JPS63137675A

JPS63137675A - 新規ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダ−ゼ及びその用途

Info

Publication number: JPS63137675A
Application number: JP61283240A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Yoshihama; 吉浜　義雄; Asuka Kagaya; 加賀谷　あすか; Susumu Matsui; 侑松井; Akira Obayashi; 晃大林
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1986-11-28
Filing date: 1986-11-28
Publication date: 1988-06-09
Also published as: JPH0441596B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規ＨＡＤ（Ｐ））１オキシダーゼ及びその用
途に関する。さらに詳しくは、アルカリ側に至適ｐＨな
有する新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、及びそれを用
いて、被検液中の基質または酵素活性を測定する方法に
関する。

〔従来の技術〕

従来より、還元型二＝チンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（以下ＮＡＤＨと略す）及び還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨと略す）
に作用して、過酸化水素を生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼについては、アコレプラズマ　ライドラライ（
ヨーロピアン・ジャーナＡ／ＩＩオプ・バイオケミスト
リー、第１２０巻、第３２９頁、１９８１年）及びバチ
ルスメガテリウム（ジャーナル・オプ働バイオケミスト
リー、第９８巻、第１４３３頁、１９８５年）などの微
生物にその存在が報告されている。

しかし、これらの微生物から得られた酵素はいずれも中
性付近に至適ｐＨを有している。

ＮＡＤ及びＮＡＤＰは種々の脱水素酵素の補酵素であり
、脱水素酵素の作用により生じる還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＰ（と略す）及び
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（
以下ＮＡＤＰＨと略す）を定量することにより、被検液
中の基質量または脱水素酵素活性を測定することが可能
であり、その測定方法は臨床分析、食品分析などにおい
て広く用いられている。

これらのＮＡＤ）１またはＮＡＤＰＨを定量する方法と
しては、一般にＮＡＤ）Ｉ及びＮＡＤＰＨに特異的な３
４０ｎｍの吸光度より測定す右方法、あるいはＮＡＤＨ
またはＮＡＤＰＨをテトラゾリウム塩と反応させて生じ
たホルマザン色素を比色定量する方法がある。

しかし、３４０ｎｍの吸光度より測定する方法は、ＮＡ
ＤＨ及びＮＡＤＰＨの分子吸光係数がさほど大きくない
ことから感度の点で問題があり、また、ホルマザン色素
の生成に導く方法においてはホルマザン色素が難溶性の
ため、色素が沈殿したり、セルやチューブに付着するな
どの欠点がある。

〔発明が解決りようとする問題点〕

そこで、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを酸化して過酸化水素
を生成するＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼを用い、酸素の
消費量あるいは過酸化水素の生成量を測定することによ
って、前記の二つの方法における欠点を解消した高感度
な測定が可能となる。しかしながら、脱水素酵素反応は
一般に可逆反応であり、中性付近では平衡はＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ→ＮＡＤ（Ｐ）の方向に大きく片寄っており、この
ような場合番こは、Ｎ　Ａ　Ｄ（Ｐ））ｌオキシダーゼ
と共役させて、基質または酵素活性を測定することは困
難である。ところが、アルカリ側では脱水素酵素反応の
平衡はＮＡＤ（Ｐ）→ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの方向に移り、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼとの共役反応が容易になって
ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼの作用による酸素の消費量
あるい１よ過酸化水素の生成量を測定することより高感
度化も可能となる。それ故、中性付近に至適ｐＨを有す
る従来のＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼとは異なり、アル
カリ側に至適ｐＨを有するＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼ
の開発、及び該酵素を用いる基質または酵素活性の優れ
た測定方法が強く望まれている。

従って本発明の目的は、上記現状に鑑み、アルカリ側に
至適ｐＨを有する新規ＮＡＤ（Ｐ））ｌオキシダーゼ及
び該酵素を用いた被検液中の基質または酵素活性の高感
度で簡便かつ安価な測定方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明のｆ！Ｓ１の発明は新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダ
ーゼに関するものであって、詳しくはアルカリ側に至適
ｐＨを有する新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼに関する
。

また、本発明の第２の発明は新規ＮＡＤ（Ｐ）１（オキ
シダーゼを用いた被検液中の基質または酵素活性の測定
方法に関するものであって、詳しくは被検液中の基質ま
たは酵素活性をＮＡＤ）ｌまたはＮＡＤＰＨな生成する
反応系を利用して測定する方法において、アルカリ側に
至適ｐＨを有する新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼを用
いて、酸素の消費１あるいは過酸化水素の生成量から、
被検液中の基質または酵素活性を測定する方法に関する
ものである。

本発明者らは、先に微生物の生産するＮＡＤ（Ｉ’）Ｈ
オキシダーゼについてスクリーニングした結果、ブレビ
バクテリウム　７ンモニアゲ卑ス（Ｂｒｅｖｉ−ｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　）などの微
生物がその菌体中にアルカリ側に至１１ｐＨを有し、か
つ安定なＮＡＤ（Ｐ））ｌオキシダーゼを生産すること
を見出し、本Ｉ！＃素の酵素化学的性質を検討した（特
願昭６１−１８８８２４号参照）。その結果、本酵素は
アクリル側に至適ｐＨを有することがら既に報告されて
いるＮＡＤ（ＰＩＨオキシダーゼとは異なるＮＡＤ（Ｐ
）ｌオキシダーゼ〔本明細書中新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキ
シダーゼと称する〕であるということが出来る。

本発明による新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ生産には
、新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼ生産能を有する菌株
であれば、すべて使用することができるが、生産に好適
な菌株の例としては、ブレビバクテリウム　アンモニア
ゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａ
ｇｅｎｅｓ　）　ＩＡＭ　１６４５、コリネバクテリウ
ム　フラカムファシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｆｌａｃｃｕｍｆｉｃｉｅｎｓ　）　ＡＨυ１６
２２、アースロバフタ−アトロシフ本ウス（Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒａｔｒｏｃｙａｎｅｕｓ　）　ＩＡＭ　
１２３３９　、ミクロコツカス　フラパス（Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｕｓ　　）　ＩＦｏ３２４２、
シュードモナス　アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　ＩＡＭ　１１５６　、
アクロモバクタ−パルプラス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔ
ｅｒｐａｒｖｕｌｕｓ　）　ＩＦｏ　１３１８２、アグ
ロバクテリウム　ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＩＦＯ１２６６４
、フラボバクテリウム　エステロア０マテイカム（Ｆｌ
ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｓｔｅｒｏａｒｏｍａｔ
ｉｃｕｍ）ＩＦＯ３７５１、ストレプトミセス　アウレ
ウス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｕｒｅｕｓ　）　Ｉ
ＡＭ　Ｏ０９２が挙げられる。

上記菌株を培養するに当って使用する培地は、使用菌株
が新規ＮＡＤ（Ｐｌ）ｌオキシダーゼを生産するもので
あれば良く、窒素源としては倒えば酵母エキス、ペプト
ン、肉エキス、コーンステイープリカー、硫安、塩化ア
ンモニウムなどが挙げられ、炭素源としては、例えばグ
ルコース、糖蜜、グリセロール、シュクロース、ソルビ
トールなどが使用できる。その他にリン酸塩、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩などの無機塩および金印塩を加え
ても良く、更にはビタミン類、生長促進因子などを加え
ても良い。

新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼ生産菌を培養するにあ
たり、培養温度は通常２０℃〜４０℃の範囲で、好適に
は３０℃付近で行われる。初発ｐＨは、通常ｐｌ’！６
〜８の範囲で、好適にはｐＨ７付近で行われ、通常１０
〜３０時間の通気撹拌培養によりＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシ
ダーゼの生産は最高に達する。

培養条件は使用する菌株、培養組成などに応じ、ＮＡＤ
（Ｐ）ｌオキシダーゼの生産量が最大になるよう設定す
るのは当然である。

かくして生産された新規ＮＡＤ（Ｐ））ｌオキシダーゼ
は大部分菌体内に存在するので、培養物を固液分離し、
得られた菌体を通常用いられる超音波処理、酵素処理、
ホモジナイズ処理等により破壊し、無細胞抽出液を得る
。次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段によ
り、精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、
有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィー、
吸着剤によるカラムクロマトグラフィー、グル濾過、凍
結乾燥等により精製を行い、ポリアクリルアミドゲルデ
ィスク電気泳動的に単一な新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダ
ーゼの標品を得ることができる。

本発明の新規ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼの酵素化学的
性質は次のとおりである。

（１）作用：本発明の酵素は、酸素の存在下、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰ
１’ｌを酸化し、ＮＡＤまたはｔｌＡＤＰと過酸化水素
を生成する。本酵素は下記反応式の如（、ＮＡＤＨまた
はＮＡＤＰＨ１モルと酸素１モルからＮＡＤまたはＮＡ
ＤＰ　１モルと過酸化水素１モルを生成する。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋　Ｈ”　＋　Ｏ，→ＮＡＤ（Ｐｙ＋＋
　Ｈ，Ｏ。

（２）基質特異性：ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに作用する。

（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：本酵素の至適ｐＨをブリトンーロビンソン緩衝液を用い
て測定したところ、本酵素はｐＨ９〜１０付近に至適ｐ
Ｈを有している（第１図）。また、同緩衝液を用い、本
酵素を各ｐＨにおいて３７℃で６０分間処理後、その残
存活性を測定したところ、ｐＨ６〜１０゜５の間で安定
である（第３図）。

（４）至適温度及び熱安定性：本酵素の至適温度をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）を用いて測定したところ、４０〜５０℃付近に至適温
度を有している（第２図）。また、同緩衝液を用い、本
酵素を各温度で１０分間処理後、その残存活性を測定し
たところ、５５℃まで安定である（第４図）。

なお、本酵素の活性測定は次の如く行う。

０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐｌ（７，０）　１．
０ｍｌ、　６　ｍＭ　ＮＡＤＨ溶液０．１−及び蒸留水
１．９４よりなろ反応液を予め３７℃で保持後、酵素液
０．１ｄを加え、３７℃で反応を行い、３４０ｎｍにお
ける吸光度の減少を測定する。酵素活性の表示は、１分
間に１μｍｏｌｅのＮＡＤＩ（を酸化する酵素量を１単
位とする。

本発明は、アルカリ側に至適ｐＨを有する新規ＮＡＤ（
Ｐ）Ｉ（オキシダーゼを用いることから、脱水素酵素反
応と共役させることが容易で高感度測定が可能である。

例えば、被検液中の乳酸デヒドロゲナーゼ（以下ＬＤ）
１とも略す）活性を新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼと
共役させて、過酸化水素の生成量から測定する場合、次
の反応系が進行する。

この場合、ＬＤ！（反応の平衡は中性付近ではＮＡＤ）
１減少方向（ＮＡＤＨ４ＮＡＤ＋）に片寄つ【いるので
、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼによる過酸化水素の生成
量から、ＬＤＨ活性を測定することは困難である。とこ
ろが、アルカリ側ではＬＤＨ反応の平衡はＮＡＤＨ増加
方向（ＮＡＤ＋→ＮＡＤＨ）に移るので、新規ＮＡＤ（
Ｐ）Ｈオキシダーゼの反応が進行して、ＬＤＨ活性を過
酸化水素の生成量から測定可能である。

また、被検液中の乳酸をＬＤＨ、新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオ
キシダーゼ系を用いて定量する場合も、同様にアルカリ
側では乳酸を過酸化水素の生成量としてとらえることが
できる。それ故、アルカリ側で安定でかつ反応性に優れ
た新規ＮＡＤ（Ｐ）１（オキシダーゼを用いることが高
感度分析に適している。

該酵素反応により生成した過酸化水素量は高感度比色法
、蛍光法あるいは化学発光法を用いる公知の方法で定量
が可能である。

このアルカリ側に至適ｐＨを有する新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
オキシダーゼは溶液状態で用いることができるが、ガラ
スピーズや多層フィルムその他種々の担体に固定化して
も使用可能である。膜に固定化して、これを酸素電極上
に装着すれば、酸素の消費量からも被検液中の基質また
は酵素活性を定量することができる。即ち、本発明は高
感度測定法が可能であること、アルカリ側に至適ｐＨを
有する新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ微生物より安価
にかつ大量に調製可能であること、とくにブレビバクテ
リウム属などから得られた新規ＮＡＤ（ＰＩＨオキシダ
ーゼは酵素生産性が高く、かつ非常に安定である、など
の特長を有しており、臨床検査分野に新規な基質または
酵素活性の測定方法を提供するものである。

本発明に供される被検液としては、ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨを含むものであればよ＜　、ＮＡＤＩ（またはＮ
ＡＤＰＨを予め含む被検液や酵素反応により生成された
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを予め含む被検液や酵素反応
により生成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含む被検
液がある。酵素反応によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを
生成する反応には、以下に例示するものがあるが、それ
らの酵素活性測定、基質または生成物の定量を行うこと
が可能である。

１．７／ｌ／コールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１
，１）７１ｖコール＋ＮＡＤ＋≠ヅルデヒド十ＮＡＤＨ
＋　Ｈ”２、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１
，１，２）アル；−ル＋ＮＡＤＰ”、：’アルデヒド十
ＮＡＤＰ）Ｉ　＋　Ｈ”３、グリセロールデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ１，１，１，６）グリセロール十ＮＡＤ％≧
ジヒドロキシアセトン＋ＮＡＤＨ＋　Ｈ”４、乳酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，２７）Ｌ−乳酸子ＮＡ
Ｄ”　Ｆ’ピルビン酸十ＮＡＤＨ＋　ｅ５．３−１ドロ
キシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，３０）Ｄ
−３−ヒドロキシ酪酸＋ＮＡＩ）九−ア七ト酢酸十ＮＡ
ＤＨ＋　ｆ６、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１
，１，３７）Ｌ−リンゴ酸＋ＮＡＤ＋≠オキザロ酢酸十
ＮＡＤＩ（＋　Ｈ”７、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
ＣＬｌ、１．４０　＞Ｌ−リンゴ酸＋ＮＡＤＰ九−ビル
ピン酸＋Ｃへ十ＮＡＤＰＨ＋　ｅ８、イソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４１）イソクエン酸＋
ＮＡＤ九−２−オキソグルタル酸＋Ｃｏ、＋　ＮＡりＨ
＋　Ｈ”９、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，
１，１，４２）イソクエン酸＋ＮＡＤＰ”　＃　２−オ
キ／グＩＬ／タル酸＋Ｃｏ、　＋　ＮＡＤＰＨ＋　Ｈ”
１０、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，
４７）β−Ｄ−ゲルコピ２ノース＋ＮＭＸＰ）＋→Ｄ−
グルコノーδ−ラクトン＋ＮＡＩＸＰ）Ｈ＋Ｈ”１１、ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，
４８）１２．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１，１，１，４９）１３．３α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，５０）１４
、テストステロン１７β−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，
１，１，６３）テストステロン＋ＮＡＤ”＝＋−アンド
ロステンー３．１７−ジオン十ＮＡＤＨ＋　ＴＩ” １５、テストステロン１７β−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１，１，１，６４）テストステロン＋ＮＡＤＰ”ｙ’４
−アンドロステン−３、１７−ジオン＋ｍＡＤＰＩＩ＋
　Ｈ” １６、ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１
，１２０）Ｄ−ガラクトフラノース＋ＮＡＤＰ＋→Ｄ−
ガラクトノ−ｒ−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋　Ｒ” １７、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１
，１２２）Ｌ−フコピラノース十ＮＡＩ）＋→Ｌ−フコ
ノー１，５−ラクトン十ＮＡＤＨ＋　Ｈ” １８、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２
，１，１’）１９、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２
，１，２）ギ酸＋ＮＡＤ＋→ＣＯ，＋　ＮＡＩ）Ｈ＋　
Ｈ”２０．１ラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，４，１
，１）Ｌ−７ラニン十〇Ｉ　Ｏ＋　ＮＡＪ）≠ピルビン
酸十ＮＨ，”＋ＮＡＤＨ＋Ｈ“２１、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１，４，１，２）２２、グルタミン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，４，１，３）以上、これ
らは例示であり、何ら本発明の対象を限定するものでは
ない。

本発明者らは、被検液中の基質または酵素活性の測定方
法について鋭意検討を重ねた結果、アルカリ側に至適ｐ
Ｈを有する新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを用いるこ
とにより、高感度で簡便かつ安価な基質または酵素活性
の測定方法を見出した。まず、被検液中の基質を定量す
る場合、被検液にその基質を酸化する脱水素酵素、ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＰ、及び新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダー
ゼを作用させると、反応の第１ステツプとして基質酸化
物とＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生成される。次に反応
の第２ステツプとして、生成されたＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨが酸素の存在下、新規１１ＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダ
ーゼの作用により、　ＮＡＤまたはＮＡＤＰと過酸化水
素に変換される。一方、被検液中の酵素活性を測定する
場合も被検液にその酵素反応の基質、ＮＡＤまたはＮＡ
ＤＰ　、及び新規ＮＡＤ（ｐＨオキシダーゼを作用させ
ると上記と同様に反応の最終生成物としてＮＡＤまたは
ＮＡＤＰと過酸化水素が生成される。

生成した過酸化水素の定量には公知の方法である比色法
、蛍光法、化学発光法、あるいは電極法が利用でき、ま
た、消費された酸素の定量には酸素電極を用いることが
できる。

過酸化水素の比色法による定量方法としては、例えばペ
ルオキシダーゼ系による呈色反応が挙げられる。この定
量方法では４−７ミノアンチビリンとフェノールの組み
合わせが一般的であるが、さらに感度を上げるために、
例えばフェノールの代すに２，４−ジクロロフェノール
、２．４−ジブロムフェノール、２，６−ジクロロフェ
ノールなどのフェノール誘導体、ジメチルアニリン、ジ
エチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエ
チル）−ｍ−）ルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−）ルイジン（以下
ＴＯＯ８と略す）などのアニリン誘導体を用いることが
できる。一方、４−７ミノアンチビリンの代りとしては
、４−アミノフェナジンや３−メチルベンゾチアゾリノ
ンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）が用いられる。

過酸化水素の蛍光法による定量方法としては、ホモバニ
リン酸やｐ−ヒドロキシフェニル咋酸などを過酸化水素
とペルオキシダーゼによりそれぞれの蛍光物質に変換し
て測定する方法が知られている。

さらに、過酸化水素の化学発光による定量方法としては
、ルミノール及びフェリシアン化カリウムと反応させ、
生じる発光を測定する方法などが知られている。

反応に用いられる緩衝液は特に限定されないが、反応液
中のＮＡＤまたはＮＡＤＰの酸化及び共役させるアルカ
リ側に至適ｐＨを有する新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダー
ゼの作用が進行しやすいように、アルカリ領域の緩衝液
が望ましい。

新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは通常０．０５〜１０
単位、好ましくは０．１〜１単位用いられる。被検液中
の基質を定量する場合は、その基質を酸化する脱水素酵
素反応が律速にならないように、脱水素酵素を充分量ま
た、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを少なくとも被検液中の基質
のモｙｖｆｌ１以上用いればよい。一方、被検液中の酵
素活性を測定する場合は、その酵素反応の基質とＮＡＤ
またはＮＡＤＰをその酵素反応が律速にならない置板上
用いる必要がある。また、通常、反応温度は２０〜４０
℃、反応時間は１〜３０分間で行われる。

〔実施例〕

以下に本発明を、実施例をもって説明するが、本発明が
以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例　１　新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの製造グ
ルコース１．０％、肉エキス１．０％、ペプトン１．０
％、ＫＨＩＰＯ，０，１％、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，００，
０５％、ｐＨ７，０からなる培地１００ｒＬｔを５００
ｄ容三角フラスコに分注Ｌ１１２０’Ｃで１５分間殺菌
後、ブレビバクテリウム　アンモニ７ゲ卑スＩＡＭ　１
６４５を接種し、３０℃で２４時間振とう培養したもの
を種培養液とした。

同組成培地５００ｄを２１容三角フラスコに分注し、１
２０℃で１５分間殺菌後、前記種培養液を２０−接種し
、３０’Ｃで１５時間振とぅ培養した。培養終了後、遠
心分離に上り固液分離を行い培養液５１より湿菌体６８
ｐを得た。

この菌体を３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）１５０−に懸濁後、超音波処理により菌体を破壊し、
遠心分離して得られた上澄を粗酵素液とした。この粗酵
素を１０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，０）
で透析後、予め同緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ　−セフ
ァ０−７ｕ（ＣＬ−６Ｂ）（７アルマシア製）のカラム
に通したところ、活性は通過液に認められた。次にこの
通過液のｐＨをＮａＯＨにより１０．０に調整後、予め
１０　ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，０）
で緩衝化したＱ−セファロース（ＦＦ）（ファルマシア
製）のカラムに通したところ新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシ
ダーゼは吸着した。そこで１０　ｍＭ〜１．０ＭのＮａ
Ｃ４の直線濃度勾配により溶出を行い、活性画分を集め
、コロジオンバッグで濃縮後、１００ｍＭ’Ｊン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファクリルＳ
−３００（ファルマシア製）のカラムでゲ／Ｉ／濾過を
行い、活性画分を回収し、新規ＮＡＤ（Ｐ））１オ午シ
ダーゼ５０ｒｎ９を得た。この比活性は２．１単位／■
であり、粗酵素液からの収率４２％であった。

実施例　２　　ＮＡＤＨの定量試薬組成Ｒ−１液トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９゜Ｏ）　　　　　５０１！
ＩＭ新規Ｎ鳩Ｐ）Ｈオキシダーゼ　　　　　　０．２５
単位／−Ｒ−２液リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　　　　　　　５００關４
−７ミノアンチビリン　　　　　　　　２．４ｍＭＴＯ
ＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．４ｍＭ
５．１０．１５及び２０　ｍＭ　（１’）　ＮＡＤＨ溶
液１０μｊをＲ−１液２ｄにそれぞれ添加後、３７℃で
５分間反応した。次いでＲ−２液１ｄを加え、５５０ｎ
ｍの吸光度を測定した。その結果、第５図に示すように
、添加したＮＡＤＨｉと５５０　ｎｍの吸光度の増加量
には良好な直線関係が得られた。

実施例　３　コール酸ナトリウムの定量試薬組成Ｒ−１液トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）　　　　　５０ｍＭ
ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　１　ｍＭ新規ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ　　　　　　　０．８単位／フ
Ｒ−２液リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　　　　　　　　５００ｍ
Ｍ４−７ミノアンチビリン　　　　　　　　２．４ｍＭ
ＴＯＯ８２，４ｍ！＋１２．４，６．８及び１０ｍＭのコール酸ナトリウム溶液
ｘｏｉｔをＲ−１液２ｄにそれぞれ添加後、３７℃で５
分間反応した。次いでＲ−２液１ｍを加え、５５０ｎｍ
の吸光度を測定した。その結果、第６図に示すように添
加したコール酸ナトリウム量と５５０ｎｍの吸光度の増
°加量には良好な直線関係が得られた。

実施例　４　コール酸す）　ＩＪウムの定量試薬組成Ｒ−１液トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）　　　　　　５０ｍ
ＭＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１ｍＭ新規Ｎ傾Ｐｉｌｌオキシダーゼ　　　　　
　　０．８単位／−クラーク型酸素電極を装着した密閉
セルにＲ−１液１．４ｄを入れ、３７℃で５分間予備加
温しズ電極を安定させた。次いで２，４，６．８及び１
０ｍＭのコール酸ナトリウム溶液１０μｌを添加し、酸
素消費量を測定した。その結果、添加したコール酸ナト
リウム量と酸素消費量には良好な直線関係が得られた。

また、７セチルセルロース膜に新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼを固定化し、上記酸素電極に装着した酵素電極
を用いて同様の実験を行ったところ、同じく良好な結果
を得た。

実施例　５　乳酸デヒドロゲナーゼ活性の測定試薬組成Ｒ−１液グリシン−Ｍａｉｌ緩衝液（ｐＨ９，５）　　　　５０
ｒＩｉＭＬ−乳酸ナトリウム　　　　　　　　　　３０
ｍＭＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１關新規ＮＡＤＩＩオキシダーゼ　　　　
　　　　Ｏ，Ｓ単位／ｍ１Ｒ−２液リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　　　　　　　　５００ｍ
Ｎ４−７ミノアンチビリン　　　　　　　　２．４−Ｔ
ＯＯ３２，４ｍＭ０．５　、１，０　、１．５　、２．０及び２．５単位
／１１１１の乳酸デヒドロゲナーゼ溶液１０ｄをＲ−１
液２ゴにそれぞれ添加後、３７℃で５分間反応した。

次いで反応停止後、Ｒ−２液１−を加え、５５０ｎｍの
吸光度を測定した。その結果、乳酸デヒドロゲナーゼ量
と５５０ｎｏ＋の吸光度の増加量には良好な直線関係が
得られた。

〔発明の効果〕

以上、詳細に説明したように、本発明の定量方法によれ
ば被検液中の基質または酵素活性を高感度かつ特異的に
定量することができる。また、本発明の新規ＮＡＤ（Ｐ
）Ｈオキシダーゼは微生物より安価にｖ４ｇ！！！する
ことが可能であり、臨床検査試薬として優れた効果を有
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｒオキシダーゼの
活性とｐＨの関係を示すグラフ、第２図は本酵素の活性
と温度の関係を示すグラフ、第３図は本酵素のｐＨ安定
領域を示すグラフ、第４図は本酵素の熱安定性を示すグ
ラフである。また、第５図は本発明の定量方法の実施例
２にあける検ｆｆｌ線をＮＡＤＨｆｉと５５０ｎｍの吸
光度との関係で示したグラフ、第６図は本発明の定量方
法の実施例３における検量線をコール酸ナトリウム量と
５５０ｎｍの吸光度との関係で示したグラフである。第５図ＮＡＩＤＨ量（ｎｍｏｌｅノコール厳ナトリウムＩ　　　（ｎｍｏｔ・〕手続補正書
（自発）昭和６２年　１月　１６日特許庁長官黒　１）明雄殿　　トコ１、事件の表示　　昭和６１年特許願第２８３２４０号
２、発明の名称新規ＮＡＩ）　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼ及びその用途３
、補正をする者事件との関係　　特許出願人へ無ど憾萬４、代理人６、補正の内容（１）明細書第６頁下より第６行「アクリル側」を「ア
ルカリ側」と訂正する。（２）同第１３頁第４行「オキシダーゼ微生物」を「オ
キシダーゼが微生物」と訂正する。（３同第２４頁下より第３行「新規ＭＡＤＨオキシダー
ゼ」を「新規１１ＡＤ（１９Ｈオキシダーゼ」と訂正す
る。（４）同第２５頁第６行「１０ＷＬｌ」を「１０μｌ」
と訂正する。以上

Claims

【特許請求の範囲】１、次の酵素化学的性質を有する新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオ
キシダーゼ、（１）作用：酸素の存在下、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを
酸化して、ＮＡＤまたはＮＡＤＰと過酸化水素を生成す
る。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＾＋＋Ｏ＿２→ＮＡＤ（Ｐ）＾＋＋
Ｈ＿２Ｏ＿２（２）基質特異性：ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰ
Ｈに作用する。（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：至適ｐＨが９〜１０付
近であり、３７℃、６０分間処理ではｐＨ６〜１０．５
の間で安定である。（４）至適温度及び熱安定性：至適温度が４０〜５０℃
付近であり、ｐＨ７．０、１０分間処理では５５℃まで
安定である。２、被検液中の基質または酵素活性をＮＡＤＨまたはＨ
ＡＤＰＨを生成する反応系を利用して測定する方法にお
いてアルカリ側に至適ｐＨを有する新規ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
オキシダーゼを用いて、酸素の消費量あるいは過酸化水
素の生成量から、被検液中の基質または酵素活性を測定
することを特徴とする基質または酵素活性の測定方法。