CH636904A5 - Verfahren zur bestimmung von h2o2. - Google Patents

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CH636904A5
CH636904A5 CH913877A CH913877A CH636904A5 CH 636904 A5 CH636904 A5 CH 636904A5 CH 913877 A CH913877 A CH 913877A CH 913877 A CH913877 A CH 913877A CH 636904 A5 CH636904 A5 CH 636904A5
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nadh
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Klaus Dr Beaucamp
Hans Dr Seidel
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Boehringer Mannheim Gmbh
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von H2O2 in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.
Zahlreiche wichtige Substanzen, wie Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Aminosäuren, Alkohole und dergleichen, werden enzymatisch unter Verwendung von Oxidasen bestimmt, welche bei dieser Reaktion H2O2 bilden. Letzteres wird anschliessend nach verschiedenen Methoden, wie Oxidation, eines Chromogens, Oxidation von Alkoholen mit Katalase (Hantzsche Reaktion), mit Aldehyddehydrogenase u.a. gemessen. Alle diese bekannten Indikatorreaktionen weisen Nachteile auf. So wird die Peroxidation von Chromogenen durch Pharmaka gestört, der Nachweis unter Verwendung der Hantz-schen Reaktion benötigt eine sehr lange Reaktionszeit, die Reaktionsführung über die Aldehyddehydrogenase ist umständlich und das Enzym ist sehr unstabil und dergleichen. Es besteht daher ein Bedarf nach einer einfachen Nachweismethode für H2O2, welche diese Nachteile nicht aufweist und sich insbesondere auch in Kombination mit spezifischen Oxidasen einsetzen lässt.
Ideal wäre es, die zur Bildung von H2O2 führende spezifische Oxidasereaktion mit der für enzymatische Bestimmungen bevorzugt eingesetzten NADH-Reaktion (NADH = Nicotin-amid-adenindinucleotid in reduzierter Form) kuppeln zu können. Eine NADH-Peroxidase, welche die Reaktion
NADH + H+ + H2O2 NADH-POD; NAD+ 2 H2O
katalysiert, ist bereits bekannt : ABB, 55,415 (1955) ; JBC, 225, 557 (1957). Dieses Enzym mit der EC-Nr. 1.11.1.1 wurde in Streptococcus faecalis 10 CI und in Lactobacillus casei gefunden und zeichnet sich durch ein pH-Optimum bei 5,4 sowie durch Michaelis-Konstanten KM für H2O2 von 2x 10_4und für NADH von l,4x 10-5 aus. Da für viele Oxidasen nur pH-Werte im alkalischen Bereich geeignet sind, die bekannte NADH-Peroxidase aber bei pH 7,0 bereits praktisch inaktiv ist (Arch. Biochem. Biophys. 111,535 [1965]) sowie aufgrund der ungünstigen Michaelis-Konstanten eignet sich das Enzym in der Praxis nicht für die H202-Bestimmung in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.
Nunmehr wurde eine weitere NADH-Peroxidase gefunden, welche die Nachteile der bekannten NADH-Peroxidase, von der sie sich klar unterscheidet, nicht aufweist und die sich vorzüglich zur Verwendung bei der enzymatischen H202-Bestim-mung, insbesondere auch in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase, eignet. Das Verfahren der eingangs genannten Art zur Bestimmung von H2O2 ist erfindungsgemäss dadurch gekennzeichnet, dass eine NADH-Peroxidase, welche NADH mit H2O2 zu NAD und H2O oxidiert und welche eine Michaelis-Konstante KM gegenüber H2O2 von 2,8x IO-5 M und gegenüber NADH von l,7x IO-5 M, gemessen bei 25 °C in 0,2 M Tris-Puffer, pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat, aufweist, der wässrigen Hz02-Lösung bei pH-Werten zwischen 5,0 und 10,0 zugesetzt und die Extinktionsänderung, welche der Änderung der NADH-Konzentration proportional ist, gemessen wird.
Das Verfahren nach der Erfindung kann unter Verwendung der neuen NADH-Peroxidase aus Mikroorganismen, welche sich in verschiedenen Eigenschaften von der bekannten NADH-Peroxidase unterscheidet, insbesondere in gekoppelter Reaktion in Gegenwart der spezifischen Oxidase durchgeführt werden.
Das neue Enzym eignet sich z.B. wegen seiner niedrigen KM wesentlich besser als das bekannte Enzym für eine H2O2-Bestimmung. Je höher nämlich z.B. die KM ist, desto höher muss bei einer Bestimmung auch die H202-Konzentration im steady state sein. Je höher z.B. aber die H202-Konzentration ist, desto grösser ist auch der Einfluss der Katalyase, die im Probenmaterial in der Regel vorhanden ist. Durch z.B. die Konkurrenz der Katalase um das H2O2 werden aber die Resultate verfälscht.
Das erfindungsgemäss verwendete neue Enzym kann wie das bekannte Enzym ein Flavoprotein und daher gelblich gefärbt sein. In z.B. Glycerin/Wasser 1:1 ist das Enzym bei +4 °C monatelang stabil. NADPH kann NADH nicht ersetzen im Gegensatz zum bekannten Enzym, welches z.B. mit NADPH etwa 8% der Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber NADH aufweist.
Das Enzym weist in Trispuffer z.B. in Gegenwart von Ace-tat- oder Propionat-Ionen ein pH-Optimum bei 6,0 auf, die Aktivität z.B. in Natriumacetatpuffer bei pH 5,4, also unter den optimalen Bedingungen des bekannten Enzyms, liegt etwa 20% niedriger. Bei pH 9,0 beträgt die Aktivität z.B. noch etwa 20% des Optimums.
Das neue Enzym kann aus Streptococcus faecalis ATCC 8043 gewonnen werden. Die Gewinnung erfolgt z.B. durch Aufschluss oder durch Behandlung des Mikroorganismus mit einem oberflächenaktiven Mittel unter Freisetzung des Enzyms, welches dann aus der Lösung isoliert werden kann. Geeignete Aufschlussmethoden sind beispielsweise Ultraschalleinwirkung, Zerreiben mit Glasperlen, Einwirkung hoher Scherkräfte und dergleichen. Alle diese Aufschlussmethoden sind bekannt und für Mikroorganismen üblich. Die Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel erfolgt vorzugsweise bei erhöhter Temperatur zwischen 25 und 60 °C. Bevorzugt wird eine Behandlung bei 45 bis 55 °C bei schwach sauren pH-Werten zwischen etwa 4,5 und 6,0. In der Regel reichen z.B. 15 bis 30 Minuten aus, diese Einwirkungsdauer kann jedoch ohne Nachteil erheblich überschritten werden. So werden z.B. selbst bei dreistündiger Einwirkung bei 55 °C noch sehr gute Ausbeuten erzielt. Die Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln wird bevorzugt, da hierbei weniger Verunreinigungen in Lösung gehen als bei mechanischen Aufschlussmethoden und daher von vornherein ein reineres Enzym gewonnen wird. Unter den oberflächenaktiven Mitteln werden die nichtionogenen bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Poly-äthylenglycolester, z.B. Alkylarylpolyäthylenglycolester wie Triton X-100. Ein besonderer Vorzug dieser Auf schlussmethode
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10
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besteht auch darin, dass der Gehalt an störender NADH-Oxi-dase hierbei besonders gering ist.
Zur Gewinnung des Enzyms werden vorzugsweise die Lösungen von den ungelösten Stoffen befreit, z.B. durch Zentri-fugieren, und aus dem gewonnenen klaren Überstand kann die 5 das Enzym enthaltende Eiweissfraktion gefällt werden. Zur Fällung eignen sich z.B. die hierfür in der Biochemie üblichen Mittel wie Aussalzen, z.B. mit Ammoniumsulfat, Fällung durch organische Lösungsmittel wie Aceton oder Methanol, Fällung mit Polyionen wie Polyäthylenimin und dergleichen. Eine wei- 10 tere Aufreinigung des rohen Enzympräparats kann beispielsweise durch Chromatographie an Adsorbentien wie Carboxy-methylcellulose, vernetztem Dextran, Ionenaustauschern und dergleichen erfolgen. Ausserdem zeigt es sich, dass das Enzym auch durch Säurebehandlung von Begleitsubstanzen befreit 15 werden kann. Zweckmässig erfolgt die Säurebehandlung z.B. bei pH-Werten zwischen 4,2 und 4,8 während 10 bis 25 Minuten.
Eine bevorzugte Reinigungsmethode besteht daher in einer Einstellung der wässrigen Enzymlösung auf pH 4,2 bis 4,8, 20 Abtrennung des Unlöslichen und Fraktionierung des im Überstand befindlichen Enzyms mit Polyäthylenimin.
Es versteht sich, dass z.B. alle Schritte des Gewinnungsverfahrens in gepufferter Lösung durchgeführt werden. Besonders geeignete Puffer können dabei Phosphatpuffer, TRIS-Puffer 25 und Acetatpuffer sein. Aber z.B. auch die anderen üblichen Puffer wie Glycinpuffer, Borat-Citratpuffer und dergleichen sind brauchbar.
Durch die Bestimmung von H2O2 unter Verwendung der neuen NADH-Peroxidase und der spezifischen Oxidase bei 30 pH-Werten zwischen 5,0 und 10,0, vorzugsweise 6,0 und 9,0, gelingt es z.B., die spezifische Oxidasereaktion mit der Messung der NADH-NAD-Reaktion zu koppeln. Letztere Reaktion lässt sich bekanntlich besonders einfach durch Bestimmung der Extinktionsänderung, die der Änderung der NADH-Konzen- 35 tration proportional ist, verfolgen.
Unter «spezifischer Oxidase» werden im Rahmen der Erfindung z.B. Enzyme verstanden, welche mit bestimmten Substraten und O2 unter Bildung von H2O2 reagieren.
Als spezifische Oxidasen werden im Rahmen der Erfindung 40 bevorzugt Glucoseoxidase, D-Aminosäureoxidase, L-Amino-säureoxidase, Cholesterinoxidase, Alkoholoxidase, Uricase und Xanthinoxidase verwendet. Dementsprechend lassen sich in der gekoppelten Reaktion Glucose, D-Aminosäuren wie D-Alanin, L-Aminosäuren wie L-Leucin, Cholesterin und Choleste- 45 rinester, niedere Alkohole, Harnsäure, Xanthin und Hypo-xanthin bestimmen. In einfacher Reaktion kann H2O2 selbst bestimmt werden, also nicht nur als Zwischenprodukt wie in Gegenwart des Oxidasesystems.
Die Messung der NADH-Peroxidase der Erfindung lässt 50 sich vorteilhaft z.B. nach folgendem Test durchführen : 2,68 ml TRIS-Kaliumacetatpuffer (0,2 M TRIS + 0,15 M Kaliumacetat) : 2,42 g TRIS + 1,42 g Kaliumacetat in 70 ml H2O lösen, mit 2 N Essigsäure auf pH 6,0 einstellen, mit H2O ad 100 ml auffüllen. 55
0,20 ml NADH (6 mM) : 5 mg NADH mit 1 ml H2O lösen. 0,02 ml Probe NADH-POD.
Mischen, bei 365 nm, d = 1 cm, 25 °C Vorlauf registrieren AE/min. Dieser Vorlauf (Extinktionsabnahme) dient zur Berechnung der 60 «NADH-Oxidase».
Start mit
0,10 ml H2O2 [40 mM (0,05 ml 30%iges H2O2 werden mit 10 ml H2O verdünnt)]
Mischen, Extinktionsänderung/min messen (AE/min). Vor Berechnung der NADH-POD-Aktivität wird von AE/min der NADH-Oxidase-Vorlauf abgezogen.
Bevorzugt wird TRIS-Acetat-Puffer verwendet, doch ist die Anwendung der NADH-POD nicht auf dieses Puffersystem beschränkt. Die Bestimmung von H2O2 mit NADH-POD kann u.a. durchgeführt werden mit:
Natriumacetat, Piperazin, Kaliumphosphat, Kaliumdiphos-phat, Borat/Citrat, Glycyl-Glycin, Triäthanolamin • HCl oder HEPES (N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N-äthan-sulfonsäure) als Puffersystem.
In entsprechender Weise kann auch die H202-Bestimmung durchgeführt werden, wobei z.B. NADH-POD im Überschuss zugegeben und die H202-Menge bestimmt wird, die der Extinktionsänderung entspricht. Die Messung kann nach der Endpunktmethode oder kinetisch, d.h. durch Messung der Extinktionsdifferenz innerhalb eines bestimmten kurzen Zeitraumes, erfolgen. Präzision und zeitlicher Verlauf der H202-Bestim-mung bei pH 8,0 im oben beschriebenen TRIS-Kaliumacetatpuffer und bei den oben angegebenen Messbedingungen zeigt beispielsweise die beigefügte Zeichnung. In dieser zeigen:
Fig. 1 eine Eichkurve, in der die H202-Menge (Abszisse) gegen die Extinktionsdifferenz (Ordinate) aufgetragen ist; und
Fig. 2 die Extinktionsabnahme mit der Zeit bei 25 °C. Am Start wurden 0,4 (xMol H2O2 zugesetzt.
Die beiden Figuren der Zeichnung lassen die Brauchbarkeit des erfindungsgemässen Enzyms für die quantitative H2O2-Bestimmung erkennen.
Die Erfindung ist in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Gewinnung und Reinigung des Enzyms
Streptococcus faecalis ATCC 8043 Biomasse wird mit einer l%igen Lösung von TRITON X 100 in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 30 Minuten auf 55 °C erhitzt. Dann wird auf 4 °C abgekühlt und das Unlösliche abgetrennt. Man erhält eine wässrige Lösung mit einer Aktivität von 1,77 U/ml und einer spezifischen Aktivität von 0,77 U/mg.
Die erhaltene Lösung wird Ammonsulfat zugesetzt, bis sich die gesamte enzymatische Aktivität im Niederschlag befindet. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Phosphatpuffer pH 5,0 aufgenommen und durch Molekularsiebpassage entsalzt. Die so erhaltene Enzymlösung kann direkt oder nach vorheriger Konzentrierung durch Lyophilisieren und Aufnehmen in 3,0 M Ammoniumsulfat-Lösung, pH ca. 7 für H202-Test verwendet werden.
Zweckmässig erfolgt eine weitere Aufreinigung der Ausgangslösung ohne vorherige Abtrennung des Enzyms durch Ammonsulfatfällung wie folgt :
Die Lösung wird mit Essigsäure auf pH 4,4 eingestellt und 20 Minuten stehengelassen. Dann wird vom Unlöslichen abfiltriert. Dem Überstand wird Polyäthyleniminlösung portionsweise zugesetzt und vom jeweils auftretenden Unlöslichen filtriert. Die das Enzym enthaltende Fraktion wird erneut in Puffer gelöst und über Diäthylaminoäthylcellulose Chromatographien. Anschliessend erfolgt eine Entsalzung über vernetztes Dextran. Man erhält so ein Präparat mit ca. 45 U/mg.
Beispiel 2
Abhängigkeit der Aktivität der NADH-POD vom im Test verwendeten Puffer
Gemessen wird in 0,1 M Puffern (1 mM H2O2,0,4 mM NADH).
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Tabelle 1
Enzymaktivitäten bei pH 7,5 in % in verschiedenen Puffern, bezogen auf die Aktivität in Natriumacetat-Puffer (= 100%)
Puffer
%
Natriumacetat TRIS* Acetat TRA-Acetat Piperazin • HCl HEPES
Kaliumphosphat
Kaliumdiphosphat
Borat/Citrat
100
101 100 100
89 63 61 25
Tabelle 4
Wiederfindung Harnsäure in %, bei 0,2 pMol Harnsäure/Testansatz (Testbedingungen: 0,2 M TRIS • Acetat, 0,15 M Kaliumacetat, 0,4 [iMol NADH, 0,1 U NADH-POD, 1 U Uricase aus Aspergillus flavus, 3 ml Testvolumen, 25 °C, 365 nm), bezogen auf 5 min Reaktionsablauf bei pH 8 = 100%.
10
TRA = Triäthanolamin Beispiel 3
Einfluss des pH-Wertes im Testsystem auf die Aktivität der NADH-POD
Gemessen wird in 0,1 M TRIS • Acetat-Puffer (1 mM H2O2 und 0,4 mM NADH).
Tabelle 2
pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität in %
pH
%
6,0
71
7,0
95
8,0
100
8,5
98
9,0
76
10,0
69
pH
%
5,0
67
5,4
98
6,0
100
7,0
88
7,5
56
8,0
37
9,0
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Beispiel 5
Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase (GOD)
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:
20
D-Glucose + H2O + O2 GOD; Gluconat + H2O2.
Die Bestimmung wurde bei pH 7,0 unter Einsatz von 210 U GOD, 0,2 U NADH-POD und 60 U Mutarotase durchgeführt. 25 Die Bestimmung der Glucose im Harn ergab 100% des mit der Referenzmethode GOD-Perid R (DT-AS 16 48 840 und H.U. Bergmeyer, Bd. II, 3. Aufl., S. 1257 [1974]) erhaltenen Wertes.
30
Beispiel 4
Harnsäurebestimmung mit Uricase
Die Bestimmung erfolgt gemäss folgender Gleichung:
2 H2O + Harnsäure + O2 Uricase Allantoin + H2O2 + CO.
Uricase, NADH-POD gemäss Erfindung und NADH wurden in 0,2 M TRIS • Acetat-Puffer unterschiedlichen pH-Wertes, welcher jeweils 0,15 M Kaliumacetat enthielt, gelöst. Dann wurde eine 0,2 uMol Harnsäure enthaltende wässrige Lösung zum Start zugesetzt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Beispiel 6
Bestimmung von D-Alanin mit D-Aminosäureoxidase (D-AOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäss folgender Gleichung:
35 D-Alanin + O2 + H2O D-AOD^ Pyruvat + NH3 + H2O2.
Die Bestimmung wurde bei pH 8,5 unter Einsatz von 0,25 U NADH-POD, 20 U D-AOD, 5 U Lactatdehydrogenase bei 25 °C durchgeführt. Bei 20minütiger Inkubation bei 25 °C betrug die 40 Wiederfindung 100%.
Referenzmethode: M. Grassi in H.U. Bergmeyer, Bd. II, 3. Aufl., S. 1731 (1974).
Beispiel 7
45 Bestimmung von L-Leucin mit L-Aminosäureoxidase (L-AOD) aus Crotalus terrificus)
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:
L-Leucin + O2 L-AOD^ Ketoisocapronsäure + H2O.
50
Tabelle 3
pH Enzymmenge im Test
Endab
% Wiederfindung,
NADH-POD Uricase laufzeit bezogen auf UV-
in min test= 100%
U
U
6 0,1
1
16
95,5
7 0,1
1
10
99
8 0,1
1
5
100
9 0,1
1
16
96,5
9 0,1
2
10
96,5
10 0,2
0,2
10
98
Die Durchführung erfolgte bei pH-Werten zwischen 7,5 und 8,0 in TRIS • acetat-Puffer 0,2 M, welcher 0,15 M Acetat enthält. Bei Zusatz von 0,2 U NADH-POD gemäss Erfindung und 0,7 U L-AOD im Test betrug die Wiederfindung etwa 100%.
55 Bei einer Konzentration von 0,2 p,Mol L-Leucin betrug die Reaktionsdauer ca. 20 Minuten. Referenzmethode: nicht bekannt.
60 Beispiel 8
Cholesterinester-Bestimmung mit Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase
Die Bestimmung erfolgt gemäss nachstehenden Gleichungen:
Referenzmethode: P. Scheibe, E. Bernt und H.U. Bergmeyer in H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Bd. II, 3. Aufl., S. 1999 (1974).
65
1. Cholesterinester+H2QChol.-Esterase Cholesterin+Fettsäure 2. Cholesterin + O2 Chol.-Oxid.-Cholestenon + H2O2.
5
636 904
Es wurden handelsübliche Cholesterin-Standardlösungen und Serum verwendet. Die Wiederfindung bei einer handelsüblichen Standardlösung mit 0,2 |xMol Cholesterin betrug 98 bis 102% bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0 innerhalb von 9 bis 12 Minuten. Eingesetzt wurden 0,1 U NADH-POD, 2 U Chole-sterinoxidase in 3 mlTestvolumen.
Die Cholesterinbestimmung im Serum unter Verseifung des veresterten Cholesterinanteils mit äthanolischer KOH ergab Wiederfindungswerte zwischen 95 und 105%.
Referenzmethode: P. Roeschlau, E. Bernt und W. Gruber, H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Bd. II, 3. Aufl., S. 1938(1974).
Beispiel 9
Bestimmung von Alkoholen mit Methanol-Oxidase (MOD) Die Bestimmung erfolgt gemäss folgender Gleichung:
Methanol + O2 MOD^ Formaldehyd + H2O2.
Die Bestimmung wurde bei pH-Werten zwischen 9,0 und 9,5 in Glycin-Na-Pyrophosphatpuffer unter Zusatz von Semi-
carbazid durchgeführt. Die eingesetzten Enzymmengen waren 0,3 U NADH-POD und 8 U MOD. Die Wiederfindung bei 0,2 (xMol Methanol und Äthanol lag um 100%. Auch mit Isopropa-nol konnte die Bestimmung durchgeführt werden.
Beispiel 10
Bestimmung von Xanthin und Hypoxanthin mit Xanthinoxi-dase (XOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäss folgender Gleichungen:
Hypoxanthin + H2O + O2 XOD^ Xanthin + H2O2
Xanthin + H2O + O2 XOD^ Harnsäure + H2O2.
Die Bestimmung erfolgte bei pH 8,0 mit TRIS-Puffer wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die Wiederfindung betrug 100% Xanthin bzw. Hypoxanthin. Als Referenzmethode wurde die in Bergmeyer, Methoden der enzymati-20 sehen Analyse, 3. Aufl., Band II, S. 1988 (1974) beschriebenen Methode verwendet.
0
G
1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

636 904
1. Verfahren zur Bestimmung von H2O2 in wässriger Lösung in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase, dadurch gekennzeichnet, dass eine NADH-Peroxidase, welche NADH mit H2O2 zu NAD und H2O oxidiert und welche eine Michaeliskonstante KM gegenüber H2O2 von 2,8x IO-5 M und gegenüber NADH von 1,7 x 10-5M, gemessen bei 25 °C in 0,2 M Tris-Puffer, pH 6,0, enthaltend
0,1 M Kaliumacetat, aufweist, der wässrigen H202-Lösung bei pH-Werten zwischen 5,0 und 10,0 zugesetzt und die Extinktionsänderung, welche der Änderung der NADH-Konzentra-tion proportional ist, gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die NADH-Peroxidase der wässrigen H202-Lösung bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0 zugesetzt wird.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als spezifische Oxidase Glucoseoxidase, D-Aminosäure-oxidase, L-Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase, Alkohol-oxidase, Urikase oder Xanthinoxidase verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine NADH-Peroxidase aus Streptococcus faecalis ATCC 8043 verwendet wird, die durch Aufschluss oder Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel freigesetzt und aus der Lösung gewonnen wird.
CH913877A 1976-07-27 1977-07-22 Verfahren zur bestimmung von h2o2. CH636904A5 (de)

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