DE2857338C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin und Reagens zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin und Reagens zur Durchführung des Verfahrens

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DE2857338C2
DE2857338C2 DE2857338A DE2857338A DE2857338C2 DE 2857338 C2 DE2857338 C2 DE 2857338C2 DE 2857338 A DE2857338 A DE 2857338A DE 2857338 A DE2857338 A DE 2857338A DE 2857338 C2 DE2857338 C2 DE 2857338C2
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Kazuo Machida Tokyo Aisaka
Hiroko Yokohama Kanagawa Akita
Akira Mihara
Toshiaki Nagai
Yoshiaki Shizuoka Shimizu
Osamu Terada
Takayuki Uwajima
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Description

Glycerin ist als Bestandteil der Lipoide, aber auch in freier Form in der Natur weitverbreitet. Außerdem kommt es in Genußmitteln und Industrieprodukten vor. In Medizin und Biologie hat die enzymatische Bestimmung von Glycerin seit ihrer ersten Beschreibung durch O. Wieland, Biochem.Z. Bd. 329 (1957), S. 313, rasch anwachsendes Interesse gefunden. Die breite Anwendung dei Methode liegt in erster Linie in ihrer Spezifität und Einfachheit begründet, die umständliche, vorausgehende Reinigung des Untersuchungsmaterials überflüssig
Glycerin wird durch ATP und Glycerokinase (GK) in Glycerophosphat übergeführt. Als Indikatorreaktion dient die Dehydrierung des Glycerin-3-phosphats durch die NAD-abhängige Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (GDH).
Glycerin+ ATP L-<-)-Glycerin-3-P + ADP W L-(-)-Glycerin-3-P + NAD + ;=S^ DAP + NADH + H+ (2)
Die NADH-Zunahme. gemessen an der Extinktionsänderung bei 340 (334, 365) mn ist der Glycerin-Menge proportional.
Ein weiteres bekanntes enzymatisches Verfahren zur Glycerinbestimmung verwendet ebenfalls Glycerokinase (E. C. 2.7.1.30). Jedoch muß die Umsetzung zusammen mit Pyruvatkinase (E. C. 2.7.1.40) und Lactatdehydrogenase (E. C. 1.1.1.27) durchgeführt werden. Diese Bestimmung ist somit sehr zeitaufwendig und für größere Probenzahlen ungeeignet.
E.C.C. Lin berichtet in Annual Review of Microbiology, Bd. 30 (1976), S. 535, 537 über die Postulierung der so Existenz eines Enz-ms, das Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff und Flavin in Dihydroxyaceton und Wasserstoffperoxid umwandelt. Dieses Enzym wird als Glycerinoxidase bezeichnet, ist jedoch nicht näher charakterisiert worden.
Ferner sind aus in Microbial Physiology, Bd. 3 (1969), S. 207 bis 208, Flavoproteinenzyme aus Lactobacilli und Chlostridia bekannt, die u. a. Glycerin und rt-Glycerinphosphorsäureester unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidieren. Eine Bildung von Dihydroxyaceton oder Glycerinaldehyd ist nicht beschrieben.
In der Stammanmeldung, vgl. DE-OS 28 17 087, ist eine Glycerinoxidase mikrobiellen Ursprungs beschrieben und beansprucht, die Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd oxidiert.
Dieses Enzym weist folgende enzymologischen und physiko-chemischen Eigenschaften auf:
1. Wirkung
Das Enzym oxidiert Glycerin unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd.
2. Substratspc/.ifitat
Das Enzym reagiert spezifisch mit ülvcerin.
3. pH-Optimum und stabiler pH-Bereich 3.1 pH-Optimum
Durch Mikroorganismen der Gattung Aspergillus gebildete Glycerinoxidase
(nachstehend als »Enzym der Gattung Aspergillus« bezeichnet) pH-Wert 7 bis 8
Glycerinoxidase, gebildet durch Mikroorganismen der Gattung Neurospora (nachstehend als »Enzym der Gattung Neurospora« bezeichnet) pH-Bereich 8,0 bis 8,5
3.2 Stabiler pH-Bereich
Enzym der Gattung Aspergillus pH-Bereich 5,0 bis 8,0
Enzym der Gattung Neurospora pH-Wert 5,0 bis 8,0
4. Verfahren zur Bestimmung der Enzymaklivität
Die Enzymaktivität wird in Einheiten angegeben. Unter »1 Einheit« ist die Enzymaktivität zu verstehen, die 1 μ Mol Glycerin bei 37°C in Gegenwart von Sauerstoff innerhalb 1 Minute zersetzt. Die Bestimmung der Enzymaktivität wird folgendermaßen durchgeführt: Glycerin wird unter Rühren mit Glycerinoxidase umgesetzt, wobei Wasserstoffperoxid gebildet wird. Das erhaltene Wasserstoffperoxid wird in Gegenwart von Peroxidase mit 4-Aminoantipyrin und Phenol umgesetzt, wobei ein Chinoniminpigment entsteht. Die optische Dichte des erhaltenen Chinoniminpigments bei 500 nm wird zur Bestimmung der Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid gemessen. Dadurch wird die Enzymaktivität bestimmt (dieses Verfahren wird nachstehend als »4-AA-Verfahren« bezeichnet).
Die spezifische Aktivität ist definiert durch die Anzahl der Enzymeinheiten pro 1 mg Protein. Die Menge des Enzymproteins wird gemäß dem Lowry-Verfahren unter Verwendung eines Kupfer-Folin-Reagens bestimmt; vgl. O. H. Lowry, N. |. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall, J. Biol. Chem., Bd. 193(1951), S. 265.
5. Temperaturoptimum der enzymatischen Wirkung
Enzym der Gattung Aspergillus etwa 400C
Enzym der Gattung Neurospora 40 bis 45°C
6. Einfluß von Temperatur und pH-Wert auf
die Enzyminaktivierung
6.1 Temperatur
Das Enzym der Gattung Aspergillus wird durch 30-minütige Behandlung bei 45°C zu etwa 60 Prozent und durch 30-minütige Behandlung bei 60'C im wesentlichen vollständig inaktiviert.
Das Enzym der Gattung Neurospora wird durch 30-minütige Behandlung bei 25°C zu etwa 50 Prozent und durch 30-minütige Behandlung bei 500C im wesentlichen vollständig inaktiviert.
6.2 pH-Wert
Das Enzym der Gattung Aspergillus wird durch 30-minütige Behandlung bei einem pH-Wert oberhalb von 10 oder unterhalb von 4 inaktiviert.
Das Enzym der Gattung Neurospora wird ebenfalls bei den vorgenannten pH-Werten inaktiviert.
7. Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung
7.1 Hemmung
Die Aktivität des Enzyms ohne Zusatz von In'.iibitor wird als 100 gesetzt. In Tabelle 1 sind die enzymatischen Aktivitäten in Gegenwart von verschiedenen Inhibitoren in einer Konzentration von 1 millimolar angegeben. Die Aktivitäten werden gemäß dem 4-AA-Verfahren gemessen, wobei mit Hilfe des entstandenen H2O2 ein 4-Aminoantipyrin-Pigmcntsystem gebildet wird.
IO 15 20 25
28 57 338 Enzym der Gattung
Tabelle ! Neurospora
Inhibitor Enzym 100
Enzym der Galtung —
Aspergilhis 23
Ohne 100 —
AgNOj 30 20
HgCI2 20 23
Pb(CH3COO)2 15 0
CuSO4 10 —
ZnSO4 — —
FeSO4 — —
NaNi 20 108
o-Phenanthrolin 90 —
Λ,Λ'-Dipyridyl 85 0
PCMBip-Chlormercuribenzoat) 50 —
N-Ethylmaleimid 100 20
NH2OH-HCI 0 —
8-Hydroxylchinolin 90 100
Diethyldithiocarbamat 35 60
Neocuproin 100 —
Jodacetat — 80
Cystein —
Dhhiothreit 100
EDTA 105
7.2 Aktivierung
Es ist keine speziell zur Aktivierung geeignete Verbindung bekannt.
7.3 Stabilisierung
Das Enzym der Gattung Aspergülus läßt sich durch Zusatz von 0,1 bis 1.0 millimolar einer Sulfhydrylverbindung, wie Mercaptoethanol und Dithiothreit, stabilisieren.
8. Reinigungsverfahren
Die Reinigung kann gemäß folgenden üblichen Verfahren durchgeführt werden:
40 45
50
55
1.' Fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat;
2. Säulenchromatographie an DEAE-Celluiose:
3. Molekularsiebfraktionierung unter Verwendung von dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex);
4. Säulenchromatographiean Hydroxyapatit;
5. Gefriertrocknung der aktiven Fraktionen.
Diese Verfahren sind nachstehend näher erläutert.
9. Molekulargewicht
Das Molekulargewicht des im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyms wird durch Gelchromatographie an einer mit dreidimensional vcrnctzicrr. Dextran (Sephadex G-200) gepackten Säule bestimmt. Es ergibt s;ch für das Enzym der Gattung Aspergülus ein Molekulargewicht von mindestens 300 000.
10. Kristallstruktur und Elementaranalyse
Eine Kristallisation des Enzyms konnte bisher nicht erreicht werden. Eine Elementaranalyse wurde nicht durchgeführt
Aus den vorstehenden Eigenschaften ergibt sich, daß es sich bei dem Enzym um eine Glycerinoxidase handelt, die in der Lage ist, Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd zu oxidieren.
Nachstehend sind Mikroorganismenstämme aufgeführt, mit denen die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Glycerinoxidase hergestellt werden kann:
Aspergülus japonicus KY-45 (FERM-P Nr. 3959, NRRL 11102),
Aspergülus oryzae KY-63 (NRRL 11103).
Aspergülus parasiticus KY-77 (NRRL 11104),
Aspergülus flavus KY-98 (NRRL 11105),
Neurospora crassa KY-462 (FERM-P Nr. 3960. NRRL 11106),
Neurospora sitophila KY-445(NRRLIl264) und
Neurospora tetrasperma KY-447 (NRRL 11265).
Zur Züchtung dieser Mikroorganismen können beliebige synthetische und natürliche Medien verwendet werden, die die entsprechenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Bestandteile und anderen Nährstoffe enthalten.
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose und Melassen, und Zuckeralkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit.
Beispiele für Stickstoffquelien sind Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumverbindüngen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff, und stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, entfettete Sojabohnen und Hydrolyseprodukte davon.
Als organische Bestandteile können Salze von Metallen, wie Natrium, Kalium, Mangan, Magnesium, Calcium, Kobalt, Nickel, Zink und Kupfer, sowie Salze der Chromsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und Salzsäure verwendet werden.
Im Züchtungsverfahren läßt sich Glycerinoxidase in besonders hohen Ausbeuten herstellen, wenn ein Glycerinoxidase bildender Mikroorganismus in einem Medium mit einem Gehalt an Glycerin gezüchtet wird. Beispielsweise ist die Produktivität an Glycerinoxidase, ausgedrückt als enzymatische Aktivität, bei Züchtung in einem Medium mit einem Gehalt an Glycerin, 10- bis lOOfach höher als bei Züchtung des Mikroorganismus in einem Medium mit einem Gehalt an 1 g/dl Glucose, 1 g/dl Malzextrakt und 0,5 g/dl Hefeextrakt oder in Czapeck-Medium. Vorzugsweise wird Glycerin in Mengen von 0,1 bis 5 g/dl dem Medium zugesetzt.
Die Züchtung wird im allgemeinen bei Temperaturen von 20 bis 40°C und vorzugsweise bei 25 bis 35°C und bei pH-Werten von 6 bis 8, vorzugsweise bei etwa 7, durchgeführt. Eine beträchtliche Menge an Glycerinoxidase bildet sich in der erhaltenen Kulturbrühe, wenn die Züchtung unter Schütteln oder unter Belüftung und Bewegung im Submersverfahren 30 bis 72 Stunden unter den angegebenen Bedingungen durchgeführt wird.
Die in der Kulturbrühe angereicherte Glycerinoxidase läßt sich auf folgende Weise gewinnen: Glycerinoxidase wird im allgemeinen in den Mikroorganismenzellen gebildet. Zur Gewinnung des Enzyms aus den Zellen werden die durch Filtration oder Zentrifugation der Kulturbrühe nach Beendigung der Züchtung erhaltenen Mikroorganismenzellen ausreichend mit Wasser oder Pufferlösung gewaschen. Anschließend werden die Mikroorganismenzellen in einer entsprechenden Menge an Puffer suspendiert und aufgebrochen. Das Aufbrechen der Zellen wird durch mechanische Zerkleinerung vorgenommen, beispielsweise durch Vermählen oder Ultraschall-Behandlung.
Feste Materialien werden aus der erhaltenen Lösung der aufgebrochenen Mikroorganismenzellen durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Anschließend wird die Glycerinoxidase aus der Lösung gemäß üblichen Verfahren zur Isolierung von Enzymen gewonnen. Beispielsweise lassen sich Enzympulver durch
1. fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat,
2. Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose,
3. Molekularsiebfraktionierung an dreidimensional vemetztem Dextran (Sephadex),
4. Säulenchromatographie an Hydroxyapatit und
5. Gefriertrocknen der aktiven Fraktionen
erhalten. Selbstverständlich können die einzelnen Verfahrensstufen wiederholt werden. Gegebenenfalls können zusätzlich auch andere übliche Reinigungsverfahren angewendet werden.
F i g. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Sauerstoffaufnahme in einem Reaktionssystem bei Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff. Die Kurve A zeigt die Sauerstoffaufnahme in einem Katalase-freien Reaktionssystem, während die Kurve B die Sauerstoffaufnahme in Gegenwart von Katalase wiedergibt.
F i g. 2 zeigt die relativen Aktivitäten des Enzyms der Gattung Aspergillus nach 10-minütiger Inkubation bei 37°C und verschiedenen pH-Werten.
F i g. 3 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Aspergillus nach 30-minütiger Behandlung bei 30° C und verschiedenen pH-Werten.
F i g. 4 zeigt die relativen Aktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 10-minütiger Inkubation bei 37°C und verschiedenen pH-Werten,
F i g. 5 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 30-minütiger Behandlung bei 30° C und verschiedenen pH-Werten.
F i g. 6 zeigt die Beziehung zwischen Reaktionszeit und der optischen Dichte bei 500 nm (Maß für die Aktivität des Enzyms).
F i g. 7 zeigt die Aktivitäten des Enzyms der Galtung Aspergillus nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen.
Fig.8 zeigt die Aktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen.
F i g. 9 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Aspergillus nach 30-minütiger Behandlung bei pH-Wert 7 und verschiedenen Temperaturen in 0,1 m Ammoniumpuffer.
Fig. 10 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 30-minütiger Behandlung bei pH-Wert 7 und verschiedenen Temperaturen in 0,1 m Ammoniumpuffer.
F i g. 11 zeigt die Beziehung zwischen Substratkonzentration (Glycerin) und optischer Dichte der Reaktionslö-
sungen bei 500 nm (vgl. Tabelle IV).
Die enzymologischen und physiko-chemischen Eigenschaften der auf diese Weise erhaltenen Glycerinoxidase sind nachstehend angegeben. Dabei werden als Glycerinoxidase-Präparate die Produkte der nachstehenden Versuche A und B verwendet.
■ , I.Wirkung
Das Enzym oxidiert unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd spezifisch Glycerin.
(a) Bestätigung der Bildung von Wasserstoffperoxid
;■■, (a)-l· Glycerin wird in Gegenwart von Sauerstoff mit Glycerinoxidase umgesetzt. Anschließend wird das
t.-.i Reaktionssystem mit Peroxidase, Phenol und 4-Amino-antipyrin versetzt, wodurch sich Chinoniminpig-
L| is ment im Reaktionssystem bildet; bezüglich der Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase,
|j Phenol und 4-Aminoantipyrin vgl. Clin. Chem., Bd. 20 (1974), S. 470.
5 (a)"2. Glycerin wird in Gegenwart von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid mit Glycerini| oxidase umgesetzt. Zur Zersetzung des Wasserstoffperoxids wird Katalase zugesetzt. Anschließend ]S wird das Reaktionssystem mit Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin versetzt, um die gleiche ,;(! 20 Reaktion, wie vorstehend erläutert, durchzuführen. Im Reaklionssystem wird aber nicht das gleiche j ; Chinoniminpigment gebildet.
;;;i (a)-3. Bei Anwesenheit von Katalase im durch Glycerinoxidase in Gegenwart von Sauerstoff katalysierten
6 Glycerin-Oxidationssystem sinkt die Menge des aufgenommenen Sauerstoffs auf die Hälfte. Diese ':$ Tatsache wird durch folgende experimentellen Befunde gestützt:
■fej 25 (a)-3-l. Reaktionssystem A (ohne Katalase):
'-j; Reagentien
si wäßrige 0,01 m Glycerinlösung 0,5 ml
'('; 30 0,1 m NHtOH-NFUCI-Puffer (nachstehend als »Ammoniumpuffer« bezeichnet)
I (pH-Wert 8,0) 1,0 ml
Jj wäßrige Glycerinoxidaselösung 0,2 ml Ί
H wäßrige 2,4-millimolare 4-Amino-antipyrinlösung 0,5 ml
H wäßrige 42-millimolare Phenollösung 0,5 ml
ρ 35 wäßrige Peroxidaselösung 0,2 ml 5>
p Wasser 0,1 ml
& 1) 5 μ Mol Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 30, erhalten gemäß Versuch 1;
d 2) mit einem Gehalt an 200 Einheiten, spezifische Aktivität 1000.
φ. 40 (a)-3-2. Reaktionssystem B (mit Katalase):
H Reagentien
wäßrige 0,01 m Glycerinlösung 0,5 ml
45 0,1 m Ammoniumpuffer (pH-Wert 8,0) 1.0 ml
wäßrige Glycerinoxidaselösung 0,2 ml''
wäßrige Katalaselösung 1,OmP'
Wasser 0,3 mi
1) vgl. Reaktionssystem A;
50 3) mit e'nem Gehalt an lOOKatslaseeinheiten, spezifische Aktivität 100.
(a)-3-3. Durchführung der Reaktion:
Im V:all des Reaktionssystems ohne Katalase werden die Bestandteile gemäß Reaktionssystem A 55 vermischt. Die Umsetzung wird unter Rühren bei 37°C durchgeführt. Die Menge der Sauerstoffaufnahme wird mit einem Warburg-Manometer gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 1 zusammengestellt.
Im Fall des Systems mit einem Gehalt an Katalase werden die Bestandteile des Reaktionssystems B vermischt. Die Umsetzung wird bei 37° C durchgeführt. In ähnlicher Weise wird die Sauerstoff aufnahme gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 1 zusammengestellt. Aus F i g. 1 ergibt sich, daß der Sauer-60 stoffverbrauch in Abwesenheit von Kataiase 4,95 μ Mol (Kurve A in Fi g. 1) für 5,5 μ Mol Glycerin als
Substrat beträgt.
In Anwesenheit von Katalase (Kurve B in Fig. 1) werden 2,49 μ Mol Sauerstoff verbraucht, was etwa der halben Menge von (A) entspricht.
65 Aus den vorstehenden Abschnitten (a)-1, (a)-2 und (a)-3 ergibt sich, daß das erfindungsgemäß eingesetzte Enzym zur Bildung von Wasserstoffperoxid in der Lage ist.
Die quantitative Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids wird durch quantitative Ermittlung des gebildeten Chinoniminpigmenis vorgenommen. Dabei ergibt sich aufgrund der quantitativen Bestimmung des
gebildeten Wasserstoffperoxids im Reaktionssystem A gemäß dem 4-AA-Verfahren, daß 4,92 μ Mol Wasserstoffperoxid aus 5 μ Mol Glycerin gebildet worden sind.
(b) Bestätigung der Bildung von Glycerinaldehyd
(b)-l. Glycerin wird in Gegenwart von Sauerstoff mit Glycerinuxidase umgesetzt. Als Reaktionsprodukt wird Glycerinaldehyd identifiziert.
(b)-l-l. Nachweisverfahren
(b)-1 -1 -(I). Reaktionslösung
5 Tropfen einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 50 mg/ml Glycerin, 5 Tropfen einer Lösung to mit einem Gehalt an 10 u/ml Glycerinoxidase in 0,02 in Tris-HCl-Puffer und 1 Tropfen mit 14 000 u/ ml Katalase werden vereinigt. Die Reaktion wird 20 Stunden unter Schütteln bei 300C durchgeführt.
(b)-l-l-(2). Nachweis
Durch Dünnschichtchromatographie läßt sich als Produkt in der Reaktionslösung Glycerinaldehyd nachweisen, der mil einer authentischen Probe verglichen wird.
Als Dünnschichtplatten werden Kieselgelplatien G-60F-254 verwendet. Als Laufmittcl dient das Lösungsmittelsystem 1 (Butanol : Essigsäure : Wasser = 4:1 :1 (Volumteile)) und das Lösungsmittelsystem 2 (Butanol : Pyridin : Wasser = 3:2:1,5 (Volumteile)).
Nach der Chromatographie werden drei verschiedene Reaktionen auf der Plane durchgeführt: p-Anisidin-Salzsäure-Reaktion, Perjodsäure-Benzidin-Rcaktion und 2,4-Diniirophenylhydrazin-Reaktion. Die Rf-Werte der Reaktionsprodukte und die Färbungen der einzelnen Flecken erweisen sich mit der authentischen Probe als identisch. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengestellt.
Tabellen
Identifizierung der bei der Dünnschichtchromatographie erhaltenen Reaktionsprodukte (Rr-Werte und Farbreaktionen)
Farbreagens Probe Laufmittcl
Lösungsniittelsysiem 1 Lösungsmiuelsystem 2
p-Anisidin-Salzsäure-Rea- Glycerinaldehyd Ri-Wcrt 0.67 (braun) 0,76 (braun)
gens 1) (authentische Probe)
Reaklionsprodukt Ri-Wert 0.67 (braun) 0,77 (braun)
Perjodsäure-Benzidin-Rea- Glycerinaldehyd Rr-Wert 0,66 (+ )* 0,76 ( + )*
gens 2) (authentische Probe)
Reaktionsprodukt Rr-Wert0,67( + )* 0,77 ( + )*
2,4-Dinitrophenylhydrazin- Glycerinaldehyd Rr-Werl0,67 0,77 (orangefarben)
Reagens 3) (authentische Probe) (orangefarben)
Reaktionsprodukt Ri-Wert 0,68 0.77 (orangefarben)
(orangefarben)
Die Farbangaben in Klammern beziehen sich auf die Färbung der Flecken. Untcr( +)' beim Perjodsäure-Benzidin-Reagens ist ein weißer Flecken auf blauem Hintergrund zu verstehen.
Anmerkungen:
1. p-Anisidin-Reagens: Reduktive Carbonylverbindungen. wie Zucker, reagieren mit p-Anisidin-Salzsäure unter Bildung von für die jeweiligen Strukturen charakteristischen Färbungen.
2. Perjodsäure-Benzidin-Reagens: Polyalkohole und Verbindungen ähnlicher Struktur reagieren mit Perjodsäure. Somit lassen sich die Verbindungen als weiße Flecken p:ichwt/Kpn.
3. 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens: Carbonylverbindungen reagieren mil 2.4-l)initrophcnylhydrazin unter Bildung von
2,4-Dinitrophenylhydrazon und lassen sich also orangefarbene Flecken nachweisen.
!,;;i Wie sich aus der vorstehenden Tabelle ergibt, verhalten sich die authentischen Glycerinaldehyd-Proben in
;ö bezug auf die Rr-Werte und bei den Färbungsreaklionen vollkommen identisch mit den eingesetzten Reaktions-
5, produkten. Dadurch wird bestätigt, daß bei der Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von
::? Sauerstoff Glycerinaldehyd entsteht.
Ji (b)-2. Die bei der Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff gebildete Menge :¥ an Glycerinaldehyd ist fast äquimolar zur verbrauchten Glycerinmcnge. Dies wird durch Zusatz von
·' 2,4-Dinitropheny|hydrazin zum Reaktionssystem unter anschließender quantitativer, colorimefrischer Be- b5
,© Stimmung des gebildeten 2,4-Dinitrophenylhydrazons bestätigt.
(c) Bestimmung der Sauerstoffaufnahme
Der Sauerstoffverbrauch des Systems bei Umsetzung von Glycerin in Gegenwart von Glycerinoxidase wird mit einer Sauerstotfelekirode und einem Warburg-Manometer gemessen. Es ergibt sich, daß die Sauerstoffauf-5 nähme der Menge dts gebildeten Glycerinaldehyds entspricht
(d) Eine quantitative Bestimmung der Menge an Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd sowie der Sauerstoffaufnahme wird gemäß den vorstehend unter (a), (b) und (c) angegebenen Verfahren durchgeführt. Die erhaltenen Werte sind im Hinblick auf ihre Stöchiometrie plausibel.
jo Die vorstehenden qualitativen und quantitativen Versuchsergebnisse bestätigen, daß durch das erfindungsgemäß verwendete Enzym Glyceiin unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd gemäß nachstehender Reaktionsgleichung oxidiert wird.
CH2OH
ι		 Q2 CH3OH
15 CHOH
CH2OH 		CHOH + H2O2
CHO
20 II. Substratspezifität
Die relative Aktivität wird unter Verwendung von anderen Substraten in äquimolaren Mengen zum Glycerin im Verfahren zur Messung der Aktivität gemäß dem 4-AA-Verfahren bestimmt.
Die relativen Aktivitäten gegenüber anderen Substraten sind in Tabelle HI zusammengestellt, wobei die 25 Aktivität gegenüber Glycerin gleich 1OO gesetzt wird.
Tabelle MI Enzym Enzym der Galtung
Substrat Enzym der Gattung Neurospora
Aspergillus 100
100 0
Glycerin 10,5 0
1,2-Propandiol 3,3 0
1,3-Propandiol 2,0 21
1,3-Butandiol 0,4 0
Glycerin-3-phosphorsäure 0,3 0
1,4-Butandiol 0,3 0
2,3-Butandiol 0 0
Ethanol 0 0
n-Propanol 0
lsopropanol
III. pH-Optimum und stabiler pH-Bereich
1. Das pH-Optimum des Enzyms der Gattung Aspergillus liegt im Bereich von 7 bis 8.
Die Aktivitäten werden nach 10-minütiger Inkubation bei 37"C bei verschiedenen pH-Werten gemessen Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt.
2. Der stabile pH-Bereich des Enzyms der Gattung Aspergillus liegt bei 5,0 bis 8,0.
50 Die Restaktivitäten werden nach 30-mipütiger Behandlung bei 300C und verschiedenen pH-Werter
gemessen, wobei die nachstehend angegebenen Puffer verwendet werden. Die Ergebnisse sind in Fig.: dargestellt.
pH-Wert 4 bis 5: Acetatpuffer
55 pH-Wert6bis7:Tris-HCl-Puffcr
pH-Wert 8 bis 9: Boratpuffer
3. Das pH-Optimum des Enzyms der Gattung Neurospora liegt bei 8,0 bis 8,5.
Die Aktivität wird nach lOminütiger Inkubation bei 370C und bei verschiedenen pH-Werten gemessen bO Die Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt.
4. Der stabile pH-Bereich des Enzyms der Gattung Neurospora liegt bei f> bis 8,0. Die Messung wird gemäl Abschnitt 111-2 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt.
IV. Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität
(a) Prinzip
Die Bestimmung der Enzymaktivität wird durch Umsetzung des enzymatisch gebildeten Wasserstoffperoxid
mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase durchgeführt. Dabei wird ein Chinoniminpigment erhalten, das quantitativ bestimmt wird.
Die nachstehenden Reaktionsgleichungen erläutern dieses Verfahren:
CH2OH CH2OH
CHOH + O2 Glycerinoxidase , CHQH + „^ (1)
I I
CH2OH CHO
NOl NO
2H2O2+CH3-N J + \ \ CHj—N \ + 4H2O (2)
CH, NH2 CI
4-Aminoantipyrin
il U
Die Reaktionsgleichung(2) ergibt sich im Prinzip ausC. C. Allain und Mitarb.,CUn. Chem., Bd. 2Q(1974), S.470.
(b) Reagentien
1. Substrat: wäßrige 0,1 m Glycerinlösung 0,5ml
2. Puffer: 0,1 m Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8 1,0 ml
3. 4-Aminoantipyridin: wäßrige 2,4 millimolare Lösung 0,5 ml
4. Phenol: 42 millimolar (wäßrige Lösung) 0,5 ml
5. wäßrige Peroxidaselösung(Proteinmengn 2 mg/ml, spezifische Aktivität 100) 0,1ml ίο
6. Wasser 03 ml
7. wäßrige Enzymlösung 0,1 ml
(c) Versuchsdurchführung
Die Reagentien 1. bis 6. werden in einem Reagenzglas vermischt und 5 Minuten bei 370C geschüttelt. Anschließend wird die Enzymlösung zugesetzt. Das Gemisch wird sodann mit Ammoniumpuffer auf 3 ml aufgefüllt. Die Umsetzung wird 10 Minuten unter Schütteln bei 37°C durchgeführt. Sodann wird das gleiche Verfahren wiederholt, wobei zum Vergleich anstelle der Versuchslösung Wasser verwendet wird. Die optische Dichte der Reaktionslösung bei 500 nm wird gemessen und der Unterschied zur Kontroilösung (Δ OD) bestimmt.
(d) Berechnung der Enzymaktivität
1 Einheit Glycerinoxidase ist die Enzymmenge, die 1 μ Mol Glycerin bei 37°C innerhalb 1 Minute zersetzt.
Der Absorptionskoeffizient von 0,5 millimolarem Chinoniminpigment wird zu 5,33 angegeben (vgl. Chlin. Chem., Bd. 20 (1974), S. 470). Somit läßt sich die gewünschte Enzymaktivität (A) pro 1 ml Enzymlösung nach folgender Gleichung berechnen, wenn die optische Dichte (JOD) bei 500 nm einer 3 ml Reaktionslösung gemäß IV-(c) ermittelt ist:
A = aXx3x
= α x 0,56 (Einheiten/ml)
Die Werte für die optische Dichte der Reaktionslösungen bei 500 nm (die ein Maß für die Enzymaktivität darstellen) werden in Abhängigkeit von der Reaktionszeit ermittelt. Die Ergebnisse sind in F i g. 6 dargestellt. A us F i g. 6 ergibt sich, daß die optische Dichte bei 500 nm proportional zur Reaktionszeit ist.
m %
V. Optimaler Temperaturbereich für die enzymatische Aktivität
1. Enzym der Gattung Aspergillus
Die enzymatischen Aktivitäten nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen sind in F i g. 7 dargestellt. Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 400C.
2. Enzym der GaUung Neurospora
Die enzymatischen Aktivitäten nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen sind in F i g. 8 angegeben. Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 35 bis 45° C.
VI. Inaktivierung bei verschiedenen pH-Werten
und Temperaturen
Einfluß des pH-Werts
Wie vorstehend unter III. in bezug auf das pH-Optimum und den stabilen pH-Bereich erläutert, wird das Enzym der Gattung Aspergillus bei pH-Werten unterhalb von 4 und oberhalb von 10 im wesentlichen zu 100 Prozent inaktiviert. In ähnlicher Weise wird das Enzym der Gattung Neurospora bei pH-Werten unterhalb von 4 und oberhalb von 10 im wesentlichen zu 100 Prozent inaktiviert.
Einfluß der Temperatur
Die restliche Aktivität nach 30-minütiger Wärmebehandlung in 0,1 m Tris-HCI-Puffer beim pH-Wert 7,0 wird gemessen.
In Fig.9 sind die Ergebnisse für das Enzym der Gattung Aspergillus und in Fig. 10 für das Enzym der Gattung Neurospora angegeben. Das erstgenannte Enzym ist bei Temperaturen bis zu 400C zu 100 Prozent stabil, wird aber bei 45°C zu etwa 60 Prozent inaktiviert. Das letztgenannte Enzym wird bei 30°C zu etwa 50 Prozent und bei 50°C zu etwa 100 Prozent inaktiviert. Das Enzym der Gattung Aspergillus wird durch Zusatz von 0,1 millimolar Dithiothreit stabilisiert. Die thermische Beständigkeit wird dadurch ebenfalls gesteigert (vgl. F i g. 9, aus der sich eine Stabilität bis etw 50° C ergibt.
Die Glycerinoxidase eignet sich zur quantitativen Bestimmung von Glycerin nach folgenden Verfahren:
(a) Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff und quantitative Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
(b) Umsetzung des gemäß (a) gebildeten Glycerinaldehyds mit 2,4-Dinilrophenylhydrazin und quantitative, colorimetrische Bestimmung des erhaltenen 2,4-Dinitrophenyl-hydrazons, was eine quantitative Glycerinbestimmung ergibt.
(c) Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff und Ermittlung der Sauerstoffaufnahme des Systems.
Die Prinzipien und die Verfahren der Bestimmungsmethoden (a), (b) und (c) sind im vorstehenden Abschnitt I erläutert. Nachstehend wird ein Beispiel für die Bestimmungsmethode (a) zur quantitativen Bestimmung von Glycerin unter Messung der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids näher erläutert:
Die optische Dichte von Rcaktionslösungen bei 500 nm wird gemäß Abschnitt IV-(c) ermittelt, wobei Lösungen mit einem Gehalt an 0,i mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 3,2 pro ml Lösung verwendet werden. Die Substratkonzentrationen (Glycerinkonzcntrationen) der Lösungen gemäß IV-(b) betragen 0,1,0,2,0,5,1,0,5,0 und 10,0 millimolar. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Substratkonzcntrat ion. millimolar
0,1 0,2 0.5 1.0 5,0 10,0
Optische Dichte
bei 500 nm 0,060 0,121 0,303 0.605 3,002 5,998
Es läßt sich eine lineare Beziehung zwischen der Subslratkon/.entration (Glycerinkonzentration) und der optischen Dichte der Lösungen bei 500 nm feststellen. Auf dieser Basis läßt sich die Glycerinkonzentration einer unbekannten Probe ermitteln.
Somit kann die Glycerinkonzentration von Lösungen unter Verwendung von Glycerinoxidase gemessen werden. Erfindungsgemäß wird also ein neues Verfahren und ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von Glycerin zur Verfugung gestellt.
b5 Für ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung von Glycerin bestand ein Bedürfnis, insbesondere auf dem Gebiet der Biochemie. Zur quantitativen Bestimmung von Triglyccriden sind verschiedene Verfahren bekannt. wobei die Triglyceride in Serum unter Bildung von Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert werden und das Glycerin bestimmt wird.
Zur quantitativen chemischen "Bestimmung von Glycerin stehen verschiedene Verfahre^ zur Verfügung, beispielsweise das Chromotropsäure-Verfahren, das Aceiylaceton-Verfahren, das Triazol-Verfahren, das Randrup-Verfahren und das Fluoreszenzverfahren gemäß Mendelsohn. Diese Verfahren haben aber alle den Nachteil, daß sie für Glycerin nicht spezifisch sind.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Glycerinoxidase Glycerin direkt unter stöchiometrischer Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert Das erhaltene Wasserstoffperoxid läßt sich leicht in ein gefärbtes System überführen, so daß eine quantitative Bestimmung von Glycerin und somit eine quantitative Bestimmung von Triglyceriden sehr einfach und spezifisch aufgrund einer colorimetrischen quantitativen Bestimmung durchgeführt werden kann.
Beispiel
(a) Reagentien
1. Zu untersuchende Lösung: Wäßrige Glycerinlösung von unbekannter Konzentration 0,5 ml
2. Puffer: 0,1 m Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8 1,0 m!
3. 2,4 millimolare wäßrige 4-Amino-antipyrinlösung 0,5 ml
4. 42 millimolare Phenollösung 03 ml
5. wäßrige Peroxidaselösung mit einem Proteingehalt von 20 mg/ml und
einer spezifischen Aktivität von 100° 0,1ml
6. Wasser 0,3 ml
7. Glycerinoxidase gemäß Beispiel 1
mit einem Proteingehalt von 1,0 mg/ml und einer spezifischen Aktivität von 3,2. 0.1 ml
(b) Verfahren
Die Reagentien 1. bis 6. werden in ein Reagenzglas gegeben und 5 Minuten bei 37°C ausreichend geschüttelt. Anschließend wird die Enzymlösung zugesetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit Ammoriiumpuffer auf 3 ml aufgefüllt. Die Reaktion wird 10 Minuten unter Schütteln bei 37CC durchgeführt.
Zum Vergleich wird das gleiche Verfahren unter Verwendung von Wasser anstelle einer GlycerinlOsüng durchgeführt. ...
Die optische Dichte der zu untersuchenden Lösung bei 500 nm wird gemessen. Die Differenz der optischen Dichte zur.Vergleichsprobe beträgt 0,230. Aus der Kurve von Fig. 11 läßt sich ein Glyceringehaft der zu bestimmenden Lösung von 0,380 milfimolar ermitteln.
Die nachstehenden Versuche erläutern die Gewinnung von Glycerinoxidase.
Versuch A
300 ml Ani.uchtmedium mit einem Gehalt an 10 g/Liter Glycerin, 10 g/Liter Malzextrakt und 5 g/Liter Hefeextrakt (pH-Wert vor der Sterilisation 6,2) werden in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben mit Aspergillus japonicus KY-45 (ATCC 1042, NRRL 11102, FERM-P Nr. 3959) beimpft und 48 Stunden unter Schütteln bei 300C gezüchtet. 900 ml (entsprechend 3 Kolben) der erhaltenen Anzuchtkultur werden auf 15 Liter des gleichen Mediums, das sich in einem 30 Liter fassenden Fermenter befindet, überimpft und unter Belüftung (15 Liter/min) und unter Rühren (250 U/min) 40 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Züchtung wird die erhaltene Kulturbrühe abgeniitscht. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen. Man erhält 150 g (Trockengewicht) Mikroorganismenzellen.
Diese Mikroorganismenzellen werden in 5 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8.Q suspendiert und in einer Dynp-Mühte (Willy A. Bachofen, Schweiz) aufgebrochen. Nach dem Aufbrechen Wird die Suspension unter Verwendung einer Gefrierzentrifuge 20 Minuten bei 20 000 g zentrifugiert. Man erhält 4.7 Liter Überstand mit einem Proteingehalt von 51 g und einer spezifischen Aktivität von 0,05 Einheiten/mg. Dieser Überstand wird mit Ammoniumsulfat versetzt. Die bei einer Ammöniumsulfatsättigung von 30 bis 70 Prozent ausgefällten Fraktionen werden gesammelt und in 50 ml 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wqrt 8.0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen 10 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffe;· dialysier?, wobei ein Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose (Ceüophan) verwendet wird.
Die Dialyse wird 48.Stunden bei einer Gesamtmenge von 40 Liter Dialyselösung fortgesetzt, wobei jeweils nach 12 Stunden die Dialyselösung ausgetauscht wird. Die dialysierte Enzymlösung wird über eine mit DEAE-Cellulose (Serva Co.) gepackte Säule der Abmessungen 5,5 · 40 cm gegeben. Diese Säule ist vorher mit 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden. Das dabei adsorbierte Enzym wird mit dem genannten Puffer gewaschen, um nicht adsorbierte Proteinverunreinigungen auszuwaschen, Zur Elution wird ein linearer 0,1 bis 0,2 m Ammoniumsulfatgradient in 2 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 verwendet. Dabei wird die Glycerinoxidase eluiert. 500 ml aktive Fraktionen mit einem Proteingehalt von 1,2 g und einer spezifischen Aktivität von 1,1 werden gewonnen. Dieses Produkt wird bis zu einer Sättigung von 70 Prozent mit Ammoniumsulfat versetzt. Bei dem gebildeten Niederschlag handelt es sich um das gewünschte Enzym.
Der Miederschlag wird durch 20-minütige Zentrifugation bei 20 000 g gesammelt und in 50 ml 10 millimqlarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die Lösui.g wird über eine mit dreidimensional vernetztem, zur Gelchromatographie geeigneten Dextran (Scphadex G-100) gepackte Säule der Abmessungen 5,5 · 80 cm gegeben. Die Säule ist vorher mit 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden. 1 Liter
10 millimolarer Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 werden zur Elution über die Säule gegeben. Man erhält eine 300 ml-Fraktion von hoher spezifischer Aktivität (Proteingehalt JlO mg, spezifische Aktivität 3,2). Diese Fraktion wird bis zu einer Sättigung von 70 Prozent mit Ammoniumsulfat versetzt. Das ausgefällte Enzym wird durch 20minütige Zentrifugation bei 20 000 g gewonnen und sodann in 20 ml 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden gegen 5 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 dialysiert, wobei ein Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose (Cellophan) verwendet wird und die Dialyselösung 2mal ausgetauscht wird. Die nach der Dialyse erhaltene Enzymlösung wird über eine mit Hydroxylapatit gepackle Säule der Abmessungen 5,5 ■ 20 cm gegeben, die vorher mit 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden ist. Ferner werden 250 ml dieser Pufferlösung über die Säule gegeben. Das Eluat wird fraktioniert. Fraktionen mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 20 werden gesammelt und gefriergetrocknet. Man erhält 10,2 mg gereinigtes, pulverförmiges Enzympräparat. Es handelt sich um Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 30,2. Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms ist 610mal größer als die des Zellextrakts. Die Ausbeute beträgt 19 Prozent, bezogen auf die Aktivität.
Versuch B
Anstelle des in Versuch A verwendeten Mikroorganismus Aspergillus japonicus K.Y-45 wird Neurospora crassa K.Y-462 (NRRL 11106, FERM-P Nr. 3960) auf 2 Liter fassende Erlenmeyerkolben überimpft, die 10 g/Liter Glycerin, 10 g/Liter Malzextrakt und 5 g/Liter Hefeexlrakt enthalten. Die Züchtung wird gemäß Versuch A unter Schütteln 48 Stunden bei 30° C durchgeführt.
Die erhaltene Kulturbrühe wird gemäß Versuch A extrahiert und gereinigt. Man erhält 1,1 mg gereinigtes Enzympräparat. Es handelt sich um Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 14,1. Bezogen auf die Aktivität beträgt die Ausbeute 10,5 Prozent.
Versuch C
Die in Tabelle V angegebenen Mikroorganismenstämme werden im Verfahren von Versuch A anstelle von Aspergillus japonicus K.Y-45 verwendet. Die Aktivitäten der erhaltenen Überstände der Zellextrakte sind ebenfalls in Tabelle V angegeben.
Tabelle V
Stämme Aktivität (μ/Liter)
Aspergillus oryzaeKY-63(NRRL 11103) 32,0
Aspergillus parasiticus KY-77 (NRRL 11104) 21,6
Aspergillus flavus KY-98(NRRL 11105) 10,8
Neurospora sitophila KY-445(NRRLIl264) 32,5
Neurospora tetrasperma K.Y-447 (NRRL 11265) 10,5
Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin in Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff mit Glycerinoxidase umsetzt und die verbrauchte Sauerstoffmenge oder die Menge an im wäßrigen Medium durch die Einwirkung der Glycerinoxidase gebildeten Wasserstoffperoxid oder Glycerinaldehyd mißt, wobei die jeweiligen Mengen ein Maß für die Glycerinkonzentration in der Lösung sind und die Glycerinoxidase durch die Fähigkeit gekennzeichnet isi. Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd zu
oxidieren. ·
2 Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man eine Glycerinoxidase aus Aspergillus
japonicus K.Y-45 (FERM-P Nr. 3959, NRRL 11102), Aspergillus oryzae K.Y-63 (NRRL 11103), Aspergillus parasiticus KY-77 (NRRL 11104), Aspergillus flavus KY-98 (NRRL 11105). Neurospora crassa ΚΎ-462 (FERM-P Nr. 3960, NRRL 11106), Neurospora sitophila KY-445 (NRRL 11264) oder Neurospora tetrasperma KY-447 (NRRL 11265) verwendet.
3 Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch einen Gehalt
an Giycerinoxidase aus Aspergillus japonicus KY-45 (FERM-P Nr. 3959. NRRL 11102), Aspergillus Oryzae KY-63 (NRRL 11103). Aspergillus parasiticus KY-77 (NRRL 11104), Aspergillus Flavus KY-98 (NRRL 11105), Neurospora crassa KY-462 (FERM-P Nr. 3960, NRRL 11106), Neurospora sitophila KY-445 (NRRL 11264) oder Neurospora tetrasperma KY-447 (NRRL 11265).
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5850719B2 (ja) * 1978-10-18 1983-11-11 協和醗酵工業株式会社 トリグリセライドの定量方法
US4399218A (en) * 1980-02-05 1983-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Method and reagent for the determination of glycerin
EP0048347B1 (de) * 1980-09-19 1983-07-27 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin
IT1153913B (it) * 1982-01-28 1987-01-21 Erba Farmitalia Metodo e reagenti per l'eliminazione dell'interferenza da bilirubina in alcune determinazioni chimico cliniche
DE3210095A1 (de) * 1982-03-19 1983-09-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagenz zur bestimmung von glycerin
US4920055A (en) * 1986-02-04 1990-04-24 American Biogenetics Corporation Conversion of alcohols to aldehydes and hydrogen peroxide by substrate and product tolerant methanol oxidases
US5234827A (en) * 1986-02-04 1993-08-10 Knobbe, Martens, Olson & Bear Enzymatic process for manufacturing formaldehyde and hydrogen peroxide
US5385827A (en) * 1989-09-20 1995-01-31 Clark; John R. Method of geochemical prospecting
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
EP0977869B2 (de) 1997-04-09 2008-11-12 Danisco A/S Lipase und verwendung davon zur verbesserung von teigen und backwaren
WO2000005396A1 (en) 1998-07-21 2000-02-03 Danisco A/S Foodstuff
JP4309137B2 (ja) 2001-05-18 2009-08-05 ダニスコ エイ／エス 酵素を使用した練り粉の調製方法
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
DE602004030000D1 (de) 2003-01-17 2010-12-23 Danisco Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
WO2008090395A1 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Danisco A/S Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
GB0405637D0 (en) * 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
AU2005263954B2 (en) 2004-07-16 2011-04-07 Dupont Nutrition Biosciences Aps Enzymatic oil-degumming method

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Advances Microbial Physiology, 3, 1969, S. 207-208 *
Annual Review of Microbiology, 30, 1976, S. 535-537 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU3525478A (en) 1979-10-25
SE7804370L (sv) 1978-10-20
US4202941A (en) 1980-05-13
DE2817087C3 (de) 1985-04-04
NO152975C (no) 1985-12-27
US4266023A (en) 1981-05-05
NO781363L (no) 1978-10-20
IT7867878A0 (it) 1978-04-18
GB1599384A (en) 1981-09-30
CH639421A5 (de) 1983-11-15
DK151266B (da) 1987-11-16
DK168478A (da) 1978-10-20
SE438509B (sv) 1985-04-22
FR2387992B1 (de) 1980-10-03
DE2817087B2 (de) 1980-02-28
NL7804133A (nl) 1978-10-23
AU519684B2 (en) 1981-12-17
IT1107881B (it) 1985-12-02
JPS53130488A (en) 1978-11-14
FR2387992A1 (fr) 1978-11-17
NO152975B (no) 1985-09-16
DK151266C (da) 1988-07-04
NL189144C (nl) 1993-01-18
DE2817087A1 (de) 1978-11-02
CA1124191A (en) 1982-05-25
JPS6049477B2 (ja) 1985-11-01
NL189144B (nl) 1992-08-17

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