DE3820404C2

DE3820404C2 -

Info

Publication number: DE3820404C2
Application number: DE19883820404
Authority: DE
Inventors: Kazumi Tsuruga Fukui Jp Yamamoto; Toshiro Tsuruga Fukui Jp Kikuchi; Shigenori Tsuruga Fukui Jp Emi
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1987-06-15
Filing date: 1988-06-15
Publication date: 1993-07-29
Also published as: DE3820404A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine neue Pyruvat-Dehydrogenase, ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms sowie Reagentien, die dieses Enzym enthalten und in einem entsprechenden analytischen Verfahren verwendet werden. Die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung wird von einem bestimmten Stamm der Gattung Lactobacillus erzeugt. Sie ist eine neue Pyruvat-Dehydrogenase mit überlegener thermischer Stabilität.

Derzeit wird die colorimetrische Messung von Pyruvat im Serum und Urin mit Hilfe von Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.3.3) durchgeführt. Diese Pyruvat-Oxidase oxidiert Brenztraubensäure (Pyruvinsäure) gemäß folgender Gleichung:

Brenztraubensäure + Phosphorsäure + O₂ → Acetylphosphat + CO₂ + H₂O₂

Das erzeugte H₂O₂ reagiert mit Peroxidase und chromogenen Stoffen. Dies führt zu einer Färbung, mit deren Hilfe die Menge der vorhandenen Brenztraubensäure bestimmt werden kann.

Die Umsetzung dieser Art verläuft in flüssigen Systemen. In jüngster Zeit werden jedoch wegen ihrer günstigen Handhabung trockene Verfahren bevorzugt, in denen keine flüssigen Systeme eingesetzt werden, d. h. Verfahren, in denen Testpapiere, z. B. Teststreifen, benutzt werden, die durch Aufbringen einer Reagensschicht auf eine Folie herstellbar sind. Das Testverfahren für Brenztraubensäure und Pyruvate, bei dem die vorstehend erwähnte Pyruvat-Oxidase eingesetzt wird, kann nicht als trockenes System ausgebildet werden, da die Pyruvat-Oxidase ungenügende Wärmebeständigkeit aufweist und gelöster Sauerstoff in den Systemen zur Umsetzung fehlt.

Ein Enzym, das auch dann zur Einwirkung auf Brenztraubensäure gebracht werden kann, wenn wenig gelöster Sauerstoff im Reaktionssystem vorhanden ist, ist Pyruvat-Dehydrogenase. Beispiele für bekannte Pyruvat-Dehydrogenasen sind Pyruvat: Lipoamid-Oxidoreductase (EC 1.2.4.1), Pyruvat: Ferricytochrom-bl-Oxidoreductase (EC 1.2.2.2) und Pyruvat: Ferredoxin-Oxidoreductase (EC 1.2.7.1), die Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexe erzeugen; vgl. B. Maruo und N. Tamiya, Enzyme Handbook, Asakura Bookstore, Herausgeber. Die Anwendung dieser Enzyme beim colorimetrischen Test von Brenztraubensäure bereitet jedoch Schwierigkeiten. Ein Enzym mit überlegener Wärmebeständigkeit, das zur Bestimmung von Brenztraubensäure in einem System verwendet werden kann, das nur wenig gelösten Sauerstoff enthält, ist bisher nicht bekannt.

Die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung, mit der die vorstehend erwähnten Nachteile des Standes der Technik überwunden werden, katalysiert die folgende Umsetzung I:

Brenztraubensäure + Phosphorsäure + Elektronenakzeptor
→ Acetylphosphat + CO₂ + reduzierter Elektronenakzeptor (I)

Die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie bei dem pH-Wert 6,3 15 Minuten bei einer Temperatur bis zu 50°C stabil ist.

Die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung läßt sich durch Züchtung eines bestimmten Stammes der Art Lactobacillus und Gewinnung des Enzyms aus dem Kulturmedium herstellen.

Das analytische Reagens der Erfindung enthält die neue Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung. Wenn das Reagens zur Bestimmung von Enzymen oder Substraten verwendet wird, die Brenztraubensäure erzeugen, dann enthält es chemische Stoffe und/oder Enzyme, die an dieser enzymatischen Reaktion unter Erzeugung von Brenztraubensäure beteiligt sind; vgl. nachstehendes Beispiel 3.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt eine Pyruvat-Dehydrogenase dar, die in vorteilhafter Weise eher auf andere Elektronenakzeptoren als auf Sauerstoff wirkt.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Pyruvat-Dehydrogenase die folgenden Eigenschaften:

(1) sie wirkt spezifisch auf Brenztraubensäure;
(2) sie wirkt bevorzugt auf andere Elektronenakzeptoren als auf Sauerstoff;
(3) sie hat einen günstigsten pH-Bereich für die Umsetzung von etwa 6,2 bis 6,3;
(4) sie ist im pH-Bereich von etwa 5 bis 8 stabil;
(5) sie hat eine günstigste Temperatur für die Umsetzung von etwa 55°C; und
(6) sie benötigt Flavin-Adenin-Dinucleotid und Thiamin-Pyrophosphat als Co-Enzyme.

Mit der Erfindung werden folgende Aufgaben gelöst bzw. Vorteile erzielt:

(1) es wird eine Pyruvat-Dehydrogenase mit überlegener Wärmebeständigkeit bereitgestellt;
(2) es wird ein Verfahren zur Herstellung einer Pyruvat- Dehydrogenase mit überlegener Wärmebeständigkeit geschaffen;
(3) durch die Verwendung der Pyruvat-Dehydrogenase mit überlegener Wärmebeständigkeit werden analytische Verfahren zur genauen Bestimmung von Brenztraubensäure sowie von verschiedenen Arten von Enzymen und Substraten, die einen Bezug zu enzymatischen Reaktionen unter Erzeugung von Brenztraubensäure haben, geschaffen, die auch in Abwesenheit von gelöstem Sauerstoff durchgeführt werden können; und
(4) es werden Reagentien mit ausgezeichneter Wärmestabilität bereitgestellt, die in trockenen Analysen verfahren eingesetzt werden können und überlegene Stabilität in Lösung aufweisen.

In der Zeichnung zeigt

Fig. 1 die Aktivitätsänderung der Pyruvat-Dehydrogenase mit hervorragender Wärmebeständigkeit der Erfindung bei Änderung des pH-Wertes;

Fig. 2 die pH-Stabilität der Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung;

Fig. 3 die günstigste Umsetzungstemperatur für die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung;

Fig. 4 die Wärmebeständigkeit der Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung;

Fig. 5 die Beziehung zwischen der Brenztraubensäure- Konzentration in Reaktionsgemischen und der optischen Dichte bei 570 nm des Reaktionsgemisches, wenn die Brenztraubensäure der Probenlösungen unter Verwendung der Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung gemessen wird;

Fig. 6 die Beziehung zwischen der ADP-Konzentration in Reaktionsgemischen und der optischen Dichte bei 570 nm von Reaktionsgemischen, wenn die ADP von Probenlösungen unter Verwendung der Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung gemessen wird;

Fig. 7 die Beziehung zwischen der Menge an Kontrollserum von Probenlösungen und der optischen Dichte bei 570 nm von Probenlösungen, wenn die Brenztraubensäure des Kontrollserums unter Verwendung der Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung gemessen wird; und

Fig. 8 die Beziehung zwischen den Werten, die erhalten werden, wenn die Brenztraubensäure in Probenlösungen unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Testreagens (mit Pyruvat-Oxidase) gemessen wird, und den Werten, die erhalten werden, wenn die Brenztraubensäure in den Probenlösungen unter Verwendung des Reagens der Erfindung gemessen wird.

Die neue Pyruvat-Dehydrogenase besitzt hervorragende thermische Stabilität. Sie wird von einem bestimmten Stamm der Gattung Lactobacillus erzeugt.

Es ist der Stamm Lactobacillus delbrueckii IFO 3202 (FERM BP-1895).

Das Enzym der Erfindung, das ausgezeichnete Wärmebeständigkeit aufweist, wird durch Züchtung des Stammes FERM BP-1895 unter üblichen Verfahrensbedingungen erhalten.

Zur Züchtung eignen sich synthetische oder natürliche Kulturmedia, sofern sie eine geeignete Menge der notwendigen Nährstoffe, nämlich eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff quelle, anorganische Stoffe und andere Nährstoffe, enthalten, die vom betreffenden Mikroorganismus verwertet werden können. Beispielsweise können Glucose, Saccharose, Dextrin, Brenztraubensäure oder Molassen als Kohlenstoff quelle benutzt werden. Als Stickstoffquelle können anorganische oder organische Stickstoffverbindungen eingesetzt werden, beispielsweise stickstoffhaltige Naturprodukte, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Kasein- Hydrolysate. Geeignet sind auch anorganische Salze, wie Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat, oder organische Salze, wie Ammoniumcitrat und Aminosäuren, wie Glutaminsäure.

Der Mikroorganismus kann in dem Kulturmedium in üblicher Weise gezüchtet werden, beispielsweise als Schüttelkultur oder als belüftete Kultur. Die Temperatur wird im Bereich von 20 bis 50°C eingestellt und liegt vorzugsweise in der Nähe von 37°C. Der pH-Wert wird auf den Bereich von 5 bis 8, vorzugsweise 6 bis 7 eingestellt. Falls der Mikroorganismus auch unter anderen Bedingungen wächst, können solche Bedingungen angewendet werden.

Die Dauer der Züchtung beträgt im allgemeinen 1 bis 4 Tage. Während dieser Zeit wächst der Mikroorganismus und erzeugt die Pyruvat-Dehydrogenase, die sich in den Zellen ansammelt.

Das Enzym der Erfindung kann in üblicher Weise aus den Bakterienzellen extrahiert und gereinigt werden. Zur Extraktion des Enzyms aus den Zellen können diese mechanisch mit einem Ultraschall-Gerät oder unter Verwendung von Glaskugeln, einer French-Presse oder von grenzflächen aktiven Mitteln aufgebrochen werden. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt (rohe Enzymlösung) wird durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, durch Metall-Aggregation unter Verwendung von Magnesiumchlorid oder Calciumchlorid, durch Aggregation unter Verwendung von Protamin oder Polyethylenimin, oder durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE (Diethylaminoethyl) Sepharose oder von CM (Carboxymethyl) Sepharose gereinigt.

Die Aktivität der erhaltenen Pyruvat-Dehydrogenase kann wie folgt bestimmt werden:

Reagentien für die Aktivitätsbestimmung
0,15 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,3)\|10 ml
3 mM Thiamin-Pyrophosphat	2 ml
0,15 mM FAD · Na₂	2 ml
15 mM EDTA ·Na₂	2 ml
0,15 M MgSO₄	2 ml
1 mM 1-Methoxy-5-methylphenazinium-methylsulfat-10 mM Nitrotetrazolium-Blau	3 ml
10% Triton X-100	1,5 ml
destilliertes Wasser	2,5 ml

Zunächst werden aus dem Gemisch der vorstehend angegebenen Komponenten 2,5 ml in ein Teströhrchen abpipettiert und mit 0,5 ml 0,3 M Kaliumpyruvat versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wird es mit 0,05 ml Enzymlösung versetzt und vorsichtig gerührt. Hierauf wird die Änderung der optischen Dichte bei 570 nm pro 1 Minute bei 37°C in einem Spektrophotometer als Testwerte bestimmt (Δ OD-Test). Anschließend werden anstelle der Enzymlösung 0,05 ml 50 mM Kaliumphosphat-Puffer vom pH-Wert 6,3 verwendet. Es werden die gleichen Stufen wie vorstehend beschrieben durchgeführt, um die Änderung der optischen Dichte pro 1 Minute als Blindwert zu bestimmen (Δ OD blind). Unter diesen Bedingungen wird die Enzym-Aktivität von Pyruvat- Dehydrogenase, die ½ µMol Diformazan erzeugt, als eine Einheit (U) bezeichnet.

Die physicochemischen Eigenschaften des Enzyms der Erfindung sind nachstehend angegeben.

1) Reaktionen

Das Enzym katalysiert die Umsetzung (I):

2) Substratspezifität

a) Das Enzym wirkt spezifisch für Brenztraubensäure. Es oxidiert nicht Oxaloessigsäure, DL-Milchsäure, Essigsäure oder α-Ketoglutarsäure.

b) Als Elektronenakzeptoren eignen sich in der vorstehend genannten Umsetzung (I) verschiedene Stoffe. Die in Tabelle I angegebenen Elektronenakzeptoren werden in einer Umsetzung bei einer bestimmten Menge Pyruvat und Phosphorsäure mit der Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung verwendet, wobei das Ausmaß der Umsetzung (d. h. die Menge des verbrauchten Elektronenakzeptors) bestimmt und mit dem Ausmaß einer Umsetzung unter Verwendung einer bekannten Pyruvat-Oxidase verglichen wird (Fed. Proc., Bd. 13 (1954), S. 734-738). Zur Bestimmung der Menge des verbrauchten Elektronen akzeptors wird die Menge an erzeugtem Wasserstoff peroxid mit Sauerstoff als Elektronenakzeptor gemessen. Diese Wasserstoffperoxidmenge wird durch die Erzeugung von Farbstoff mit Hilfe eines Chromogens und Peroxidase gemessen. Gemessen wird die Absorption des Reaktionssystems. Wenn 1-Methoxy-5-methylphenazinium- methylsulfat (1-Methoxy-PMS) als Elektronenakzeptor verwendet wird, wird die Menge des verbrauchten Elektronenakzeptors durch Anwendung der Messung der Aktivität der Dehydrogenase dieser Erfindung bestimmt. Wenn Methylenblau als Elektronenakzeptor eingesetzt wird, wird der Grad der Reduktion des Methylenblau (die der Menge des verbrauchten Elektronenakzeptors entspricht) über das Ausmaß der Abnahme der Absorption bei 578 nm bestimmt. Wenn Ferricyanid verwendet wird, wird das Ausmaß der Reduktion des Ferricyanids über das Maß der Abnahme der Absorption bei 420 nm bestimmt. Bei Verwendung von 2,6-Dichlorphenol indophenol (DCPIP) wird das Ausmaß der Reduktion des DCPIP über das Ausmaß der Abnahme der Absorption bei 600 nm bestimmt. Die relative Aktivität dieser Elektronen akzeptoren ist in Tabelle I angegeben, wobei Sauerstoff als 100% gesetzt ist.

Tabelle I

Tabelle I zeigt, daß die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung mit allen in der Tabelle aufgeführten Elektronenakzeptoren wirksam ist. Sie zeigt auch, daß die Pyruvat-Dehydrogenase stärker auf die anderen Stoffe als auf Sauerstoff wirkt. Dieses Enzym hat also Eigenschaften sowohl der Pyruvat-Dehydrogenase, d. h. die Eigenschaft, auf andere Elektronenakzeptoren als auf Sauerstoff zu wirken, als auch von Pyruvat-Oxidase, d. h. die Eigenschaft der Wirkung auf Sauerstoff. In diesem Punkt unterscheidet sich das Enzym der Erfindung von der bekannten Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.3.3), die im wesentlichen auf Sauerstoff wirkt.

3) Günstigster pH-Wert

Die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung wird zu 50 mM Kaliumphosphat-Puffer mit verschiedenen pH-Werten gegeben und ihre Aktivität unter diesen Bedingungen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Fig. 1 zeigt, daß der günstigste pH-Wert des Enzyms der Erfindung bei etwa 6,2 bis 6,3 liegt.

4) Bereich der pH-Stabilität

Das Enzym der Erfindung wird zu Pufferlösungen mit verschiedenen pH-Werten gegeben und 20 Stunden bei 25°C belassen. Dann wird die Restaktivität gemessen. Als Pufferlösungen werden 50 mM Acetat-Puffer vom pH-Wert 3 bis 6, 50 mM Kaliumphosphat-Puffer vom pH-Wert 5,5 bis 8 und 50 mM Tris-HCl-Puffer vom pH 8 bis 9 verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefaßt. Fig. 2 zeigt, daß der Bereich der pH-Stabilität von etwa 5 bis 8 reicht.

5) Günstigste Temperatur

Die Aktivität des Enzyms wird bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Fig. 3 zeigt, daß die günstigste Temperatur bei etwa 55°C liegt.

6) Wärmestabilität

Die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung wird zu 50 mM Kaliumphosphat-Puffer mit dem pH-Wert 6,3 gegeben und 15 Minuten auf eine bestimmte Temperatur von 40 bis 60°C erhitzt. Dann wird die Restaktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Fig. 4 zeigt, daß das Enzym bis etwa 50°C stabil ist.

7) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung

a) Zur Bestimmung der Enzymaktivität werden die vorstehend erwähnten Reaktionssysteme hergestellt, wobei jedoch jeweils eine der in Tabelle II aufgeführten Substanzen weggelassen wird. Sodann wird die Aktivität des Enzyms in diesen Systemen bestimmt und als relative Aktivität in Tabelle II angegeben. Im System ohne Phosphat werden 50 mM Acetat-Puffer vom pH-Wert 6,3 eingesetzt.

Nicht verwendete Substanz
relative Aktivität (%)
-
100
TPP	0
FAD	85,7
Phosphat	0
Mg²⁺	0

Aus den Ergebnissen der Tabelle II ist zu ersehen, daß TPP, FAD und Mg²⁺ vom Enzym als Co-Faktoren benötigt werden. Als Substrat ist Phosphat erforderlich.

b) Die Reaktionssysteme zur Messung der Enzymaktivität werden mit verschiedenen Metallkomponenten gemäß Tabelle III anstelle von Magnesiumsulfat hergerichtet und die Enzymaktivität in diesen Systemen wird bestimmt. Die Metallionenkonzentration in den Reaktions gemischen beträgt 10 mM. Die Aktivitäten werden in Tabelle III relativ zu der Aktivität mit Magnesium sulfat als 100% angegeben.

Metallverbindung
relative Aktivität (%)
MgSO₄
100
MnCl₂	3,0
CoCl₂	114,4
CaCl₂	108,9
ZnSO₄	66,7
BaAc₂	0
FeCl₃	0
NiCl₂	88,3
CuSO₄	0

Tabelle III zeigt, daß die Enzymaktivität bei Zusatz von Mg²⁺, Co²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺ oder Ni²⁺ zufriedenstellend ist.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung sowohl die Eigenschaften von Pyruvat-Dehydrogenase als auch von Pyruvat-Oxidase aufweist und daß sie ein neues Enzym mit überlegener Wärme beständigkeit darstellt.

Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Pyruvat-Dehydrogenase können die Verbindungen, die an der von Pyruvat-Dehydrogenase katalysierten Umsetzung teilnehmen, sowie die an der Umsetzung beteiligten Enzyme und Substrate mit hoher Genauigkeit analysiert werden. Beispielsweise können folgende Bestandteile in verschiedenen Probenarten (Serum oder andere Körperflüssigkeiten, Nahrungs mittel oder andere Proben ohne besondere Begrenzung) gemessen oder bestimmt werden:

Die Menge an Brenztraubensäure in solchen Proben; die Enzymmenge in dem enzymatischen Reaktionssystem, die Brenztraubensäure erzeugt; und die Substratmenge in dem enzymatischen Reaktionssystem, die Brenztraubensäure erzeugt.

Beispielsweise können folgende Enzyme und Substrate bestimmt werden:

1. Glutamin-Pyruvin-Transaminase (GPT), α-Ketoglutarsäure;
2. Glutamin-Oxaloessig-Transaminase (GOT);
3. Lactat-Dehydrogenase, Milchsäure; und
4. Pyruvat-Kinase, ADP.

Dabei wird zur Bestimmung der Brenztraubensäure oder von Enzymen und Substraten, die mit der Brenztraubensäure erzeugenden Enzymreaktion verbunden sind, ein Reagens, das die Pyruvat-Dehydrogenase der Erfindung enthält, zu einem Brenztraubensäure enthaltenden System gegeben. In dem Reagens befinden sich FAD, Thiamin- Pyrophosphat (TPP), Phosphate, Elektronenakzeptoren und Metallionen zusammen mit der erwähnten Pyruvat-Dehydrogenase. Als Metallionen wird mindestens ein Ion eines Metalls, nämlich von Magnesium, Kobalt, Calcium, Nickel oder Zink, verwendet. Die Menge an Pyruvat-Dehydrogenase und der anderen Verbindungen im Reagens ist nicht kritisch, sofern die durch die Pyruvat-Dehydrogenase katalysierte Enzymreaktion zufriedenstellend verläuft. Die Menge an Pyruvat-Dehydrogenase im Reagens wird in Abhängigkeit von der Temperatur und der Dauer der Enzymreaktion eingestellt. Das Reagens der Erfindung enthält die erfindungsgemäße Pyruvat-Dehydrogenase in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 20 U/ml, und ferner etwa 1 bis 100 mM anorganisches Phosphat, etwa 1 bis 20 µM FAD, etwa 0,1 bis 0,5 mM Thiamin-Pyrophosphat, etwa 1 bis 50 mM Metallionen und etwa 0,01 bis 1 mM Elektronenakzeptor. Außerdem wird ein geeigneter Puffer zugesetzt, so daß die Reaktion im pH-Bereich von 5 bis 7,5 abläuft.

Wenn das genannte Reagens zugesetzt wird, wird die Brenztraubensäure in der Probe nach der enzymatischen Reaktion I umgesetzt und es entsteht Acetylphosphat, Kohlendioxid und ein reduzierter Elektronenakzeptor. Durch Messung der in der Reaktion I erzeugten Menge reduzierten Elektronenakzeptors, Kohlendioxids oder Acetylphosphats und/oder durch Messung der in der Umsetzung verbrauchten Menge anorganischen Phosphats oder Elektronenakzeptors kann die Menge an Brenztraubensäure in der Probe berechnet werden. Besonders geeignet ist dabei die Messung der Menge an erzeugtem reduziertem Elektronenakzeptor.

Die Menge an reduziertem Elektronenakzeptor im Reaktions system kann beispielsweise in Form eines Formazan-Farb stoffes bestimmt werden, der durch Umsetzung eines Tetra zoliumsalzes, d. h. eines oxidierten Formazan-Farbstoffes, mit dem reduzierten Elektronenakzeptor entsteht. Die nach stehend aufgeführten Elektronenakzeptoren und Tetrazolium salze sind beispielsweise in geeigneten Kombinationen im Reagens der Erfindung enthalten:

1) Elektronenakzeptoren
Phenazin-Methosulfat (PMS)
1-Methoxy-5-methylphenazinium-methylsulfat (1-mPMS)
9-Dimethylaminobenzo-α-phenazoxonium
2) Tetrazoliumsalze
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazolium (MTT)
Neotetrazolium-Blau
Nitrotetrazolium-Blau (NTB)
Tetrazolium-Blau (TB)
Tetranitrotetrazolium-Blau (TNTB)

Die vorstehend aufgeführten Tetrazoliumsalze können dem Reaktionssystem in Konzentrationen von 0,1 bis 10 mM zugesetzt werden.

Auf die angegebene Weise kann die Menge der Brenztraubensäure im Reaktionssystem bestimmt werden. Die Bestimmung der Verbindungen und Enzyme, die bei der Erzeugung der Brenztraubensäure eine Rolle spielen (beispielsweise die Messung der Enzymaktivität im Brenztraubensäure erzeugenden Enzymsystem und die Messung der Substrate im Brenztraubensäure erzeugenden Enzym-Reaktionssystem) kann durch Kombination des vorstehend beschriebenen Bestimmungsverfahrens für Brenztraubensäure mit bekannten Verfahren erfolgen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

90 ml Kulturmedium vom pH-Wert 6,8 mit einem Gehalt von 0,5% Fleischextrakt, 2% Polypepton, 1% Hefeextrakt, 1%K₂HPO₄ · 3 H₂O, 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,02% MnSO₄ · 7 H₂O werden in einen 500 ml fassenden Sakaguchi-Kolben eingebracht und 15 Minuten bei 121°C sterilisiert. Dann wird das Medium abgekühlt und mit 10 ml 20% wäßrige Lösung von sterilisiertem Natriumpyruvat vom pH-Wert 5,0 versetzt. Das erhaltene Medium (Medium A) wird mit einer Platin schlinge mit Lactobacillus delbrueckii FERM BP-1895 überimpft und 24 Stunden bei 37°C gezüchtet. Es wird eine Saatkultur erhalten. Dann werden 5,4 l frisches Medium A in einem 10 l fassenden Fermentationsgefäß vorgelegt und 15 Minuten bei 121°C sterilisiert. Das Medium wird abgekühlt und mit 600 ml 20% wäßrige Lösung von sterilisiertem Natriumpyruvat versetzt. Dieses Gemisch wird dann mit 100 ml der Saatkultur versetzt und anschließend 24 Stunden bei 37°C unter Rühren mit 300 U.p.m. und 2 l Belüftung pro Minute kultiviert. Die Aktivität der Pyruvat- Dehydrogenase in der erhaltenen Kulturflüssigkeit beträgt 0,35 U/ml.

6 l der Kulturbrühe werden zentrifugiert und die erhaltenen Bakterienzellen in 100 ml 50 mM Kaliumphosphat- Puffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert. Die Zellen werden durch 15 Minuten Behandlung mit Ultraschall (19 KHz) aufgebrochen. Das erhaltene Gemisch wird zur Entfernung der Zell-Bruchstücke zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule mit DEAE-Sepharose GL-6B aufgebracht, die mit 50 mM Kaliumphosphat-Puffer äquilibriert ist. Nach dem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wird das adsorbierte Enzym mit einem NaCl-Dichte gradienten (0-0,5 M) eluiert. Die Pyruvat-Oxidase-Aktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, mit einem Ultrafilter konzentriert, auf eine mit 50 mM Kaliumphosphat- Puffer vom pH-Wert 7,0 äquilibrierte Säule mit Sephadex G-200 aufgebracht und entsalzt. Die Pyruvat-Dehydrogenase- Aktivität in der entsalzten Lösung beträgt 840 U.

Beispiel 2
Formulierung des analytischen Reagens
Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,3)\|50 mM
FAD · Na₂	10 µM
TPP	0,2 mM
MgSO₄	10 mM
1-mPMS	0,1 mM
NTB	1,0 mM
Triton X-100	0,5 %
Pyruvat-Dehydrogenase (von Beispiel 1)	3 U/ml

Zunächst werden 3 ml der vorstehend angegebenen Formulierung etwa 5 Minuten auf 37°C erwärmt. Die Formulierung wird dann mit 0,2 ml wäßrige Lösung von Kalium-Pyruvat (0,2 bis 1 mM) versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Sodann wird die optische Dichte des Reaktions gemisches bei 570 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Fig. 5 zeigt, daß die Pyruvat- Konzentration im Reaktionsgemisch zur optischen Dichte (OD) proportional ist.

Beispiel 3
Formulierung des analytischen Reagens
Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,3)\|50 mM
FAD · Na₂	10 µM
TPP	0,2 mM
MgSO₄	10 mM
1-mPMS	0,1 mM
NTB	1,0 mM
Triton X-100	0,5%
Phosphoenolpyruvinsäure	0,5 mM
Pyruvat-Kinase	10 U/ml
Pyruvat-Dehydrogenase (von Beispiel 1)	3 U/ml

3 ml der vorstehend angegebenen Formulierung werden etwa 5 Minuten auf 37°C erwärmt. Dann wird das Gemisch mit 0,2 ml wäßriger Lösung von ADP (0,2 bis 1 mM) versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Sodann wird die optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 570 nm gemessen. Die in Fig. 6 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die ADP-Konzentration im Reaktionsgemisch zur optischen Dichte (OD) proportional ist.

Beispiel 4
Formulierung des analytischen Reagens
Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,3)\|50 mM
FAD · Na₂	10 µM
TPP	0,2 mM
MgSO₄	10 mM
1-mPMS	0,1 mM
NTB	10 mM
Triton X-100	0,5%
Pyruvat-Dehydrogenase (von Beispiel 1)	3 U/ml

3,0 ml der vorstehend genannten Formulierung werden etwa 5 Minuten auf 37°C erwärmt. Getrennt davon wird ein bestimmtes Volumen Vergleichsserum (Q-pak I; 0,2 bis 1,0 ml) auf 1,0 ml verdünnt und als Probe verwendet. 0,2 ml der Probe werden zu dem vorstehend genannten Reagens gegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C umgesetzt und seine optische Dichte bei 570 nm gemessen. Die in Fig. 7 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Menge Serum im Reaktionsgemisch zur optischen Dichte (OD) proportional ist. Die Standard-Kurve (Fig. 5) der Ergebnisse von Beispiel 2 kann zur Berechnung der Brenztraubensäure-Konzentration in der Serumprobe verwendet werden. Sie beträgt 113 µM.

Beispiel 5
Formulierung des analytischen Reagens
Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,3)\|50 mM
FAD · Na₂	10 µM
TPP	0,2 mM
MgSO₄	10 mM
1-mPMS	0,1 mM
NTB	10 mM
Triton X-100	0,5%
Pyruvat-Dehydrogenase (von Beispiel 1)	3 U/ml

3,0 ml der vorstehenden Formulierung werden etwa 5 Minuten auf 37°C erwärmt. Dann wird das Gemisch mit 0,2 ml wäßriger Lösung von Brenztraubensäure mit bestimmter Konzen tration (0 bis 1 mM) versetzt und das Gemisch 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Farbe des Reaktionsgemisches wird hierauf bei 570 nm gemessen. Sodann wird in gleicher Weise eine wäßrige Lösung von Brenztraubensäure mit Hilfe eines handelsüblichen Bestecks zur Bestimmung von Brenz traubensäure (Determiner-PA) gemessen. Die Ergebnisse bei Verwendung einer wäßrigen Brenztraubensäure lösung als Probe und Messung gemäß vorliegender Erfindung werden auf der Y-Achse aufgetragen, während die Ergebnisse mit der gleichen Probe bei der Messung mit dem im Handel erhältlichen Besteck auf der X-Achse aufgetragen werden. Die erhaltene graphische Darstellung zeigt Fig. 8. Die Beziehung der nach vorliegender Erfindung gemessenen Werte zu den in bekannter Weise bestimmten Werten beträgt r = 0,982 (n = 11) und die Übereinstimmungs-Gleichung ist y = 1,02x + 0,05, was auf eine sehr gute Übereinstimmung hinweist.

Claims

1. Pyruvat-Dehydrogenase mit hervorragender Wärmebeständigkeit, welche die Umsetzung I Brenztraubensäure + Phosphorsäure + Elektronenakzeptor → Acetylphosphat + CO₂ + reduzierter
Elektronenakzeptor (I)katalysiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Pyruvat-Dehydrogenase 15 Minuten bei einer Temperatur bis zu 50°C und einem pH-Wert von 6,3 stabil ist.

2. Pyruvat-Dehydrogenase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie bevorzugt auf andere Elektronenakzeptoren als auf Sauerstoff wirkt.

3. Pyruvat-Dehydrogenase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden Eigenschaften aufweist:

4. Verfahren zur Herstellung einer Pyruvat-Dehydrogenase durch Züchtung von Lactobacillus delbrueckii IFO 3202 (FERM BP-1895) und Gewinnung der Pyruvat-Dehydrogenase aus dem Kulturmedium oder den Bakterienzellen.

5. Analytisches Reagens, enthaltend die Pyruvat-Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.

6. Analytisches Reagens nach Anspruch 5 zur Bestimmung von Benztraubensäure, einem Substrat, aus dem die Brenztraubensäure erzeugt wird, und/oder einem Enzym, das die Umsetzung zur Erzeugung der Brenztraubensäure katalysiert.