DE3882770T2 - Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Dehydrogenase oder ihrem Substrat. - Google Patents
Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Dehydrogenase oder ihrem Substrat.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Dehydrogenase oder ihrem Substrat in einer Dehydrogenaseumsetzung, bei dem die Dehydrogenase oder das Substrat genau und schnell ungeachtet ihrer Konzentration ohne Verfärbung der Bestimmungsapparatur mit Farbstoff oder ähnlichem bestimmt werden kann, und ein Reagenz zur Verwendung bei dem Verfahren zur Bestimmung der Dehydrogenase oder ihrem Substrat.
- Es sind eine Reihe von durch verschiedene Dehydrogenasen katalysierte Dehydrierungsreaktionen bekannt. Zum Beispiel sind die Reaktion zur Umwandlung von Glucose-6-phosphat in Glucono-δ-lacton-6-phosphat und die Reaktion zur Umwandlung von Milchsäure in Brenztraubensäure durch Glucose- 6-phosphatdehydrogenase bzw. Lactatdehydrogenase katalysiert. Bei diesen Reaktionen wurde die Bestimmung des Enzyms oder des Substrats durch zum Beispiel Bestimmung der reduzierten Coenzyme (z. B. NADH, NADPH und ähnliche) durchgeführt, die durch die Reduktion der Coenzyme, die an diesen Umsetzungen teilnehmen (z. B. NAD&spplus;, NADP&spplus; und ähnliche), erzeugt werden. Die Bestimmung des Enzyms oder des Substrats wird durch Messen der Extinktion von zum Beispiel NADH durchgeführt. Jedoch besitzen diese Verfahren den Nachteil, daß die Empfindlichkeit nicht ausreichend ist. Aus diesem Grund wurde ein Verfahren eingeführt, bei dem das Enzym oder das Substrat auf diese Weise bestimmt wird, daß das vorstehende NADH weiter in eine andere zu messende Verbindung umgewandelt wird. Eines dieser Verfahren ist das folgende Verfahren unter Verwendung einer Formazan-Entwicklung: (Elektronenträger)
- in dem 1-mPMS 1-Methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat bedeutet, 1-mPMSH&sub2; einen reduzierten Typ davon darstellt, MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid bedeutet und MTTH&sub2; ein reduzierter Typ davon (Formazan-Farbstoff) ist.
- Bei der vorstehenden Reaktion wird NADH, das in der Dehydrogenasereaktion von D-Glucose-6-phosphat in D-Glucono-6- lacton-6-phosphat erzeugt wird, in NAD&spplus; durch Abgabe von Elektronen an den Elektronenträger, wie 1-mPMS, umgewandelt (NADPH reagiert genauso). 1-mPMS wird dann zu 1-mPMSH&sub2; reduziert. Anschließend wird das im Reaktionssystem vorhandene MTT durch 1-mPMSH&sub2; zu MTTH&sub2; oder dem Formazan-Farbstoff reduziert, dessen Purpurfärbung mit einem Spektrophotometer gemessen wird, um das NADH zu bestimmen, und so wird das Enzym oder das Substrat indirekt bestimmt. Zusätzlich zum vorstehenden 1-mPMS schließt der Elektronenträger auch Phenazinmethosulfat (PMS), 9-Dimethylaminobenzo-α-phenazoxonium (Merdoler-Blau) und ähnliche ein. Das Verfahren mit der Messung des Formazan-Farbstoffs weist in der Tat eine höhere Empfindlichkeit als das vorstehende Verfahren der Bestimmung von NADH auf, aber es weist auch den Nachteil auf, daß es schwierig ist, einen automatischen Analysator zu verwenden, da der Farbstoff stark an den Röhrchen oder Zellen des Bestimmungsapparats haftet.
- Um die vorstehende Verfärbung mit dem Farbstoff zu vermeiden, ist in der ersten japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. 83598/1985 ein Verfahren offenbart. Gemäß dem Verfahren sind Sauerstoff, Peroxidase (POD) und ein Chromogen [z. B. N-Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS) und 4-Aminoantipyrin (4-AA)] im Reaktionssystem statt MTT beim Verfahren zur Messung der Formazan-Entwicklung vorhanden. Der erste Teil der Reaktion ist der gleiche wie im Verfahren mit der Bestimmung der Formazan-Entwicklung. Die Reaktion nach der Erzeugung von NADH ist durch das folgende Reaktionsschema veranschaulicht, in dem der Elektronenträger 1-mPMS ist, und das Chromogen ein Gemisch aus TOOS und 4-AA ist. Farbstoff
- Im vorstehenden Reaktionssystem werden die Elektronen auch von NADH zu 1-mPMS übertragen, wobei 1-mPMSH&sub2; hergestellt wird, das dann die Elektronen zu dem im Reaktionssystem vorhandenen O&sub2; überträgt, wobei über O&sub2;&supmin; H&sub2;O&sub2; gebildet wird. H&sub2;O&sub2; wirkt in Gegenwart von Peroxidase auf TOOS und 4-AA und dabei werden die Chromogene oxidiert, wobei ein Farbstoff hergestellt wird. Obwohl dieser Farbstoff anders als der Formazan-Farbstoff ohne Verschmutzung des Bestimmungsapparats bestimmt werden kann, weist dieses Verfahren noch einen zu überwindenden Nachteil auf. Nämlich haben die Erfinder das vorstehende Verfahren geprüft und festgestellt, daß es schwierig ist, eine genaue Bestimmung wegen der starken Farbabnahme nach der Farbentwicklung zu erhalten, insbesondere im Fall einer hohen Konzentration des Substrats.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die vorstehenden Nachteile zu vermeiden und ein Verfahren zu schaffen, mit dem das Enzym oder sein Substrat in einer Dehydrogenaseumsetzung leicht in genauer und einfacher Weise ohne Verschmutzung des Bestimmungsapparats mit Farbstoff oder ähnlichem bestimmt werden kann. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Bestimmung des Enzyms oder seines Substrats in der Dehydrogenaseumsetzung ungeachtet ihrer Konzentration in der Testprobe zu schaffen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Reagenzkit zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Dehydrogenase oder ihres Substrats bereitzustellen. Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung offensichtlich.
- Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen der Extinktion (OD&sub5;&sub5;&sub0;) und der Konzentration des Substrats Glucose-6-phosphat (M), gemessen mit dem üblichen Verfahren.
- Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Extinktion (OD&sub5;&sub5;&sub0;) und der Konzentration des Substrats Glucose-6-phosphat (M), gemessen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren im Vergleich zum üblichen Verfahren.
- Fig. 3 zeigt die Extinktion (OD&sub5;&sub5;&sub0;) gemessen zu verschiedenen Reaktionszeiten beim erfindungsgemäßen Verfahren.
- Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen der Fructose-Dehydrogenase-Aktivität und der Extinktion (OD&sub5;&sub5;&sub0;) der Reaktionslösung bei der Messung der Fructose-Dehydrogenase-Aktivität mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.
- Vor der Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die experimentellen Ergebnisse des in der vorstehenden ersten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 83598/1985 beschriebenen Verfahrens aufgeführt, die von den Erfindern wie folgt durchgeführt wurden:
- Reaktionsbestandteile (1):
- Tris-Salzsäure-Puffer (pH-Wert 8.0) 1.4 ml
- Glucose-6-phosphatlösung (0-0.01 mol/l) 0.1 ml
- Glucose-6-phosphat-Dehydrogenaselösung (0.5 E/ml) 0.3 ml
- NAD&spplus;-Lösung (0.1 mol/l) 0.2 ml
- 1-mPMS-Lösung (0.5 mg/ml) 0.1 ml
- Reaktionsbestandteile (2):
- 4-Aminoantipyrinlösung (10 mg/ml) 0.3 ml
- TOOS-Lösung (10 mg/ml) 0.3 ml
- Peroxidaselösung (100 E/ml) 0.3 ml
- Die vorstehenden Reaktionsbestandteile (1) wurden gemischt und bei 37ºC genau 5 Minuten lang umgesetzt, und die Reaktionsbestandteile (2) wurden zugegeben und das Gemisch weitere 4 Minuten umgesetzt. Die Extinktion dieses Reaktionsgemisches wurde bei 550 nm gemessen. Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen der Substrat (Glucose-6-phosphat)-Konzentration und dem OD-Wert (durch Abziehen eines Blindwerts vom gemessenen Wert erhaltener Wert, als OD&sub5;&sub5;&sub0; dargestellt).
- Wie aus Fig. 1 offensichtlich ist, wird eine lineare Beziehung zwischen der Substrat (Glucose-6-phosphat)-Konzentration und dem OD-Wert bei einer relativ geringen Konzentration des Substrats (unter 0.0003 mol/l) beobachtet, aber im Fall einer höheren Konzentration des Substrats (0.005 mol/l und 0.010 mol/l) wurde eine Erhöhung der Extinktion nach 4 Minuten wegen der starken Farbabnahme nach der Farbentwicklung wie im Fall der Konzentration von 0 mol/l nicht beobachtet.
- Als Ergebnis der Untersuchung der Erfinder wird angenommen, daß die starke Farbabnahme des entwickelten Farbstoffs im Fall einer hohen Substratkonzentration durch eine Nebenreaktion wie im folgenden Diagramm 1 auftritt, und weiter, daß im Fall einer anderen Art der Umsetzung, d. h. einer Umsetzung der Sarcosin-Dehydrogenase, in der kein Coenzym an der Umsetzung teilnimmt, eine Reaktion wie im folgenden Diagramm 2 abläuft und daher die Farbabnahme wie in der vorstehenden Glucose-6-phosphat-Dehydrogenaseumsetzung auftritt. Diagramm 1 Substrat Dehydrogenase Produkt vermindertes Coenzym Elektronenträger starke Farbabnahme entwickelter Darbstoff Chromogen unfähig zur Farbentwicklung Diagramm 2 Substrat Dehydrogenase Produkt Elektronenträger starke Farbabnahme entwickelter Farbstoff Chromogen unfähig zur Farbentwicklung
- Beim vorstehenden Diagramm 1 werden die in der Dehydrogenaseumsetzung erzeugten Elektronen zum Coenzym und dem Elektronentransfersystem und dann zu O&sub2; übertragen. Ist jedoch die Substratkonzentration so groß, daß die Enzymreaktion nicht gestoppt wird, werden (1) die Elektronen vom reduzierten Elektronenträger zum Farbstoff (gebildet durch die Reaktion mit Peroxidase), nicht zum O&sub2;, übertragen, woraus sich die starke Farbabnahme ergibt, und (2) die Elektronen vom reduzierten Elektronenträger nicht zu O&sub2;, sondern zu TOOS übertragen, und dabei wird TOOS reduziert und wird unfähig zur Farbentwicklung, woraus sich eine schlechte Farbentwicklung ergibt. Vorstehendes ist der Grund der schlechten Farbentwicklung und der starken Farbabnahme im Reaktionssystem. Das gleiche Prinzip, wie vorstehend, ist im Fall von Diagramm 2 anwendbar. Nach Erwägung dieser Tatsachen haben die Erfinder festgestellt, daß die Elektronen vom Elektronentransfersystem vollständig zu O&sub2; übertragen werden könnten, wenn man (a) das Reaktionssystem so festlegt, daß die Dehydrogenasereaktion und die Bildung von H&sub2;O&sub2; vollständig sind, bevor die Peroxidaseumsetzung beginnt, und (b) ein Chromogen nach Stoppen der Dehydrogenaseumsetzung zugibt.
- So betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Dehydrogenase oder ihres Substrats in einer Dehydrogenaseumsetzung, umfassend die Dehydrogenaseumsetzung einer Dehydrogenase und ihres Substrats in Gegenwart eines Elektronenträgers oder einer Kombination aus einem Coenzym und einem Elektronenträger, wobei die Bildung von H&sub2;O&sub2; durch Übertragung von Elektronen, die von dem Substrat stammen, durch die Dehydrogenaseumsetzung mittels Elektronenträgers oder mittels des Coenzyms und des Elektronenträgers auf O&sub2; ermöglicht wird, das Stoppen der Dehydrogenaseumsetzung, die Umsetzung des H&sub2;O&sub2; mit einer Peroxidase und einem Chromogen und die Messung des gebildeten Farbstoffs. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Reagenzkit zur Verwendung bei der Bestimmung eines Dehydrogenasesubstrats, das ein erstes Reagenz, umfassend (i) eine Dehydrogenase, (ii) einen Elektronenträger oder eine Kombination eines Coenzyms und eines Elektronenträgers, ein zweites Reagenz, umfassend (iii) eine Stoplösung für die Dehydrogenaseumsetzung, und ein drittes Reagenz, umfassend (iv) eine Peroxidase und (v) ein Chromogen, enthält, und ein Reagenzkit zur Verwendung bei der Bestimmung einer Dehydrogenase, das ein erstes Reagenz, umfassend (i) ein Dehydrogenasesubstrat, (ii) einen Elektronenträger oder eine Kombination eines Coenzyms und eines Elektronenträgers, ein zweites Reagenz, umfassend (iii) eine Stoplösung für die Dehydrogenaseumsetzung, und ein drittes Reagenz, umfassend (iv) eine Peroxidase und (v) ein Chromogen, enthält.
- Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Dehydrogenase oder ihr Substrat in der Dehydrogenaseumsetzung in genauer und einfacher Weise durch Verwendung der oxidativen Entwicklung des Chromogens durch die Peroxidase bestimmt werden. Anders als das herkömmliche Verfahren, das eine Schwierigkeit bei der Substratbestimmung mit hoher Konzentration aufweist, stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine genaue Bestimmung des Susbstrats ungeachtet seiner Konzentration bereit. Da der bei der erfindungsgemäßen Reaktion gebildete Farbstoff, unterschiedlich zum Formazan-Farbstoff, nicht an den Röhrchen oder Zellen der Bestimmungsapparatur haftet, wird es möglich, eine große Menge an Proben kontinuierlich mit einem automatischen Analysator zu behandeln.
- Die Begriffe "Dehydrogenase" und "Substrat" bedeuten bei der vorliegenden Erfindung eine solche Dehydrogenase und ihr Substrat, wie sie bei der in den vorstehenden Diagrammen 1 und 2 aufgeführten Dehydrogenaseumsetzung beteiligt sind, d. h. die Umsetzungen, bei denen die Elektronen vom Substrat zu O&sub2; mittels eines Elektronenträgers oder mittels des Coenzyms und eines Elektronenträgers übertragen werden, wobei H&sub2;O&sub2; gebildet wird. Typische Beispiele der Dehydrogenase und ihres Substrats sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Kombinationen der Dehydrogenase und ihres Substrats beschränkt. Außerdem ist das Substrat nicht auf jene, die jeweils der Dehydrogenase entsprechen, beschränkt, sondern schließt andere Substrate insofern ein, daß sie spezifisch mit Dehydrogenase umgesetzt werden können.
- Substrat Dehydrogenase
- Glucose Glucosedehydrogenase (EC 1.1.1.47)
- Glucose-6-phospnat Glucose-6-phosphatdehydrogenase (EC 1.1.1.49)
- Malat Malatdehydrogenase (EC 1.1.1.37)
- 3-α-Hydroxysteroid 3-α-Hydroxysteroiddehydrogenase (EC 1.1.1.50)
- Lactat Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27)
- L-Glutamat L-Glutamatdehydrogenase (EC 1.4.1.2)
- Leucin Leucindehydrogenase (EC 1.4.1.9)
- Sarcosin Sarcosindehydrogenase (SC 1.5.99.1)
- Amin Amindehydrogenase (EC 1.4.99.3)
- Bernsteinsäure Succindehydrogenase (EC 1.3.99.1)
- Cholin Cholindehydrogenase (EC 1.1.99.1)
- Fructose Fructosedehydrogenase (SC 1.1.99.11)
- Sorbit Sorbitdehydrogenase (erste japan. Pat.veröff. Nr. 2999/1981)
- Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Coenzym schließt NAD&spplus;, NADP&spplus;, Flavine und ähnliche ein. Die Flavine schließen Flavinadenindinucleotid (FAD), Flavinmononucleotid (FMN) und ähnliche ein. Die Dehydrogenierungsreaktion unter Einbezug des Coenzyms schließt die ein, die durch Glucose- Dehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase, 3-α-Hydroxystereoid-Dehydrogenase, Lactat-Dehydrogenase, L-Glutamindehydrogenase und Leucin-Dehydrogenase unter den Dehydrogenasen der vorstehenden Tabelle 1 katalysiert werden. Die Konzentration des Coenzyms ist nicht besonders eingeschränkt und beträgt üblicherweise 0.001 bis 2000 mmol/l.
- Der vorzugsweise beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Elektronenträger schließt Phenazinmethosulfat (PMS), 1-Methoxy-5-methylphenaziummethylsulfat, 9-Dimethylaminobenzo-α-phenazoxoniumchlorid und ähnliche ein. Diese Elektronenträger können allein oder in einem Gemisch von mehreren verwendet werden. Die Konzentration des Elektronenträgers im Reaktionssystem ist nicht festgelegt, beträgt aber üblicherweise 0.0001 bis 1.0 mg/l.
- Die Stoplösung für die erfindungsgemäße Dehydrogenaseumsetzung schließt eine Säure oder eine Alkalie, eine Pufferlösung mit einem unterschiedlichen pH-Wert zum Dehydrogenaseumsetzungssystem, einen Dehydrogenaseinhibitor, ein grenzflächenaktives Mittel und ähnliche ein. Geeignete Beispiele der Stoplösung sind nachstehend offenbart.
- Das erfindungsgemäße Chromogen kann jede Verbindung sein, die mit H&sub2;O&sub2; in Gegenwart von Peroxidase oxidiert wird, wobei eine Farbe entwickelt wird, einschließlich folgender Kombinationen:
- (1) 4-Aminoantipyrin/Anilin-Derivate
- (2) 4-Aminoantipyrin/Phenol-Derivate
- (3) Benzothiazolinonhydrazonderivat/Anilin-Derivate Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Anilinderivate schließen N-Methyl-N-hydroxymethyl-3-methylanilin, N-Ethyl-N-hydroxyethyl-3-methylanilin, N-Ethyl-N-hydroxyethyl-3-ethylanilin, N-Methyl-N-hydroxyethyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxypropyl-3-methylanilin, N-Ethyl-N-hydroxypropyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxyethyl-3-ethylanilin, N-Propyl-N-hydroxyethyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxyethyl-3-propylanilin, N,N-Bis (β-hydroxyethyl)-3-methylanilin, N,N-Bis(β-hydroxypropyl)-3-methylanilin, N,N-Dimethyl-3-methylanilin, N,N-Dimethyl-3-ethylanilin, N,N-Dimethyl-3-propylanilin, N,N-Diethyl-3-methylanilin, N,N-Diethyl-3-ethylanilin, N,N-Dipropyl-3-methylanilin, N-Ethyl-N- (β-methansulfonamidethyl)-m-toluidin, N-Ethyl-N-(β-acetamidethyl)-3-methylanilin, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, N,N-Diisopropylanilin, N-Methyl-N-hydroxyethylanilin, N-Ethyl-N-hydroxyethylanilin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-anisidin, N-Ethyl-N-(2- hydroxy-3-sulfopropyl)anilin, 3,5-Dimethoxy-N-ethyl-N-(2- hydroxy-3-sulfopropyl)anilin, 3,5-Dimethyl-N-ethyl-N-(2- hydroxy-3-sulfopropyl)anilin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylanilin, N-Ethyl-N- sulfopropyl-3,5-dimethoxyanilin und ähnliche ein.
- Die Phenolderivate schließen p-Chlorphenol, p-Bromphenol, 3,5-Dichlorphenolsulfonsäure, 3-Hydroxy-2,4,6-Trijodbenzoesäure und ähnliche ein.
- Die Benzothiazolinonhydrazonderivate schließen 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon und ähnliche ein.
- Die Konzentration der Anilinderivate und Phenolderivate ist nicht festgelegt, beträgt aber am stärksten bevorzugt 0.1 bis 20 mmol/l. 4-Aminoantipyrin wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 20 mmol/l verwendet. Die Benzothiazolinonhydrazonderivate werden vorzugsweise mit einer Konzentration von 0.1 bis etwa 2 mmol/l verwendet.
- Wie bereits vorstehend erwähnt, umfaßt das erfindungsgemäße Mittel zur Bestimmung des Dehydrogenasesubstrats das erste Reagenz, das (i) eine Dehydrogenase und (ii) einen Elektronenträger oder eine Kombination eines Coenzyms und eines Elektronenträgers enthält, das zweite Reagenz, das (iii) eine Stoplösung für die Dehydrogenaseumsetzung enthält, und das dritte Reagenz, das (iv) eine Peroxidase und (v) ein Chromogen enthält. Das zweite Reagenz und das dritte Reagenz können miteinander vor der Verwendung vermischt werden. Das erfindungsgemäße Mittel zur Bestimmung der Dehydrogenase umfaßt das erste Reagenz, das (i) ein Dehydrogenasesubstrat und (ii) einen Elektronenträger oder eine Kombination eines Coenzyms und eines Elektronenträgers enthält, das zweite Reagenz, das (iii) eine Stoplösung für die Dehydrogenasereaktion enthält, und das dritte Reagenz, das (iv) eine Peroxidase und (v) ein Chromogen enthält. Das zweite Reagenz und das dritte Reagenz können vor der Verwendung gemischt werden.
- Zur Messung der Dehydrogenase oder des Substrats mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden das Substrat, die Dehydrogenase, der Elektronenträger und, falls erforderlich das Coenzym, im Reaktionsgemisch gemischt, um die Dehydrogenaseumsetzung durchzuführen. Die vom Substrat erzeugten Elektronen werden zum Coenzym und Elektronenträger (Diagramm 1) oder zum Elektronenträger (Diagramm 2) übertragen. Die Elektronen werden dann vom Elektronenträger zum O&sub2; übertragen, der über O&sub2;&supmin; in H&sub2;O&sub2; umgewandelt wird. Dann wird das Reaktionssystem unter festen Bedingungen gehalten und die Dehydrogenaseumsetzung wird gestoppt.
- Zum Stoppen der Dehydrogenaseumsetzung können folgende Verfahren angewandt werden, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Verfahren beschränkt.
- 1) Verfahren der Zugabe einer Säure oder einer Alkalie:
- Im allgemeinen zeigen Enzyme eine unterschiedliche Stabilität in Abhängigkeit vom pH-Wert. Das heißt Enzyme können ihre Aktivitäten nicht in einem pH-Bereich oberhalb oder unterhalb eines bestimmten pH-Werts zeigen. Diese Eigenschaft des Enzyms legt nahe, daß die Dehydrogenaseumsetzung durch Zugabe einer Säure oder einer Alkalie zum Reaktionssystem, wobei der pH-Wert des Reaktionssystems so geändert wird, daß er in den pH-Bereich fällt, in dem die Enzyme nicht ihre Aktivität zeigen können, gestoppt werden kann. Die hier erwähnte Säure oder Alkalie schließt zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, wäßrigen Ammoniak und ähnliche ein, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Säuren und Alkalien beschränkt.
- 2) Verfahren der Zugabe einer Pufferlösung mit einem zu dem des Dehydrogenaseumsetzungssystems unterschiedlichen pH- Wert:
- In einer anderen Ausführungsform kann der pH-Wert des Dehydrogenaseumsetzungssystems durch Zugabe einer Pufferlösung mit einem zu dem des Reaktionssystems unterschiedlichen pH-Wert statt der Zugabe einer Säure oder Alkalie, wie vorstehend in (1), so geändert werden, daß die Enzyme ihre Aktivität nicht zeigen können, und dadurch kann die Dehydrogenaseumsetzung gestoppt werden. Wird zum Beispiel eine Dehydrogenaseumsetzung in einer Acetatpufferlösung (pH-Wert 4) durchgeführt, wird ein Boratpuffer (pH-Wert 10) zugegeben, um den pH-Wert des Reaktionssystems auf 8 zu ändern, wodurch die Dehydrogenaseumsetzung gestoppt wird. Der Puffer schließt jeden üblichen Puffer ein, sofern dieser bei üblichen Enzymreaktionen verwendet werden kann.
- 3) Verfahren der Zugabe eines Dehydrogenaseinhibitors zum Reaktionssystem:
- Wie allgemein bekannt ist, werden die Enzymaktivitäten durch verschiedene Verbindungen gehemmt, wobei einige die Enzyme vollständig desaktivieren können. Durch Zugabe solcher Inhibitoren kann die Dehydrogenaseumsetzung ebenfalls unterbrochen werden. Zum Beispiel führt im Fall einer Sarcosindehydrogenase eine Zugabe einer wäßrigen p-Chlormercuriobenzoatlösung zu einer vollständigen Desaktivierung der Dehydrogenase. Auch im Fall der Fructosedehydrogenase kann die Enzymaktivität durch Zugabe von Quecksilberchlorid vollständig gehemmt werden. Der Inhibitor ist nicht auf p-Chlormercuriobenzoat oder Quecksilberchlorid beschränkt, sondern kann jede übliche Verbindung sein, sofern sie die Dehydrogenaseumsetzung hemmen und Enzyme desaktivieren kann.
- 4) Verfahren der Zugabe eines grenzflächenaktiven Mittels:
- Enzyme sind Proteine mit einer dreidimensionalen sterischen Struktur und, wenn die Enzyme diese sterische Struktur verlieren, können sie ihre Aktivität nicht zeigen. Daher ist es durch Zugabe einer Substanz, die die sterische Struktur der Enzyme zerstören kann (d. h. eine Dehydrogenase) möglich, die Dehydrogenase zu desaktivieren und die Dehydrogenaseumsetzung zu hemmen, so daß die Dehydrogenaseumsetzung abgebrochen wird. Eine solche, zur Zerstörung der sterischen Struktur der Dehydrogenase fähige Substanz schließt ein grenzflächenaktives Mittel, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumdodecylbenzolsulfonat und Lithiumdodecylsulfat ein. Das grenzflächenaktive Mittel ist nicht auf die veranschaulichten grenzflächenaktiven Mittel beschränkt, sondern schließt jedes übliche grenzflächenaktive Mittel ein, das die Enzyme desaktivieren kann.
- Nachdem die Umsetzung gestoppt ist, werden das Chromogen und die Peroxidase zum Reaktionssystem gegeben. Der durch Umsetzung mit Peroxidase gebildete Farbstoff wird üblicherweise optisch unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen.
- Da die Dehydrogenierungsreaktion beim erfindungsgemäßen Verfahren gestoppt wird, verbleibt, unabhängig von der Substratkonzentration, der reduzierte Elektronenträger (z. B. 1-mPMSH&sub2;) nicht im Reaktionssystem. Daher bestehen beim erfindungsgemäßen Verfahren keine solchen Nachteile, wie daß die Elektronen vom reduzierten Elektronenträger zum Chromogen übertragen werden und dabei das Chromogen reduziert wird und unfähig zur Farbentwicklung wird, und daß die Elektronen auf den vom Chromogen gebildeten Farbstoff wirken und dabei den Farbstoff entfärben. Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine genaue Bestimmung bei jeder Konzentration des Substrats ohne Bewirkung einer Farbstoffabnahme liefern kann. Weiter haftet der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildete Farbstoff unterschiedlich zum Formazan- Farbstoff nicht an den Röhrchen oder Zellen des Bestimmungsapparats und ermöglicht so eine Massenbehandlung der Testproben innerhalb kurzer Zeit unter Verwendung eines automatischen Analysators. Weiter besteht ein großer Vorteil darin, daß eine Dehydrogenase oder ihr Substrat mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Konzentration von mehr als 0.005 mol/l bestimmt werden kann. Die Konzentration könnte mit einem üblichen Verfahren nicht bestimmt werden.
- Die vorliegende Erfindung wird im einzelnen durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Jedoch sollte die vorliegende Erfindung nicht als auf solche Beispiele beschränkt aufgefaßt werden.
- Reaktionsbestandteile (1):
- Tris-Salzsäurepuffer (pH-Wert 8.0) 1.3 ml
- Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 0. 1 ml
- (EC 1.1.1.49)-Lösung (0.5 E/ml) Glucose-6-phosphat-Lösung (0-0.01 mol/l) 0.3 ml
- NAD&spplus;-Lösung 0.2 ml
- 1-mPMS-Lösung (0.5 mg/ml) 0.1 ml
- Reaktionsbestandteile (2):
- 4-Aminoantipyrinlösung (10 mg/ml) 0.3 ml
- TOOS-Lösung (10 mg/ml) 0.3 ml
- Peroxidase-Lösung (100 E/ml) 0.3 ml
- Die vorstehenden Reaktionsbestandteile (1) (pH-Wert 8.0) wurden gemischt und bei 37ºC genau 5 Minuten umgesetzt. Dazu wurde eine wäßrige SDS-Lösung (300 mg/ml) gegeben, um die Dehydrogenaseumsetzung zu stoppen. Dann wurden die vorstehenden Reaktionsbestandteile (2) zugegeben und das Gemisch weitere 4 Minuten umgesetzt, und dann wurde die Extinktion des Reaktionsgemisches bei 550 nm gemessen. Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen den Konzentrationen des Substrats Glucose-6-phosphat und den OD-Werten nach der Umsetzung (erhalten durch Abziehen des Blindwerts vom gefundenen Wert, als OD&sub5;&sub5;&sub0; bezeichnet).
- Die Dehydrierungsreaktion vom Beispiel 1 wurde im gleichen Reaktionssystem wie die Reaktionsbestandteile (1) wiederholt, außer daß 1.4 ml Tris-Salzsäure-Puffer verwendet wurden. Nach genau 5 Minuten Umsetzung wurden die Reaktionsbestandteile (2) (die gleichen wie im Beispiel 1) sofort zum Gemisch gegeben und das Gemisch 4 Minuten lang umgesetzt. Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei 550 nm gemessen, die Ergebnisse sind in Fig. 2 aufgeführt.
- Wie in Fig. 2 aufgeführt, ist offensichtlich, daß eine genaue Bestimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sogar bei einer hohen Substratkonzentration möglich ist. Im Gegensatz dazu kann das übliche Verfahren das Substrat nur bei einer geringen Menge an Substrat bestimmen, kann aber das Substrat bei einer großen Menge (mehr als etwa 0.005 mol/l) wegen der Farbabnahme, die zu einer Extinktion mit keinem deutlichen Unterschied von der mit einer Substratkonzentration von 0 mol/l führt, nicht bestimmen.
- Reaktionsbestandteile (1):
- Tris-Salzsäurepuffer (pH-Wert 8.0) 1.4 ml
- Sarcosindehydrogenase (EC 1.5.99.1)-Lösung 0.1 ml
- Sarcosin-Lösung (1 mol/l) 0.1 ml
- 1-mPMS-Lösung (0.5 mg/ml) 0.1 ml
- Die vorstehenden Reaktionsbestandteile (1) (pH-Wert 8.0) wurden gemischt und bei 37ºC 1 Minute lang umgesetzt. Dazu wurde eine wäßrige p-Chlormercuriobenzoatlösung (0.1 mol/l, 0.1 ml) gegeben, um die Dehydrogenaseumsetzung zu stoppen. Dann wurden die Reaktionsbestandteile (2) (die gleichen wie im Beispiel 1) zum Gemisch gegeben. Die Umsetzung wurde 4 Minuten lang durchgeführt und dann die Extinktion des Reaktionsgemisches bei 550 nm gemessen. Die vorstehenden Verfahren wurden wiederholt, außer daß die Umsetzung 2, 3, 4, 5, 6 und 7 Minuten lang durchgeführt wurde. Fig. 3 zeigt eine Beziehung zwischen der Umsetzungszeit und den OD-Werten (erhalten durch Abziehen eines Blindwerts vom gefundenen Wert, als OD&sub5;&sub5;&sub0; bezeichnet). Wie aus Fig. 3 offensichtlich ist, wird die Enyzmaktivität der Sarcosindehydrogenase mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genau bestimmt.
- Reagenz 1:
- Fructose 1 mol/l
- m-PMS 10 mmol/l
- 4-AA 1 mg/ml
- McIlvaines-Pufferlösung (pH-Wert 4.5)
- Reagenz 2
- TOOS 1 mg/ml
- TES-Pufferlösung (pH-Wert 7.5)
- Reagenz 3
- Natriumdodecylsulfat (SDS) 10%ig
- Fructosedehydrogenaselösungen (0-20 E/ml) wurden einer Fructosedehydrogenasemessung unter Verwendung der vorstehenden Reagenzien 1-3 unterzogen.
- Zuerst wurde das Reagenz 1 in ein Teströhrchen gegeben und bei 37ºC vorher inkubiert. Dazu wurde eine Fructosedehydrogenaselösung gegeben und 5 Minuten lang bei 37ºC umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reagenz 3 zum Reaktionsgemisch gegeben, um die Umsetzung zu stoppen, und dann wurde das Reagenz 2 (1 ml) zugegeben. Fünf Minuten nach der Zugabe des Reagenz 2 wurde die Extinktion des Reaktionsgemisches bei 550 nm mit einer Blindprobe als Kontrolle gemessen. Als Ergebnis wurde, wie in Fig. 4 aufgeführt, eine lineare Grafik erhalten. So bestätigte sich, daß die Furctosedehydrogenaseaktivität korrekt gemessen wurde.
Claims (14)
1. Verfahren zur Bestimmung einer Dehydrogenase oder ihres
Substrats in einer Dehydrogenaseumsetzung, umfassend die
Dehydrogenaseumsetzung einer Dehydrogenase und ihres
Substrats in Gegenwart eines Elektronenträgers oder
einer Kombination aus einem Coenzym und einem
Elektronenträger, wobei die Bildung von H&sub2;O&sub2; durch Übertragung
von Elektronen, die von dem Substrat stammen, durch die
Dehydrogenaseumsetzung mittels des Elektronenträgers
oder mittels des Coenzyms und des Elektronenträgers auf
O&sub2; ermöglicht wird, das Stoppen der
Dehydrogenaseumsetzung, die Umsetzung des H&sub2;O&sub2; mit einer Peroxidase und
einem Chromogen und die Messung eines gebildeten
Farbstoffs.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die
Dehydrogenaseumsetzung durch Desaktivierung der Dehydrogenase gestoppt
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Dehydrogenase durch
Zugabe einer Säure oder einer Base zu dem
Reaktionssystem, durch Änderung des pH-Wertes des
Reaktionssystems mit einer Pufferlösung, die einen
unterschiedlichen pH-Wert hat, durch Zufügen eines oberflächenaktiven
Mittels zu-dem Reaktionssystem oder durch Zufügen eines
Dehydrogenaseinhibitors zu dem Reaktionssystem
desaktiviert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das oberflächenaktive
Mittel Natriumdodecylsulfat oder
Natriumdodecylbenzolsulfonat
ist
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Coenzym aus NAD&spplus;,
NADP&spplus; und Flavinen ausgewählt ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Dehydrogenase aus
Glucosedehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase,
Malatdehydrogenase, 3-α-Hydroxysteroiddehydrogenase,
Lactatdehydrogenase, L-Glutamatdehydrogenase,
Leucindehydrogenase, Sarcosindehydrogenase, Amindehydrogenase,
Succinatdehydrogenase, Cholindehydrogenase,
Fructosedehydrogenase und Sorbitdehydrogenase ausgewählt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Elektronenträger
aus Phenazinmethosulfat,
1-Methoxy-5-methylphenaziummethylsulfat und Dimethylaminobenzo-α-phenazoxoniumchlorid
ausgewählt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Chromogen aus 4-
Aminoantipyrin/Anilin-Derivaten,
4-Aminoantipyrin/Phenolderivaten und
Benzothiazolinonhydrazonderivat/Anilinderivaten ausgewählt ist.
9. Verfahren zur Bestimmung eines Dehydrogenasesubstrats
nach Anspruch 1, umfassend die Verwendung eines
Reagenzkits zur Bestimmung eines Dehydrogenasesubstrats,
bestehend im wesentlichen aus einem ersten Reagenz, umfassend
(i) eine Dehydrogenase, (ii) einen Elektronenträger;
einen- zweiten Reagenz, umfassend (iii) eine Stoplösung
für die Dehydrogenaseumsetzung; und einem dritten
Reagenz, umfassend (iv) eine Peroxidase und (v) ein
Chromogen.
10. Verfahren zur Bestimmung eines Dehydrogenasesubstrats
nach Anspruch 1, umfassend die Verwendung eines
Reagenzkits zur Bestimmung eines Dehydrogenasesubstrats,
bestehend im wesentlichen aus einem ersten Reagenz, umfassend
(i) eine Dehydrogenase, (ii) ein Coenzym und einen
Elektronenträger; einem zweiten Reagenz, umfassend (iii)
eine Stoplösung für die Dehydrogenaseumsetzung; und
einem dritten Reagenz, umfassend (iv) eine Peroxidase
und (v) ein Chromogen.
11. Reagenzkit zur Bestimmung eines Dehydrogenasesubstrats,
enthaltend ein erstes Reagenz, umfassend (i) eine
Dehydrogenase, (ii) einen Elektronenträger oder eine
Kombination aus einem Coenzym und einem
Elektronenträger; ein zweites Reagenz, umfassend (iii) eine
Stoplösung für die Dehydrogenaseumsetzung; und ein
drittes Reagenz, umfassend (iv) eine Peroxidase und (v)
ein Chromogen.
12. Reagenzkit zur Bestimmung von Dehydrogenase, enthaltend
ein erstes Reagenz, umfassend (i) ein
Dehydrogenasesubstrat, (ii) einen Elektronenträger oder eine
Kombination aus einem Coenzym und einem Elektronenträger; ein
zweites Reagenz, umfassend (iii) eine Stoplösung für die
Dehydrogenaseumsetzung; und ein drittes Reagenz,
umfassend (iv) eine Peroxidase und (v) ein Chromogen.
13. Reagenzkit zur Bestimmung von Dehydrogenase nach
Anspruch 12, enthaltend ein erstes Reagenz, umfassend
(i) ein Dehydrogenasesubstrat, (ii) einen
Elektronenträger; ein zweites Reagenz, umfassend (iii) eine
Stoplösung für die Dehydrogenaseumsetzung; und ein drittes
Reagenz, umfassend (iv) eine Peroxidase und (v) ein
Chromogen.
14. Reagenzkit zur Bestimmung von Dehydrogenase nach
Anspruch 12, enthaltend ein erstes Reagenz, umfassend
(i) ein Dehydrogenasesubstrat, (ii) ein Coenzym und
einen Elektronenträger; ein zweites Reagenz, umfassend
(iii) eine Stoplösung für die Dehydrogenaseumsetzung;
und ein drittes Reagenz, umfassend (iv) eine Peroxidase
und (v) ein Chromogen.
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