DE3020646C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft neue Glycerinkinase und ihre
Herstellung (vgl. die Patentansprüche 1 und 2).
Glycerinkinase ist in der Vergangenheit als Enzym bekannt
geworden, das die folgende Reaktion katalysiert.
Reaktion:
ATP + Glycerin → ADP + L-α-Glycerophosphat
(EC 2.7.1.30 ATP : Glycerinphosphattransferase, empfohlener Name: Glycerinkinase).
ATP + Glycerin → ADP + L-α-Glycerophosphat
(EC 2.7.1.30 ATP : Glycerinphosphattransferase, empfohlener Name: Glycerinkinase).
Die bis heute bekannten Glycerinkinasen (im folgenden wird
die Glycerinkinase als GK bezeichnet) sind Enzyme aus Candida
mycoderma (Biochem. Z., 329, 320 (1957), ibid., 333,
471 (1961)), Enzyme aus Escherichia coli (J. Biol. Chem.,
242, 1030 (1967)) und Enzyme aus Taubenleber (Method in
Enzymology, Band 5, 476 (1962), Biochem. Z., 329, 320 (1957),
J. Biol. Chem., 211, 951 (1954)).
Es wurde gefunden, daß ein Streptomyces-Stamm A 2408, der
aus einer Bodenprobe des Sojabohnenfelds in Kakegawa-shi
Shizuoka-ken, Japan, isoliert worden ist, in seinen Zellen
ein Enzym erzeugt, welches die Reaktion mit Glycerin
und ATP zur Bildung von ADP und L-α-Glycerophosphat katalysiert.
Elektrophoretisch wurde ein homogenes Enzym in
gereinigter Form isoliert. Das Enzym gehört zur GK-Gruppe,
seine physikochemischen und biochemischen Eigenschaften
sind bis jetzt jedoch noch nicht bekannt und somit
ist es eine neue GK.
Gegenstand der Erfindung ist Glycerinkinase, die dadurch
gekennzeichnet ist, daß sie die folgenden Eigenschaften
aufweist:
- (1) Enzymwirkung: sie katalysiert mindestens die
folgende Reaktion:
(2) Molekulargewicht: 72000 ± 7200, bestimmt durch
Sephadex G-100
(3) isoelektrischer Punkt: 4,5(4) Km-Wert:
Glycerin4,8 × 10-5 M Dihydroxyaceton6,6 × 10-4 M D-Glyceraldehyd3,5 × 10-4 M ATP2 × 10-5 M(5) Spezifizitäten für Nukleotide: ATP < CTP < ITP » GTP, UTP
(6) optimaler pH-Wert: 9 bis 10
(7) pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10
(8) Einfluß auf Metallionen: stimuliert durch Mg++ inhibiert durch Ca++ und Mn++
(9) Wärmestabilität: stabil bis zu 45°C.
Die taxonomischen Eigenschaften des Streptomyces-Stamms A 2408
sind wie folgt:
Die Farbe der Lufthyphen, die gereifte Sporen tragen, ist
bräunlich-grau bis gräulich-braun. Gelblich-braunes Substrat
mycelium. Es bildet ein gelblich-braunes löslisches Pigment.
Beobachtungen auf einem anorganischen Stärkeagar bei 30°C
während 10 Tagen sind wie folgt. Man beobachtet die gleichen
morphologischen Merkmale wie auf Hafermehlagar und Glycerin/
Asparagin-Agar.
Die Lufthyphen besitzen einen Durchmesser von 0,6 bis 0,8 µm,
sie sind gerade oder wellenförmig, wachsen mit einfacher
Verzweigung und bilden viele Sporenketten. Die Sporenketten
bilden Spiralen mit losen 3 bis 5 Spiren in Form von Haken,
Schlingen oder Schlangen.
Die Form der Sporen ist kugelförmig oder oval, 0,8 bis 1,0 × 1,0
bis 1,5 µm, Oberflächen mit Stacheln.
Die Substratmycelien sind verzweigt, sie wachsen wellen
förmig oder schlangenförmig, 0,5 bis 0,6 µm Durchmesser
und üblicherweise kein Aufspalten der Hyphen und Tragen
von Sporen.
Keine Bildung von Geiselsporen und Sporenträgern.
L-Diaminopimelinsäure wird nachgewiesen.
Die Beobachtungen erfolgten auf verschiedenen Medien bei
30°C während 20 Tagen, wie es in Tabelle I (die Farbangabe
beruht auf "Color Harmony Manual", 4. Auflage 1958 (Container
Corp. of America USA)) erlautert wird.
1) Wachstumstemperatur: 12 bis 45°C
2) Verflüssigung von Gelatine: positiv
3) Stärkehydrolyse: positiv
4) Magermilch: Peptonisierung positiv, Koagulation negativ
5) Bildung von melaminartigem Pigment: negativ 6) Ausnutzung der Kohlenstoffquellen:
Ausnutzen: L-Arabinose, D-Fructose, D-Glucose, i-Inosit, D-Mannit, Raffinose, L-Rhamnose, Saccharose und D-Xylose.
2) Verflüssigung von Gelatine: positiv
3) Stärkehydrolyse: positiv
4) Magermilch: Peptonisierung positiv, Koagulation negativ
5) Bildung von melaminartigem Pigment: negativ 6) Ausnutzung der Kohlenstoffquellen:
Ausnutzen: L-Arabinose, D-Fructose, D-Glucose, i-Inosit, D-Mannit, Raffinose, L-Rhamnose, Saccharose und D-Xylose.
Wie zuvor erläutert, gehört der erfindungsgemäß eingesetzte Mikro
organismusstamm A 2408 zu Streptomyces wegen seiner Eigenschaften,
daß das Luftmycelium ein Sporenkettenwachstum von
einen nicht-geteilten wahren Substratmycelium zeigt, dem
Durchmesser des Myceliums und der Sporengröße und der
L-Art der Diaminopimelinsäure. Der Stamm A 2408 besitzt
die folgenden Eigenschaften. Die Farbe des Luftmyceliums
ist bräunlich-grau bis gräulich-braun. Die Sporenkette ist
lose 3 bis 5 aufgespulte Spiralen. Die Oberfläche der Sporen
besitzt Dornen. Die Farbe des Substratmyceliums ist
gelblich-braun. Bildung von gelblich-braunem löslischen
Pigment. Die Ausnutzung von Zucker ist weit. Keine Bildung
von melaminartigem Pigment. Diese Eigenschaften können als
Streptomyces canus zugeordnet werden (Heinemann et al.)
(Antibiotics and Chemotherapy, 3, 1239 bis 1242 (1953))
in International Streptomyces Project (ISP) (Inter. J.
System. Bacteriol., 18 (2), 95 (1968)). Ein Vergleich mit
dem erfindungsgemäßen Stamm A 2408 und Streptomyces canus
ISP 5017 zeigt die Ähnlichkeit der morphologischen, Züch
tungs- und physiologischen Eigenschaften.
Der erfindungsgemäße Stamm A 2408 wird somit als Streptomyces
canus A 2408 bezeichnet. Dieser Stamm wurde im Institute
for Microbial Industry and Technology, Japan, als Hinter
legungsstelle unter der FERM-Nr. 4977 hintergelegt. Diese
Hinterlegung wurde in die Hinterlegung FERM BP-1202 umgewandelt.
Es wurde gefunden, daß GK, das durch Streptomyces canus A 2408
gebildet wird, ein neues Enzym ist, das die im folgenden
erläuterten physikochemischen und biochemischen Eigenschaften
aufweist.
GK kann als Forschungsreagenz oder diagnostisches Reagenz
für den Metabolismus von Triglycerid in einem Körperfluid,
wie Serum, verwendet werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
ein neues GK und ein Verfahren zu seiner Herstellung zur
Verfügung zu stellen.
Die neue GK kann erzeugt werden, indem man den Stamm FERM BP-1202
in einem an sich bekannten
Medium für die Enzymerzeugung kultiviert. Die Züchtung ist
normalerweise eine flüssige Züchtung und eine eingetauchte
Belüftungskultur ist für die industrielle Produktion
geeignet. Es können übliche Nährmedien für Mikroorganismen
verwendet werden.
Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare Kohlenstoff
quellen, besonders bevorzugt Glycerin, verwendet werden.
Andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose,
Stärke, Melassen, können ebenfalls verwendet werden.
Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoff
quellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver bzw. Soja
bohnenmehl, Baumwollsamenmehl, trockene Hefe, Caseinhydro
lysat, Hefeextrakt, Fischmehlextrakt und Pepton, verwendet
werden. Gegebenfalls können Phosphat, Sulfat und anorga
nische Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan
oder Zink verwendet werden.
Die Züchtungstemperatur kann entsprechend den Bedingungen
für das Wachstum von Mikroorganismen und die Bildung von
GK ausgewählt werden und sie beträgt bevorzugt 25 bis 30°C.
Die Züchtungszeit hängt von den Bedingungen ab und die
Züchtung sollte bei der maximalen Produktion von GK beendet
werden. Sie dauert im allgemeinen 1 bis 3 Tage.
Das erfindungsgemäße Enzym kann aus Mycelien isoliert werden.
Die Kulturbrühe wird zum Sammeln des gezüchteten
Myceliums, das mit Ultraschall beschallt worden ist, zen
trifugiert, wobei man eine überstehende Lösung erhält.
Die überstehende Lösung wird unter Verwendung von Ammonium
sulfat (das im folgenden als AS bezeichnet wird) oder
Natriumsulfat zur Abtrennung der Verunreinigungen ausge
salzt. Nachdem das überstehende Material ausgesalzt wurde,
wird es zentrifugiert, wobei man einen GK enthaltenden
Niederschlag erhält. Das ausgefällte GK wird weiter durch
Entsalzen mit Sephadex G-25, Biogel P-2 durch eine Dialyse
membran oder ein Hohlfilter gereinigt. Dann wird
eine Ionenaustauschchromatographie unter Vervendung von
DEAE-Cellulose durchführen. Die so erhaltene GK-Fraktion
wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmenbrane, wie
Amicon XM-50 konzentriert. Die
entsalzte Fraktion wird einer Adsorptionschromatographie,
wie unter Verwendung einer Calciumphosphatgelsäule, zur
Abtrennung der Verunreinigungen unterworfen. Anschließend wird
mit einem Gradienten unter Verwendung eines Phosphatpuffers
eluiert. Die GK enthaltende Fraktion wird entsalzt und
durch eine Ultrafiltrationsmenbran, wie Amicon XM-50, kon
zentriert. Das Konzentrat wird der Gelchromatographie unter
Verwendung von Biogel P-200 oder Sephadex
G-150 unterworfen. Dann wird die GK-Fraktion
lyophilisiert.
Das gemäß dem obigen Reinigungsverfahren erhaltene GK
besitzt die folgenden physikochemischen und biochemischen
Eigenschaften:
0,2M-Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)0,4 ml
0,1M-Glycerin0,05 ml
10 mM ATP0,1 ml
10 mM MgCl₂0,1 ml
0,25% Nitrotetrazoliumblau0,1 ml
1% Rinderserumalbumin0,14 ml
10 mM NAD0,1 ml
0,05% Phenazinmethosulfat0,01 ml
Glycerophosphatdehydrogenase (2 mg/ml, 65 U/mg)5 µl
Das obige Gemisch (1 ml) wird bei 37°C während 5 min pre
inkubiert und eine GK-Lösung (50 µl) (verdünnt mit GL-
Puffer (10 mM Phosphatpuffer, der 10 mM Glycerin enthält,
pH 7,5)) wird zugegeben und dann wird bei 37°C während
10 min inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man
0,1N-HCl zugibt, und dann wird bei 550 nm zur Bestimmung
der Absorption (A550 nm) analysiert.
Eine Einheit GK wird so definiert, daß sie 1 Mol Glycero-
3-phosphat pro min freisetzt.
Die Enzymaktivität wird durch die folgende Gleichung
berechnet:
Enzymwirkung: Sie katalysiert mindestens die folgende
Reaktion.
Molekulargewicht: 72000 ± 7200
72000: bestimmt durch Sephadex G-100
65000: bestimmt durch SDS-Polyacrylamid
72000: bestimmt durch Sephadex G-100
65000: bestimmt durch SDS-Polyacrylamid
Isoelektrischer Punkt: 4,5
Km-Wert:
Glycerin4,8 × 10-5 M Dihydroxyaceton6,6 × 10-4 M D-Glyceraldehyd3,5 × 10-4 M ATP2 × 10-5 M
Glycerin4,8 × 10-5 M Dihydroxyaceton6,6 × 10-4 M D-Glyceraldehyd3,5 × 10-4 M ATP2 × 10-5 M
Substratspezifizität:
(1) Spezifizität für Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat und D-Glyceraldehyd:
Assayverfahren:
(1) Spezifizität für Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat und D-Glyceraldehyd:
Assayverfahren:
Reaktionsgemisch:
0,2M-Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)0,4 ml 0,1M-Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat
oder D-Glyceraldehyd0,05 ml 10 mM ATP0,1 ml 10 mM MgCl₂0,1 ml destilliertes Wasser0,1 ml
0,2M-Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)0,4 ml 0,1M-Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat
oder D-Glyceraldehyd0,05 ml 10 mM ATP0,1 ml 10 mM MgCl₂0,1 ml destilliertes Wasser0,1 ml
0,95 ml des Reaktionsgemisches werden bei 37°C während 3 min
preinkubiert und die Enzymlösung (gelöst in 10 mM Phosphat
puffer, pH 7,5, 0,05 ml) wird zugegeben. Dann wird bei 37°C
während 10 min inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man 3 min kocht. Nach dem Abkühlen auf 37°C wird die Menge
an ADP analysiert. ADP wird analysiert, indem man eine ADP-
Analyselösung (2,0 ml) zugibt, die das folgende Gemisch
enthält:
0,1M-Phosphatpuffer (pH 7,5)0,1 ml
0,2M-Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)0,1 ml
Peroxidase (0,5 mg/ml)0,1 ml
0,2% Phenol0,1 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin0,1 ml
10 mM MnCl₂0,05 ml
10 mM Thiaminpyrophosphat0,03 ml
1 mM FAD0,01 ml
10 mM Phosphoenolpyruvat0,1 ml
Pyruvatoxydase (100 U/ml)0,05 ml
Pyruvatkinase (4400 U/ml)1 µl
destilliertes Wasser1,26 ml
Das Reaktionsgemisch wird bei 37°C während 15 min inkubiert.
Die gemessene Farbe wird bei 550 nm zur Berechnung der Sub
stratspezifizität gemessen.
(2) Spezifische Aktivität für das Nukleotide:
ATP < CTP < ITP » GTP, UTP
Analyseverfahren:
Bei dem obigen Analyseverfahren (1) werden 10 mM ATP durch
CTP, ITP, und UTP ersetzt und dann wird das gebildete
Glycero-3-Phosphat gemessen. Wie im folgenden erläutert,
können alle analysierten Nukleotide ein Substrat sein.
Es wurde eine besonders hohe Spezifizität füt ATP und CTP
beobachtet.
Optimaler pH: pH 9 bis 10, wie in Fig. 1 dargestellt.
(In der Fig. ○ - ○ : Dimethylglutarat-NaOH-Puffer
(pH 6 bis 7,5), . - .: Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9),
∆ - ∆ : Phosphatpuffer (pH 6 bis 8), ▲ - ▲ : Glycin-NaOH-
Puffer (pH 9 bis 10,5)).
pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10, wie in Fig. 2 dargestellt.
Dimethylglutaratpuffer (pH 4 bis 7) und Glycin-NaOH-Puffer
(pH 10 bis 10,5), die je 10 mM Glycerin enthalten, werden
verwendet. Die Inkubation wird bei 37°C während 60 min
durchgeführt.
Das erfindungsgemäße GK wird durch Mg++ aktiviert und durch
Ca++ und Mn++ inhibiert. 7,5 × 10-6 M PCMB inhibieren die
Aktivität des erfindungsgemäßen GK vollständig.
Wärmestabilität: stabil bis zu 45°C, wie in Fig. 3
dargestellt.
Analyse: 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,8), der 10 mM Glycerin
enthält. Inkubation bei 45 bis 75°C jeweils
während 10 min.
Wie zuvor erläutert, gehört das erfindungsgemäße Enzym zu
einer Enzymklasse, die die Reaktion Glycerin und ATP zu
ADP und L-α-Glycerat katalysiert.
Ein Vergleich mit der bekannten Glycerinkinase von Candida
mycoderma GK (im folgenden als C.My.-GK bezeichnet), Esche
richia coli GK (im folgenden als E.Co-GK bezeichnet) und
Taubenherz-GK (im folgenden als Pig.-GK bezeichnet) und
der erfindungsgemäßen GK ist wie folgt.
Molekulargewicht von E.Co-GK beträgt 300000 und von C.My.-
GK 250000 (Tetrameres: Molekulargewicht von 60000), wohin
gegen das erfindungsgemäße GK ein Monomer mit einem Mole
kulargewicht von etwa 70000 ist. Die pH-Stabilität ist pH
6,5 bis 7 für E.Co-GK, pH 4,5 bis 5,5 für Pig.-GK und pH 6,7
für C.My.-GK, hingegen pH 5,5 bis 10 für das erfindungsgemäße
GK. Da Reaktionen, die ATP erfordern, zweiwertige
Metallionen benötigen, erfordert das obige GK ebenfalls Mg++.
Jedoch kann Mn++ für E.Co.GK und Pig.-GK ersetzt werden,
wohingegen Mn++ das Erfindungsgemäße GK stark inhibiert.
Außerdem unterscheiden sich die Substratspezifizitäten von
einander. E.Co.-GK zeigt fast die doppelt starke Aktivität
für Dihydroxyacetonphosphat, verglichen mit der von Glycerin,
wohingegen das erfindungsgemäße GK eine höhere Spezifizität für Glycerin zeigt als für Dihydroxyacetonphosphat.
E.Co-GK wirkt nur für ATP und das erfindungsgemäße GK für
ATP und CTP, ebenfalls für ITP, GTP und UTP. Als Folge des
Molekulargewichts, der pH-Stabilität, des Erfordernisses
von zweiwertigen Metallionen und der Substratspezifizität
läßt sich beweisen, daß die erfindungsgemäße Glycerinkinase
eine neue GK ist.
Die erfindungsgemäße GK kann für diagnostisches Enzym
verwendet werden.
Beispielsweise kann die erfindungsgemäße GK zur Analyse
von Triglycerid und Glycerin verwendet werden, indem man
mit Triglycerid und Lipoproteinlipase umsetzt, das Reak
tionsgemisch mit GK und ATP unter Bildung von Glycero-3-
phosphat inkubiert, das weiter mit Glycero-3-phosphatoxi
dase inkubiert wird, und dann wird der verbrauchte Sauer
stoff oder das freigesetzte Wasserstoffperoxid gemessen.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
100 ml eines Mediums (pH 7,0), das 1,0% Pepton, 1,5% Glycerin,
0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ und 20% KCl enthält, wird
in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei 120°C
20 min lang sterilisiert. Es wird dann mit Streptomyces
canus A 2408 FERM BP-1202 inokuliert. Anschließend wird
bei 26°C während 3 Tagen gezüchtet. Die Kulturbrühe wird
in ein 30-l-Kolbenfermentationsgefäß gegeben, das das gleiche
Medium (20 l) enthält, und aerob bei 26°C während 40 h
kultiviert (300 Upm, Belüftung 20 l/min). 2 l Kulturbrühe
werden bei 4°C zum Sammeln des Myceliums zentrifugiert
(15000 Upm, 10 min). Das Mycelium wird in GL-Puffer (800 ml)
suspendiert und bei 0°C während 5 min durch eine Ultra
schallvorrichtung (Kubota Insonator 200M)
beschallt.
Die Lösung wird bei 4°C während 10 min bei 15000 Upm
zentrifugiert, um überstehendes Material (760 ml) zu erhalten.
Nach der Zugabe einer 5%igen Protaminlösung (23,0 ml)
werden die Verunreinigungen durch Zentrifugieren bei 4°C
und 5000 Upm während 10 min prezitipiert. Gesättigte Ammo
niumsulfatlösung (pH 7,5, 1125 ml) wird zu dem überstehenden
Material (750 ml) gegeben und dann wird bei 4°C und
15000 Upm während 10 min zum Sammeln des Prezipitats zen
trifugiert. Gesättigte AS (pH 7,5, 37,2 ml) wird zu der
Lösung des Prezipitats in 62 ml GL-Puffer zur Ausfällung
der Verunreinigungen gegeben. Überstehendes Material (82 ml)
wird durch Zentrifugieren bei 4°C und 15000 Upm während
10 min erhalten. Dann wird gesättigte AS (pH 7,5, 20,5 ml)
zugegeben. Anschließend wird bei 4°C und 15000 Upm während
10 min zentrifugiert. Man erhält einen Niederschlag.
Der Niederschlag wird in GL-Puffer (11,0 ml) gelöst und die
Lösung wird auf eine Säule von Sephadex G-25 (3 × 30 cm),
die mit dem gleichen Puffer gepackt ist, gegeben, dann
wird mit dem gleichen Puffer bei 25°C und einer Strömungs
rate von 40 ml/h eluiert. Fraktionen, die Absorptionen bei
280 nm zeigen, werden gesammelt (etwa 21 ml). Diese gibt
man auf eine Säule aus DEAE-Cellulose (2,2 × 17 cm), die
mit GL-Puffer gepackt worden ist. Dann wird mit GL-Puffer
(80 ml) (Strömungsrate 25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion) gewaschen.
Danach werden die Verunreinigungen mit GL-Puffer, der 0,1M-
KCl enthält, (Strömungsrate 25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion)
eluiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 63 bis 79 werden durch
lineare Gradientenelution mit GL-Puffer, der 200 ml 0,1M-
KCl enthält, und GL-Puffer, der 200 ml 0,4M-KCl enthält,
eluiert (Strömungsrate 25 ml/h, pro Fraktion 5,8 ml). Das
vereinigte aktive Eluat (98 ml) wird entsalzt und mit
Amicon XM-50 bei 4°C während 4 h konzentriert. Man erhält
eine konzentrierte Lösung (10 ml). Das Konzentrat wird
auf eine Säule aus Calciumphosphatgel (2,0 × 17,2 cm),
die mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben. Dann wird mit GL-
Puffer (100 ml) gewaschen und mit einem linearen Gradienten
von GL-Puffer 200 ml bis 100 mM Phosphatpuffer, der 200 ml
100 mM Glycerin enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h,
eine Fraktion 6 ml). Die aktiven Fraktionen 48 bis 58 werden
gesammelt und die vereinigte Lösung wird mit Amicon
XM-50 konzentriert. Man erhält 2 ml Konzentrat. Das Konzentrat
wird auf eine Säule aus Biogel P-200 (3 × 60 cm), die
mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben. Es wird mit dem gleichen
Puffer (Strömungsrate 25 ml/h, eine Fraktion 6 ml) eluiert.
Die aktiven Fraktionen Nr. 17 bis 20 werden gesammelt. Sie
werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält gereinigte
GK (spezifische Aktivität: 57,6 U/mg, 16,9 mg-Protein).
Fig. 1: optimale pH-Kurve für das erfindungsgemäße GK.
Fig. 2: pH-Stabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.
Fig. 3: Wärmestabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.
Fig. 2: pH-Stabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.
Fig. 3: Wärmestabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.
Claims (3)
1. Glycerinkinase, dadurch gekennzeichnet,
daß sie die folgenden Eigenschaften aufweist:
- (1) Enzymwirkung: sie kalysiert mindestens die
folgende Reaktion:
(2) Molekulargewicht: 72000 ± 7200, bestimmt durch
Sephadex G-100
(3) isoelektrischer Punkt: 4,5(4) Km-Wert:
Glycerin4,8 × 10-5 M Dihydroxyaceton6,6 × 10-4 M D-Glyceraldehyd3,5 × 10-4 M ATP2 × 10-5 M(5) Spezifizitäten für Nukleotide: ATP < CTP < ITP » GTP, UTP
(6) optimaler pH-Wert: 9 bis 10
(7) pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10
(8) Einfluß auf Metallionen: stimuliert durch Mg++ inhibiert durch Ca++ und Mn++
(9) Wärmestabilität: stabil bis zu 45°C.
2. Verfahren zur Herstellung der Glycerinkinase des
Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man Streptomyces canus FERM BP-1202 in einem Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden
Nährmedium kultiviert, die Kulturbrühe mit Ultraschell
beschallt, zentrifugiert, die überstehende Lösung unter Ver
wendung von Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat zur Abtrennung
der Verunreinigungen aussalzt, das ausgesalzte über
stehende Material zentrifugiert, dabei einen Glycerin
kinase enthaltenden Niederschlag erhält, die ausgefällte
Glycerinkinase weiter durch Entsalzen mit Sephadex G-25
oder Biogel P-2 durch eine Dialysemembran oder ein Hohl
filter reinigt, dann eine Ionenaustauschchromatographie
unter Verwendung von DEAE-Cellulose durchführt, die so
erhaltene Glycerinkinase-Fraktion entsalzt und durch eine
Ultrafiltrationsmembran konzentriert, durch Absorptions
chromatographie Verunreinigungen abtrennt, anschließend
mit einem Gradienten unter Verwendung eines Phosphatpuffers
eluiert, entsalzt und durch eine Ultrafiltrations
membran konzentriert, das Konzentrat der Gelchromato
graphie unter Verwendung von Biogel P-200 oder Sephadex
G-150 unterwirft und dann die Glycerinkinase-Fraktion
lyophilisiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Kohlenstoffquelle Glycerin verwendet.
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