DE3245267C2 - - Google Patents
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Description
Die Beschreibung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Phosphatidylethanolamin.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein
Verfahren zur Analyse von Phosphatidylethanolamin
in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man die Phosphatidylethanolamin enthaltende Probe mit Phospholipase
D und mit Ethanolaminoxidase, einem Enzym, das
die Reaktion von Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser zu Glykolaldehyd,
Ammoniak und Wasserstoffperioxid katalysiert, behandelt
und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder die
Menge an gebildetem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid in dem
Reaktionssystem mißt, wobei die Menge an Ethanolaminoxidase
mehr als 0,1 U/ml beträgt.
Bei der klinischen Prüfung kann das Serum Phospholipid, bei
dem 95% Phospholipide von Cholinderivat sind, nach einem
enzymatischen Verfahren analysiert werden, bei dem Phospholipase
D und Cholinoxidase verwendet werden. Jedoch können
die verbleibenden 5% von Phospholipiden, bedingt durch die
Nichtreaktivität gegenüber Cholinoxidase, nicht analysiert
werden. Die nichtanalysierbaren Phospholipide sind Phospholipide
von Ethanolaminderivaten.
Die WO 80/01 081 betrifft die quantitative Bestimmung von
Wasserstoffperoxid in wäßrigen Medien und von Substraten,
die enzymatisch unter Bildung von Wasserstoffperoxid
oxidiert werden können. Dabei läuft folgende Reaktion ab:
Die gebildeten Fluoridionen werden mit einer fluoridselektiven
Elektrode gemessen. Als Beispiel für eine Wasserstoffperoxid
erzeugende Reaktion wird die enzymatische Umsetzung
von Ethanolamin zu Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid
mittels Ethanolaminoxidase aufgeführt.
Die US 41 35 980 A betrifft eine quantitative Bestimmung von
Phosphatidylcholin unter Verwendung von Cholinoxidase.
Die Druckschrift S.A. Narrod u. W.B. Jakoby; The Journal of
Biological Chemistry 239 (7), Seiten 2189 bis 2193 (1964)
betrifft den aeroben Katabolismus von Ethanolamin durch ein
Bodenbakterium. Dabei wurde gefunden, daß der erste Schritt
des Stoffwechselwegs zur Verwertung von Ethanolamin durch
Ethanolaminoxidase katalysiert wird.
Die Druckschrift S.A. Narrod u. W.B. Jakoby, in: Methods in
Enzymology, ed. W.A. Wood (Academic Press, New York) 1966,
Vol. IX, Seiten 354 bis 357, die im übrigen obiger Druckschrift
entspricht, beschreibt ein Bestimmungsverfahren, bei
dem Ethanolaminoxidase verwendet wird. Dem Bestimmungsverfahren
liegt folgende Reaktion zugrunde:
Ethanolamin + 1/2 O₂ → Glykolaldehyd + NH₃
Die Druckschrift T. Taki u. J.N. Kanfer, in: Methods in
Enzymology, ed. J.M. Lowenstein (Academic Press, New York)
1981, Vol. 71, Seiten 746 bis 750 beschreibt die enzymatischen
Reaktionen von Phospholipase D:
Phosphatidylcholin (oder Phosphatidylethanolamin) + H₂O
→ Phosphatidsäure + Cholin (oder Ethanolamin)
→ Phosphatidsäure + Cholin (oder Ethanolamin)
Chemical Abstracts 65 (1966): 17341h betrifft die Bestimmung
von Ethanolamin und Serin in Phospholipiden. Dabei wird das
Phospholipidgemisch mit Salzsäure hydrolysiert, durch Ionenaustausch-Chromatographie
aufgetrennt und Ethanolamin wird
colorimetrisch mittels Ninhydrin bestimmt.
Chemical Abstracts 81 (1975): 36519n betrifft die Bildung
von Phospholipase D durch Streptomyces hachÿoensis sowie
die Spezifität dieses Enzyms. Es wurde gefunden, daß dieses
Enzym mit Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin und
Phosphatidylserin zu Phosphatidsäure und Ethanolamin, Cholin
bzw. Serin und mit Sphingomyelin zu N-Acetylsphingosylphosphat
und Cholin reagiert.
Chemical Abstracts 88 (1978): 132931f betrifft Reagenzien
zur Bestimmung von Lezithinen. Die Lezithine in biologischen
Proben werden dabei unter Verwendung eines Inkubationssystem
bestimmt, das Phospholipase D, Cholindehydrogenase,
Betainaldehyddehydrogenase und NAD enthält. Die quantitative
Bestimmung erfolgt durch spektrometrische Messung des während
der Inkubation gebildeten NADH.
Es wurde jetzt gefunden, daß Bacillus sp. B-0783 FERM-P
Nr. 5798 Ethanolamiinoxidase erzeugt, welche eine Reaktion
zwischen Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser unter Bildung
von Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid katalysiert.
Es wurde weiterhin gefunden, daß Ethanolamin analysiert
werden kann, indem man eine Ethanolamin enthaltende
Probe mit Ethanolaminoxidase behandelt und die Menge an verbrauchtem
Sauerstoff oder freigesetztem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid
mißt. Es wurde weiterhin gefunden, daß durch
Anwendung dieses Verfahrens die Phospholipide von Ethanolaminderivaten
allein ebenfalls analysiert werden können, indem
man diese Derivate mit Phospholipase D unter Freisetzung
von Ethanolamin behandelt und gleichzeitig oder danach mit
Ethanolaminoxidase behandelt und dann den verbrauchten
Sauerstoff oder das freigesetzte Ammoniak oder Wasserstoffperoxid
mißt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
ein Analyseverfahren für Phosphatidylethanolamin in
einer Probe zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß soll ein Analyseverfahren zur Verfügung gestellt
werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man die Phosphatidylethanolamin enthaltende Probe mit Phospholipase
D und mit Ethanolaminoxidase, einem Enzym, das
die Reaktion von Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser zu Glykolaldehyd,
Ammoniak und Wasserstoffperoxid katalysiert, behandelt
und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder die
Menge an gebildetem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid in dem
Reaktionssystem mißt, wobei die Menge an Ethanolaminoxidase
mehr als 0,1 U/ml beträgt.
Erfindungsgemäß soll ein einfaches und genaues Analyseverfahren
für Phosphatidylethanolamin in einer Probe zur Verfügung
gestellt werden.
Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt
werden, mit dem quantitativ ein spezifisches Phosphatidylethanolaminderivat
in einer Probe, welche verschiedene
Phospholipide, wie Phospholipide von Ethanolaminderivaten
und Cholinderivaten, enthält, bestimmt werden kann.
Die Phospholipase D ist ein Enzym, welches
eine Reaktion katalysiert, bei der Phosphatidinsäure
und Cholin aus einem Molekül Lecithin und Wasser gebildet
werden.
Phospholidase D wird bevorzugt aus Mikroorganismen gewonnen.
Beispielsweise kann sie aus der Kulturbrühe von Streptomyces
hachÿoensis A-1143 FERM-P Nr. 1329, Streptomyces
chromofuscus A-0848 FERM-P Nr. 3519 erhalten werden, oder
man kann im Handel erhältliche Phospholipase D verwenden.
Die Menge an Phospholipase D sollte eine ausreichende Menge
sein, um Ethanolamin freizusetzen, beispielsweise mehr als
0,1 U/ml enzymatische Aktivität, vorzugsweise 2 bis 50 U/ml.
Die Reaktion verläuft in schwach sauerer oder alkalischer
Pufferlösung, wie Tris-HCl-Puffer, Citratpuffer, Boratpuffer,
Pipes-NaOH-Puffer oder Imidazolpuffer, über 5 Minuten,
bevorzugt 10 bis 20 Minuten, bei 37°C.
Das so freigesetzte Ethanolamin oder das ursprünglich vorhandene
Ethanolamin wird mit Ethanolaminoxidase behandelt,
welche Ethanolamin, Sauerstoff und Wasse unter Bildung von
Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid verbraucht.
Ethanolaminoxidase kann beispielsweise aus der Kulturbrühe
von Bacillus sp. B-0783 FERM-P Nr. 5798 (japanische Patentanmeldung
Nr. 56-91 937) oder einem Mikrobenstamm des Genus
Arthrobacter. (J. Biol. Chem., 239, 2189 (1964)) erhalten
werden. Das Enzym kann bevorzugt gereinigt oder zu einem immobilisierten
Enzym modifiziert werden.
Die taxonomischen Eigenschaften von Bacillus sp. B-0783
sind wie folgt:
- (1) Bouillon-Agarplatte (30°C, 18 Stunden Kultur):
rund, ebene Kolonie, glatte Kante, gräulich-weiß bis schwach gelblich-grau
keine Bildung von löslichem Pigment - (2) Bouillon-Agarschrägplatte (30°C, 18 Stunden Kultur):
filamentartiges gutes Wachstum, gräulich-weiß bis schwach gelblich-grau
keine Bildung von löslichem Pigment - (3) Bouillon-Brühe (30°C, 32 Stunden Kultur):
schwaches Wachstum, Präzipitation
Züchtung auf Nähragarmedium bei 30°C über 18 Stunden.
- (1) Form und Größe der Zellen:
einzelne, doppelte oder kurze Verbindung, Bacilli mit runden Kanten, 1,0-1,5 × 2,0-5,0 µm - (2) Polymorphismus: keiner
- (3) Mobilität und Flagella:
peritrichös, mobil - (4) Sporen (Form, Stellung, Größe):
Sporen, sphärisch oder elliptisch, Formen an den Kanten oder fast Kanten der Zellen, spindelartige Sporen
(C) Physiologische Eigenschaften | ||
Nitratreduktion|+ | ||
Dinitratreaktion | - | |
MR-Test | - | |
VP-Test | - | |
Indolbildung | - | |
H₂S | - | |
Gelatinehydrolyse | + (schwach) | |
Stärkehydrolyse | - | |
Citratausnutzung @ | Simons-Medium | - |
Chrystensen-Medium | - | |
Nitratausnutzung | + | |
Ammoniumsalzausnutzung | - | |
Pigmentbildung | - | |
Oxidase | + | |
Catalase | + | |
Urease @ | SSR-Medium | - |
Chrystensen-Medium | - | |
Wachstumsbedingungen: @ | pH: optimaler pH-Wert | 6,5-8,0 |
Wachstums-pH-Wert | 5,0-9,0 | |
Temperatur: @ | optimale Temperatur | 25-37°C |
Wachstumstemperatur | 10-42°C | |
Natur: aerob @ | OF-Test (Hugh-Leifson-Medium) | Al (alkalisch) |
OF-Test (modifiziertes Medium) | Al (alkalisch) | |
Aesculinzersetzung | - | |
Cellulosezersetzung | - | |
Gram-Verfahren | + | |
schnelles Säure-Verfahren | - | |
Säure- und Gasbildung |
Unter Beachtung der obigen taxonomischen Eigenschaften kann
der Stamm B-0783, der gram-positiv und ein sporenbildender
Bazillus ist, als genus Bacillus betätigt werden, wenn man
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl.
(1974) zur Prüfung heranzieht. Es werden weiterhin verschiedene
taxometrische Eigenschaften entsprechend der Beschreibung
des obigen Manuals und The Genus Bacillus, Agricultural
Handbook, Seite 427 geprüft, und nachdem keine identischen
Eigenschaften festgestellt wurden, wurde dieser Stamm
als Bacillus sp. B-0783 bezeichnet. Der Stamm wurde im Fermentation
Research Institute, Agency of Technological Science
and Industry, M.I.T.I., Japan unter FERM-P Nr. 5798 hinterlegt.
Ethanolaminoxidase kann erhalten werden, indem man den obigen
Ethanolamin erzeugenden Bacillus sp. in einem an sich
bekannten Medium züchtet. Man kann ein festes oder flüssiges
Medium verwenden, jedoch ist eine flüssige submerse
Lüftungskultur für die industrielle Erzeugung bevorzugt.
Für die Enzymbildung können die an sich bekannten Nährmedien
ausgewählt werden. Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare
Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose,
Lactose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melassen oder Glycerin,
verwendet werden. Assimilierbare Stickstoffquellen, wie
Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenpulver,
Weizengluten, Pepton, Fleichextrakt, Hefeextrakt oder Caseinhydrolysat
können verwendet werden. Verschiedene Salze,
wie Natriumchlorid, Kaliumchloid, Kaliumphosphat oder Magnesiumsulfat,
können ebenfalls gegebenenfalls verwendet
werden. Die Zugabe von Alkylamin, wie Ethanolamin oder
Propionylamin, zu dem Medium bei einer Konzentration von
0,1 bis 1% induziert die Bildung von Ethanolaminoxidase.
Die Züchtungstemperatur kann innerhalb eines Bereichs, der
für das Wachstum der Mikroorganismen und Bildung von Enzym
geeignet ist, ausgewählt werden und beträgt bevorzugt 26
bis 33°C, besonders bevorzugt 30°C. Die Züchtungszeit kann
in Abhängigkeit von den Bedingungen ausgewählt werden und
beträgt im allgemeinen 15 bis 25 Stunden. Die Züchtung erfolgt
bei 200 bis 400 rpm unter Belüftung und sollte natürlich
beendet werden, wenn die Ethanolaminoxidasebildung im
wesentlichen beendet ist.
Beispiele für die Extraktion der Ethanolaminoxidase aus der
Kulturmasse werden im folgenden erläutert.
Da die Ethanolaminoxidase ein Endo-Enzym ist, wird die Kulturmasse
filtriert oder zentrifugiert, und die Bakterienzellen
werden mittels mechanischer Einrichtungen, wie einer
Französischen Presse oder einer Behandlung mit Glasperlen,
oder mittels enzymatischer Verfahren, wie mit Lysozym,
zerstört bzw. abgebaut. Oberflächenaktive Mittel, wie Triton
X-100 (Warenzeichen) oder Adekatol SO-120 (Warenzeichen)
werden gegebenenfalls weiter zugegeben. Die so erhaltene
rohe Ethanolaminoxidase wird nach an sich für Enzyme bekannten
Isolierungs- und Reinigungsverfahren gereinigt. Beispielsweise
kann man eine fraktionelle Präzipitation mit
Aceton, Ethanol oder Isopropanol und Aussalzen mit Ammoniumsulfat
bevorzugt anwenden. Die weitere Reinigung kann
beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie unter
Verwendung von DEAE-Sephadex, DEAE-Sephalose, DEAE-Cellulose,
CM-Cellulose, CM-Sephadex oder CM-Sephadex, oder
durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von
Sephadex G-200, Sepharose CL-6B oder Sephacryl S-200, und
Lyophilisierung erfolgen.
Das Analyseverfahren und die biochemischen Eigenschaften
von Ethanolaminoxidase, erhalten aus Bacillus sp. B-0783,
sind wie folgt:
- (1) Analyse- bzw. Assayverfahren (Wenn in der vorliegenden
Anmeldung von "Analyse" gesprochen wird, kann hierfür
selbstverständlich auch der Ausdruck "Assay" verwendet
werden.)
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)|0,1 ml 0,3% 4-Aminoantipyrin 0,02 ml 2 mM N,N-Diethyl-m-toluidin 0,05 ml (45 U/ml) Peroxidase 0,05 ml 0,1 M Ethanolamin 0,05 ml destilliertes Wasser 0,18 ml insges. 0,45 ml
Das obige Gemisch (0,45 ml) wird bei 37°C während 2
Minuten vorinkubiert, dann wird Enzymlösung (50 µl)
zugegeben, und bei 37°C wird während 10 Minuten inkubiert.
Die Reaktion wird beendet, indem man Ethanol
(2,5 ml) zugibt und colorimetrisch bei 550 nm mißt.
Eine Einheit (1 Einheit, 1 U) von Enzymaktivität wird
als die Aktivität des Enzyms definiert, welche 1 µmol
Wasserstoffperoxid pro Minute freisetzt.
Die Potenz des Enzyms wird gemäß folgender Gleichung
berechnet.
worin ΔA₅₅₀ der Absorptionswert bei 550 nm ist.
Bei der Oxidation von einem Mol Ethanolamin werden ein
Mol Sauerstoff und ein Mol Wasserstoff verbraucht, und
es werden ein Mol Glykolaldehyd, ein Mol Ammoniak und
ein Mol Wasserstoffperoxid freigesetzt.
Substrat | |
Aktivität (%) | |
Ethanolamin | |
100 | |
1-Amino-2-propanol | 26,5 |
3-Amino-2-propanol | 357 |
3-Amino-1,2-propandiol | 0 |
Diethanolamin | 0 |
Triethanolamin | 0 |
Cholin | 0 |
pH 7 bis 7,5
vgl. Fig. 1
pH 6-7: Phosphatpuffer
pH 7-9: Tris-HCl-Puffer
vgl. Fig. 1
pH 6-7: Phosphatpuffer
pH 7-9: Tris-HCl-Puffer
Die Enzymlösung wird zu Puffern (100 mM) verschiedener
pH-Werte (pH 5-7,5: Dimethylglutarat-Puffer, pH 8-
9,5: Tris-HCl-Puffer, pH 9-10: Glycin-NaOH-Puffer)
zugegeben, und dann wird bei 60°C während 15 Minuten
erwärmt, und die restliche Aktivität wird analysiert.
Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt, wobei ein stabiler
pH 6 bis 8 beträgt.
Die Enzymlösung (2,5 U/ml) in 10 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 8,0) wird während 10 Minuten bei 40 bis 75°C behandelt,
und die verbleibende Aktivität wird analysiert.
Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Das Enzym ist
bis 60°C stabil.
Ungefähr pH 4,60 (analysiert durch isoelektrischer Fokussierung
unter Verwendung eines Ampholits als Carrier)
(8) Wirkung von Metallion und EDTA | |
Metallion, EDTA | |
Aktivität (%) | |
Vergleich (keine Zugabe) | |
100 | |
1 mM CaCl₂ | 35 |
1 mM MgCl₂ | 110 |
1 mM BaCl₂ | 58 |
1 mM MnCl₂ | 52 |
1 mM EDTA | 122 |
100 mM KCl | 97 |
100 mM NaCl | 64 |
100 mM NH₄Cl | 61 |
100 mM LiCl | 36 |
(9) Wirkung der oberflächenaktiven Mittel | |
Oberflächenaktive Mittel | |
Aktivität (%) | |
Kontrolle (keine Zugabe) | |
100 | |
0,1% Triton X=100 | 98 |
0,1% Adekatol SO-145 | 90 |
0,1% Natriumdeoxycholat | 83 |
0,1% Natriumlaurylbenzolsulfat | 29 |
0,1% Natriumlaurylsulfat | 26 |
Die Menge an Ethanolaminoxidase, die bei dem Assay verwendet
wird, beträgt mehr als 0,1 U/ml, bevorzugt mehr als 0,5
U/ml, bei 37°C während einer Minute, bevorzugt während 5
Minuten. Die Ethanolaminoxidase kann mit Phospholipase D
gleichzeitig oder daran anschließend verwendet werden.
Am Ende der Reaktion wird der verbrauchte Sauerstoff oder
das freigesetzte Ammoniak oder Wasserstoffperoxid gemessen.
Die entsprechende Elektrode, wie eine Sauerstoffelektrode,
Ammoniakelektrode, Ammoniumelektrode oder Wasserstoffperoxidelektrode,
wird für den Nachweis verwendet. Man kann
auch eine immobilsierte Enzymelektode von Ethanolaminoxidase
oder Ethanolaminoxidase-Phospholipase D verwenden. Bei
der Analyse mit der Elektrode werden die elektrischen Stromänderungen,
die der Menge an der nachzuweisenden Komponente
entsprechen, für die quantitative Analyse gemessen, und
der elektrische Strom wird durch Grenzflächen-Endpunkt-Bestimmung
oder ein Meßverfahren, bei dem die Höhe der Werte
bestimmt wird, oder ein quadratisches Differentialverfahren
gemessen, wobei die entsprechenden Werte in der Aufzeichnungseinrichtung
aufgezeichnet werden.
Die colorimetrische Analyse kann für die quantitative Bestimmung
von Wasserstoffperoxid angewendet werden. Beispielsweise
kann man ein oder mehrere sich verfärbende
Mittel oder fluoreszierende Mittel, die ihre Farbe in Anwesenheit
von Wasserstoffperoxid, ändern, verwenden. Beispiele
für Farbstoffe sind Peroxidase, wie Meerrettichperoxdase,
und Farbstoffvorstufen, wie ein Gemisch aus einem
Elektronenakzeptor und einer Phenolverbindung.
Beispiele für Elektronenakzeptoren sind 4-Aminoantipyrin,
2-Hydrozinobenzothiazol bzw. 2-Hydrazinbenzothiazol, 3-Methyl-2-benzothiazolhydrozin
oder 2-Aminobenzothiazol. Beispiele für Phenolverbindungen
sind Phenol, 3-Methyl-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)anilin,
3,5-Xylenol, N,N-Dimethylanilin oder N,N-Diethylanilin.
Beispiele für fluoreszierende Mittel sind die üblichen Mittel,
wie beispielsweise Bis(2,4,6-trichlorphenol)oxalat,
Phenylthiohydantoin, Homovanillinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure,
Vanillylamin, 3-Methylthiramin, Fluorlethinsäure,
Hordenin, Luminolmonoanion, Lucigenin oder Wafin.
Diese fluoreszierenden Mittel können gegebenenfalls zusammen
mit Elektronenakzeptoren und Peroxidase verwendet werden.
Die Menge an Enzymreagenz und Farbstoffvorstufe ist nicht
begrenzt und beträgt im allgemeinen mehr als 0,05 Einheiten
für die Peroxidase bei einem einfachen Test, bevorzugt 0,1
bis 500 Einheiten, bei einer Konzentration von 0,1 mM in
destilliertem Wasser oder einem schwach sauren oder alkalischen
Puffer für den Elektronenakzeptor und die Phenolverbindung.
Diese Reagenzien können getrennt und zusammen mit
der obigen Phospholinpase C oder D und der Ethanolaminoxidase
verwendet werden. Diese Reagenzien können weiterhin
in lyophilisierter Form oder in laminierter Form auf Filterpapier
oder Film für die quantitative Analyse vorliegen.
Das erfindungsgemäße Analyse- bzw. Assayverfahren ist für
die spezifische quantitative Bestimmung von Phosphatidylethanolamin
in Serum-Phospholipiden geeignet.
Die klinische Prüfung in Kombination mit der Analyse von
Cholinderivat und Ethanolaminderivat erlaubt die getrennte
Bestimmung von Phospholipid der Ethanolaminderivate und
von Phospholipid der Cholinderivate.
Die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele erläutern die
Erfindung.
Beispiel 1 | ||
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)|0,5 ml | ||
0,3% 4-Aminoantipyrin | 0,3 ml | |
0,2% Phenol | 0,3 ml | |
Peroxidase (45 U/ml, Sigma Chem.) | 0,1 | |
Ethanolaminoxidase (6 U/ml, erhalten aus dem Bezugsbeispiel 1) @ | 0,5% NaN₃ | 0,3 ml |
5% Triton X-100 | 0,2 ml | |
10 mM MgCl₂ | 0,3 ml | |
destilliertes Wasser | 0,9 ml | |
insgesamt | 3,0 ml |
Zum Vergleich wird eine Ethanolaminlösung (5 bis 25 µl)
zu dem obigen Reaktionsgemisch (3,0 ml) zugegeben.
Bei 37°C wird 20 Minuten lang inkubiert und anschließend bei
500 nm colorimetrisch gemessen.
Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt. Man erhält eine
ganz genaue Standardkurve von Ethanolamin.
Das Ethanolamin wird durch ein Reaktionsgemisch aus Phosphatidylethanolamin,
behandelt mit Phospholipase D (die
Triton X-100 und MgCl₂ enthält), ersetzt, und dann wird
bei 37°C während 10 Minuten inkubiert, um das Phosphatidylethanolamin
zu analysieren.
Beispiel 2 | |
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)|0,5 ml | |
0,3% 4-Aminoantipyrin | 0,3 ml |
0,2% Phenol | 0,3 ml |
Peroxidase (45 U/ml) | 0,1 ml |
Ethanolaminoxidase (6 U/ml) | 0,1 ml |
0,5% NaN₃ | 0,3 ml |
5% Triton X-100 | 0,2 ml |
10 mM MgCl₂ | 0,3 ml |
Phospholipase D (20 U/ml, Toyo Jozo Co.) | 0,1 ml |
destilliertes Wasser | 0,8 ml |
insgesamt | 3,0 ml |
10 mM Phospholipidemulsion (5 bis 25 µl) wird zu dem obigen
Reaktionsgemisch (3 ml) zugegeben, und dann wird bei 37°C
während 20 Minuten inkubiert und colorimetrisch bei 500 nm
gemessen.
Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt, worin Phosphatidylamin und Lecithin als Phospholipid verwendet wurden.
Gemäß der Figur wirkt das Enzym nicht auf Lecithin,
und das Phosphatidylethanolamin konnte genau analysiert
werden.
Beispiel 3 | |
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)|0,2 ml | |
Ethanolaminoxidase (6 U/ml) | 0,1 ml |
destilliertes Wasser | 0,7 ml |
insgesamt | 1,0 ml |
Als Vergleich wird 2 mM Ethanolamin (5 bis 25 µl) zu dem
obigen Reaktionsgemisch (1 ml) zugegeben; dann wird bei
37°C während 10 Minuten inkubiert, und der verbrauchte
Sauerstoff wird mittels einer Sauerstoffelektrode (Produkt
von Ishikawa Seisakusho) gemessen.
Das Ergebnis ist in Fig. 6 dargestellt. Man kann eine genaue
lineare Standardkurve beobachten. Die Linearität kann
bis mindestens 0,05 µmol Ethanolamin beobachtet werden.
Phosphatidylethanolamin kann quantitativ bestimmt werden,
indem man Phosphatidylethanolamin, welches mit Phospholipase
D (die Triton X-100 und MgCl₂ enthält) behandelt wurde,
statt Ethanolamin verwendet.
Beispiel 4 | |
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)|0,5 ml | |
Ethanolaminoxidase (6 U/ml) | 0,1 ml |
10 mM MgCl₂ | 0,2 ml |
5% Triton X-100 | 0,1 ml |
Phospholipase D (20 U/ml) | 0,1 ml |
destilliertes Wasser | 1,0 ml |
insgesamt | 2,0 ml |
2 mM Phosphatidylethanolamin (5 bis 25 µl) wird zu dem obigen
Reaktionsgemisch (2,0 ml) zugegeben, und dann wird bei
37°C während 10 Minuten inkubiert. Die Menge an freigesetztem
Wasserstoffperoxid wird unter Verwendung einer Wasserstoffperoxidelektrode
(YSI Co., Oxidasemeter) bestimmt,
und 0,05 µmol Phosphatidylethanolamin konnte linear analysiert
werden.
Die obige Wasserstoffperoxidelektrode kann durch eine
Sauerstoffelektrode ersetzt werden, mit der die Menge an
verbrauchtem Sauerstoff gemessen werden kann.
Beispiel 5 | |
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)|0,2 ml | |
Ethanolaminoxidase (6 U/ml) | 0,1 ml |
5% Triton X-100 | 1,0 ml |
destilliertes Wasser | 2,6 ml |
insgesamt | 3,0 ml |
Als Vergleich wird 2,5 mM Ethanolamin (10 bis 50 µl) zu
dem obigen Reaktionsgemisch (3,0 ml) zugegeben; dann wird
bei 37°C während 15 Minuten inkubiert, anschließend wird
5 N NaOH (50 µl) zugegeben, und die Menge an freigesetztem
Ammoniak wird unter Verwendung einer Ammoniakelektrode
(Produkt von Ishikawa Works) gemessen.
Das Ergebnis ist in Fig. 7 dargestellt. 0,025 µmol Ethanolamin
konnte linear analysiert werden.
Anstelle von Ethanolamin, kann Phosphatidylethanolamin, welches
mit Phospholipase D (die Triton X-100 und MgCl₂ enthält)
bei 37°C während 10 Minuten behandelt wurde, analysiert
werden.
Ein wäßriges Medium (20 l, pH 6,8), welches 1,5% Pepton,
0,5% gepulverten Hefeextrakt, 0,2% KCl, 0,1% NaCl, 0,1%
K₂HPO₄, 0,1% MgSO₄, 0,05% Silicon KM-72 und 0,5% Ethanolamin
enthält, wird in einem 20-Liter-Fermentationsbehälter
bei 120°C während 20 Minuten sterilisiert. Eine Impfkultur
von Bacillus sp. B-0783 FERM-P Nr. 5798, welche auf einer
Rotationsschüttelvorrichtung bei 30°C während 20 Stunden
im gleichen Medium (500 ml) gezüchtet wurde, wurde zur Inokulation
des obigen Mediums verwendet. Dann wurde bei 30°C
während 17 Stunden bei 3000 rpm mit einer Belüftung von
20 l/min gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde bei 5000 rpm
während 20 Minuten zentrifugiert, und man erhält Bakterienzellen.
Die Zellen werden in Lysozym (Eizai Co., 500 mg)-
Lösung (2 l) in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert
und bei 37°C während 2 Stunden inkubiert, und man erhält
eine rohe Enzymlösung (1700 ml, 0,2 U/ml). Kaltes Aceton
(850 ml) wird zugegeben, und das Präzipitat wird durch
Zentrifugieren (5000 rpm, 10 Minuten) entfernt. Weiter
wird kaltes Aceton (1200 ml) zu der überstehenden Lösung
gegeben, und der Niederschlag wird bei 0°C und 5000 rpm
während 10 Minuten abzentrifugiert.
Das Präzipitat wird in 0,1 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 100
ml), welcher 0,5 M KCl enthält, gelöst und in einem Cellophanbeutel
dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert, und
man erhält Ethanolaminpulver (0,1 U/mg, 3,2 g).
1,0 g Pulver wird in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 15 ml)
gelöst und auf eine Säule (2,5×21 cm) von DEAE-Sepharose
CL-6B (Pharmacia Co.) gegeben, die mit dem gleichen Puffer
equilibriert ist, und dann wird mit dem gleichen Puffer
(500 ml) gewaschen. Die Gradienteneluierung mit 200 ml
10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und dem gleichen Puffer, der
0,5 M KCl enthält, wird durchgeführt. Es werden je 10-ml-
Fraktionen fraktioniert, und die aktiven Fraktionen Nr. 56
bis 66 werden gesammelt. Die vereinigte aktive Fraktion
wird gegenüber 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert
und lyophilisiert, und man erhält Ethanolaminoxidasepulver
(0,7 U/ml, 110 mg).
Die Zeichnungen erläutern die Erfindung. Es zeigt
Fig. 1 den optimalen pH-Wert von Ethanolaminoxidase;
Fig. 2 die pH-Stabilitätskurve von Ethanolaminoxidase;
Fig. 3 die Wärmestabilitätskurve von Ethanolaminoxidase;
Fig. 4 die Standardkurve von Ethanolamin;
Fig. 5 die Kurve für die quantitative Analyse von
Phosphatidylethanolamin durch Bestimmung der Menge an
Wasserstoffperoxid;
Fig. 6 die Kurve für die quantitative Analyse von
Ethanolamin durch Bestimmung der Menge an verbrauchtem
Sauerstoff; und
Fig. 7 die Kurve für die quantitative Analyse von
Ethanolamin mittels einer Ammoniakelektrode.
Claims (1)
- Verfahren zur Analyse von Phosphatidylethanolamin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphatidylethanolamin enthaltende Probe mit Phospholipase D und mit Ethanolaminoxidase, einem Enzym, das die Reaktion von Ethanolamin, Sauerstoff und Wasser zu Glykolaldehyd, Ammoniak und Wasserstoffperoxid katalysiert, behandelt und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder die Menge an gebildetem Ammoniak oder Wasserstoffperoxid in dem Reaktionssystem mißt, wobei die Menge an Ethanolaminoxidase mehr als 0,1 U/ml beträgt.
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