DE2857338C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin und Reagens zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin und Reagens zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Description
Glycerin ist als Bestandteil der Lipoide, aber auch in freier Form in der Natur weitverbreitet. Außerdem
kommt es in Genußmitteln und Industrieprodukten vor. In Medizin und Biologie hat die enzymatische Bestimmung
von Glycerin seit ihrer ersten Beschreibung durch O. Wieland, Biochem.Z. Bd. 329 (1957), S. 313, rasch
anwachsendes Interesse gefunden. Die breite Anwendung dei Methode liegt in erster Linie in ihrer Spezifität
und Einfachheit begründet, die umständliche, vorausgehende Reinigung des Untersuchungsmaterials überflüssig
Glycerin wird durch ATP und Glycerokinase (GK) in Glycerophosphat übergeführt. Als Indikatorreaktion
dient die Dehydrierung des Glycerin-3-phosphats durch die NAD-abhängige Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase
(GDH).
Die NADH-Zunahme. gemessen an der Extinktionsänderung bei 340 (334, 365) mn ist der Glycerin-Menge
proportional.
Ein weiteres bekanntes enzymatisches Verfahren zur Glycerinbestimmung verwendet ebenfalls Glycerokinase
(E. C. 2.7.1.30). Jedoch muß die Umsetzung zusammen mit Pyruvatkinase (E. C. 2.7.1.40) und Lactatdehydrogenase
(E. C. 1.1.1.27) durchgeführt werden. Diese Bestimmung ist somit sehr zeitaufwendig und für größere
Probenzahlen ungeeignet.
E.C.C. Lin berichtet in Annual Review of Microbiology, Bd. 30 (1976), S. 535, 537 über die Postulierung der
so Existenz eines Enz-ms, das Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff und Flavin in Dihydroxyaceton und Wasserstoffperoxid
umwandelt. Dieses Enzym wird als Glycerinoxidase bezeichnet, ist jedoch nicht näher charakterisiert
worden.
Ferner sind aus in Microbial Physiology, Bd. 3 (1969), S. 207 bis 208, Flavoproteinenzyme aus Lactobacilli und
Chlostridia bekannt, die u. a. Glycerin und rt-Glycerinphosphorsäureester unter Bildung von Wasserstoffperoxid
oxidieren. Eine Bildung von Dihydroxyaceton oder Glycerinaldehyd ist nicht beschrieben.
In der Stammanmeldung, vgl. DE-OS 28 17 087, ist eine Glycerinoxidase mikrobiellen Ursprungs beschrieben
und beansprucht, die Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd
oxidiert.
Dieses Enzym weist folgende enzymologischen und physiko-chemischen Eigenschaften auf:
1. Wirkung
Das Enzym oxidiert Glycerin unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid und
Glycerinaldehyd.
2. Substratspc/.ifitat
Das Enzym reagiert spezifisch mit ülvcerin.
Das Enzym reagiert spezifisch mit ülvcerin.
3. pH-Optimum und stabiler pH-Bereich 3.1 pH-Optimum
Durch Mikroorganismen der Gattung Aspergillus gebildete Glycerinoxidase
(nachstehend als »Enzym der Gattung Aspergillus« bezeichnet) pH-Wert 7 bis 8
Glycerinoxidase, gebildet durch Mikroorganismen der Gattung Neurospora
(nachstehend als »Enzym der Gattung Neurospora« bezeichnet) pH-Bereich 8,0 bis 8,5
3.2 Stabiler pH-Bereich
Enzym der Gattung Aspergillus pH-Bereich 5,0 bis 8,0
Enzym der Gattung Neurospora pH-Wert 5,0 bis 8,0
4. Verfahren zur Bestimmung der Enzymaklivität
Die Enzymaktivität wird in Einheiten angegeben. Unter »1 Einheit« ist die Enzymaktivität zu verstehen, die
1 μ Mol Glycerin bei 37°C in Gegenwart von Sauerstoff innerhalb 1 Minute zersetzt. Die Bestimmung der
Enzymaktivität wird folgendermaßen durchgeführt: Glycerin wird unter Rühren mit Glycerinoxidase umgesetzt, wobei Wasserstoffperoxid gebildet wird. Das
erhaltene Wasserstoffperoxid wird in Gegenwart von Peroxidase mit 4-Aminoantipyrin und Phenol umgesetzt,
wobei ein Chinoniminpigment entsteht. Die optische Dichte des erhaltenen Chinoniminpigments bei 500 nm
wird zur Bestimmung der Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid gemessen. Dadurch wird die Enzymaktivität
bestimmt (dieses Verfahren wird nachstehend als »4-AA-Verfahren« bezeichnet).
Die spezifische Aktivität ist definiert durch die Anzahl der Enzymeinheiten pro 1 mg Protein. Die Menge des
Enzymproteins wird gemäß dem Lowry-Verfahren unter Verwendung eines Kupfer-Folin-Reagens bestimmt;
vgl. O. H. Lowry, N. |. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall, J. Biol. Chem., Bd. 193(1951), S. 265.
5. Temperaturoptimum der enzymatischen Wirkung
Enzym der Gattung Aspergillus etwa 400C
Enzym der Gattung Neurospora 40 bis 45°C
6. Einfluß von Temperatur und pH-Wert auf
die Enzyminaktivierung
6.1 Temperatur
Das Enzym der Gattung Aspergillus wird durch 30-minütige Behandlung bei 45°C zu etwa 60 Prozent und
durch 30-minütige Behandlung bei 60'C im wesentlichen vollständig inaktiviert.
Das Enzym der Gattung Neurospora wird durch 30-minütige Behandlung bei 25°C zu etwa 50 Prozent und
durch 30-minütige Behandlung bei 500C im wesentlichen vollständig inaktiviert.
6.2 pH-Wert
Das Enzym der Gattung Aspergillus wird durch 30-minütige Behandlung bei einem pH-Wert oberhalb von 10
oder unterhalb von 4 inaktiviert.
Das Enzym der Gattung Neurospora wird ebenfalls bei den vorgenannten pH-Werten inaktiviert.
7. Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung
7.1 Hemmung
Die Aktivität des Enzyms ohne Zusatz von In'.iibitor wird als 100 gesetzt. In Tabelle 1 sind die enzymatischen
Aktivitäten in Gegenwart von verschiedenen Inhibitoren in einer Konzentration von 1 millimolar angegeben.
Die Aktivitäten werden gemäß dem 4-AA-Verfahren gemessen, wobei mit Hilfe des entstandenen H2O2 ein
4-Aminoantipyrin-Pigmcntsystem gebildet wird.
IO
15
20
25
28 57 338 | Enzym der Gattung | |
Tabelle ! | Neurospora | |
Inhibitor | Enzym | 100 |
Enzym der Galtung | — | |
Aspergilhis | 23 | |
Ohne | 100 | — |
AgNOj | 30 | 20 |
HgCI2 | 20 | 23 |
Pb(CH3COO)2 | 15 | 0 |
CuSO4 | 10 | — |
ZnSO4 | — | — |
FeSO4 | — | — |
NaNi | 20 | 108 |
o-Phenanthrolin | 90 | — |
Λ,Λ'-Dipyridyl | 85 | 0 |
PCMBip-Chlormercuribenzoat) | 50 | — |
N-Ethylmaleimid | 100 | 20 |
NH2OH-HCI | 0 | — |
8-Hydroxylchinolin | 90 | 100 |
Diethyldithiocarbamat | 35 | 60 |
Neocuproin | 100 | — |
Jodacetat | — | 80 |
Cystein | — | |
Dhhiothreit | 100 | |
EDTA | 105 | |
7.2 Aktivierung
Es ist keine speziell zur Aktivierung geeignete Verbindung bekannt.
7.3 Stabilisierung
Das Enzym der Gattung Aspergülus läßt sich durch Zusatz von 0,1 bis 1.0 millimolar einer Sulfhydrylverbindung,
wie Mercaptoethanol und Dithiothreit, stabilisieren.
8. Reinigungsverfahren
Die Reinigung kann gemäß folgenden üblichen Verfahren durchgeführt werden:
Die Reinigung kann gemäß folgenden üblichen Verfahren durchgeführt werden:
40
45
50
55
1.' Fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat;
2. Säulenchromatographie an DEAE-Celluiose:
3. Molekularsiebfraktionierung unter Verwendung von dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex);
4. Säulenchromatographiean Hydroxyapatit;
5. Gefriertrocknung der aktiven Fraktionen.
Diese Verfahren sind nachstehend näher erläutert.
9. Molekulargewicht
Das Molekulargewicht des im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyms wird durch Gelchromatographie
an einer mit dreidimensional vcrnctzicrr. Dextran (Sephadex G-200) gepackten Säule bestimmt. Es
ergibt s;ch für das Enzym der Gattung Aspergülus ein Molekulargewicht von mindestens 300 000.
10. Kristallstruktur und Elementaranalyse
Eine Kristallisation des Enzyms konnte bisher nicht erreicht werden. Eine Elementaranalyse wurde nicht
durchgeführt
Aus den vorstehenden Eigenschaften ergibt sich, daß es sich bei dem Enzym um eine Glycerinoxidase handelt,
die in der Lage ist, Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd
zu oxidieren.
Nachstehend sind Mikroorganismenstämme aufgeführt, mit denen die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete Glycerinoxidase hergestellt werden kann:
Aspergülus japonicus KY-45 (FERM-P Nr. 3959, NRRL 11102),
Aspergülus oryzae KY-63 (NRRL 11103).
Aspergülus parasiticus KY-77 (NRRL 11104),
Aspergülus flavus KY-98 (NRRL 11105),
Aspergülus parasiticus KY-77 (NRRL 11104),
Aspergülus flavus KY-98 (NRRL 11105),
Neurospora crassa KY-462 (FERM-P Nr. 3960. NRRL 11106),
Neurospora sitophila KY-445(NRRLIl264) und
Neurospora tetrasperma KY-447 (NRRL 11265).
Neurospora sitophila KY-445(NRRLIl264) und
Neurospora tetrasperma KY-447 (NRRL 11265).
Zur Züchtung dieser Mikroorganismen können beliebige synthetische und natürliche Medien verwendet
werden, die die entsprechenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Bestandteile und anderen
Nährstoffe enthalten.
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose und Melassen, und Zuckeralkohole, wie
Glycerin, Sorbit und Mannit.
Beispiele für Stickstoffquelien sind Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumverbindüngen,
wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat,
Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff, und stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, Hefeextrakt,
Caseinhydrolysat, entfettete Sojabohnen und Hydrolyseprodukte davon.
Als organische Bestandteile können Salze von Metallen, wie Natrium, Kalium, Mangan, Magnesium, Calcium,
Kobalt, Nickel, Zink und Kupfer, sowie Salze der Chromsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure
und Salzsäure verwendet werden.
Im Züchtungsverfahren läßt sich Glycerinoxidase in besonders hohen Ausbeuten herstellen, wenn ein Glycerinoxidase
bildender Mikroorganismus in einem Medium mit einem Gehalt an Glycerin gezüchtet wird. Beispielsweise
ist die Produktivität an Glycerinoxidase, ausgedrückt als enzymatische Aktivität, bei Züchtung in
einem Medium mit einem Gehalt an Glycerin, 10- bis lOOfach höher als bei Züchtung des Mikroorganismus in
einem Medium mit einem Gehalt an 1 g/dl Glucose, 1 g/dl Malzextrakt und 0,5 g/dl Hefeextrakt oder in
Czapeck-Medium. Vorzugsweise wird Glycerin in Mengen von 0,1 bis 5 g/dl dem Medium zugesetzt.
Die Züchtung wird im allgemeinen bei Temperaturen von 20 bis 40°C und vorzugsweise bei 25 bis 35°C und
bei pH-Werten von 6 bis 8, vorzugsweise bei etwa 7, durchgeführt. Eine beträchtliche Menge an Glycerinoxidase
bildet sich in der erhaltenen Kulturbrühe, wenn die Züchtung unter Schütteln oder unter Belüftung und Bewegung
im Submersverfahren 30 bis 72 Stunden unter den angegebenen Bedingungen durchgeführt wird.
Die in der Kulturbrühe angereicherte Glycerinoxidase läßt sich auf folgende Weise gewinnen:
Glycerinoxidase wird im allgemeinen in den Mikroorganismenzellen gebildet. Zur Gewinnung des Enzyms aus
den Zellen werden die durch Filtration oder Zentrifugation der Kulturbrühe nach Beendigung der Züchtung
erhaltenen Mikroorganismenzellen ausreichend mit Wasser oder Pufferlösung gewaschen. Anschließend werden
die Mikroorganismenzellen in einer entsprechenden Menge an Puffer suspendiert und aufgebrochen. Das
Aufbrechen der Zellen wird durch mechanische Zerkleinerung vorgenommen, beispielsweise durch Vermählen
oder Ultraschall-Behandlung.
Feste Materialien werden aus der erhaltenen Lösung der aufgebrochenen Mikroorganismenzellen durch
Filtration oder Zentrifugation entfernt. Anschließend wird die Glycerinoxidase aus der Lösung gemäß üblichen
Verfahren zur Isolierung von Enzymen gewonnen. Beispielsweise lassen sich Enzympulver durch
1. fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat,
2. Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose,
3. Molekularsiebfraktionierung an dreidimensional vemetztem Dextran (Sephadex),
4. Säulenchromatographie an Hydroxyapatit und
5. Gefriertrocknen der aktiven Fraktionen
erhalten. Selbstverständlich können die einzelnen Verfahrensstufen wiederholt werden. Gegebenenfalls können
zusätzlich auch andere übliche Reinigungsverfahren angewendet werden.
F i g. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Sauerstoffaufnahme in einem Reaktionssystem bei Umsetzung von
Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff. Die Kurve A zeigt die Sauerstoffaufnahme in einem
Katalase-freien Reaktionssystem, während die Kurve B die Sauerstoffaufnahme in Gegenwart von Katalase
wiedergibt.
F i g. 2 zeigt die relativen Aktivitäten des Enzyms der Gattung Aspergillus nach 10-minütiger Inkubation bei
37°C und verschiedenen pH-Werten.
F i g. 3 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Aspergillus nach 30-minütiger Behandlung bei 30° C
und verschiedenen pH-Werten.
F i g. 4 zeigt die relativen Aktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 10-minütiger Inkubation bei
37°C und verschiedenen pH-Werten,
F i g. 5 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 30-minütiger Behandlung bei 30° C
und verschiedenen pH-Werten.
F i g. 6 zeigt die Beziehung zwischen Reaktionszeit und der optischen Dichte bei 500 nm (Maß für die Aktivität
des Enzyms).
F i g. 7 zeigt die Aktivitäten des Enzyms der Galtung Aspergillus nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert 8
und verschiedenen Temperaturen.
Fig.8 zeigt die Aktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert
8 und verschiedenen Temperaturen.
F i g. 9 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Aspergillus nach 30-minütiger Behandlung bei
pH-Wert 7 und verschiedenen Temperaturen in 0,1 m Ammoniumpuffer.
Fig. 10 zeigt die Restaktivitäten des Enzyms der Gattung Neurospora nach 30-minütiger Behandlung bei
pH-Wert 7 und verschiedenen Temperaturen in 0,1 m Ammoniumpuffer.
F i g. 11 zeigt die Beziehung zwischen Substratkonzentration (Glycerin) und optischer Dichte der Reaktionslö-
sungen bei 500 nm (vgl. Tabelle IV).
Die enzymologischen und physiko-chemischen Eigenschaften der auf diese Weise erhaltenen Glycerinoxidase
sind nachstehend angegeben. Dabei werden als Glycerinoxidase-Präparate die Produkte der nachstehenden
Versuche A und B verwendet.
■ , I.Wirkung
Das Enzym oxidiert unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd
spezifisch Glycerin.
(a) Bestätigung der Bildung von Wasserstoffperoxid
;■■, (a)-l· Glycerin wird in Gegenwart von Sauerstoff mit Glycerinoxidase umgesetzt. Anschließend wird das
t.-.i Reaktionssystem mit Peroxidase, Phenol und 4-Amino-antipyrin versetzt, wodurch sich Chinoniminpig-
L| is ment im Reaktionssystem bildet; bezüglich der Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase,
|j Phenol und 4-Aminoantipyrin vgl. Clin. Chem., Bd. 20 (1974), S. 470.
5 (a)"2. Glycerin wird in Gegenwart von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid mit Glycerini|
oxidase umgesetzt. Zur Zersetzung des Wasserstoffperoxids wird Katalase zugesetzt. Anschließend
]S wird das Reaktionssystem mit Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin versetzt, um die gleiche
,;(! 20 Reaktion, wie vorstehend erläutert, durchzuführen. Im Reaklionssystem wird aber nicht das gleiche
j ; Chinoniminpigment gebildet.
;;;i (a)-3. Bei Anwesenheit von Katalase im durch Glycerinoxidase in Gegenwart von Sauerstoff katalysierten
6 Glycerin-Oxidationssystem sinkt die Menge des aufgenommenen Sauerstoffs auf die Hälfte. Diese
':$ Tatsache wird durch folgende experimentellen Befunde gestützt:
■fej 25 (a)-3-l. Reaktionssystem A (ohne Katalase):
'-j; Reagentien
si wäßrige 0,01 m Glycerinlösung 0,5 ml
'('; 30 0,1 m NHtOH-NFUCI-Puffer (nachstehend als »Ammoniumpuffer« bezeichnet)
I (pH-Wert 8,0) 1,0 ml
Jj wäßrige Glycerinoxidaselösung 0,2 ml Ί
H wäßrige 2,4-millimolare 4-Amino-antipyrinlösung 0,5 ml
H wäßrige 42-millimolare Phenollösung 0,5 ml
ρ 35 wäßrige Peroxidaselösung 0,2 ml 5>
p Wasser 0,1 ml
& 1) 5 μ Mol Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 30, erhalten gemäß Versuch 1;
d 2) mit einem Gehalt an 200 Einheiten, spezifische Aktivität 1000.
φ. 40 (a)-3-2. Reaktionssystem B (mit Katalase):
H Reagentien
wäßrige 0,01 m Glycerinlösung 0,5 ml
45 0,1 m Ammoniumpuffer (pH-Wert 8,0) 1.0 ml
wäßrige Glycerinoxidaselösung 0,2 ml''
wäßrige Katalaselösung 1,OmP'
Wasser 0,3 mi
1) vgl. Reaktionssystem A;
50 3) mit e'nem Gehalt an lOOKatslaseeinheiten, spezifische Aktivität 100.
50 3) mit e'nem Gehalt an lOOKatslaseeinheiten, spezifische Aktivität 100.
(a)-3-3. Durchführung der Reaktion:
Im V:all des Reaktionssystems ohne Katalase werden die Bestandteile gemäß Reaktionssystem A
55 vermischt. Die Umsetzung wird unter Rühren bei 37°C durchgeführt. Die Menge der Sauerstoffaufnahme
wird mit einem Warburg-Manometer gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 1 zusammengestellt.
Im Fall des Systems mit einem Gehalt an Katalase werden die Bestandteile des Reaktionssystems B
vermischt. Die Umsetzung wird bei 37° C durchgeführt. In ähnlicher Weise wird die Sauerstoff aufnahme
gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 1 zusammengestellt. Aus F i g. 1 ergibt sich, daß der Sauer-60
stoffverbrauch in Abwesenheit von Kataiase 4,95 μ Mol (Kurve A in Fi g. 1) für 5,5 μ Mol Glycerin als
Substrat beträgt.
In Anwesenheit von Katalase (Kurve B in Fig. 1) werden 2,49 μ Mol Sauerstoff verbraucht, was
etwa der halben Menge von (A) entspricht.
65 Aus den vorstehenden Abschnitten (a)-1, (a)-2 und (a)-3 ergibt sich, daß das erfindungsgemäß eingesetzte
Enzym zur Bildung von Wasserstoffperoxid in der Lage ist.
Die quantitative Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids wird durch quantitative Ermittlung des
gebildeten Chinoniminpigmenis vorgenommen. Dabei ergibt sich aufgrund der quantitativen Bestimmung des
gebildeten Wasserstoffperoxids im Reaktionssystem A gemäß dem 4-AA-Verfahren, daß 4,92 μ Mol Wasserstoffperoxid
aus 5 μ Mol Glycerin gebildet worden sind.
(b) Bestätigung der Bildung von Glycerinaldehyd
(b)-l. Glycerin wird in Gegenwart von Sauerstoff mit Glycerinuxidase umgesetzt. Als Reaktionsprodukt
wird Glycerinaldehyd identifiziert.
(b)-l-l. Nachweisverfahren
(b)-1 -1 -(I). Reaktionslösung
5 Tropfen einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 50 mg/ml Glycerin, 5 Tropfen einer Lösung to
mit einem Gehalt an 10 u/ml Glycerinoxidase in 0,02 in Tris-HCl-Puffer und 1 Tropfen mit 14 000 u/
ml Katalase werden vereinigt. Die Reaktion wird 20 Stunden unter Schütteln bei 300C durchgeführt.
(b)-l-l-(2). Nachweis
Durch Dünnschichtchromatographie läßt sich als Produkt in der Reaktionslösung Glycerinaldehyd
nachweisen, der mil einer authentischen Probe verglichen wird.
Als Dünnschichtplatten werden Kieselgelplatien G-60F-254 verwendet. Als Laufmittcl dient das Lösungsmittelsystem
1 (Butanol : Essigsäure : Wasser = 4:1 :1 (Volumteile)) und das Lösungsmittelsystem 2 (Butanol
: Pyridin : Wasser = 3:2:1,5 (Volumteile)).
Nach der Chromatographie werden drei verschiedene Reaktionen auf der Plane durchgeführt: p-Anisidin-Salzsäure-Reaktion,
Perjodsäure-Benzidin-Rcaktion und 2,4-Diniirophenylhydrazin-Reaktion. Die Rf-Werte der
Reaktionsprodukte und die Färbungen der einzelnen Flecken erweisen sich mit der authentischen Probe als
identisch. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengestellt.
Identifizierung der bei der Dünnschichtchromatographie erhaltenen Reaktionsprodukte
(Rr-Werte und Farbreaktionen)
Farbreagens Probe Laufmittcl
Lösungsniittelsysiem 1 Lösungsmiuelsystem 2
p-Anisidin-Salzsäure-Rea- Glycerinaldehyd Ri-Wcrt 0.67 (braun) 0,76 (braun)
gens 1) (authentische Probe)
Reaklionsprodukt Ri-Wert 0.67 (braun) 0,77 (braun)
Perjodsäure-Benzidin-Rea- Glycerinaldehyd Rr-Wert 0,66 (+ )* 0,76 ( + )*
gens 2) (authentische Probe)
Reaktionsprodukt Rr-Wert0,67( + )* 0,77 ( + )*
2,4-Dinitrophenylhydrazin- Glycerinaldehyd Rr-Werl0,67 0,77 (orangefarben)
Reagens 3) (authentische Probe) (orangefarben)
Reaktionsprodukt Ri-Wert 0,68 0.77 (orangefarben)
(orangefarben)
Die Farbangaben in Klammern beziehen sich auf die Färbung der Flecken. Untcr( +)' beim Perjodsäure-Benzidin-Reagens ist
ein weißer Flecken auf blauem Hintergrund zu verstehen.
Anmerkungen:
1. p-Anisidin-Reagens: Reduktive Carbonylverbindungen. wie Zucker, reagieren mit p-Anisidin-Salzsäure unter Bildung
von für die jeweiligen Strukturen charakteristischen Färbungen.
2. Perjodsäure-Benzidin-Reagens: Polyalkohole und Verbindungen ähnlicher Struktur reagieren mit Perjodsäure. Somit
lassen sich die Verbindungen als weiße Flecken p:ichwt/Kpn.
3. 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens: Carbonylverbindungen reagieren mil 2.4-l)initrophcnylhydrazin unter Bildung von
2,4-Dinitrophenylhydrazon und lassen sich also orangefarbene Flecken nachweisen.
!,;;i Wie sich aus der vorstehenden Tabelle ergibt, verhalten sich die authentischen Glycerinaldehyd-Proben in
;ö bezug auf die Rr-Werte und bei den Färbungsreaklionen vollkommen identisch mit den eingesetzten Reaktions-
5, produkten. Dadurch wird bestätigt, daß bei der Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von
::? Sauerstoff Glycerinaldehyd entsteht.
Ji (b)-2. Die bei der Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff gebildete Menge
:¥ an Glycerinaldehyd ist fast äquimolar zur verbrauchten Glycerinmcnge. Dies wird durch Zusatz von
·' 2,4-Dinitropheny|hydrazin zum Reaktionssystem unter anschließender quantitativer, colorimefrischer Be- b5
,© Stimmung des gebildeten 2,4-Dinitrophenylhydrazons bestätigt.
(c) Bestimmung der Sauerstoffaufnahme
Der Sauerstoffverbrauch des Systems bei Umsetzung von Glycerin in Gegenwart von Glycerinoxidase wird
mit einer Sauerstotfelekirode und einem Warburg-Manometer gemessen. Es ergibt sich, daß die Sauerstoffauf-5
nähme der Menge dts gebildeten Glycerinaldehyds entspricht
(d) Eine quantitative Bestimmung der Menge an Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd sowie der Sauerstoffaufnahme
wird gemäß den vorstehend unter (a), (b) und (c) angegebenen Verfahren durchgeführt. Die
erhaltenen Werte sind im Hinblick auf ihre Stöchiometrie plausibel.
jo Die vorstehenden qualitativen und quantitativen Versuchsergebnisse bestätigen, daß durch das erfindungsgemäß
verwendete Enzym Glyceiin unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd gemäß nachstehender
Reaktionsgleichung oxidiert wird.
CH2OH ι |
Q2 | CH3OH | |
15 |
CHOH
CH2OH |
CHOH + H2O2 CHO |
|
20 | II. Substratspezifität | ||
Die relative Aktivität wird unter Verwendung von anderen Substraten in äquimolaren Mengen zum Glycerin
im Verfahren zur Messung der Aktivität gemäß dem 4-AA-Verfahren bestimmt.
Die relativen Aktivitäten gegenüber anderen Substraten sind in Tabelle HI zusammengestellt, wobei die
25 Aktivität gegenüber Glycerin gleich 1OO gesetzt wird.
Tabelle MI | Enzym | Enzym der Galtung |
Substrat | Enzym der Gattung | Neurospora |
Aspergillus | 100 | |
100 | 0 | |
Glycerin | 10,5 | 0 |
1,2-Propandiol | 3,3 | 0 |
1,3-Propandiol | 2,0 | 21 |
1,3-Butandiol | 0,4 | 0 |
Glycerin-3-phosphorsäure | 0,3 | 0 |
1,4-Butandiol | 0,3 | 0 |
2,3-Butandiol | 0 | 0 |
Ethanol | 0 | 0 |
n-Propanol | 0 | |
lsopropanol | ||
III. pH-Optimum und stabiler pH-Bereich
1. Das pH-Optimum des Enzyms der Gattung Aspergillus liegt im Bereich von 7 bis 8.
Die Aktivitäten werden nach 10-minütiger Inkubation bei 37"C bei verschiedenen pH-Werten gemessen
Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt.
2. Der stabile pH-Bereich des Enzyms der Gattung Aspergillus liegt bei 5,0 bis 8,0.
50 Die Restaktivitäten werden nach 30-mipütiger Behandlung bei 300C und verschiedenen pH-Werter
gemessen, wobei die nachstehend angegebenen Puffer verwendet werden. Die Ergebnisse sind in Fig.:
dargestellt.
pH-Wert 4 bis 5: Acetatpuffer
55 pH-Wert6bis7:Tris-HCl-Puffcr
55 pH-Wert6bis7:Tris-HCl-Puffcr
pH-Wert 8 bis 9: Boratpuffer
3. Das pH-Optimum des Enzyms der Gattung Neurospora liegt bei 8,0 bis 8,5.
Die Aktivität wird nach lOminütiger Inkubation bei 370C und bei verschiedenen pH-Werten gemessen
bO Die Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt.
4. Der stabile pH-Bereich des Enzyms der Gattung Neurospora liegt bei f>
bis 8,0. Die Messung wird gemäl Abschnitt 111-2 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt.
IV. Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität
(a) Prinzip
Die Bestimmung der Enzymaktivität wird durch Umsetzung des enzymatisch gebildeten Wasserstoffperoxid
Die Bestimmung der Enzymaktivität wird durch Umsetzung des enzymatisch gebildeten Wasserstoffperoxid
mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase durchgeführt. Dabei wird ein Chinoniminpigment
erhalten, das quantitativ bestimmt wird.
Die nachstehenden Reaktionsgleichungen erläutern dieses Verfahren:
Die nachstehenden Reaktionsgleichungen erläutern dieses Verfahren:
CH2OH CH2OH
I I
CH2OH CHO
NOl NO
2H2O2+CH3-N J + \ \ CHj—N \ + 4H2O (2)
CH, NH2 CI
4-Aminoantipyrin
il U
Die Reaktionsgleichung(2) ergibt sich im Prinzip ausC. C. Allain und Mitarb.,CUn. Chem., Bd. 2Q(1974), S.470.
(b) Reagentien
1. Substrat: wäßrige 0,1 m Glycerinlösung 0,5ml
2. Puffer: 0,1 m Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8 1,0 ml
3. 4-Aminoantipyridin: wäßrige 2,4 millimolare Lösung 0,5 ml
4. Phenol: 42 millimolar (wäßrige Lösung) 0,5 ml
5. wäßrige Peroxidaselösung(Proteinmengn 2 mg/ml, spezifische Aktivität 100) 0,1ml ίο
6. Wasser 03 ml
7. wäßrige Enzymlösung 0,1 ml
(c) Versuchsdurchführung
Die Reagentien 1. bis 6. werden in einem Reagenzglas vermischt und 5 Minuten bei 370C geschüttelt. Anschließend
wird die Enzymlösung zugesetzt. Das Gemisch wird sodann mit Ammoniumpuffer auf 3 ml aufgefüllt.
Die Umsetzung wird 10 Minuten unter Schütteln bei 37°C durchgeführt. Sodann wird das gleiche Verfahren
wiederholt, wobei zum Vergleich anstelle der Versuchslösung Wasser verwendet wird. Die optische Dichte der
Reaktionslösung bei 500 nm wird gemessen und der Unterschied zur Kontroilösung (Δ OD) bestimmt.
(d) Berechnung der Enzymaktivität
1 Einheit Glycerinoxidase ist die Enzymmenge, die 1 μ Mol Glycerin bei 37°C innerhalb 1 Minute zersetzt.
Der Absorptionskoeffizient von 0,5 millimolarem Chinoniminpigment wird zu 5,33 angegeben (vgl.
Chlin. Chem., Bd. 20 (1974), S. 470). Somit läßt sich die gewünschte Enzymaktivität (A) pro 1 ml Enzymlösung
nach folgender Gleichung berechnen, wenn die optische Dichte (JOD) bei 500 nm einer 3 ml Reaktionslösung
gemäß IV-(c) ermittelt ist:
A = aXx3x
= α x 0,56 (Einheiten/ml)
Die Werte für die optische Dichte der Reaktionslösungen bei 500 nm (die ein Maß für die Enzymaktivität
darstellen) werden in Abhängigkeit von der Reaktionszeit ermittelt. Die Ergebnisse sind in F i g. 6 dargestellt.
A us F i g. 6 ergibt sich, daß die optische Dichte bei 500 nm proportional zur Reaktionszeit ist.
m
%
V. Optimaler Temperaturbereich für die enzymatische Aktivität
1. Enzym der Gattung Aspergillus
Die enzymatischen Aktivitäten nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen
sind in F i g. 7 dargestellt. Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 400C.
2. Enzym der GaUung Neurospora
Die enzymatischen Aktivitäten nach 10-minütiger Inkubation bei pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen
sind in F i g. 8 angegeben. Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 35 bis 45° C.
VI. Inaktivierung bei verschiedenen pH-Werten
und Temperaturen
und Temperaturen
Einfluß des pH-Werts
Wie vorstehend unter III. in bezug auf das pH-Optimum und den stabilen pH-Bereich erläutert, wird das
Enzym der Gattung Aspergillus bei pH-Werten unterhalb von 4 und oberhalb von 10 im wesentlichen zu
100 Prozent inaktiviert. In ähnlicher Weise wird das Enzym der Gattung Neurospora bei pH-Werten unterhalb
von 4 und oberhalb von 10 im wesentlichen zu 100 Prozent inaktiviert.
Einfluß der Temperatur
Die restliche Aktivität nach 30-minütiger Wärmebehandlung in 0,1 m Tris-HCI-Puffer beim pH-Wert 7,0 wird
gemessen.
In Fig.9 sind die Ergebnisse für das Enzym der Gattung Aspergillus und in Fig. 10 für das Enzym der
Gattung Neurospora angegeben. Das erstgenannte Enzym ist bei Temperaturen bis zu 400C zu 100 Prozent
stabil, wird aber bei 45°C zu etwa 60 Prozent inaktiviert. Das letztgenannte Enzym wird bei 30°C zu etwa
50 Prozent und bei 50°C zu etwa 100 Prozent inaktiviert. Das Enzym der Gattung Aspergillus wird durch Zusatz
von 0,1 millimolar Dithiothreit stabilisiert. Die thermische Beständigkeit wird dadurch ebenfalls gesteigert (vgl.
F i g. 9, aus der sich eine Stabilität bis etw 50° C ergibt.
Die Glycerinoxidase eignet sich zur quantitativen Bestimmung von Glycerin nach folgenden Verfahren:
Die Glycerinoxidase eignet sich zur quantitativen Bestimmung von Glycerin nach folgenden Verfahren:
(a) Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff und quantitative Bestimmung
des gebildeten Wasserstoffperoxids.
(b) Umsetzung des gemäß (a) gebildeten Glycerinaldehyds mit 2,4-Dinilrophenylhydrazin und quantitative,
colorimetrische Bestimmung des erhaltenen 2,4-Dinitrophenyl-hydrazons, was eine quantitative Glycerinbestimmung
ergibt.
(c) Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff und Ermittlung der Sauerstoffaufnahme
des Systems.
Die Prinzipien und die Verfahren der Bestimmungsmethoden (a), (b) und (c) sind im vorstehenden Abschnitt I
erläutert. Nachstehend wird ein Beispiel für die Bestimmungsmethode (a) zur quantitativen Bestimmung von
Glycerin unter Messung der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids näher erläutert:
Die optische Dichte von Rcaktionslösungen bei 500 nm wird gemäß Abschnitt IV-(c) ermittelt, wobei Lösungen
mit einem Gehalt an 0,i mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 3,2 pro ml Lösung verwendet werden.
Die Substratkonzentrationen (Glycerinkonzcntrationen) der Lösungen gemäß IV-(b) betragen 0,1,0,2,0,5,1,0,5,0
und 10,0 millimolar. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Substratkonzcntrat ion. millimolar
0,1 0,2 0.5 1.0 5,0 10,0
Optische Dichte
bei 500 nm 0,060 0,121 0,303 0.605 3,002 5,998
Es läßt sich eine lineare Beziehung zwischen der Subslratkon/.entration (Glycerinkonzentration) und der
optischen Dichte der Lösungen bei 500 nm feststellen. Auf dieser Basis läßt sich die Glycerinkonzentration einer
unbekannten Probe ermitteln.
Somit kann die Glycerinkonzentration von Lösungen unter Verwendung von Glycerinoxidase gemessen
werden. Erfindungsgemäß wird also ein neues Verfahren und ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von
Glycerin zur Verfugung gestellt.
b5 Für ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung von Glycerin bestand ein Bedürfnis, insbesondere auf dem
Gebiet der Biochemie. Zur quantitativen Bestimmung von Triglyccriden sind verschiedene Verfahren bekannt.
wobei die Triglyceride in Serum unter Bildung von Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert werden und das
Glycerin bestimmt wird.
Zur quantitativen chemischen "Bestimmung von Glycerin stehen verschiedene Verfahre^ zur Verfügung,
beispielsweise das Chromotropsäure-Verfahren, das Aceiylaceton-Verfahren, das Triazol-Verfahren, das Randrup-Verfahren
und das Fluoreszenzverfahren gemäß Mendelsohn. Diese Verfahren haben aber alle den Nachteil,
daß sie für Glycerin nicht spezifisch sind.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Glycerinoxidase Glycerin direkt unter stöchiometrischer Bildung
von Wasserstoffperoxid oxidiert Das erhaltene Wasserstoffperoxid läßt sich leicht in ein gefärbtes System
überführen, so daß eine quantitative Bestimmung von Glycerin und somit eine quantitative Bestimmung von
Triglyceriden sehr einfach und spezifisch aufgrund einer colorimetrischen quantitativen Bestimmung durchgeführt
werden kann.
Beispiel
(a) Reagentien
(a) Reagentien
1. Zu untersuchende Lösung: Wäßrige Glycerinlösung von unbekannter Konzentration 0,5 ml
2. Puffer: 0,1 m Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8 1,0 m!
3. 2,4 millimolare wäßrige 4-Amino-antipyrinlösung 0,5 ml
4. 42 millimolare Phenollösung 03 ml
5. wäßrige Peroxidaselösung mit einem Proteingehalt von 20 mg/ml und
einer spezifischen Aktivität von 100° 0,1ml
6. Wasser 0,3 ml
7. Glycerinoxidase gemäß Beispiel 1
mit einem Proteingehalt von 1,0 mg/ml und einer spezifischen Aktivität von 3,2. 0.1 ml
(b) Verfahren
Die Reagentien 1. bis 6. werden in ein Reagenzglas gegeben und 5 Minuten bei 37°C ausreichend geschüttelt.
Anschließend wird die Enzymlösung zugesetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit Ammoriiumpuffer auf
3 ml aufgefüllt. Die Reaktion wird 10 Minuten unter Schütteln bei 37CC durchgeführt.
Zum Vergleich wird das gleiche Verfahren unter Verwendung von Wasser anstelle einer GlycerinlOsüng
durchgeführt. ...
Die optische Dichte der zu untersuchenden Lösung bei 500 nm wird gemessen. Die Differenz der optischen
Dichte zur.Vergleichsprobe beträgt 0,230. Aus der Kurve von Fig. 11 läßt sich ein Glyceringehaft der zu
bestimmenden Lösung von 0,380 milfimolar ermitteln.
Die nachstehenden Versuche erläutern die Gewinnung von Glycerinoxidase.
Versuch A
300 ml Ani.uchtmedium mit einem Gehalt an 10 g/Liter Glycerin, 10 g/Liter Malzextrakt und 5 g/Liter Hefeextrakt
(pH-Wert vor der Sterilisation 6,2) werden in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben mit Aspergillus
japonicus KY-45 (ATCC 1042, NRRL 11102, FERM-P Nr. 3959) beimpft und 48 Stunden unter Schütteln bei
300C gezüchtet. 900 ml (entsprechend 3 Kolben) der erhaltenen Anzuchtkultur werden auf 15 Liter des gleichen
Mediums, das sich in einem 30 Liter fassenden Fermenter befindet, überimpft und unter Belüftung (15 Liter/min)
und unter Rühren (250 U/min) 40 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Züchtung wird die erhaltene Kulturbrühe
abgeniitscht. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen. Man erhält 150 g (Trockengewicht) Mikroorganismenzellen.
Diese Mikroorganismenzellen werden in 5 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8.Q suspendiert
und in einer Dynp-Mühte (Willy A. Bachofen, Schweiz) aufgebrochen. Nach dem Aufbrechen Wird die
Suspension unter Verwendung einer Gefrierzentrifuge 20 Minuten bei 20 000 g zentrifugiert. Man erhält 4.7 Liter
Überstand mit einem Proteingehalt von 51 g und einer spezifischen Aktivität von 0,05 Einheiten/mg. Dieser
Überstand wird mit Ammoniumsulfat versetzt. Die bei einer Ammöniumsulfatsättigung von 30 bis 70 Prozent
ausgefällten Fraktionen werden gesammelt und in 50 ml 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wqrt 8.0
gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen 10 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffe;· dialysier?, wobei ein Dialyseschlauch
aus regenerierter Cellulose (Ceüophan) verwendet wird.
Die Dialyse wird 48.Stunden bei einer Gesamtmenge von 40 Liter Dialyselösung fortgesetzt, wobei jeweils
nach 12 Stunden die Dialyselösung ausgetauscht wird. Die dialysierte Enzymlösung wird über eine mit DEAE-Cellulose
(Serva Co.) gepackte Säule der Abmessungen 5,5 · 40 cm gegeben. Diese Säule ist vorher mit 10 millimolarem
Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden. Das dabei adsorbierte Enzym wird mit dem
genannten Puffer gewaschen, um nicht adsorbierte Proteinverunreinigungen auszuwaschen, Zur Elution wird
ein linearer 0,1 bis 0,2 m Ammoniumsulfatgradient in 2 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert
8,0 verwendet. Dabei wird die Glycerinoxidase eluiert. 500 ml aktive Fraktionen mit einem Proteingehalt von
1,2 g und einer spezifischen Aktivität von 1,1 werden gewonnen. Dieses Produkt wird bis zu einer Sättigung von
70 Prozent mit Ammoniumsulfat versetzt. Bei dem gebildeten Niederschlag handelt es sich um das gewünschte
Enzym.
Der Miederschlag wird durch 20-minütige Zentrifugation bei 20 000 g gesammelt und in 50 ml 10 millimqlarem
Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die Lösui.g wird über eine mit dreidimensional vernetztem, zur
Gelchromatographie geeigneten Dextran (Scphadex G-100) gepackte Säule der Abmessungen 5,5 · 80 cm gegeben.
Die Säule ist vorher mit 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden. 1 Liter
10 millimolarer Ammoniumpuffer vom pH-Wert 8,0 werden zur Elution über die Säule gegeben. Man erhält eine
300 ml-Fraktion von hoher spezifischer Aktivität (Proteingehalt JlO mg, spezifische Aktivität 3,2). Diese Fraktion
wird bis zu einer Sättigung von 70 Prozent mit Ammoniumsulfat versetzt. Das ausgefällte Enzym wird durch
20minütige Zentrifugation bei 20 000 g gewonnen und sodann in 20 ml 10 millimolarem Ammoniumpuffer vom
pH-Wert 8,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden gegen 5 Liter 10 millimolarem Ammoniumpuffer
vom pH-Wert 8,0 dialysiert, wobei ein Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose (Cellophan) verwendet wird
und die Dialyselösung 2mal ausgetauscht wird. Die nach der Dialyse erhaltene Enzymlösung wird über eine mit
Hydroxylapatit gepackle Säule der Abmessungen 5,5 ■ 20 cm gegeben, die vorher mit 10 millimolarem Ammoniumpuffer
vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden ist. Ferner werden 250 ml dieser Pufferlösung über die Säule
gegeben. Das Eluat wird fraktioniert. Fraktionen mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 20 werden
gesammelt und gefriergetrocknet. Man erhält 10,2 mg gereinigtes, pulverförmiges Enzympräparat. Es handelt
sich um Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 30,2. Die spezifische Aktivität des gereinigten
Enzyms ist 610mal größer als die des Zellextrakts. Die Ausbeute beträgt 19 Prozent, bezogen auf die Aktivität.
Versuch B
Anstelle des in Versuch A verwendeten Mikroorganismus Aspergillus japonicus K.Y-45 wird Neurospora
crassa K.Y-462 (NRRL 11106, FERM-P Nr. 3960) auf 2 Liter fassende Erlenmeyerkolben überimpft, die 10 g/Liter
Glycerin, 10 g/Liter Malzextrakt und 5 g/Liter Hefeexlrakt enthalten. Die Züchtung wird gemäß Versuch A
unter Schütteln 48 Stunden bei 30° C durchgeführt.
Die erhaltene Kulturbrühe wird gemäß Versuch A extrahiert und gereinigt. Man erhält 1,1 mg gereinigtes
Enzympräparat. Es handelt sich um Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 14,1. Bezogen auf die
Aktivität beträgt die Ausbeute 10,5 Prozent.
Versuch C
Die in Tabelle V angegebenen Mikroorganismenstämme werden im Verfahren von Versuch A anstelle von
Aspergillus japonicus K.Y-45 verwendet. Die Aktivitäten der erhaltenen Überstände der Zellextrakte sind
ebenfalls in Tabelle V angegeben.
Stämme Aktivität (μ/Liter)
Aspergillus oryzaeKY-63(NRRL 11103) 32,0
Aspergillus parasiticus KY-77 (NRRL 11104) 21,6
Aspergillus flavus KY-98(NRRL 11105) 10,8
Neurospora sitophila KY-445(NRRLIl264) 32,5
Neurospora tetrasperma K.Y-447 (NRRL 11265) 10,5
Hierzu 6 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin in Lösung, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff mit Glycerinoxidase umsetzt und die verbrauchte
Sauerstoffmenge oder die Menge an im wäßrigen Medium durch die Einwirkung der Glycerinoxidase
gebildeten Wasserstoffperoxid oder Glycerinaldehyd mißt, wobei die jeweiligen Mengen ein Maß für die
Glycerinkonzentration in der Lösung sind und die Glycerinoxidase durch die Fähigkeit gekennzeichnet isi.
Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd zu
oxidieren. ·
2 Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man eine Glycerinoxidase aus Aspergillus
japonicus K.Y-45 (FERM-P Nr. 3959, NRRL 11102), Aspergillus oryzae K.Y-63 (NRRL 11103), Aspergillus
parasiticus KY-77 (NRRL 11104), Aspergillus flavus KY-98 (NRRL 11105). Neurospora crassa ΚΎ-462
(FERM-P Nr. 3960, NRRL 11106), Neurospora sitophila KY-445 (NRRL 11264) oder Neurospora tetrasperma
KY-447 (NRRL 11265) verwendet.
3 Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch einen Gehalt
an Giycerinoxidase aus Aspergillus japonicus KY-45 (FERM-P Nr. 3959. NRRL 11102), Aspergillus Oryzae
KY-63 (NRRL 11103). Aspergillus parasiticus KY-77 (NRRL 11104), Aspergillus Flavus KY-98 (NRRL
11105), Neurospora crassa KY-462 (FERM-P Nr. 3960, NRRL 11106), Neurospora sitophila KY-445 (NRRL
11264) oder Neurospora tetrasperma KY-447 (NRRL 11265).
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