
V)に共有結合したM−領域に特異的な抗体からなる。RVVは凝固ファクター
XをXaに転換する蛇毒である。この反応率はファクターVの存在下で上昇する
。試料はCKMB(心筋タイプ)を含有するが、また干渉物質であるCKMM(
骨格筋タイプ)およびCKBB(脳タイプ)をも含有する。CKMMやCKBB
存在下でのCKMBのアッセイは以下の方法で行われる。
試料を毛細管チャンバーである第一のチャンバーに導入する。試料は血漿、血
清、または全血試料である。好ましくは、試料は、第一のチャンバーに適用する
前にバッファーやコントロール用の血漿で希釈し、存在する凝固カスケード阻害
剤を正規化する。試料が第一のチャンバーに導入されると試薬は溶解し、磁性粒
子は1800−3600RPMの回転磁界中で自由に運動する。この結果、対流
が起こり、CKMBとCKBBとの粒子上のB−特異抗体への結合を向上させる
。M−特異抗体とRVVのコンジュゲートはCKMBに結合し、これは粒子に結
合したCKMBに付着するとともに溶解したCKMMにも付着する。対流は所定
期間続けられる。次いで開口部カバーを装置によって自動的に持ち上げるかバル
ブを開放すると、反応液の一部が第二のチャンバーに流入してこれを満たす。第
二
のチャンバーは第一のチャンバーより小さいことが好ましい。第一のチャンバー
内の磁性粒子は回転磁界によって保持されるか、あるいは直流磁界をかけること
によって第一の反応チャンバーの底に運ばれる。
第二のチャンバーにおいて、反応液は凝固ファクターX、ファクターV、リン
脂質、プロトロンビン、カルシウム、フィブリノーゲン、HEPESやOWRE
NSなどのバッファー、および磁性酸化鉄粒子を含有する乾燥試薬を迅速に溶解
する。磁性酸化鉄粒子はコーティングされていなくてもよいが、BSAコーティ
ングなどでブロックされていてもよい。磁性粒子は回転磁界または振動磁界で駆
動されて運動する。運動している磁性粒子は900nmで発光ダイオードによっ
て照らされ、光検出器でモニターされる。粒子の運動によって凝固の終点が正確
に決定される。凝固時間は第二の反応チャンバーに流入する液体中に存在する抗
体に結合したRVVの濃度に反比例して変化する。この抗体とコンジュゲートし
たRVVは未結合の状態かあるいはCKMM分子に結合した状態で存在するであ
ろう。抗体とコンジュゲートしたRVVで第二のチャンバーに流入しないものは
、磁性粒子上の第一のB−領域に特異的な抗体によって捕捉されたCKMB(C
KBBではない)に結合しているものである。従って、第二のチャンバー内で測
定された凝固時間は、試料中のCKMB濃度に直接関係することになる。
CKMBに対するアッセイの上記のタイプのものは、Xa分子、または紫外線
に暴露されるまでは酵素として機能しないXa分子を用いて行うこともできる。
紫外線による引き金機構は、固相化学分析用試薬が溶解され十分混合された後、
第二の反応チャンバーで作動されるとより高い精度と再現性を有するアッセイを
提供できる。
上記の二チャンバー式アッセイは、希釈された血清、血漿、全血などの希釈試
料を用いて行われる。これはキニジンアッセイの例とは異なった手法であって、
個々の患者の試料中の凝固因子における差を最小にすることができる。
上記のアッセイにおいては、X、V、リン脂質、プロトロンビン、およびフィ
ブリノーゲンなどの個々の凝固因子を用いる代わりに乾燥試薬としてプール血漿
試料を利用できる。
アテローム性動脈硬化症のスクリーニングなどにおいて、心筋梗塞などに関す
るテストを提供するアッセイパネルが望まれる場合には、異なる反応試薬を組み
合わせて含有する反応エレメントを使用することがしばしば必要となる。これは
反応エレメントを組み合わせるという大きな挑戦であり、異なる反応成分、異な
る乾燥時間、固相化学分析の調製における異なる温度、などが必要となるであろ
う。パネルテストを行う一つの方法は、個々の反応スライド成分を、従来の独立
した生産プロセスの仕様に従って個々に調製して処理し、後でそれらを再結合し
て組み合わせの形態として共通の試料ウェルにパネル中の全テストを開始させる
ものである。これは図11A、BおよびCにおいて示されるようにして行われる
。図11Aにおいて、反応スライド117、118、119および120は、接
続部材121およびキャリアーカード112と容易に結合される。接続部材12
1が反応スライドと組み合わされた時の図を図11Bに示す。試料ウェル(1)
は接続部材121の上面に位置し、出口(図11Aで206、204、204’
および206’)は121の底面に位置して、反応スライド117、118、1
19及び120の上面とそれぞれ対応する試料入口101、102、103およ
び104と連結する。出口は、接続部材121の底面を個々の反応スライド(1
17、118、119および120)の上面に結合することによって液密形態の
入口と連結する。反応スライド部材はそれぞれキャリアカード122上のスロッ
ト(125、126、127および128)に個々に嵌合していてよく、超音波
溶接、溶媒結合、接着剤などによって直接キャリアカードに搭載される。最終組
立て体(124)は、同様にしてキャリアカード(122)に直接搭載された接
続部材(121)を含んでいてもよい。
図11Cにおける最終形態においては、パネルを容易に作動できる。試料が試
料ウェル201に添加されると、試料は(毛細管作用、圧力、真空、またはシリ
ンジフィルで)導管202へと移動し、次いで導管203と203’に分岐して
さらに出口204、204’、導管205、205’、および206、206’
と移動する。出口204と204’において、試料は入口102と103に入り
、それぞれ反応スライド118と119上の導管106と107へと進み、それ
ぞれの反応チャンバーである110および111を満たす。流れは通気口114
と
115(これらは、反応スライドを満たすための駆動力として毛細管作用を利用
しない場合には、図示していない疎水性膜で覆われていても良い)で止まる。同
様に、試料充填導管205および205’はそれぞれ出口206と206’へと
進み、反応スライド117においては領域101、105および109を横切っ
て113で止まり、また反応スライド120においては104、108および1
12を横切って116で停止する。
凍結乾燥を応用した他の先行技術では、アッセイの化学成分を個々に処理し乾
燥するのと同時にマルチテストやパネルを達成するのは困難であるかあるいは不
可能であった(例えばSchembiら,Clin.Chem.,38/9,第
1665−1670頁,1992年参照)。
本発明を総体的に記述したが、以下に記載する特定の実施例を参照することに
よりより一層の理解が得られるであろう。但しここに掲載する実施例は、例示の
ためだけのものであってなんら本発明を限定するものではない。実施例
1)カスケードの概念を示すために、プラスチックフィルムで反応スライドを
作成した。これは10×8×0.178mmの長方形の毛細管スペースからなり
、この毛細管スペースには8×3mmの通気開口が一端に近接して設けられると
ともに、一端が2mmと細く形成されこの端部で直径6.5mmの円形の試料ウ
ェルと連通している9mmのネック領域部が設けられている。基材は乳白色であ
ってカバーとスペーサーは透明であった。基材とカバーは厚さが0.25mmで
あって、スペーサーは厚さが0.178mmであった。空の反応スライドを装置
内に置き、磁性粒子の一斉運動を測定した。測定は最高出力が900nmのLE
D光源を用いて光拡散/反射によって900nmで行い、また光検出器と直流増
幅器も使用した。振動磁界は、700ガウスのU−字型アルニコ磁石を用いて発
生させた。このU−字型磁石の二つの6.35mmの広さの極を反応スライドに
対面させて使用した。磁石は直流モーターの軸に磁石中心のドリル孔を介して取
り付けられ、その軸を回転中心として2400RPMで回転した。極は反応スラ
イド基材の5mm下方に位置させた。反応スライドの温度は電気線ヒーターを磁
石
と反応スライドの間に位置させることによって37℃に保持した。
この様な装置によって、血液凝固反応を測定することができる。なぜなら懸濁
した磁性酸化鉄粒子の凝結およびフィブリンクロット中への取り込みによって光
拡散と吸収の減少が進行し、その結果、カード基材からのバックグラウンド反射
を増大させるからである。
固相化学分析における反応スライドは、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA
)、10ミリモルの塩化カルシウム、および0.1%の3400ダルトンのポリ
エチレングリコール(PEG)に、平均粒子径が0.3ミクロンのFe3O4(磁
鉄鉱)7mg/mlの懸濁液を加えたものを、反応スライドの反応容積部に入れ
、液体窒素で−195℃で凍結することにより調製した。このようにして得た反
応スライドを凍結乾燥機に入れ、初期の棚温度を−45℃に設定して凍結乾燥し
た。得られた乾燥反応スライドを室温に戻し、ジップロック(Ziplock)
の小袋に乾燥剤とともに包装して使用時まで4℃で保存した。
磁性粒子インタロゲーション・システムを使用した凝固カスケードシステムに
よって免疫的「先端部」なしで達成される感度を示すため、カスケード反応を以
下のようにして試験した:OWRENSバッファーに溶解したトロンビン溶液3
マイクロリットルを反応スライドのネック部に添加した。第二段階において27
マイクロリットルのウシフィブリノーゲン(7.3マイクロモル)を添加し、ト
ロンビン溶液3マイクロリットル中に流した。反応チャンバーに液体が入った時
点で磁性粒子を乾燥試薬から開放し、渦を巻かせ、十分混合した。トロンビン濃
度によって時間は異なるが、暫くすると血漿中のフィブリノーゲンが凝固した。
凝固の進行を前記のように光学的に測定し、終点を容易に決定できた。図7は、
ウシトロンビン濃度に対する凝固時間をプロットしたものであり、1ナノモル/
リットルという極微量のトロンビンが検出できることが示された。
2)2段階カスケードを示すため、反応スライドを実施例1のようにして調製
し、同じ分析装置を使用した。今回はファクターXaの100ミリモル塩化カル
シウムとOWRENSバッファーの溶液を使用した。この溶液3マイクロリット
ルを、反応スライドのネックにピペットで量り取った。第2段階において、再調
製されたプール血漿27マイクロリットルを加え、Xa溶液3マイクロリットル
中に流した。液体が反応チャンバーに入った時点で磁性粒子を試薬から開放し、
対流を起こした。磁性粒子は、凝固の終点を測定する手段として前記のようにし
て用いた。図8aおよび8bはファクターXa濃度に対する凝固時間をプロット
したものである。添加した血漿試料が全カスケード成分を十分な濃度で含有して
いれば、即ち、凍結乾燥した血漿が脂質(1:15のウサギ脳セファリン、シグ
マケミカル社)と5マイクログラム/mlのウシファクターV(エンザイム・リ
サーチ・ラボラトリーズ社)で強化されていれば、感度はリットル当たりXa0
.1ピコモルである。このシステムを用いて、下方の感度がリットル当たりXa
で約1ナノモルであるカスケード反応の標準曲線を作製することもできる。これ
は、幾つかのカスケード成分(例えばファクターV)の濃度を極小にすることに
よって行われ、これにより多くのイムノアッセイにおいて十分な固有感度を提供
できるであろう。
3)3段階カスケードを示すため、反応スライドを実施例1のようにして調製
し、同じ分析装置を使用した。
この実施例ではOWRENSバッファーで希釈したラッセルクサリヘビ毒(R
VV)溶液を用いた。この溶液3マイクロリットルを、反応スライドのネックに
ピペットで量り取った。第2段階において、再調製されたプール血漿27マイク
ロリットルを脂質で1:15に強化したものを加え、RVV溶液3マイクロリッ
トル中に流した。実施例1、2に記載のようにして凝固終点から標準曲線を得た
。試料希釈曲線の最後の3点を別のグラフに示してあるが、これは脂質−強化血
漿の新しいロットからのデータのためである。図9aおよび9bより、本発明シ
ステムによって下方の感度がリットル当たり約2.5ピコモルであるカスケード
反応の標準曲線を作製することができる。この感度は恐らく実施例2のように血
漿にファクターVを添加することによって改善することができるであろう。
4) イニシエーターとして阻害された酵素を用いた例を示すため、ファクタ
ーXaをα−メチル−2−ヒドロキシ−4−ジエチルアミノ桂皮酸(AMHDA
C)で不活化した。この化合物の調製については、Porter及びBrunk
e,Photochemistry and Photobiology,51
(1),37−43,1990年を参照された
い。阻害と光分解反応は以下のようにして行った:薄光または暗室中の赤色光で
、2ミリグラムのAMHDACを2ミリリットルのメチルアルコールに溶解した
。この溶液の分割量100マイクロリットルを、100ミリモルの塩化カルシウ
ムを含有する900マイクロリットルのTRIS/メチルアルコール(50/5
0)に添加した。この溶液の分割量202マイクロリットルを、100ミリモル
の塩化カルシウムを含有する298マイクロリットルのTRISに添加した。こ
の最終溶液を、等容量の、塩化カルシウム100ミリモルを含有するOWREN
Sバッファーに溶解したファクターXa(1.5×10-6モル)に添加した。最
終溶液は酵素の阻害を確実にするために過剰量のAMHDACを含有するもので
あった。反応のアッセイは暗条件下で30−90秒毎に反応スライドのネックを
3マイクロリットルの混合物で満たし、次いで27マイクロリットルの血漿を添
加して行った。凝固時間が250秒を超えた場合に完全な阻害であるとした。再
活性化には、この溶液3マイクロリットルを実施例1の反応スライドに置き、次
いでプール血漿27マイクロリットルを加えた。凝固反応は観察されなかった。
テストカードを装置から外し、365ナノメーター、4ワット、一体フィルター
付き長波長紫外線管(11cm長)、最大強度6”で540マイクロワット/c
m2の条件で、2秒間紫外線照射した。光は反応スライドの平坦な毛細管反応容
積部を通して照射した。カードは直ぐに装置に戻し、凝固終点を15秒後に測定
した。
このように、磁性粒子インタロゲーション・システムをカスケード反応システ
ムと組み合わせて使用することによって感度を向上させ、さらにまた結合対アッ
セイやイムノアッセイにおけるカスケードシステムのための活性化可能なイニシ
エーターと組み合わせることによって、迅速で使用が容易なアッセイシステムを
得ることができる。これを例えば医師の職場等で使用すると、患者が帰る前に結
果を知ることができる。商業的に入手できる同様の感度を有するイムノアッセイ
が数時間を要するのに対し、本発明によれば典型的には3分以下で結果が得られ
る。加えて、本発明方法によって達成される感度は基本的にはあらゆる市販のイ
ムノアッセイについて十分なものであり、他のタイプの結合対アッセイに関して
も適切な範囲にあるものである。
5) 実施例1と同様にして反応スライドを調製した。ただし、Fe3O4、
BSA、およびPEGの他に溶液を塩化カルシウム10ミリモルおよびファクタ
ーXa32ナノモルに調製した。反応スライドを実施例1と同様に処理し、次い
で実施例1で用いた装置で試験した。試験においては、正常なクエン酸血漿試料
を単に反応スライドの試料ウェルに反応容積部に満ちるまで過剰量添加しただけ
であった。得られた波形を図10に示す。これから凝固時間は70秒であること
が判る。t=0は試料が添加されて試薬を溶解しはじめた点である。t=70秒
において、光信号が増大し、凝固終点に至ったことを示す。この応答は振動磁界
や交流磁界で得られるものとは異なっており、後者においては光信号は凝固終点
で減少する。
上記の記述から本発明に対し多くの改変例や変形例が考えられることは明白で
ある。よって添付の請求の範囲で、本発明をこの明細書中に明記した以外の仕方
で実施することができるものであることが理解されなければならない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.アフィニティアッセイを実施するための方法であって、 − 分析物の存在を調べるためのアッセイ対象試料を、 反応カスケードイニシエーターにコンジュゲートし、分析物、当該分析物と反応 可能な結合対パートナー、および磁性粒子を含有する乾燥試薬に接触させ、反応 チャンバー内でアッセイ混合物を形成し; − 当該アッセイ混合物をインキュベートし; − 振動磁界または運動する静磁界である磁界を当該アッセイ混合物に加え; − 反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ; − 磁性粒子の磁界に対する応答を光学的手段でモニターして時間とともに変 化する光信号を得;さらに − 試料中の分析物の濃度を時間とともに変化する光信号を分析することによ って決定することを含むアフィニティアッセイを実施するための方法。 2.反応カスケードイニシエーターが、光または熱に暴露することによって活性 化されるものである請求項1記載の方法。 3.反応カスケードイニシエーターが、アッセイ混合物を反応チャンバーの第一 の部分から反応チャンバーの第二の部分へと移動させることによって活性化され 、当該第一の部分には一以上の阻害剤が存在してイニシエーターの活性化を防止 し、当該第二の部分には一以上の中和剤が存在し、前記一以上の阻害剤を中和し てイニシエーターを活性化するものである請求項1記載の方法。 4.結合対パートナーが、遊離抗体または固相支持体に結合した抗体である請求 項1記載の方法。 5.固相支持体が反応スライドである請求項4記載の方法。 6.固相支持体が磁性粒子である請求項4記載の方法。 7.乾燥試薬が、イニシエーターによって反応が開始されたとき反応カスケード を完了するために必要な一以上のカスケード成分をさらに含有するものである請 求項1記載の方法。 8.一以上のカスケード成分が、反応カスケードにおいてイニシエーターの初期 反応を律速段階とするのに十分な量存在する請求項7記載の方法。 9.反応カスケードイニシエーターが、反応カスケードにおける酵素である請求 項2記載の方法。 10.光学的手段が、光検出器および発光源を含む請求項1記載の方法。 11.発光源か900ナノメーターの発光ダイオードである請求項10記載の方 法。 12.磁界が回転磁界または交流磁界である請求項1記載の方法。 13.磁界が交流磁界である請求項12記載の方法。 14.磁界が回転磁界である請求項12記載の方法。 15.反応カスケードが、ヒト血液凝固カスケード、ウシ血液凝固カスケード、 ブタ血液凝固カスケード、ウシ乳凝固カスケード、補体カスケード、溶解カスケ ード、カブトガニ血リンパカスケード、及び昆虫血カスケードからなる群より選 ばれるものである請求項1記載の方法。 16.請求項1記載のアフィニティアッセイを実施するためのキットであって、 − 反応チャンバーを有する反応スライド;および − 当該反応チャンバー中において、反応カスケードイニシエーターに結合し たアッセイされるべき分析物、当該分析物と反応可能な結合対パートナー、磁性 粒子、磁界生成手段、および光学的手段を含有する乾燥試薬 を含有するキット。 17.一以上のカスケード成分が、プール血漿試料として提供されるものである 請求項7記載の方法。 18.分析物がキニジンであり、イニシエーターが血液凝固カスケードのファク ターXaであり、磁性粒子が磁鉄鉱であり、抗体が抗キニジン抗体であり、一以 上のカスケード成分がプロトロンビン、フィブリノーゲン、またはリン脂質であ り、乾燥試薬が血液凝固カスケードのファクターV、Va、および血小板因子3 に対する阻害剤並びにバッファーをさらに含有する請求項7記載の方法。 19.アフィニティアッセイを実施するための方法であって、 − 分子量が>2000ダルトンで2以上の結合領域を有する分析物の存在を 調べるためのアッセイ対象試料を、 当該分析物の第一の結合領域と反応性を有し、固相支持体に結合している第一の 結合対パートナー、および当該分析物の第二の結合領域と反応性を有し、反応カ スケードイニシエーターに結合している第二の結合対パートナーを含有する第一 の乾燥試薬に接触させ、第一の反応チャンバー内でアッセイ混合物を形成し; − 当該アッセイ混合物をインキュベートし; − インキュベートされたアッセイ混合物を、磁性粒子および開始によりカス ケード反応を完了するために有効な量の一以上の付加的カスケード成分を含有す る第二の乾燥試薬を含有する第二の反応チャンバーに移し; − 反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ; − 磁性粒子の、振動磁界または運動する静磁界に対する応答を光学的手段で モニターして時間とともに変化する光信号を得;さらに − 試料中の分析物の濃度を時間とともに変化する光信号を分析することによ って決定することを含むアフィニティアッセイを実施するための方法。 20.分析物がアポリポプロテインBであり、第一の結合対パートナーがアポリ ポプロテインBの第一のエピトープに特異的なポリクローナル抗体であり、イニ シエーターがトロンビンであり、イニシエーターに結合した第二の抗体がアポリ ポプロテインBの第二のエピトープに特異的なモノクローナル抗体であり、固相 支持体が磁性粒子であり、付加的なカスケード成分がフィブリノーゲンであり; 第二の乾燥試薬がさらにバッファーを含有し、第一の乾燥試薬の固相支持体が 、第一の反応チャンバー内において、第二の反応チャンバーへと移動される直前 に磁界を加えることによって保持されるものである請求項19記載の方法。 21.分析物がCKMBであり、第一の結合対パートナーがCKMBの「B」領 域エピトープに特異的な抗体であり、固相支持体が磁性粒子であり、イニシエー ターがラッセルクサリヘビ毒であり、第二の結合対パートナーがCKMBの「M 」領域エピトープに特異的な抗体であり; 第二の乾燥試薬の一以上の付加的カスケード成分が、凝固ファクターX、ファ クターV、リン脂質、プロトロンビン、カルシウム、およびフィブリノーゲンで あり、第二の乾燥試薬がさらにバッファーを含有し; 第一の乾燥試薬の固相支持体が、第一の反応チャンバー内において、第二の反 応チャンバーへと移動される直前に磁界を加えることによって保持されるもので ある請求項19記載の方法。 22.イニシエーター活性化段階が、反応カスケードイニシエーターを紫外線光 で照射することを含む請求項19記載の方法。 23.一以上の付加的なカスケード成分がプール血漿試料として提供されるもの である請求項19記載の方法。 24.結合対パートナーがレセプター分子である請求項1記載の方法。 25.結合対パートナーが遊離レセプター分子である請求項24記載の方法。 26.結合対パートナーが表面に結合されたレセプター分子である請求項24記 載の方法。 27.結合対パートナーがリガンドである請求項1記載の方法。 28.結合対パートナーが抗体または抗原である請求項16記載のアフィニティ アッセイを実施するためのキット。 29.結合対パートナーがレセプターまたはリガンドである請求項16記載のア フィニティアッセイを実施するためのキット。 30.分析物が抗原であり、第一の結合対パートナーがポリクローナル抗体であ り、第二の結合対パートナーがモノクローナル抗体である請求項19記載の方法 。 31.分析物がリドカインである請求項18記載の方法。 32.乾燥試薬が、さらに血液凝固カスケードにおける過剰量のファクターVお よびVaと、過剰量の血小板因子3を含有し、付加された阻害剤を含有しないも のである請求項18記載の方法。 33.反応カスケードが哺乳類血液凝固カスケードである請求項1記載の方法。 34.請求項19記載のアフィニティアッセイを実施するためのキットであって 、 − 二つの反応チャンバーを有する反応スライド、 − 反応チャンバーの各々の中に含有され、磁性粒子を含む乾燥試薬:および − 磁界生成手段と光学的手段 を含むキット。 35.光学的手段が、近赤外線領域の照射手段および検出手段を含む請求項16 記載のキット。 36.光学的手段が、さらにイニシエーターを活性化するための紫外線光源を含 むものである請求項35記載のキット。 37.光学的手段が、近赤外線領域の照射手段および検出手段を含む請求項34 記載のキット。 38.光学的手段が、さらにイニシエーターを活性化するための紫外線光源を含 むものである請求項37記載のキット。 39.分析物が反応カスケードイニシエーターにコンジュゲートされておらず、 結合対パートナーが反応カスケードイニシエーターにコンジュゲートされ、分析 物と結合対パートナーとの結合が立体化学的にイニシエーター分子機能と連結す るようにされたものである請求項1記載の方法。 40.乾燥試薬がジゴキシン−ラッセルクサリヘビ毒コンジュゲートを含有する 請求項7記載の方法。 41.乾燥試薬がリドカイン−トロンビンのコンジュゲートを含有する請求項7 記載の方法。 42.乾燥試薬がファクターIXaコンジュゲートを含有する請求項7記載の方 法。 43.乾燥試薬がファクターIXaコンジュゲートを含有する請求項19記載の 方法。 44.アフィニティアッセイを実施するための診断システムであって、 a)1)分析すべき試料を適用する試料ウェル、 2)当該試料ウェルと液通して連結している反応チャンバー、 3)磁性粒子と、反応チャンバー内に置かれた固相化学分析アフィニティ 試薬および凝固カスケード試薬 を含有する反応スライド、 b)回転磁界を生成する手段、 c)照射手段と検出手段を含む光学的検出システム、 d)光学的検出システムからの信号を増幅および処理して試料中の分析物の濃 度を決定する手段、 を含み、信号が回転磁界中の磁性粒子の応答を表すものである診断システム。 45.反応スライドの試料ウエルが反応チャンバーの並列アレーに液通しており 、反応チャンバーの各々が異なった固相化学組成物を含有し;各々が分離した反 応容量部のために設けられた複数の回転磁界を生成する手段と;各々が分離した 反応容量部のために設けられた複数の光学検出システムと;試料中の多数の分析 物を分析するための増幅および信号処理手段とを有している請求項44記載の診 断システム。 46.反応チャンバーに紫外線の供給手段をも含む請求項44記載の診断システ ム。 47.反応チャンバーが、アフィニティ反応を行なうための第1チャンバー、凝 固カスケード反応を行なうための隣接した第2チャンバー、第1チャンバーから 隣接第2チャンバーに液体を移送する手段、各チャンバー内の磁性粒子、および 各チャンバーのための回転磁界とを有する請求項44記載の診断システム。 48.分析物が小分子である請求項1記載の方法。 49.分析物が抗不整脈薬である請求項1記載の方法。 50.分析物が、大分子、細胞、細胞断片およびウイルスから成る群より選択さ れるものである請求項19記載の方法。 51.分析物がハプテンである請求項1記載の方法。 52.分析物がアポリポプロテインである請求項19記載の方法。 53.分析物がペプチドである請求項1記載の方法。 54.分析物が小さいポリペプチドである請求項1記載の方法。 55.分析物がタンパクである請求項19記載の方法。 56.分析物が、リポプロテイン、アポリポプロテイン、ホルモン、酵素、イン テグリン、成長因子、サイトカイン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン 、アネクシン、コラーゲン、細胞骨格成分、細胞表面分子、細胞表面レセプター 、およびポリヌクレオチドから成る群より選択される請求項19記載の方法。 57.アフィニティアッセイがイムノアッセイであり、分析物が細胞表面抗原で ある請求項1記載の方法。 58.アフィニティアッセイがイムノアッセイである請求項1記載の方法。 59.アフィニティ反応を行なう第1チャンバーの並列アレー、各第1チャンバ ーからそれに隣接する凝固カスケード反応を行なうための第2チャンバーに液体 を移送する手段、各チャンバー内の磁性粒子、および各チャンバーのための回転 磁界と含み、試料中の多数の分析物を分析できるようにした請求項45記載の診 断システム。 60.アテローム硬化症のリスクを評価するために、Apo B−100、Ap o A−1およびApo(a)から成るアポリポプロテインイムノアッセイパネ ルを含んでいる請求項60記載の診断システム。 61.急性心筋梗塞の確認のために、CKMB、トロポニンT、ミオグロビン、 線維素ペプチドAおよび線維素から成るイムノアッセイパネルを含んでいる請求 項60記載の診断システム。 62.乾燥試薬がトロンビンコンジュゲートを含有するものである請求項1記載 の方法。 63.乾燥試薬がファクターXaコンジュゲートを含有するものである請求項1 記載の方法。 64.乾燥試薬がファクターIXaコンジュゲートを含有するものである請求項 1記載の方法。 65.乾燥試薬がラッセルクサリヘビ毒コンジュゲートを含有するものである請 求項1記載の方法。 66.乾燥試薬がトロンビンコンジュゲートを含有するものである請求項19記 載の方法。 67.乾燥試薬がラッセルクサリヘビ毒コンジュゲートまたはファクターIXa コンジュゲートを含有するものである請求項19記載の方法。 68.乾燥試薬がファクターXaのコンジュゲートを含有するものである請求項 19記載の方法。 69.温度制御のための加熱手段、および反応スライドと試料を認識するための 手段とを更に含む請求項44記載の診断システム。 70.更に、反応チャンバーに通気***み、この通気口が疎水性膜で覆われてお り、通気口を真空にして試料を試料ウエルから反応チャンバーに移動させるため の移動力を提供する手段を含む請求項44記載の診断システム。 71.更に、入口を試料ウエル内に、通気口を反応チャンバーに含み、この通気 口が疎水性膜で覆われており、入口に圧力を加えて試料を試料ウエルから反応チ ャンバーに移動させるための移動力を提供する手段を含む請求項44記載の診断 システム。 72.更に、ルアー・アダプターを取り付けた入口を試料ウエル内に、通気口を 反応チャンバーに含み、この通気口が疎水性膜で覆われており、液体試料に圧力 を加えて試料を試料ウエルから反応チャンバーに移動させるための移動力を提供 するルアー・アダプターに結合されたシリンジ手段を含む請求項44記載の診断 システム。 73.アフィニティアッセイを実施するための診断システムであって、 a)1)分析すべき試料を適用する試料ウェル、 2)当該試料ウェルと液通して連結している複数の反応チャンバー、 3)磁性粒子と共に反応チャンバーの各々に加えられる、アフィニティ試 薬、酵素試薬、および凝固カスケード試薬からなる群より選ばれる一以上の固相 化学分析試薬、 を含有する反応パネルテストカード、 b)回転磁界を生成する手段、 c)照射手段と検出手段を含む光学的検出システム、 d)光学的検出システムからの信号を増幅および処理して試料中の分析物の濃 度を決定する手段、 を含み、信号が回転磁界中の磁性粒子の応答を表すものである診断システム。 74.アフィニティアッセイを実施するための方法であって、 − 分析物の存在を調べるためのアッセイ対象試料を、 反応カスケードのチモーゲンにコンジュゲートした分析物、当該分析物と反応可 能な結合対パートナー、反応カスケードイニシエーター、および磁性粒子を含有 する乾燥試薬に接触させ、反応チャンバー内でアッセイ混合物を形成し; − 当該アッセイ混合物をインキュベートし; − 振動磁界または運動する静磁界である磁界を当該アッセイ混合物に加え; − 反応カスケードイニシエーターを活性化して反応カスケードを開始させ; − 磁性粒子の磁界に対する応答を光学的手段でモニターして時間とともに変 化する光信号を得;さらに − 試料中の分析物の濃度を時間とともに変化する光信号を分析することによ って決定することを含むアフィニティアッセイを実施するための方法。 75.反応カスケードイニシエーターが、反応カスケードにおいて分析物に結合 するチモーゲンよりも高いトリガー可能な酵素である請求項75記載の方法。 76.反応カスケードイニシエーターが光または熱に暴露することによって活性 化されるものである請求項75記載の方法。 77.結合対パートナーが遊離抗体または固体支持体に結合した抗体である請求 項75記載の方法。 78.固相支持体が反応スライドである請求項78記載の方法。 79.固相支持体が磁性粒子である請求項78記載の方法。 80.乾燥試薬が、イニシエーターによって開始された反応カスケードを完了さ せるために必要な一種以上のカスケード成分を更に含有している請求項75記載 の方法。 81.一種以上のカスケード成分が、反応カスケードにおいてイニシエーターの 初期反応を律速段階とするのに十分な量存在する請求項81記載の方法。 82.光学的手段が、光検出器および発光源を含む請求項75記載の方法。 83.発光源が900ナノメーターの発光ダイオードである請求項83記載の方 法。 84.磁界が回転磁界または交流磁界である請求項75記載の方法。 85.磁界が交流磁界である請求項85記載の方法。 86.磁界が回転磁界である請求項85記載の方法。 87.反応カスケードが、ヒト血液凝固カスケード、ウシ血液凝固カスケード、 ブタ血液凝固カスケード、ウシ乳凝固カスケード、補体カスケード、溶解カスケ ード、カブトガニ血リンパカスケード、及び昆虫血カスケードからなる群より選 ばれるものである請求項75記載の方法。 88.更に、試料を乾燥試薬に接触させる工程の前に、試料を希釈することを含 む請求項1記載の方法。 89.更に、試料を乾燥試薬に接触させる工程の前に、試料を希釈することを含 む請求項19記載の方法。 90.更に、試料を乾燥試薬に接触させる工程の前に、試料を希釈することを含 む請求項75記載の方法。 91.複数の反応チャンバーの各々の反応チャンバーを、パネルテストカード上 への載置および試料ウエルとの結合の前に、異なる試薬処理条件におくようにし た請求項74記載のシステム。
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