DE3725851C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen
angegebenen Gegenstand.
Es wurde berichtet, daß eine NAD(P)H-Oxidase, die auf
Nicotinamid-adenindinucleotid der reduzierten Form (nachfol
gend als NADH bezeichnet) und Nicotinamid-adenindinucleotid
phosphat der reduzierten Form (nachfolgend als NADPH
bezeichnet) unter Bildung von Wasserstoffperoxid einwirkt,
in Acholeplasma laidlawii [European Journal of Biochemistry,
120, 329 (1981)] und in Bacillus megaterium [Journal of
Biochemistry, 98, 13 (1985)] gefunden wurde. Das aus diesen
Mikroorganismen erhaltene Enzym hat ein pH-Optimum nahe dem
neutralen Bereich.
NAD und NADP sind Coenzyme für verschiedene Dehydrogenasen.
Die Menge eines Substrates und die Enzymaktivität einer
Probelösung kann durch quantitative Bestimmung von NADH oder
NADPH, welches bei der Dehydrogenasereaktion gebildet wird,
bestimmt werden. Von dieser Technik wird in der klinischen
Analyse und der Lebensmittelanalyse weitverbreitet Gebrauch
gemacht.
NADH und NADPH werden im allgemeinen durch Messung der
Absorption bei 340 nm bestimmt, die für diese Verbindungen
charakteristisch ist, oder durch eine colorimetrische
Bestimmung mittels Formazan, welches bei der Reaktion mit
einem Tetrazoliumsalz gebildet wird. Die ältere Methode
leidet an der geringen Empfindlichkeit, weil die molaren
Extinktionskoeffizienten von NADH und NADPH nicht sehr hoch
sind, und das letztere Verfahren weist das Problem auf, daß
der gebildete Formazanfarbstoff, welcher in Wasser schwach
löslich ist, dazu neigt, zu präzipitieren oder an der Zelle
oder dem verwendeten Teströhrchen anzuhaften.
Diese Nachteile können durch Verwendung der NAD(P)H-Oxidase
vermieden werden, die NADH oder NADPH unter Bildung von
Wasserstoffperoxid oxidiert, wobei die Menge des
verbrauchten Sauerstoffs oder die Menge des gebildeten
Wasserstoffperoxids bestimmt werden kann. Die Reaktionen von
Dehydrogenasen sind im allgemeinen jedoch reversibel, wobei
das Gleichgewicht im neutralen Bereich stark auf die Seite
NAD(P)H → NAD(P) verschoben ist, und somit ist es
schwierig, die Menge des Substrates oder die Enzymaktivität
durch Verknüpfung mit der NAD(P)H-Oxidasereaktion zu messen.
Im alkalischen Bereich hingegen verschiebt sich das
Gleichgewicht zugunsten von NAD(P) → NAD(P)H. Unter
dieser Bedingung wird die Kupplungsreaktion einfach
durchgeführt und ermöglicht eine hochempfindliche Analyse
durch Bestimmung der Menge verbrauchten Sauerstoffs oder der
gebildeten Wasserstoffperoxidmenge. Somit bestand eine große
Nachfrage zur Entwicklung einer NAD(P)H-Oxidase mit einem im
alkalischen Bereich liegenden pH-Optimum und einem Verfahren
zur Substrat- und Enzymaktivitätsbestimmung unter Verwendung
dieser NAD(P)H-Oxidase.
Aufgabe der Erfindung ist somit die Bereitstellung einer
NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich
und einer einfachen, hochempfindlichen und preiswerten
Methode zur Bestimmung der Substratmenge oder der
Enzymaktivität in einer Probelösung unter Verwendung
derselben.
Diese Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen gelöst.
Die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase besitzt ein pH-Optimum
im alkalischen Bereich, sie kann vorzugsweise mit Hilfe von
Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 (FERM BP-1392) gewonnen
werden, und sie eignet sich zur Bestimmung der Menge eines
Substrats und der Enzymaktivität in einer Probelösung unter
Verwendung eines NADH oder NADPH bildenden Reaktionssystems
durch Bestimmung der Menge verbrauchten Sauerstoffs oder der
Menge gebildeten Wasserstoffperoxids.
Nachfolgend wird die Erfindung unter teilweiser
Berücksichtigung der Zeichnungen erläutert:
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Beziehung
zwischen dem pH-Wert und der Aktivität der erfindungsgemäßen
NAD(P)H-Oxidase;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche die
Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität der
erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase zeigt;
Fig. 3 zeigt den pH-Wertbereich, in welchem das
erfindungsgemäße Enzym stabil bleibt;
Fig. 4 zeigt die Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms in
Abhängigkeit von der Temperatur;
Fig. 5 ist eine Kalibrierungskurve und wird in Beispiel 2
für das erfindungsgemäße analytische Verfahren verwendet,
wobei die Absorption bei 550 nm gegen die NADH-Menge
aufgetragen ist, und
Fig. 6 ist eine Kalibrierungskurve, die in Beispiel 3 für
das erfindungsgemäße analytische Verfahren verwendet wird,
bei dem die Absorption bei 550 nm gegen die Natriumcholatmenge
aufgetragen ist.
Als Ergebnis der Auswahlverfahren nach von Mikroorganismen
produzierten NAD(P)H-Oxidasen wurde festgestellt, daß bestimmte Stämme von
Brevibacterium ammoniagenes und anderer Spezien eine stabile
NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich
produzieren. Deshalb wurden ihre enzymatischen Eigenschaften
untersucht (JP-A 1 88 824). Die Ergebnisse weichen von denen
bereits bekannter NAD(P)H-Oxidasen hinsichtlich des
pH-Optimums im alkalischen Bereich ab. Deshalb handelt es
sich um eine neue NAD(P)H-Oxidase.
Zu den bevorzugten
Beispielen von Stämmen, welche die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase besitzen, gehören Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645
(FERM BP-1392), Corynebacterium flaccumfaciens AHU 1622,
Arthrobacter atrocyaneus IAM 12339, Micrococcus flavus IFO
3242, Pseudomonas aeruginosa IAM 1156, Achromobacter
parvulus IFO 13182, Agrobacterium radiobacter IFO 12664,
Flavobacterium esteroaromaticum IFO 3751 und Streptomyces
aureus IAM 0092.
Diese Stämme können in allen Kulturmedien gezüchtet werden,
die eine Produktion der erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase
ermöglichen. Geeignete Stickstoffquellen umfassen
Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser,
Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, geeignete Kohlenstoffquellen
umfassen Glucose, Melasse, Glycerin, Saccharose und
Sorbit. Zusätzlich können anorganische Salze oder
Metallsalze (beispielsweise Phosphate, Kalziumsalze und
Magnesiumsalze), Vitamine und geeignete Wachstumsfaktoren
im Kulturmedium enthalten sein.
Die Stämme werden im allgemeinen bei einer Temperatur im
Bereich von 20 bis 40°C, vorzugsweise nahe 30°C, kultiviert.
Der Anfangs-pH-Wert liegt im allgemeinen im Bereich von 6
bis 8, vorzugsweise nahe 7. Der höchste Ausstoß an der
erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase wird im allgemeinen nach
10 bis 30 Stunden kontinuierlicher Kultivierung unter Rühren
und Belüftung erreicht. Es ist überflüssig zu erwähnen, daß
die gewählten Kulturbedingungen so gewählt werden, daß die
höchste Ausbeute an erfindungsgemäßer NAD(P)H-Oxidase
erzielt wird.
Der größte Anteil der gebildeten erfindungsgemäßen
NAD(P)H-Oxidase liegt innerhalb der Bakterienzelle vor.
Die oben beschriebene Kulturbrühe wird zuerst einer
Fest-/Flüssigtrennung unterzogen, die so abgetrennten Zellen
werden durch eine herkömmliche Technik aufgebrochen
(beispielsweise Ultraschallbehandlung, Behandlung mit einem
Enzym und Homogenisieren), und es wird ein zellfreier Extrakt
erhalten. Eine gereinigte Probe der NAD(P)H-Oxidase, die in
der Polyacrylamidgelelektrophorese lediglich eine einzige
Bande zeigt, kann aus diesem zellfreien Extrakt durch
bekannte Techniken wie Aussalzen, Präzipitation mit einem
organischen Lösungsmittel, Ionenaustausch-Chromatographie,
Adsorptionschromatographie, Gelfiltration und Gefriertrocknung
erhalten werden.
Die enzymatischen Eigenschaften der NAD(P)H-Oxidase, die aus
der Kulturbrühe von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645
(FERM BP-1392) aus Beispiel 1 isoliert wurde, sind in
Anspruch 1 angegeben.
Die Messung von pH-Optimum und pH-Stabilität erfolgte unter
Verwendung von Britton-Robinson-Pufferlösungen. Es wurde
gefunden, daß das erfindungsgemäße Enzym sein pH-Optimum bei
etwa 9 bis 10 (Fig. 1) hat. Getrennt davon wurde das
erfindungsgemäße Enzym bei 37°C 60 min lang in
Britton-Robinson-Pufferlösungen verschiedener pH-Werte
behandelt und in jeder Probe wurde die Restaktivität
gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß die Enzymaktivität
in einem pH-Wertbereich von 6 bis 10,5 erhalten bleibt (Fig.
3).
Die bevorzugte Temperatur und Temperaturstabilität wurde
durch Messung in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0)
bestimmt, die ergab, daß die optimale Reaktionstemperatur
der NAD(P)H-Oxidase im Bereich von etwa 40 bis 50°C (Fig.
2) liegt. Unabhängig davon wurde das erfindungsgemäße Enzym
im gleichen Puffer bei verschiedenen Temperaturen 10 min
lang behandelt und in jedem Fall die Restaktivität gemessen.
Es konnte gezeigt werden, daß diese bis zu Temperaturen von
55°C (Fig. 4) stabil ist.
Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wurde gemäß dem
nachfolgend beschriebenen Verfahren gemessen.
Eine Lösung, die durch Mischen von 1,0 ml 0,3
M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,1 ml 6 mM NADH-Lösung und
1,9 ml destilliertem Wassers hergestellt worden war, wurde
bei 37°C gehalten, es wurden 0,1 ml der zu untersuchenden
Enzymlösung hinzugegeben, die Reaktion wurde bei 37°C
durchgeführt und der Abfall der Absorption bei 340 nm wurde
gemessen. Die Menge Enzym, die 1 µMol NADH in einer Minute
oxidiert, entspricht einer Einheit.
Die vorliegende Erfindung verwendet eine NAD(P)H-Oxidase,
die ihr pH-Optimum im alkalischen Bereich hat, und die sich
leicht in eine Dehydrogenasereaktion einsetzen läßt und
somit hochempfindliche Messungen erlaubt. Wird die neue
NAD(P)H-Oxidase beispielsweise zur Bestimmung der
Lactatdehydrogenase (nachfolgend abgekürzt als LDH) in einer
Probelösung mittels Messung der Menge gebildeten Wasserstoffperoxids
verwendet, kann folgendes Reaktionssystem
aufgestellt werden:
Da das Gleichgewicht der LDH-Reaktion im neutralen Bereich
entsprechend der Reaktion NADH → NAD⁺ verschoben ist,
ist es schwierig, die LDH-Aktivität aus der Menge des durch
die Reaktion der NAD(P)H-Oxidase gebildeten Wasserstoffperoxids
zu bestimmen. Unter alkalischen Bedingungen ist das
Gleichgewicht auf die andere Seite zum NADH hin verschoben,
was der durch die neue NAD(P)H-Oxidase katalysierten
Reaktion ermöglicht, vollständig abzulaufen, und somit kann
die LDH-Aktivität aus der Menge gebildeten Wasserstoffperoxids
bestimmt werden. In ähnlicher Weise kann die Milchsäuremenge
einer Probelösung aus der Wasserstoffperoxidmenge,
welche gebildet wird, wenn LDH und die neue
NAD(P)H-Oxidase unter alkalischen Bedingungen miteinander
reagieren, bestimmt werden. Somit ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase, die stabil ist und eine
hohe Aktivität aufweist, für Hochempfindlichkeitsanalysen
hervorragend geeignet. Die Menge des in der oben
beschriebenen enzymatischen Reaktion gebildeten
Wasserstoffperoxids kann durch bekannte Fluoreszenz- oder
Chemilumineszenzverfahren bestimmt werden.
Die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase mit einem pH-Optimum im
alkalischen Bereich kann in Form einer Lösung oder immobilisiert
(an einen geeigneten Träger wie beispielsweise
Glaskügelchen oder einen Mehrschichtfilm gebunden) verwendet
werden. Wird das Enzym an einer Sauerstoffelektrode fixiert,
kann die Menge des Substrates oder die Enzymaktivität einer
Probelösung durch Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs
bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung zeichnet sich
dadurch aus, daß hochempfindliche Messungen durchgeführt
werden können, daß die neue NAD(P)H-Oxidase durch
Mirkoorganismen in großen Mengen bei geringen Kosten zur
Verfügung gestellt werden kann und daß die durch die
Brevibacteriumstämme hergestellte erfindungsgemäße
NAD(P)H-Oxidase eine hohe Produktionseffektivität und eine
hohe Stabilität bereitstellt und somit ein neues Verfahren
zur Bestimmung von Substraten und der Enzymaktivität bei
klinischen Untersuchungen liefert.
Das analytische Verfahren unter Verwendung der vorliegenden Erfindung kann
auf alle Probelösungen, die NADH oder NADPH enthalten,
eingeschlossen solche Lösungen, in denen NADH oder NADPH als
Ergebnis einer enzymatischen Reaktion gebildet wird,
angewendet werden. Nachfolgend werden einige typische
Beispiele enzymatischer Reaktionen, die NADH oder NADPH
bilden und auf die das Verfahren zur
Bestimmung von Substraten und der Enzymaktivität anwendbar
ist, beispielhaft dargestellt.
- 1. Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1)
Alkohol + NAD⁺ Aldehyd + NADH + H⁺ - 2. Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.2)
Alkohol + NADP⁺ Aldehyd + NADPH + H⁺ - 3. Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6)
Glycerin + NAD⁺ Dihydroxyaceton + NADH + H⁺ - 4. L-Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27)
L-Milchsäure + NAD⁺ Brenztraubensäure + NADH + H⁺ - 5. 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.30)
D-3-Hydroxybuttersäure + NAD⁺ Acetylessigsäure + NADH + H⁺ - 6. L-Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37)
L-Äpfelsäure + NAD⁺ Oxalessigsäure + NADH + H⁺ - 7. L-Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.40)
L-Äpfelsäure + NADP⁺ Brenztraubensäure + CO₂ + NADPH + H⁺ - 8. Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.41)
Isocitronensäure + NAD⁺ 2-Oxoglutarsäure + CO₂ + NADH + H⁺ - 9. Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.42)
Isocitronensäure + NADP⁺ 2-Oxoglutarsäure + CO₂ + NADPH + H⁺ - 10. Glucose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.47)
β-D-Glucopyranose + NAD(P)⁺ D-Glucono-δ-lacton + NAD(P)H + H⁺ - 11. Galactose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.48)
D-Galactofuranose + NAD⁺ D-Galactono-δ-lacton + NADH + H⁺ - 12. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49)
D-Glucose-6-phosphat + NADP⁺ D-Glucono-γ-lacton-6-phosphat + NADPH + H⁺ - 13. 3-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (EC 1.1.1.50)
3-Hydroxysteroid + NAD(P)⁺ 3-Oxosteroid + NAD(P)H + H⁺ - 14. Testosteron-17β-dehydrogenase (EC 1.1.1.63)
Testosteron + NAD⁺ 4-Androsten-3,17-dion + NADH + H⁺ - 15. Testosteron-17β-dehydrogenase (EC 1.1.1.64)
Testosteron + NADP⁺ 4-Androsten-3,17-dion + NADPH + H⁺ - 16. Galactose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.120)
D-Galactofuranose + NADP⁺ D-Galactono-γ-lacton + NADPH + H⁺ - 17. L-Fucose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.122)
L-Fucopyranose + NAD⁺ L-Fucono-1,5-lacton + NADH + H⁺ - 18. Formaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.1)
Formaldehyd + Glutathion (reduzierte Form) + NAD⁺ S-Formylglutathion + NADH + H⁺ - 19. Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.2)
Ameisensäure + NAD⁺ CO₂ + NADH + H⁺ - 20. L-Alanin-Dehydrogenase (EC 1.4.1.1)
L-Alanin + H₂O + NAD⁺ Brenztraubensäure + NH₄⁺ + NADH + H⁺ - 21. L-Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2)
L-Glutaminsäure + H₂O + NAD⁺ 2-Oxoglutarsäure + NH₄⁺ + NADH + H⁺ - 22. L-Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.3)
L-Glutaminsäure + H₂O + NAD⁺ 2-Oxoglutarsäure + NH₄⁺ + NAD(PH)H + H⁺
Ist die Substratmenge einer Probelösung zu bestimmen, wird
eine Dehydrogenase zur Oxidation des Substrats, NAD oder
NADP, und die NAD(P)H-Oxidase zu der Probelösung
hinzugegeben.
Ein oxidiertes Substrat und NADH (oder NADPH) werden in der
ersten Reaktionsstufe gebildet, und anschließend wird das so
gebildete NADH (oder NADPH) in NAD (oder NADP) und
Wasserstoffperoxid durch die Reaktion der erfindungsgemäßen
NAD(P)H-Oxidase in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt. Dies
trifft auch für die Bestimmung der Enzymaktivität zu, wenn
NAD (oder NADP) und Wasserstoffperoxid als Endprodukte
erhalten werden. Die Menge gebildeten Wasserstoffperoxids
kann durch jede bekannte Methode wie beispielsweise
colorimetrische, fluoreszenzanalytische, chemilumineszenzanalytische
und elektroanalytische Verfahren bestimmt
werden, und eine Sauerstoffelektrode kann zur Bestimmung der
verbrauchten Menge Sauerstoffs verwendet werden.
Ein typisches colorimetrisches Verfahren zur Bestimmung des
Wasserstoffperoxids ist die Verwendung eines Peroxidasesystems.
Die bekanntesten Reagenzien, die in diesem System
angewendet werden, sind die 4-Aminoantipyrine in Kombination
mit Phenol. Phenolderivate wie 2,4-Dichlorphenol,
2,4-Dibromphenol und 2,6-Dichlorphenol und Anilinderivate
wie Dimethylanilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin
und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin,
nachfolgend abgekürzt als TOOS) können zur weiteren
Vergrößerung der Empfindlichkeit anstelle von Phenol
verwendet werden. 4-Aminophenazon und 3-Methylbenzothiazolinonhydrazon
(MBTH) können ebenfalls anstelle von
4-Aminoantipyrin verwendet werden.
Zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch fluorimetrische
Analyse sind Verfahren bekannt, in denen Homovanillinsäure
oder p-Hydroxyphenylessigsäure in das korrespondierende
fluoreszierende Produkt durch die Wirkung von Wasserstoffperoxid
und einer Peroxidase umgesetzt werden.
Zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch ein Chemilumineszenzverfahren
ist eine Technik bekannt, in der Wasserstoffperoxid
mit Luminol und Kaliumferricyanid umgesetzt
wird, um eine Chemilumineszenz zu verursachen.
Hinsichtlich der Auswahl der in der erfindungsgemäßen
Reaktion zu verwendenden Pufferlösung bestehen keine
Begrenzungen, jedoch wird die Verwendung eines alkalischen
Puffers bevorzugt, um die Oxidation von NAD oder NADP zu
erleichtern und weil die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase
ein pH-Optimum im alkalischen Bereich aufweist.
Die NAD(P)H-Oxidase der vorliegenden Erfindung wird im
allgemeinen in einer Menge von 0,05 bis 10 Einheiten, bevorzugt
in einer Menge von 0,1 bis 1 Einheit verwendet. Zur Bestimmung
der Menge eines Substrats in einer Probenlösung, ist es
erforderlich, eine ausreichende Menge Dehydrogenase
hinzuzufügen, damit NAD oder NADP nicht in einer geringeren
Molmenge als das Substrat umgesetzt wird, so daß die
Oxidation des Substrates (Dehydrogenasereaktion) nicht der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Gesamtreaktion ist.
Ebenso ist es bei der Bestimmung der Enzymaktivität
erforderlich, daß das Substrat und NAD (oder NADP) in
ausreichenden Mengen verwendet werden, so daß die korrespondierende
Enzymreaktion nicht die geschwindigkeitsbestimmende
Reaktion in der Gesamtreaktion darstellt. Die Reaktion wird
im allgemeinen bei 20 bis 40°C 1 bis 30 Minuten lang
durchgeführt.
Nachfolgend wird das Verfahren zur Herstellung der
erfindungsgemäßen NAD(P)H-Oxidase detalliert durch die
folgenden Beispiele erläutert.
Ein Kulturmedium (100 ml), enthaltend 1,0% Glucose, 1,0%
Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05%
MgSO₄×7 H₂O (pH 7,0), wurde in einem 500-ml-
Erlenmeyerkolben gegeben und bei 120°C 15 Minuten lang
sterilisiert. Das Medium wurde mit Brevibacterium
ammoniagenes IAM 1645 (FERM BP-1392) beimpft und bei 30°C 24
Stunden lang geschüttelt, um eine Stamm(Keim-)kultur zu
erhalten.
500 ml Kulturmedium der gleichen Zuammensetzung, wie oben
beschrieben, wurden in einen 2-Liter-Erlenmeyerkolben
gegeben und 15 Minuten lang bei 120°C sterilisiert, mit 20
ml der wie oben beschriebenen erhaltenen Stammkultur beimpft,
und die Kultur kontinuierlich 15 Stunden lang bei 30°C
geschüttelt. 68 g Zellen (Feuchtgewicht), von 5 l
Kulturbrühe durch Zentrifugieren getrennt, wurden in 150 ml
30 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, die
Suspension wurde einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, um
die Zellwände aufzubrechen, der Überstand (rohe Enzymlösung)
wurde gegen 10 mM Glycin-NaOH-Pufferlösung (pH 9,0)
dialysiert und das Dialysat über eine vorher im gleichen
Puffer, wie oben beschrieben, equilibrierte DEAE-Sepharose
(CL-6B)-Säule gegeben. Das Eluat, welches
Enzymaktivität aufwies, wurde auf pH 10,0 durch Hinzufügen
einer Natriumcarbonatlösung eingestellt und zur Adsorption
der NAD(P)H-Oxidase über eine Q-Sepharose (FF)-Säule
(Pharmacia), die vorher mit einem 10 mM Glycin-NaOH-Puffer
(pH 10,0) equilibriert worden war, gegeben. Das adsorbierte
Material wurde mit einer einen linear steigenden NaCl-
Gradienten von
10 mM bis 1,0 M aufweisenden Lösung eluiert. Die gesammelten
aktiven Fraktionen wurden mittels eines Kollodiumbeutels
konzentriert und mit dem Konzentrat eine Gelfiltration über
eine Sephacryl-S-300-Säule, die vorher mit 100
mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) equilibriert worden war,
durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und
wiesen 50 ml NAD(P)H-Oxidase auf. Ihre relative Aktivität
betrug 2,1 Einheiten/mg, und ihre Ausbeute aus der rohen
Enzymlösung war
42%.
Ein Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie in
Beispiel 1 wurde in 500-ml-Erlenmeyerkolben (100 ml in
jeden) gegeben, die Kolben wurden durch 15minütiges Erhitzen
bei 120°C sterilisiert und mit den in Tabelle 1 aufgeführten
Stämmen beimpft. Anschließend wurden die Kulturen
kontinuierlich bei 30°C 24 Stunden lang geschüttelt. Jede so
erhaltene Kultur wurde einer Fest-/Flüssigtrennung
unterworfen und die gesammelten Zellen in 20 ml eines 30 mM
Kaliumphosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension
wurde der Ultraschallbehandlung und einer anschließenden
Trennung durch Zentrifugieren unterworfen und aus dem
Überstand die NAD(P)H-Oxidaseaktivität gemessen. Das
Ergebnis ist in Tabelle 1 dargestellt.
| Stämme | |
| Aktivität (Einheit/ml) | |
| Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 (FERM BP-1392) | |
| 0,250 | |
| Corynebacterium flaccumfaciens AHU 1622 | 0,122 |
| Arthrobacter atrocyaneus IAM 12339 | 0,092 |
| Micrococcus flavus IFO 3242 | 0,119 |
| Pseudomonas aeruginosa IAM 1156 | 0,107 |
| Achromobacter parvulus IFO 13182 | 0,107 |
| Agrobacterium radiobacter IFO 12664 | 0,100 |
| Flavobacterium esteroaromaticum IFO 3751 | 0,124 |
| Streptomyces aureus IAM 0092 | 0,068 |
| Zusammensetzung der Reagenzien | ||
| Lösung R-1 | ||
| Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) | 50 mM | |
| erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase | 0,25 U/ml | |
| Lösung R-2 @ | Phosphat-Puffer (pH 6,0) | 500 mM |
| 4-Aminoantipyrin | 2,4 mM | |
| TOOS | 2,4 mM | |
| Peroxidase (aus Meerrettich, Sigma) | 24 U/ml |
2 ml einer Mischung von Lösung R-1 mit 10 µl NADH-Lösung
(jeweils 5, 10, 15 und 20 mM) wurden 5 Minuten bei 37°C zur
Durchführung der Oxidation gehalten. 1 ml der Lösung R-2
wurde zu jeder Reaktionsmischung hinzugegeben und die
Absorption bei 550 nm gemessen. Eine gute lineare Beziehung
zwischen der verwendeten NADH-Menge und dem Ansteigen der
Absorption bei 550 nm konnte, wie in Fig. 5 dargestellt,
beobachtet werden.
| Zusammensetzung der Reagenzien | ||
| Lösung R-1 | ||
| Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) | 50 mM | |
| NAD | 1 mM | |
| 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase (von Pseudmonas testosteroni) | 0,4 U/ml | |
| erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase | 0,8 U/ml | |
| Lösung R-2 @ | Phosphat-Puffer (pH 6,0) | 500 mM |
| 4-Aminoantipyrin | 2,4 mM | |
| TOOS | 2,4 mM | |
| Peroxidase (aus Meerrettich) | 24 U/ml |
2 ml einer Mischung aus Lösung R-1 mit 10 µl Natriumcholatlösung
(jeweils 2, 4, 6, 8 und 10 mM) wurden zur
Durchführung der Oxidation 5 Minuten lang bei 37°C gehalten.
1 ml der Lösung R-2 wurde zu jeder Reaktionsmischung
hinzugegeben und die Absorption bei 550 nm bestimmt. Eine
gute lineare Beziehung konnte zwischen der verwendeten
Natriumcholatmenge und dem Ansteigen der Absorption bei 550
nm, wie in Fig. 6 dargestellt, beobachtet werden.
| Zusammensetzung der Reagenz | |
| Lösung R-1 | |
| Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) | 50 mM |
| NAD | 1 mM |
| 3 α-Hydroxysteroiddehydrogenase (von Pseudmonas testosteroni) | 0,4 U/ml |
| erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase | 0,8 U/ml |
Die Lösung R-1 (1,4 ml) wurde in eine geschlossene, mit
einer Clark-Sauerstoffelektrode ausgerüsteten Zelle gegeben;
10 µl Natriumcholatlösung (jeweils 2, 4, 6, 8 und 10 mM)
wurden hinzugefügt und die Elektrode zur Stabilisierung 5
Minuten lang bei 37°C behalten. 10 µl einer 10 mM
Natriumcholatlösung wurden anschließend hinzugefügt und
die Menge des verbrauchten Sauerstoffs gemessen. Eine gute
lineare Beziehung wurde zwischen der verwendeten
Natriumcholatmenge und der Menge verbrauchten Sauerstoffs
beobachtet.
Unabhängig davon wurde die erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase
auf einen Acetylcellulosefilm fixiert, und das fixierte
Enzym in die gleiche Art Sauerstoffelektrode eingesetzt. Es
wurde ein ähnliches Experiment, wie oben beschrieben, unter
Verwendung dieser Sauerstoffelektrode durchgeführt, wobei in
diesem Falle ähnlich befriedigende Ergebnisse erhalten
wurden.
| Zusammensetzung der Reagenzien | ||
| Lösung R-1 | ||
| Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,5) | 50 mM | |
| L-Natriumlactat | 30 mM | |
| NAD | 1 mM | |
| erfindungsgemäße NAD(P)H-Oxidase | 0,8 U/ml | |
| Lösung R-2 @ | Phosphat-Puffer (pH 6,0) | 500 mM |
| 4-Aminoantipyrin | 2,4 mM | |
| TOOS | 2,4 mM | |
| Peroxidase (aus Meerrettich) | 24 U/ml |
Eine Mischung aus 2 ml Lösung R-1 mit 10 µl Lactatdehydrogenaselösung
(jeweils 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 und 2,5 mM) wurde 5
Minuten lang bei 37°C zur Durchführung der Oxidation
gehalten. Die Reaktion wurde beendet und 1 ml der Lösung R-2
wurde zu jeder Reaktionsmischung hinzugefügt und
anschließend die Absorption bei 550 nm gemessen. Es wurde
eine gute lineare Beziehung zwischen der verwendeten Menge
Lactatdehydrogenase und dem Anstieg der Absorption bei 550
nm beobachtet.
Claims (2)
1. NAD(P)H-Oxidase mit folgenden enzymologischen
Eigenschaften:
- (1) Reaktionsweise
Sie oxidiert NADH oder NADPH in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von NAD oder NADP und Wasserstoffperoxid. NAD(P)H+H⁺+O₂ → NAD(P)⁺+H₂O₂ - (2) Substratspezifität
Sie reagiert mit NADH und NADPH. - (3) pH-Optimum
gemäß Fig. 1, die Bestandteil dieses Anspruchs ist.
2. Verwendung der NAD(P)H-Oxidase des Anspruchs 1 zur
Bestimmung der Substratmenge oder der Enzymaktivität in
einer Probelösung.
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| JP18882486A JPS6344882A (ja) | 1986-08-12 | 1986-08-12 | Ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダ−ゼの製造法 |
| JP61283240A JPS63137675A (ja) | 1986-11-28 | 1986-11-28 | 新規ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダ−ゼ及びその用途 |
Publications (2)
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|---|---|
| DE3725851A1 DE3725851A1 (de) | 1988-02-18 |
| DE3725851C2 true DE3725851C2 (de) | 1989-11-16 |
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ID=26505171
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|---|---|---|---|
| DE3725851A Granted DE3725851A1 (de) | 1986-08-12 | 1987-08-04 | Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung |
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-
1987
- 1987-08-04 DE DE3725851A patent/DE3725851A1/de active Granted
- 1987-08-11 US US07/083,921 patent/US4954445A/en not_active Expired - Fee Related
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